JP4574962B2 - 小粒子の溶液を特徴付けるための方法および装置 - Google Patents
小粒子の溶液を特徴付けるための方法および装置 Download PDFInfo
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以下に記載の特許および出願は、分子および粒子の質量およびサイズを測定するための光散乱方法に関するものである。
S.トレイノフおよびP.J.ワイアット(S. Trainoff and P. J. Wyatt)による2002年7月24日出願の出願番号第10/205,637号「注入方法による巨大分子の平均溶解特性の判定方法(Method for determining average solution properties of
macromolecules by the injection method)」。
ナノメートル範囲の粒子サイズを測定するのに用いられ得る装置のうち、高い分解能での分離を最もよく提供できるものとして、円盤型遠心分離機および超遠心分離機がある。そのような分解能にもかかわらず、このような遠心分離機の動作は一般にかなりの不明確さを伴っている。これらの問題はそのほとんどが、導き出す分子サイズの不確定さに関するものであるが、それはこのようなサイズが、分離される粒子の検出器への到着時間に完全に基づくからである。未知のサンプル粒子と、サイズが精密に知られている粒子との混合物を用いることで、この到着時間は或る程度まで較正可能である。しかし残念ながらそのような較正にもかかわらず、いわゆる流動現象に加え温度およびロータ速度の小さなばらつきのため、そのような較正はしばしば疑わしいものとなってしまう。別の大きな問題は、想定した同質な球状の粒子構造の密度と、分離を行なう流体環境の密度とを精密に知る必要があることに関するものである。勾配を用いる場合は常に、密度についてもまた明確なばらつきを知っておく必要がある。検出器への到着時間を測定して粒子サイズを求めることに関する別の問題には、0.5%を超えるレイノルズ数の偏り、ブラウン運動によるサンプル分散の影響とその結果としての同一の粒子の到着時間の拡散、分離速度に依存する帯の広がり、流動を防ぐのに好適な勾配の確立、サンプル濃度の過剰供給、サンプルの粒子サイズの範囲、デコンボリューション解析に関する問題などが含まれる。これらの問題は、そのほとんどすべてがこれら装置が抱える1つの基本的な欠点と関連している。すなわち遠心分離は、ほとんどの粒子クラスについて絶対的な測定方法ではないのである。換言すると、検出器への同質の球の理論的到着時間以外、1組の粒子が一旦到着する時、そのサイズは直接測定不可能である。当然のことながら、粒子が同質の球でない、すなわち未知の構造のものであれば、先行技術による最良の較正手順ですら、大きな解釈の不確定さを招くおそれがある。
って分離されたサンプルの分析にもまた適用されてきた。分離後の接近可能な溶離サンプルを伴う遠心分離装置がJ.カルビン・ギディングズ(J. Calvin Giddings)により開発されており、沈降場流れ分別、略してSdFFFと呼ばれている。たとえばサイエンス(Science)第260巻、1456頁以降に掲載されているギディングズによる1993年
の論文などに記載されたこの方法は、1組の精巧なスリップリングおよび毛管を必要としていた。ギディングズの論文ではその他の種類のFFF分離技術もまた論じられている。MALSと組合されると、溶離サンプルの分析は、放散効果とは独立に粒子の各抽出分を正確に特徴付けることを可能にした。しかしSdFFF装置には、より従来からある遠心分離装置の分解能もダイナミックレンジもなく、また新たな封止を設ける短時間のうちに漏れが生じやすかった。
定値をもたらす。これには吸収および順方向散乱の測定値、さらに装置によっては蛍光性も含まれ得る。通常、粒子サンプルのサイズ分布をこのような測定値から導き出すためにさらなる試みが行なわれるが、これはローレンツ・ミー散乱理論に関して、すなわち粒子が球であると仮定して、検出器における透過光ビームの散乱および/または暗化を解釈することによって行なわれる。既知の半径aを有するそのような球が入射光ビームに入ったので、順方向の散乱光強度が生じると想定される。しかしそのような「既知の」サイズは、以下の関係に基づき粒子の到着時間から導き出されていた。
