JP2002310886A - ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置 - Google Patents
ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来から行われてきた塗抹標本作製による一般
的な細胞診とフローサイトメトリーによる臨床診断の効
果を併せ持ったような新規な分析方法および装置を提供
する。 【解決手段】細胞、菌体、ウイルス、ＤＮＡ、ミトコン
ドリアなどの粒子様物質を含む検体を板状のサンプル容
器１内に注入し、サンプル容器１を遠心し、これによっ
てサンプル容器１内に粒子様物質の分布を形成せしめた
ものをプレパラートとする。その後、プレパラートとし
たサンプル容器１に対してレーザ光を照射及び走査し、
粒子様物質から得られる蛍光強度、散乱光強度、散乱固
体数のうちの少なくともいずれかの１組のデータを分析
データとして取得する。
的な細胞診とフローサイトメトリーによる臨床診断の効
果を併せ持ったような新規な分析方法および装置を提供
する。 【解決手段】細胞、菌体、ウイルス、ＤＮＡ、ミトコン
ドリアなどの粒子様物質を含む検体を板状のサンプル容
器１内に注入し、サンプル容器１を遠心し、これによっ
てサンプル容器１内に粒子様物質の分布を形成せしめた
ものをプレパラートとする。その後、プレパラートとし
たサンプル容器１に対してレーザ光を照射及び走査し、
粒子様物質から得られる蛍光強度、散乱光強度、散乱固
体数のうちの少なくともいずれかの１組のデータを分析
データとして取得する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査などの分
野において細胞やＤＮＡ、抗原、ウイルスなどを分析す
るための新規の分析方法及び装置に関し、特に、フロー
サイトメトリーや細胞診などと組み合わせることができ
る分析方法及び装置に関する。
野において細胞やＤＮＡ、抗原、ウイルスなどを分析す
るための新規の分析方法及び装置に関し、特に、フロー
サイトメトリーや細胞診などと組み合わせることができ
る分析方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】フローサイトメトリーによる分析装置
（フローサイトメータ）は、細胞の表面抗原をこれに対
するひとつまたはそれ以上の蛍光標識抗体などで特異的
に標識したり、同じくＤＮＡに結合するさまざまな色素
を用いて、そのときの蛍光強度や前方および側方散乱の
強度とそれぞれの蛍光強度、および個数のパラメータか
らさまざまな解析をする装置として一般的である。一
方、病理、細胞診、血液の一般的な化学染色の分野で
は、従来通り塗抹標本を作製し、顕微鏡観察によって判
定を下すのが一般的である。
（フローサイトメータ）は、細胞の表面抗原をこれに対
するひとつまたはそれ以上の蛍光標識抗体などで特異的
に標識したり、同じくＤＮＡに結合するさまざまな色素
を用いて、そのときの蛍光強度や前方および側方散乱の
強度とそれぞれの蛍光強度、および個数のパラメータか
らさまざまな解析をする装置として一般的である。一
方、病理、細胞診、血液の一般的な化学染色の分野で
は、従来通り塗抹標本を作製し、顕微鏡観察によって判
定を下すのが一般的である。
【０００３】臨床検査などにおける細胞診などでは、機
器の自動化が進み、いかに画像処理による判定技術が進
歩しても、最終的には専門医の判定を必要とする場合は
少なくない。このことは、画像観察を伴わないフローサ
イトメトリーにおいては、よりいっそう当てはまること
である。フローサイトメトリーは、その操作性、簡便性
もあって、臨床的にも優位性のある検査として広く認め
られている一方、画像情報を伴わないために貴重な情報
を捨てていることも少なくない。そこで、特開平５−１
１９０３５号公報「イメージングフローサイトメータ」
は、画像を取得できる機能を有するフローサイトメータ
を開示しているが、この装置では、細胞などがフローセ
ルの中を流れ出てしまうため、標本としての機能を発揮
しない。
器の自動化が進み、いかに画像処理による判定技術が進
歩しても、最終的には専門医の判定を必要とする場合は
少なくない。このことは、画像観察を伴わないフローサ
イトメトリーにおいては、よりいっそう当てはまること
である。フローサイトメトリーは、その操作性、簡便性
もあって、臨床的にも優位性のある検査として広く認め
られている一方、画像情報を伴わないために貴重な情報
を捨てていることも少なくない。そこで、特開平５−１
１９０３５号公報「イメージングフローサイトメータ」
は、画像を取得できる機能を有するフローサイトメータ
を開示しているが、この装置では、細胞などがフローセ
ルの中を流れ出てしまうため、標本としての機能を発揮
しない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、従来の細胞診に必要とされる標本機能を備えたまま
フローサイトメトリー（フローサイトメータ）の機能も
維持した新規の分析方法及び装置を提供することにあ
る。
は、従来の細胞診に必要とされる標本機能を備えたまま
フローサイトメトリー（フローサイトメータ）の機能も
維持した新規の分析方法及び装置を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述した
課題を解決するために鋭意検討を加えた結果、遠心分離
法とフローサイトメトリーのような蛍光標識法とを組み
合わせることにより、画像取得機能と細胞等の標本化機
能とをあわせ持つ新規の分析方法及び装置を発明するに
至った。この分析装置は、いわば画像標本化機能を持っ
たフローサイトメータというものである。またこの分析
装置では、典型的には、ディスク（円盤）状の構造をし
たサンプル容器を用いるので、この装置をディスクサイ