注入された際の半径、Rはこれらが検出される際の半径、ηは流体粘度、そしてρpおよ
びρfはそれぞれ粒子および流体についての特定の重力である。式(1)の項における誤
差の考えられる原因は重大であり得る。より重要なことに、厳密に式(1)が当てはまるのは同質な球状構造の場合についてのみである。
差もその結果として、導き出す粒子直径Dの顕著な誤差を引起すおそれがある。加えて、当然のことながら式(1)は球状の粒子にのみ当てはまる。球状でない粒子については、導き出した流体力学半径rhは単に等価の球のそれにすぎない。この発明の目的は、検出
ビームを通過する粒子の流体力学半径をはるかに正確に、かつ遠心分離較正でしばしば用いられる既知の粒子標準を参照せずに、求めることができる手段を提供することである。流体力学半径の測定に加えて、この発明の特に有益な目的はいわゆる平均平方半径の測定である。これら半径の両方を知ることによって、しばしば粒子構造もまた導き出すことが可能となる。
この発明により、較正のための標準を用いなくても、円盤型遠心機または分析用遠心機などの沈降手段で分離する粒子のサイズ評価が可能となる。この能力によって、分離機構自体に関する問題が容易に見極められる。ほとんどの遠心分離およびその後のサイズ評価方法は、沈降分離を受けているサンプルを通過した光の極めてコリメートされたビームの強度測定に基づく。透過した光ビームによって、サンプル吸収および順方向散乱の測定が可能となる。順方向散乱の寄与を補正し、粒子が同質の球であると仮定してローレンツ・ミー散乱理論を用い、かつ式(1)に示すようなサイズ/時間関係を適用すれば、粒子の実質的なサイズが求められる。たとえばコーラー(Koehler)他の米国特許第4,311,039号など、ほとんどの装置では、このようなビーム構成を用いて光源および検出器をコリメートすることにより、検出される光が、照明されている粒子の小片を含む体積物と相互作用するものに対応するようにする。
図1に、円盤型遠心分離機の、典型的なロータおよびサンプルを含む要素を示す。これらは透明な側板1,2を含み、これら側板は、間にある流体が入ったサンプル室の側部を形成し、上記要素はさらに、側板のうち一方に取付けられた中心ロータハブ3を含む。コリメートした細光源は4で表わされ、検出器セルは5で表わされる。サンプルは一般に流
路7を介して1の中心開口部6を通じて導入される。このような構造、およびこれと類似の構造がたとえば、コーラー他による米国特許第4,311,039号、およびフィッツパトリック(Fitzpatrick)による米国特許第5,786,898号で開示されている。
図2は、動作中のサンプル室の断面図(end-on view)を示す。粒子サンプルは、ロータ
3を通る回転軸8と同心である開口部6を通じて挿入され、流体メニスカス9と一旦接触すると分離を開始する。遠心力によってサンプルは外方向に移り、最終的には室の最も外にある境界10に達し、ここにサンプルは室が洗浄されるまで留まる。サンプルの各断片は検出領域11に達すると、光源4からの入射光ビーム12を通過するが、この光源は検出器5で監視される。光ビームは一般によくコリメートされ、たとえば光源がレーザであればしばしば単色性である。また一方で光ビームは、制御された可変波長のビームを生じさせるモノクロメータで生成してもよい。このようなモノクロメータはしばしば分析用遠心機の装置の一部として提供されている。粒子のクラスによっては、紫外光源からのよくコリメートした光ビームが好ましい。
かし粒子密度がρp、流体密度がρfであり、かつ粒子が体積Vを占める場合、遠心力は(ρp−ρf)VRω2となる。半径aの球状の粒子の場合、遠心力は単に4πa3(ρp−ρf)Rω2/3となる。径方向の運動にいわゆるストークス力が対抗し、これは球について単
に6πηa dR/dtであり、ここでaは球の半径、ηは流体の粘度である。なおこの
後者の式は球にのみ当てはまるため、閉じた形で導くことができる唯一の結果である。したがって球状の粒子に対する正味の径方向の力は単にこれら2つの力の差であり、すなわち
nmであり、粒子と流体との密度差は5×10-2のオーダであり、量2ω/b<<1である。よって式(6)は単に以下のようになる。
式会社堀場製作所(Horiba, Ltd)製造の円盤型遠心分離機の一応用例が開示されている