トメーター、その方法をディスクサイトメトリーと呼ぶ
ことにした。もっとも、後述する説明から明らかなよう
に、サンプル容器の形状は円盤状に限定されるものでは
ない。なお、細胞診や、蛍光標識法による分析、細胞等
の画像の取得を行なうことから、サンプル容器は、光学
的に透明な材料で構成されている必要がある。
課題を解決するために鋭意検討を加えた結果、遠心分離
法とフローサイトメトリーのような蛍光標識法とを組み
合わせることにより、画像取得機能と細胞等の標本化機
能とをあわせ持つ新規の分析方法及び装置を発明するに
至った。この分析装置は、いわば画像標本化機能を持っ
たフローサイトメータというものである。またこの分析
装置では、典型的には、ディスク（円盤）状の構造をし
たサンプル容器を用いるので、この装置をディスクサイ
トメーター、その方法をディスクサイトメトリーと呼ぶ
ことにした。もっとも、後述する説明から明らかなよう
に、サンプル容器の形状は円盤状に限定されるものでは
ない。なお、細胞診や、蛍光標識法による分析、細胞等
の画像の取得を行なうことから、サンプル容器は、光学
的に透明な材料で構成されている必要がある。
【０００６】ディスクサイトメトリーの方法は、従来か
ら生物材料の分離精製技術として使われてきた分画遠心
法、密度勾配法を用いる。密度勾配法は、目的物質の大
きさや形状、密度、比重といった違いを利用して、サン
プルを入れた遠心管を遠心機で遠心分離することによっ
て、容器内にその違いすなわちある勾配に応じた分布を
つくる方法である。本発明では、従来の密度勾配法にお
ける円筒状の遠心管の代わりに、サンプル容器として、
サンプル容器内に入れたままの状態で細胞診を行なうこ
とができ、また、蛍光標識法による分析や画像の取得が
行なえるように、板状のサンプル容器を使用する。遠心
機にかけることを想定すると、円盤状のサンプル容器と
することが好ましいが、遠心分離操作に支障がない限り
他の形状とすることも可能であり、例えば、短冊形のサ
ンプル容器とすることもできる。
ら生物材料の分離精製技術として使われてきた分画遠心
法、密度勾配法を用いる。密度勾配法は、目的物質の大
きさや形状、密度、比重といった違いを利用して、サン
プルを入れた遠心管を遠心機で遠心分離することによっ
て、容器内にその違いすなわちある勾配に応じた分布を
つくる方法である。本発明では、従来の密度勾配法にお
ける円筒状の遠心管の代わりに、サンプル容器として、
サンプル容器内に入れたままの状態で細胞診を行なうこ
とができ、また、蛍光標識法による分析や画像の取得が
行なえるように、板状のサンプル容器を使用する。遠心
機にかけることを想定すると、円盤状のサンプル容器と
することが好ましいが、遠心分離操作に支障がない限り
他の形状とすることも可能であり、例えば、短冊形のサ
ンプル容器とすることもできる。
【０００７】また遠心時に勾配を作るための媒体として
は、生物材料の場合には通常は、ＰＥＧ（ポリエチレン
グリコール）やショ糖を適当な濃度範囲に調整したもの
が用いられる。臨床検査の場では、その他Ｆｉｃｏｌｌ
（商品名）液やＰｅｒｃｏｌｌ（商品名）液など、各メ
ーカーから目的に応じて入手できる専用液も用いること
ができる。
は、生物材料の場合には通常は、ＰＥＧ（ポリエチレン
グリコール）やショ糖を適当な濃度範囲に調整したもの
が用いられる。臨床検査の場では、その他Ｆｉｃｏｌｌ
（商品名）液やＰｅｒｃｏｌｌ（商品名）液など、各メ
ーカーから目的に応じて入手できる専用液も用いること
ができる。
【０００８】したがって本発明の分析方法は、粒子様物
質を含む検体を板状のサンプル容器内に注入し、サンプ
ル容器を遠心し、これによってサンプル容器内に粒子様
物質の分布を形成せしめたものをプレパラートとするこ
とを特徴とする。
質を含む検体を板状のサンプル容器内に注入し、サンプ
ル容器を遠心し、これによってサンプル容器内に粒子様
物質の分布を形成せしめたものをプレパラートとするこ
とを特徴とする。
【０００９】本発明において、粒子様物質とは、典型的
には、細胞診や臨床検査の対象となる生物材料であっ
て、例えば、細胞、菌体、ウイルス、ＤＮＡ、ミトコン
ドリアからなる群から選ばれたものである。
には、細胞診や臨床検査の対象となる生物材料であっ
て、例えば、細胞、菌体、ウイルス、ＤＮＡ、ミトコン
ドリアからなる群から選ばれたものである。
【００１０】さらに本発明では、プレパラートとしたサ
ンプル容器に対してレーザ光を照射及び走査し、粒子様
物質から得られる蛍光強度、散乱光強度、散乱固体数の
うちの少なくともいずれかの１組のデータを分析データ
として取得するようにしてもよい。また、粒子様物質に
対して目的の蛍光標識がなされるように反応を予め行な
わせ、その後、サンプル容器を遠心するようにしてもよ
い。さらに、分析データに基づいて粒子様物質の画像デ
ータを取得するようにしてもよい。
ンプル容器に対してレーザ光を照射及び走査し、粒子様
物質から得られる蛍光強度、散乱光強度、散乱固体数の
うちの少なくともいずれかの１組のデータを分析データ
として取得するようにしてもよい。また、粒子様物質に
対して目的の蛍光標識がなされるように反応を予め行な
わせ、その後、サンプル容器を遠心するようにしてもよ
い。さらに、分析データに基づいて粒子様物質の画像デ
ータを取得するようにしてもよい。
【００１１】本発明において、蛍光標識抗体との反応
や、一般的な試料作成に関する実験プロトコールは、す
べてフローサイトメトリーで行われている方法をそのま
ま用いることができる。したがってこのように反応が終
了した試料を、さきほどの密度勾配液の入ったディスク
円盤状の容器に重層し、ある時間ある回転数で遠心した
後、ある勾配にしたがって並んだ細胞等、すなわち細
胞、菌体、ウイルス、ミトコンドリアなどの小器官、そ
の他微粒子など、円盤を回転させながら半径方向にレー