。堀場製円盤型遠心機たとえばCAPA500では、水平面で回転する円盤構造内に装着したキュベットが利用される。これら小さなキュベットは、回転方向におけるあらゆる運動を制限することによって、系の角速度がどれほど大きくてもあらゆるコリオリ効果をなくす。こうしてサンプルはキュベット内に均一な分散物となるように入れられ、円盤の回転中に特定の集団へと分離する。
ば「コロイドおよび界面科学報(Journal of Colloid and Interface Science)」第34巻、159〜162頁に掲載の1970年の論文で示している。球状の対称性を呈する粒子構造は、場合によってはその光散乱特性の測定によっても導くことができる。このような構造を求めるのにMALS測定を応用する例がたとえば以下の論文に記載されている。
ー(Nature)第226号、277頁(1970年)、
「差分光散乱からの胞子の誘電構造(Dielectric Structure of Spores from Differential Light Scattering)」胞子(Spores)第V号、米国微生物学協会(American Society for Microbiology)(1971年)、
「光散乱からの単一のバクテリアの構造(Structure of Single Bacteria from Light Scattering)」、D.T.フィリップス(D. T. Phillips)と共著、理論生物学報(J. Theor. Biol)第37号、493頁(1972年)、
「フライアッシュ粒子のいくつかの化学的、物理的および光学的特性(Some Chemical,
Physical and Optical Properties of Fly Ash Particles)」応用光学(Applied Optics)第14号、975頁(1980年)。
いるので、これらは原理的にサンプルのどの点においても絶対的な濃度測定ができる。この発明によるMALSの能力があれば、濃度結果と光散乱データとを直接組合せることによりタンパク質モル質量を導き出すことができる。歴史的に、対象となっている粒子またはタンパク質が球でない場合に伝統的な超遠心機の結果をよりよく理解するために、超遠心機による測定を他の測定、たとえば光散乱、準弾性光散乱および粘度測定などと組合せていたことに触れておかなければならない。
して、迷光の検出器への通過を防ぐのに好適な遮蔽を設けなければならないことで、さらなる構造的な要素がかなり加わる可能性がある。この発明の好ましい実施例では、光はレーザ源からのものであり、図示する検出器17を含む平面に対して垂直に平面偏光されることになる。このような同一平面の検出器は、測定される分子/粒子をこの後で分析するための基礎となる特徴付けデータをもたらすのに十分ではあるが、測定のクラスによっては、または幾何学的制限のため、このような好ましい平面の外側にある検出器を採用することがあり得る。このような検出器は、規定された平面に対する方位角および散乱角の両方により分類される。
代わりに、摩擦力を以下の式と仮定する。
式(7)の円盤型遠心機についての対応する結果との類似性に注目されたい。ln(R)対tのグラフは、sが算出され得る傾斜ω2sの直線をもたらす。次に境界拡散のレート
測定を用いて、対応する摩擦係数fを通じ、放散する分子の実質的なサイズに依存する放散係数Dを算出できる。よって
される。回折格子はまた光源、この場合はキセノンランプと関連付けられた範囲の可能性にわたり入射ビームの波長の選択を許す。一般には近紫外線の波長を選択するが、それはこのような装置による研究の多くが、紫外線下で強く吸収するタンパク質材料に関わるからである。26または27内のサンプルを通じて透過した光は、沈降するサンプル内の放射状の小領域から光学結像系35によって収集される。照明されたサンプルにおけるマスク36の像がこの狭い視野を定める。光電子倍増管37などの光検出器がこの透過光を検出するが、その他の検出システムを用いてもよい。
トに入っている分離サンプル28に対して同じ径方向の位置を通じて逆時計回りに回転するため、入射レーザビーム43がキュベット28を通過した後、図8のキセノンフラッシュランプ30からの紫外光源ビーム34がここに当たる。サンプル吸収を算出するのに用いられる、対応する透過紫外光/可視光ビーム34の強度と、レーザビーム43から散乱されて検出器17に入る光とを組合せて、サイズおよび質量を算出する。紫外線およびレーザビームとサンプルとの相互作用についての信号は、サンプルの同じ径方向の位置で逐次的に収集される。なお、紫外光/可視光源自体は、サンプルからの散乱光を検出するための、関連付けられた1組の散乱光検出器41を有する。紫外光/可視光源の代わりに、その他どの光源も等価に用いることができ、さらにたとえば光ダイオードアレイ検出器とともに用いることができる。
Claims (19)
- 遠心分離手段により分離した粒子を多角度散乱分析によって粒子の分析を行う装置であり、大きさが異なる粒子からなるサンプル内の、大きさが同様の1組の粒子によって角度の関数として散乱させられた光を測定する装置であって、前記光は、前記サンプルが前記装置内で発生した遠心力によって同様の粒子からなる別々の群に分離した後に測定され、前記装置の構成は、
a)駆動されて自身の軸を中心として回転する円筒対称室の構成を備え、前記室には、各々が前記軸から径方向距離の範囲にわたる透明領域を含む第1の側壁および第2の側壁の間に形成された流体収容空所手段が組込まれており、
i.前記第1の側壁は前記室を回転の前記軸に装着するための手段を提供し、
ii.前記第2の側壁は、前記軸の場所に開口を有し、前記開口を通して前記サンプルを前記流体収容空所手段内に導入することができ、光ビームによって照射されるサンプル領域を中心とする透明の円筒対称凸光学面が外側に組込まれ、
b)細い光ビームを与える静止外部光源を備え、前記光ビームは、前記第1の側壁の平坦な円形の側面の前記透明領域、流体を含む前記サンプル、および前記第2の側壁の平坦な内側側面の前記透明領域を、順次通過し、前記第2の側壁の最外部表面には前記円筒対称凸光学面が組込まれ、前記光ビームは前記透明の円筒対称凸光学面の頂点を通して出射し、
c)前記細い光ビームが前記透明の円筒対称凸光学面の前記頂点から出た後に入る、静止順方向透過光ビーム閉じ込め手段と、
d)前記透明の円筒対称凸光学面の表面から法線方向に出射した光を受入れるよう異なる角度で配置された複数の静止検出器とを備え、前記検出器は各々、前記サンプルが入射した前記光ビームの中で遠心力により径方向に移動するときに前記サンプルから散乱した光のみを受入れるようコリメートされている、装置。 - 前記順方向透過光ビーム閉じ込め手段は各々、入射透過ビームの強度をモニタするための検出手段を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記透明の円筒対称凸光学面は、前記細い光ビームによって照射される前記サンプルの領域を中心とする曲率半径を有する、請求項1に記載の装置。
- 前記透明の円筒対称凸光学面の、照射される前記サンプルの領域を中心とする前記曲率半径は、平坦な頂部を有し、透過した細い光ビームは前記頂部に対して法線方向に通過して前記静止順方向透過光ビーム閉じ込め手段の中に入る、請求項3に記載の装置。
- 入射したビームおよび散乱した光が通過するすべての光学表面は透明光学材料で被覆されてすべての空気界面での散乱および反射を減じる、請求項1に記載の装置。
- 前記光の細いビームはレーザによって生成される、請求項1に記載の装置。
- 遠心分離手段により分離した粒子を多角度散乱分析によって粒子の分析を行う装置であり、大きさが異なる粒子の複数の群からなるサンプル内の、大きさが同様の粒子の1つの群によって角度の関数として散乱させられた光を測定する装置であって、前記光は、前記サンプルが前記装置内で発生した遠心力によって同様の粒子からなる別々の群に分離した後に測定され、前記装置の構成は、
a)遠心回転機手段内に配置されたサンプル保持手段を備え、前記サンプル保持手段は、回転軸を基準とした径方向距離の範囲にわたって延在し、かつ、溶液のサンプルを間で封じ込める平らで透明な壁を含み、
b)細い光ビームを与える第1の光源を備え、前記溶液のサンプルが前記回転軸を中心とした円軌道の回転によって遠心力を受けて分離されている間において、前記保持手段が前記細い光ビームの経路内にあるとき、前記細い光ビームは前記透明な壁を通過し、
c)前記細い光ビームが透明なサンプル封じ込め領域を通り抜けた後に入る、第1の順方向透過光ビーム閉じ込め手段と、
d)前記平らで透明な壁に垂直な面において透過する前記光ビームを中心として異なる角度で配置された複数の第1の検出器とを備え、各第1の検出器は、透明な前記サンプル保持手段を通過する入射した前記細い光ビームによって照射された前記サンプルの同一領域から、特定の角度方向において、定められた対応する立体角で散乱した光を集めるように配置され、