ザ照射によるスキャンを行い、そのときの蛍光強度と散
乱光強度と個数を情報として取り込み、また目的に応じ
て、共焦点レーザ顕微鏡の光学系によって、センサから
のディスクの位置情報をもとに、その位置での画像情報
を取得できる。
や、一般的な試料作成に関する実験プロトコールは、す
べてフローサイトメトリーで行われている方法をそのま
ま用いることができる。したがってこのように反応が終
了した試料を、さきほどの密度勾配液の入ったディスク
円盤状の容器に重層し、ある時間ある回転数で遠心した
後、ある勾配にしたがって並んだ細胞等、すなわち細
胞、菌体、ウイルス、ミトコンドリアなどの小器官、そ
の他微粒子など、円盤を回転させながら半径方向にレー
ザ照射によるスキャンを行い、そのときの蛍光強度と散
乱光強度と個数を情報として取り込み、また目的に応じ
て、共焦点レーザ顕微鏡の光学系によって、センサから
のディスクの位置情報をもとに、その位置での画像情報
を取得できる。
【００１２】以上が、本発明で述べるところのディスク
サイトメトリーの分析方法となる。
サイトメトリーの分析方法となる。
【００１３】このような分析方法を実施するための本発
明の分析装置は、板状のサンプル容器を遠心する手段
と、レーザ光を発生する手段と、レーザ光によってサン
プル容器を走査し、遠心によって分離した、サンプル容
器内の粒子様物質に対してレーザ光を照射する手段と、
サンプル容器からの散乱光を検出する手段と、を有する
ことを特徴とする。
明の分析装置は、板状のサンプル容器を遠心する手段
と、レーザ光を発生する手段と、レーザ光によってサン
プル容器を走査し、遠心によって分離した、サンプル容
器内の粒子様物質に対してレーザ光を照射する手段と、
サンプル容器からの散乱光を検出する手段と、を有する
ことを特徴とする。
【００１４】本発明において、散乱光を検出する手段
は、サンプル容器からの角度の異なる複数の散乱光を検
出する手段であってもよく、その場合は、複数の散乱光
に基づいて、蛍光強度及び／または粒子様物質の個数を
検出するようにすることが好ましい。また、照射する手
段は、回転している前記サンプル容器に対して半径方向
にレーザ光を走査することが好ましい。
は、サンプル容器からの角度の異なる複数の散乱光を検
出する手段であってもよく、その場合は、複数の散乱光
に基づいて、蛍光強度及び／または粒子様物質の個数を
検出するようにすることが好ましい。また、照射する手
段は、回転している前記サンプル容器に対して半径方向
にレーザ光を走査することが好ましい。
【００１５】また、散乱光を検出する手段からの検出信
号をＡ／Ｄ変換してパラメータとしてデータ処理及びデ
ータ解析を行なう手段をさらに設けてもよく、粒子様物
質の画像を得るための光学系及び撮像手段をさらに設け
てもよい。
号をＡ／Ｄ変換してパラメータとしてデータ処理及びデ
ータ解析を行なう手段をさらに設けてもよく、粒子様物
質の画像を得るための光学系及び撮像手段をさらに設け
てもよい。
【００１６】本発明に基づく画像標本化機能は、たとえ
ば従来フローサイトメトリーのみでは鑑別が難しいとさ
れている白血病と悪性リンパ腫、リンパ性と骨髄性急性
転化時の鑑別や、非リンパ性であったり、幼若Ｔ細胞の
確認、その他腫瘍に関してはＤＮＡインデックス判定で
は難しいような場合の補助的確認手段として、有意な臨
床判定結果をもたらすことができる。
ば従来フローサイトメトリーのみでは鑑別が難しいとさ
れている白血病と悪性リンパ腫、リンパ性と骨髄性急性
転化時の鑑別や、非リンパ性であったり、幼若Ｔ細胞の
確認、その他腫瘍に関してはＤＮＡインデックス判定で
は難しいような場合の補助的確認手段として、有意な臨
床判定結果をもたらすことができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】次に、本発明の好ましい実施の形
態について、図面を参照して説明する。図１は本発明の
原理を示す斜視図である。
態について、図面を参照して説明する。図１は本発明の
原理を示す斜視図である。
【００１８】図１に示した例では、透明な板状のサンプ
ル容器としてディスク円盤状のサンプル容器１を使用す
る。このサンプル容器１は、例えば、半径８０ｍｍ、内
のり部分の高さは１ｍｍである。一般的にディスポーザ
ブルな試料セルとしてよく用いられていて可視光から波
長２８０ｎｍまで均一な透過特性を示す、ポリメチルメ
タクリル酸（ＰＭＭＡ）樹脂でできている。サンプル容
器１の中央部上面にはサンプル注入口２が設けられてお
り、中央部下面には、サンプル注入口２と対面するよう
に、サンプル排泄口３が形成されている。
ル容器としてディスク円盤状のサンプル容器１を使用す
る。このサンプル容器１は、例えば、半径８０ｍｍ、内
のり部分の高さは１ｍｍである。一般的にディスポーザ
ブルな試料セルとしてよく用いられていて可視光から波
長２８０ｎｍまで均一な透過特性を示す、ポリメチルメ
タクリル酸（ＰＭＭＡ）樹脂でできている。サンプル容
器１の中央部上面にはサンプル注入口２が設けられてお
り、中央部下面には、サンプル注入口２と対面するよう
に、サンプル排泄口３が形成されている。
【００１９】ここでサンプル注入口２から密度勾配液を
容器内に満たしておき、さらに細胞等を含むサンプル
（検体）溶液を重層し、サンプル排泄口３にスクリュー
キャップをしておく。サンプル溶液は、予め、目的とす
る蛍光標識がなされるように反応が終了しているものと
する。次に、遠心機により、回転軸４のまわりにこのサ
ンプル容器１を回転させ、遠心分離を行なう。遠心分離
ののち、サンプル容器１の全範囲をレーザ光によって走
査し、そのときの前方散乱光、側方散乱光、および標識
された蛍光強度を測定する。さらに、サンプル容器１内
の所望の位置のサンプルを顕微鏡観察あるいは撮像す
る。
容器内に満たしておき、さらに細胞等を含むサンプル
（検体）溶液を重層し、サンプル排泄口３にスクリュー
キャップをしておく。サンプル溶液は、予め、目的とす
る蛍光標識がなされるように反応が終了しているものと
する。次に、遠心機により、回転軸４のまわりにこのサ
ンプル容器１を回転させ、遠心分離を行なう。遠心分離
ののち、サンプル容器１の全範囲をレーザ光によって走
査し、そのときの前方散乱光、側方散乱光、および標識
された蛍光強度を測定する。さらに、サンプル容器１内
の所望の位置のサンプルを顕微鏡観察あるいは撮像す
る。
【００２０】図２は、本発明の実施の一形態の分析装置
の構成を示すブロック図である。この分析装置は、ディ
スク円盤状のサンプル容器１を真空（バキューム）装着
するディスクホルダ５と、ディスクホルダ５を回転させ
るモータ６と、真空装着を行なうためのポンプ７及び電
磁弁８と、モータ６を制御するモータコントローラ９
と、後述する可動ユニット１０と、サンプル容器１の回
転角を検出するための反射型センサ１４及び二値化ユニ
ット１５と、電磁弁８、モータコントローラ９及び可動
ユニット１０を制御し可動ユニット１０及び二値化ユニ
ット１５から信号が入力する１チップマイクロコンピュ
ータ２３と、１チップマイクロコンピュータ２３に接続
する外部メモリ１４と、外部のパソコン（ＰＣ）と１チ
ップマイクロコンピュータ２３とを接続するＵＳＢ(uni
versal serial bus)インタフェース２５とを備えてい
る。ディスク円盤状のサンプル容器１を真空装着する機
構は、原理的には、半導体装置製造プロセスに使われる
スピンコーターと同じものであって、ポンプ７によって
ホルダ内の空気を排気することによって行われる。逆に
サンプル容器１を取り外す際には、電磁弁８を切り替
え、外気と連通させる。また、１チップマイクロコンピ
ュータ２３は、可動ユニット１０から入力するアナログ
信号を処理するためのＡ／Ｄ（アナログ／デジタル）変
換器と、二値化ユニット１５からのパルスを処理するタ
イマカウンタ部とを内蔵している。
の構成を示すブロック図である。この分析装置は、ディ
スク円盤状のサンプル容器１を真空（バキューム）装着
するディスクホルダ５と、ディスクホルダ５を回転させ
るモータ６と、真空装着を行なうためのポンプ７及び電
磁弁８と、モータ６を制御するモータコントローラ９
と、後述する可動ユニット１０と、サンプル容器１の回
転角を検出するための反射型センサ１４及び二値化ユニ
ット１５と、電磁弁８、モータコントローラ９及び可動
ユニット１０を制御し可動ユニット１０及び二値化ユニ
ット１５から信号が入力する１チップマイクロコンピュ
ータ２３と、１チップマイクロコンピュータ２３に接続
する外部メモリ１４と、外部のパソコン（ＰＣ）と１チ
ップマイクロコンピュータ２３とを接続するＵＳＢ(uni
versal serial bus)インタフェース２５とを備えてい
る。ディスク円盤状のサンプル容器１を真空装着する機
構は、原理的には、半導体装置製造プロセスに使われる
スピンコーターと同じものであって、ポンプ７によって
ホルダ内の空気を排気することによって行われる。逆に
サンプル容器１を取り外す際には、電磁弁８を切り替
え、外気と連通させる。また、１チップマイクロコンピ
ュータ２３は、可動ユニット１０から入力するアナログ
信号を処理するためのＡ／Ｄ（アナログ／デジタル）変
換器と、二値化ユニット１５からのパルスを処理するタ
イマカウンタ部とを内蔵している。
【００２１】このディスクサイトメータは、外部のＰＣ
上のソフトウェアによってその動作が制御される。すな
わち、ＰＣからはこのディスクサイトメータに対してコ
マンドが送られ、これらのコマンドは、ＵＳＢインター
フェース２５を通して、１チップマイクロコンピュータ
２３に入力し、１チップマイクロコンピュータによって
解釈される。
上のソフトウェアによってその動作が制御される。すな
わち、ＰＣからはこのディスクサイトメータに対してコ
マンドが送られ、これらのコマンドは、ＵＳＢインター
フェース２５を通して、１チップマイクロコンピュータ
２３に入力し、１チップマイクロコンピュータによって
解釈される。
【００２２】次に、可動ユニット１０について説明す
る。
る。
【００２３】可動ユニット１０は、サンプル容器１に対
してレーザを照射するとともに、レーザを照射したとき
の側方散乱光及び前方散乱光を検出するものであって、
レーザ照射及び散乱光検出のための光学系を一体のもの
として構成したものである。
してレーザを照射するとともに、レーザを照射したとき
の側方散乱光及び前方散乱光を検出するものであって、
レーザ照射及び散乱光検出のための光学系を一体のもの
として構成したものである。
【００２４】可動ユニット１０には、可動ユニット１０
をＸＹＺの各軸方向に例えば０．１μｍのステップ幅で
移動させるＸＹＺ軸コントローラ１１と、アルゴンレー
ザ（波長４８８ｎｍ）１２と、アルゴンレーザ１２のオ
ン／オフやスタンバイなどのモードを制御するレーザコ
ントローラ１３と、アルゴンレーザ１２を用いた共焦点
顕微鏡光学系を構成するためのビームエキスパンダ２６
と、ビームエキスパンダ２６を駆動するソレノイド１６
と、アルゴンレーザ１２からビームエキスパンダ２６を
通過したレーザ光をサンプル容器１に向ける対物レンズ
２７と、サンプル容器１と通過した前方散乱光を例えば
９０°曲げるミラー２８と、ミラー２８の出射側に設け
られた集光レンズ２９と、集光レンズ２９の出射側に設
けられ前方散乱光を検出する光電子増倍管１８と、集光
レンズ２９と光電子増倍管１８との間に配置された絞り
ユニット３０と、絞りユニット３０を駆動するソレノイ
ド１７と、サンプル容器１からの側方散乱光を集光する
集光レンズ３１と、集光レンズ３１の出射側に配置され
たハーフミラー３２と、ハーフミラー３２で反射された
光が入射し側方散乱光の強度を検出する光電子増倍管１
９と、ハーフミラー３２と光電子増倍管１９との間に設
けられた絞り３５と、ハーフミラーを透過した光が入射
する赤色反射のダイクロイックミラー３３と、ダイクロ
イックミラー３３で反射された赤色光を検出する光電子
増倍管２０と、ダイクロイックミラー３３と光電子増倍
管２０の間に配置された絞り３６と、絞り３６と光電子
増倍管２０の間に配置されたバンドパスフィルタ３８
と、赤色反射のダイクロイックミラー３３を透過した光
が入射する緑色反射のダイクロイックミラー３４と、ダ
イクロイックミラー３４で反射された緑色光を検出する
光電子増倍管２１と、ダイクロイックミラー３４と光電
子増倍管２１の間に配置された絞り３７と、絞り３７と
光電子増倍管２１の間に配置されたバンドパスフィルタ
３９と、光電子増倍管１８〜２１からの信号を増幅して
１チップマイクロコンピュータ２３に出力する増幅器２
２と、を備えている。可動ユニット１０において、ＸＹ
Ｚ軸コントローラ１１、レーザコントローラ１３、ソレ
ノイド１６，１７及び増幅器２２は、１チップマイクロ
コンピュータ２３によって制御される。
をＸＹＺの各軸方向に例えば０．１μｍのステップ幅で
移動させるＸＹＺ軸コントローラ１１と、アルゴンレー
ザ（波長４８８ｎｍ）１２と、アルゴンレーザ１２のオ
ン／オフやスタンバイなどのモードを制御するレーザコ
ントローラ１３と、アルゴンレーザ１２を用いた共焦点
顕微鏡光学系を構成するためのビームエキスパンダ２６
と、ビームエキスパンダ２６を駆動するソレノイド１６
と、アルゴンレーザ１２からビームエキスパンダ２６を
通過したレーザ光をサンプル容器１に向ける対物レンズ
２７と、サンプル容器１と通過した前方散乱光を例えば
９０°曲げるミラー２８と、ミラー２８の出射側に設け
られた集光レンズ２９と、集光レンズ２９の出射側に設
けられ前方散乱光を検出する光電子増倍管１８と、集光
レンズ２９と光電子増倍管１８との間に配置された絞り
ユニット３０と、絞りユニット３０を駆動するソレノイ
ド１７と、サンプル容器１からの側方散乱光を集光する
集光レンズ３１と、集光レンズ３１の出射側に配置され
たハーフミラー３２と、ハーフミラー３２で反射された
光が入射し側方散乱光の強度を検出する光電子増倍管１
９と、ハーフミラー３２と光電子増倍管１９との間に設
けられた絞り３５と、ハーフミラーを透過した光が入射
する赤色反射のダイクロイックミラー３３と、ダイクロ
イックミラー３３で反射された赤色光を検出する光電子
増倍管２０と、ダイクロイックミラー３３と光電子増倍
管２０の間に配置された絞り３６と、絞り３６と光電子
増倍管２０の間に配置されたバンドパスフィルタ３８
と、赤色反射のダイクロイックミラー３３を透過した光
が入射する緑色反射のダイクロイックミラー３４と、ダ
イクロイックミラー３４で反射された緑色光を検出する
光電子増倍管２１と、ダイクロイックミラー３４と光電
子増倍管２１の間に配置された絞り３７と、絞り３７と
光電子増倍管２１の間に配置されたバンドパスフィルタ
３９と、光電子増倍管１８〜２１からの信号を増幅して
１チップマイクロコンピュータ２３に出力する増幅器２
２と、を備えている。可動ユニット１０において、ＸＹ
Ｚ軸コントローラ１１、レーザコントローラ１３、ソレ
ノイド１６，１７及び増幅器２２は、１チップマイクロ
コンピュータ２３によって制御される。
【００２５】次に、このように構成したディスクサイト
メータによる計測を説明する。
メータによる計測を説明する。
【００２６】ディスクホルダ５に装着されたサンプル容
器１は、予め１チップマイクロコンピュータ２３によっ
てモータコントローラ９に与えられた回転数と加減速と
時間にしたがって、モータ６によって遠心される。遠心
が終了した後、サンプル容器１の回転速度が接線方向で
通常のフローサイトメトリーと同じ程度、つまり１０ｍ
／ｓｅｃになるように制御しながら、アルゴンレーザ１
２を照射して、計測を行う。このとき、半径方向の照射
位置は、上述したＸＹＺ軸コントローラ１１により、例
えば、０．１μｍのステップ幅で制御される。またこの
ときのモータ６の回転数は、サンプル容器１の側面に向
けられた反射型センサ１４およびその信号を二値化する
二値化ユニット１５によって、サンプル容器１の外周側
面に凹凸として形成されたエンコーダ情報を１チップマ
イコン２３のタイマカウンタ部に導くことにより、モニ
タできるようになっている。また、図３に示すように、
サンプル容器１の外周側面には刻み幅の異なる凹凸４１
を１つだけ設けあり、この凹凸４１を検出することによ
り、サンプル容器１の絶対位置が取得できるようになっ
ている。
器１は、予め１チップマイクロコンピュータ２３によっ
てモータコントローラ９に与えられた回転数と加減速と
時間にしたがって、モータ６によって遠心される。遠心
が終了した後、サンプル容器１の回転速度が接線方向で
通常のフローサイトメトリーと同じ程度、つまり１０ｍ
／ｓｅｃになるように制御しながら、アルゴンレーザ１
２を照射して、計測を行う。このとき、半径方向の照射
位置は、上述したＸＹＺ軸コントローラ１１により、例
えば、０．１μｍのステップ幅で制御される。またこの
ときのモータ６の回転数は、サンプル容器１の側面に向
けられた反射型センサ１４およびその信号を二値化する
二値化ユニット１５によって、サンプル容器１の外周側
面に凹凸として形成されたエンコーダ情報を１チップマ
イコン２３のタイマカウンタ部に導くことにより、モニ
タできるようになっている。また、図３に示すように、
サンプル容器１の外周側面には刻み幅の異なる凹凸４１
を１つだけ設けあり、この凹凸４１を検出することによ
り、サンプル容器１の絶対位置が取得できるようになっ
ている。
【００２７】可動ユニット１０においては、遠心が終了
した後、レーザコントローラ１３によって、アルゴンレ
ーザ１２はスタンバイモードからオン状態に切り替わ
る。これによって、レーザによるサンプル容器１のスキ
ャンが開始される。この時点では、ソレノイド１６を制
御することにより、共焦点顕微鏡光学系を構成するため
のビームエキスパンダ２６を光路から外しておく。レー
ザビームは、対物レンズ２７を通ってサンプル容器１に
照射され、サンプル容器１の８０度方向に散乱される側
方散乱とまっすぐ直進する前方散乱に分かれる。直進し
たほうの前方散乱光は、ミラー２８で反射され、集光レ
ンズ２９で集光され、絞りユニット３０を通過して光電
子増倍管１８に入射する。絞りユニット３０では、共焦
点光学系を構成するためのピンホールと、１〜１０度方
向の散乱光を取得するための絞りとが、ソレノイド１７
を操作することにより交換できるようになっている。
した後、レーザコントローラ１３によって、アルゴンレ
ーザ１２はスタンバイモードからオン状態に切り替わ
る。これによって、レーザによるサンプル容器１のスキ
ャンが開始される。この時点では、ソレノイド１６を制
御することにより、共焦点顕微鏡光学系を構成するため
のビームエキスパンダ２６を光路から外しておく。レー
ザビームは、対物レンズ２７を通ってサンプル容器１に
照射され、サンプル容器１の８０度方向に散乱される側
方散乱とまっすぐ直進する前方散乱に分かれる。直進し
たほうの前方散乱光は、ミラー２８で反射され、集光レ
ンズ２９で集光され、絞りユニット３０を通過して光電
子増倍管１８に入射する。絞りユニット３０では、共焦
点光学系を構成するためのピンホールと、１〜１０度方
向の散乱光を取得するための絞りとが、ソレノイド１７
を操作することにより交換できるようになっている。
【００２８】一方、側方散乱光は、集光レンズ３１を通
過したあと、３つの検出器（光電子増倍管１９〜２１）
に導かれることになる。まず、側方散乱光は、ハーフミ
ラー３２で分割され、反射した方の光は、絞り３５を介
して、側方散乱光強度を測るための光電子増倍管１９に
導かれる。一方、ハーフミラー３２を透過した光は、赤
色反射のダイクロイックミラー３３に導かれる。このダ
イクロイックミラー３３で反射された光は、バンドパス
フィルタ３８及び絞り３６を介して、赤色蛍光を測るた
めの光電子増倍管２０に導かれる。赤色反射のダイクロ
イックミラー３３を透過した光は、緑色反射のダイクロ
イックミラー３４により、バンドパスフィルタ３９と絞
り３７を介して緑色蛍光を測るための光電子増倍管２１
に導かれる。
過したあと、３つの検出器（光電子増倍管１９〜２１）
に導かれることになる。まず、側方散乱光は、ハーフミ
ラー３２で分割され、反射した方の光は、絞り３５を介
して、側方散乱光強度を測るための光電子増倍管１９に
導かれる。一方、ハーフミラー３２を透過した光は、赤
色反射のダイクロイックミラー３３に導かれる。このダ
イクロイックミラー３３で反射された光は、バンドパス
フィルタ３８及び絞り３６を介して、赤色蛍光を測るた
めの光電子増倍管２０に導かれる。赤色反射のダイクロ
イックミラー３３を透過した光は、緑色反射のダイクロ
イックミラー３４により、バンドパスフィルタ３９と絞
り３７を介して緑色蛍光を測るための光電子増倍管２１
に導かれる。
【００２９】光電子増倍管１８〜２１からの受光信号
は、光電子増倍管のゲインを調節できる増幅器２２から
１チップマイクロコンピュータ２３に内蔵のＡ／Ｄ変換
部に入力され、１チップマイクロコンピュータ２３のＤ
ＭＡ(Direct Memory Access)コントローラを介して外部
メモリ２４にストアされる。
は、光電子増倍管のゲインを調節できる増幅器２２から
１チップマイクロコンピュータ２３に内蔵のＡ／Ｄ変換
部に入力され、１チップマイクロコンピュータ２３のＤ
ＭＡ(Direct Memory Access)コントローラを介して外部
メモリ２４にストアされる。
【００３０】画像を取り込む場合には、ソレノイド１
６，１７を操作して共焦点光学系を形成しておき、サン
プル容器１の外周側面の刻み幅の異なる凹凸４１から原
点を検出し、サンプル容器１の一周でリセットされるリ
ングカウンタ情報と径の位置情報から画像を取り込みた
い位置を割り出し、そこにレーザ照射位置を移動し、そ
の後、ＸＹＺ軸コントローラ１１を制御し、画像を得
る。なおこの実施の形態では共焦点光学顕微鏡の系を用
いているために、１点１点スキャンしているが、ＣＣＤ
（電荷結合素子）と位相差顕微鏡の光学系を用いること
も可能である。
６，１７を操作して共焦点光学系を形成しておき、サン
プル容器１の外周側面の刻み幅の異なる凹凸４１から原
点を検出し、サンプル容器１の一周でリセットされるリ
ングカウンタ情報と径の位置情報から画像を取り込みた
い位置を割り出し、そこにレーザ照射位置を移動し、そ
の後、ＸＹＺ軸コントローラ１１を制御し、画像を得
る。なおこの実施の形態では共焦点光学顕微鏡の系を用
いているために、１点１点スキャンしているが、ＣＣＤ
（電荷結合素子）と位相差顕微鏡の光学系を用いること
も可能である。
【００３１】次に、この実施の形態の装置を用いて実際
に行った実験プロトコール、ヒト末梢血のリンパ球表面
抗原のＣＤ４とＣＤ８を染色した例について説明する。
に行った実験プロトコール、ヒト末梢血のリンパ球表面
抗原のＣＤ４とＣＤ８を染色した例について説明する。
【００３２】正常人のヘパリン加静脈血をＰＢＳ（リン
酸干渉生理食塩水）で３倍希釈し、２ｍｌのＦｉｃｏｌ
ｌ（商品名）液にこれを８ｍｌ加え、毎分１１００回転
で１０分間遠心した。次に、リンパ球層をパスツールピ
ペットで取り出し、１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）加Ｐ
ＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ（フルオレセインチオシア
ネート）標識抗ＣＤ４モノクローナル抗体とＰＥ（フィ
コエリスリン）標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体を１：
１に混合したものを、先ほどの洗浄済みサンプルであっ
てリンパ球の濃度を１×１０7／ｍｌに調整したもの
に、２ｍｌ加え、４℃、３０分間反応させた。反応終了
後、１０％ＦＣＳ加ＰＢＳで３回洗浄し、サンプルとし
た。
酸干渉生理食塩水）で３倍希釈し、２ｍｌのＦｉｃｏｌ
ｌ（商品名）液にこれを８ｍｌ加え、毎分１１００回転
で１０分間遠心した。次に、リンパ球層をパスツールピ
ペットで取り出し、１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）加Ｐ
ＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ（フルオレセインチオシア
ネート）標識抗ＣＤ４モノクローナル抗体とＰＥ（フィ
コエリスリン）標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体を１：
１に混合したものを、先ほどの洗浄済みサンプルであっ
てリンパ球の濃度を１×１０7／ｍｌに調整したもの
に、２ｍｌ加え、４℃、３０分間反応させた。反応終了
後、１０％ＦＣＳ加ＰＢＳで３回洗浄し、サンプルとし
た。
【００３３】サンプル容器１には、予め、Ｆｉｃｏｌｌ
（商品名）液４２を充填しておく。そして、上述のよう
にして調製したサンプル４０を、図４に示すように、液
４２の中心部（すなわちサンプル容器１の中心部）に注
入し、上述のようなディスクサイトメータに装着して測
定を行なった。その結果を図５に示す。図５において本
発明で取得した分析結果を表す。図５において、縦軸及
び横軸はいずれも対数目盛りであって、横軸［ＦＬ１］
はＦＩＴＣの蛍光を表し、縦軸［ＦＬ２］はＰＥの蛍光
を表している。
（商品名）液４２を充填しておく。そして、上述のよう
にして調製したサンプル４０を、図４に示すように、液
４２の中心部（すなわちサンプル容器１の中心部）に注
入し、上述のようなディスクサイトメータに装着して測
定を行なった。その結果を図５に示す。図５において本
発明で取得した分析結果を表す。図５において、縦軸及
び横軸はいずれも対数目盛りであって、横軸［ＦＬ１］
はＦＩＴＣの蛍光を表し、縦軸［ＦＬ２］はＰＥの蛍光
を表している。
【００３４】また図６は、パラメータを変更してプロッ
トした結果を示している。図６において、縦軸及び横軸
はいずれも線形目盛り（リニアスケール）であって、横
軸［ＳＳ］は側方散乱強度を表し、縦軸［ＦＳ］は前方
散乱強度を表している。
トした結果を示している。図６において、縦軸及び横軸
はいずれも線形目盛り（リニアスケール）であって、横
軸［ＳＳ］は側方散乱強度を表し、縦軸［ＦＳ］は前方
散乱強度を表している。
【００３５】図５及び図６の結果から、本発明に基づく
ディスクサイトメータは、従来のフローサイトメータと
同等の分析機能を持っていることが確認できた。さら
に、図５の結果をもとに、少々不審と思われたもっとも
ＦＩＴＣの蛍光強度が高かった位置について、共焦点レ
ーザ顕微鏡の光学系で画像を取得したところ、ペリフェ
ラールな染色像が得られ、たしかに表面抗原と反応して
いることが確認できた。すなわち、ペリフェラールな染
色像が、単なる非特異染色でなく、正しい表面抗原に対
応していることが確認された。
ディスクサイトメータは、従来のフローサイトメータと
同等の分析機能を持っていることが確認できた。さら
に、図５の結果をもとに、少々不審と思われたもっとも
ＦＩＴＣの蛍光強度が高かった位置について、共焦点レ
ーザ顕微鏡の光学系で画像を取得したところ、ペリフェ
ラールな染色像が得られ、たしかに表面抗原と反応して
いることが確認できた。すなわち、ペリフェラールな染
色像が、単なる非特異染色でなく、正しい表面抗原に対
応していることが確認された。
【００３６】
【発明の効果】以上説明したように本発明は、従来のフ
ローサイトメータと同等の分析結果が得られ、画像を取
得することが可能であるとともに標本としての機能を有
するという効果がある。また、ある条件で選び出した細
胞等の実際の染色画像を繰り返し確認できるため、より
詳細な解析を行うことができるという効果もある。
ローサイトメータと同等の分析結果が得られ、画像を取
得することが可能であるとともに標本としての機能を有
するという効果がある。また、ある条件で選び出した細
胞等の実際の染色画像を繰り返し確認できるため、より
詳細な解析を行うことができるという効果もある。
【図１】本発明の原理を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施の一形態の分析装置の構成を示す
ブロック図である。
ブロック図である。
【図３】サンプル容器の位置情報を取得するための構成
を示す図である。
を示す図である。
【図４】サンプルを配置すべき位置関係を表わす図であ
る。
る。
【図５】得られた分析結果を示すグラフである。
【図６】得られた分析結果を示すグラフである。
１ サンプル容器 ２ サンプル注入口 ３ サンプル排泄口 ５ ディスクホルダ ６ モータ ７ ポンプ ８ 電磁弁 ９ モータコントローラ １０ 可動ユニット １１ ＸＹＺ軸コントローラ １２ アルゴンレーザ（波長４８８ｎｍ） １３ レーザコントローラ １４ 反射型センサ １５ 二値化ユニット １６，１７ ソレノイド １８〜２１ 光電子増倍管 ２２ 増幅器 ２３ １チップマイクロコンピュータ ２４ 外部メモリ ２５ ＵＳＢインターフェース ２６ ビームエキスパンダ ３２ ハーフミラー ３３，３４ ダイクロイックミラー ３８，３９ バンドパスフィルタ ４０ サンプル ４１ 刻み幅の異なる凹凸
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/49 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｅ 21/64 Ｆ 33/48 Ａ 33/48 33/483 Ｃ 33/483 33/58 Ａ // Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｚ 1/28 Ｊ Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 BA17 DA02 DA06 EA01 FA02 GA07 GB19 HA01 HA02 HA09 HA15 JA02 KA02 KA03 KA09 LA02 LA03 NA01 NA05 NA06 2G045 AA02 AA15 BA13 BB10 BB25 CA01 CA25 CB01 CB03 CB21 CB30 DA13 FA05 FA12 FA19 FA40 FB07 FB12 GC11 GC15 HA04 HA14 JA01 JA07 2G052 AA29 AB16 AB20 AD09 AD29 AD49 BA14 DA05 ED17 FA08 GA11 JA08 2G059 AA01 BB14 CC16 DD03 DD12 DD13 EE02 FF01 GG01 JJ02 JJ07 KK01 KK04 MM01 MM09 MM10
Claims (13)
- 【請求項１】 粒子様物質を含む検体を板状のサンプル
容器内に注入し、 前記サンプル容器を遠心し、 これによって前記サンプル容器内に前記粒子様物質の分
布を形成せしめたものをプレパラートとすることを特徴
とする分析方法。 - 【請求項２】 前記粒子様物質が、細胞、菌体、ウイル
ス、ＤＮＡ、ミトコンドリアからなる群から選ばれたも
のである、請求項１に記載の分析方法。 - 【請求項３】 前記サンプル容器がディスク円盤状のサ
ンプル容器である請求項１または２に記載の分析方法。 - 【請求項４】 前記プレパラートとした前記サンプル容
器に対してレーザ光を照射及び走査し、前記粒子様物質
から得られる蛍光強度、散乱光強度、散乱固体数のうち
の少なくともいずれかの１組のデータを分析データとし
て取得する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の分
析方法。 - 【請求項５】 前記粒子様物質に対して目的の蛍光標識
がなされるように反応を予め行なわせ、その後、前記サ
ンプル容器を遠心する、請求項４に記載の分析方法。 - 【請求項６】 前記分析データに基づいて前記粒子様物
質の画像データを取得する、請求項４または５に記載の
分析方法。 - 【請求項７】 板状のサンプル容器を遠心する手段と、 レーザ光を発生する手段と、 前記レーザ光によって前記サンプル容器を走査し、遠心
によって分離した、前記サンプル容器内の粒子様物質に
対してレーザ光を照射する手段と、 前記サンプル容器からの散乱光を検出する手段と、を有
することを特徴とする分析装置。 - 【請求項８】 前記散乱光を検出する手段は、前記サン
プル容器からの角度の異なる複数の散乱光を検出する手
段であり、 前記複数の散乱光に基づいて、蛍光強度及び／または前
記粒子様物質の個数を検出する請求項７に記載の分析装
置。 - 【請求項９】 前記散乱光を検出する手段からの検出信
号をＡ／Ｄ変換してパラメータとしてデータ処理及びデ
ータ解析を行なう手段をさらに有する、請求項７または
８に記載の分析装置。 - 【請求項１０】 前記粒子様物質の画像を得るための光
学系及び撮像手段を有する請求項７乃至９のいずれか１
項に記載の分析装置。 - 【請求項１１】 前記粒子様物質が、細胞、菌体、ウイ
ルス、ＤＮＡ、ミトコンドリアからなる群から選ばれた
ものである、請求項７乃至１０に記載の分析装置。 - 【請求項１２】 前記サンプル容器がディスク円盤状の
サンプル容器である請求項７乃至１１のいずれか１項に
記載の分析装置。 - 【請求項１３】 前記照射する手段は、回転している前
記サンプル容器に対して半径方向にレーザ光を走査す
る、請求項７乃至１２のいずれか１項に記載の分析装
置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001112612A JP2002310886A (ja) | 2001-04-11 | 2001-04-11 | ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置 |
| US10/118,936 US6831735B2 (en) | 2001-04-11 | 2002-04-10 | Analytical method and device using disc cytometry |
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|---|---|---|---|
| JP2001112612A JP2002310886A (ja) | 2001-04-11 | 2001-04-11 | ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002310886A true JP2002310886A (ja) | 2002-10-23 |
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ID=18964000
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2001112612A Pending JP2002310886A (ja) | 2001-04-11 | 2001-04-11 | ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置 |
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