e)第1の機械的支持手段を備え、前記第1の機械的支持手段によって、前記第1の光源、前記第1の順方向透過光ビーム閉じ込め手段および前記複数の第1の検出器が同時に径方向に移動することにより、前記光ビームが、封じ込められた前記サンプルの異なる径方向領域を照射できるようにし、かつ、前記複数の第1の検出器が、対応する、異なる径方向領域で、前記サンプルから散乱した光を検出できるようにし、
f)紫外線の細い光ビームを生成する第2の光源を備え、前記紫外線の細い光ビームは、前記回転機手段が前記サンプル保持手段を前記第2の光ビームの中に移動させたとき、前記サンプルを、第1の細い光ビームの次に、同一の径方向距離の位置で照射し、
g)前記第2の紫外線の細い光ビームが前記透明なサンプル封じ込め領域を通り抜けた後に入る、第2の順方向透過光ビーム光検出手段と、
h)第2の機械的支持手段とを備え、前記第2の機械的支持手段によって、前記第2の光源手段および前記第2の順方向透過光ビーム光検出手段が同時に径方向に移動することにより、前記第2の光ビームが、封じ込められた前記サンプルの異なる径方向領域を照射できるようにし、前記第2の機械的支持手段は、前記第2の光源が、サンプルを、前記第1の光源と同じ径方向距離の位置で照射できるよう動作し、
i)散乱した光を検出する前記検出器および前記第2の順方向透過光ビーム光検出手段からの信号を時間的に連続して変換する電子手段を備え、前記電子手段は、前記信号をデジタル表現に変換し、結果として得られた前記デジタル信号を後の処理および分析のためにコンピュータ手段に送信する、装置。 - 前記順方向透過光ビーム閉じ込め手段は各々、入射透過ビームの強度をモニタするための検出手段を含む、請求項7に記載の装置。
- 前記第2の光源は、前記強度をモニタするための検出手段によって、順方向透過光ビームの前記サンプルによる吸収を測定できるようにする波長の光ビームを生成する、請求項8に記載の装置。
- 前記第1の光源はレーザである、請求項7に記載の装置。
- 前記レーザである光源は、前記遠心回転機手段の回転軸に垂直な平面で平面偏光される、請求項10に記載の装置。
- 入射したビームおよび散乱した光が通過するすべての光学表面は透明光学材料で被覆されてすべての空気界面での散乱および反射を減じる、請求項7に記載の装置。
- 前記光ビームを中心として異なる角度で配置された前記複数の検出器は、前記平らで透明な壁に垂直で前記遠心回転機手段の前記回転軸と交差する平面にある、請求項7に記載の装置。
- 遠心分離手段により分離した粒子を多角度散乱分析によって粒子の分析を行う方法であり、大きさが異なる粒子の複数の群からなるサンプル内の、大きさが同様の粒子の1つの群によって角度の関数として散乱させられた光を測定することにより小粒子の溶液を特徴付ける方法であって、
a)前記溶液の一部を、遠心回転機手段に組込まれた透明封じ込め手段の中に入れるステップを備え、
i.前記封じ込め手段の中の透明壁を通して前記溶液の一部を見ることができ、
ii.前記封じ込め手段は遠心回転軸を基準とする径方向距離の範囲を含み、前記範囲を通して前記溶液の一部の中の前記粒子が分離の間移動でき、
b)前記遠心回転機手段を作動させその回転軸を中心として回転させることにより、前記溶液の一部の中の前記粒子に作用する遠心力を発生させるステップと、
c)前記溶液の一部の領域を、前記透明封じ込め手段を通して第1の細い光ビームで照射するステップとを備え、
i.前記第1の細い光ビームは、前記溶液と、前記回転軸から所定の径方向距離の位置で交差し、
ii.前記溶液が前記第1の細い光ビームを通すとき、前記第1の細い光ビームは1つの透明封じ込め壁を通して入射し、別の透明封じ込め壁を通して出射し、前記溶液の一部は前記壁の間に封じ込められており、
d)前記入射した第1の細い光ビームから、前記溶液の一部によって複数の角度方向に散乱させられた散乱光を、対応する複数の検出器手段によって、選択された時間間隔で検出するステップを備え、前記検出器手段は各々、コリメートされ、かつ、有限規定立体角を定める特定方向に散乱した光のみを集めるように構成され、各検出器手段は、検出した前記散乱光から電気信号を生成し、
e)前記電気信号をそのデジタル表現に変換し、後の処理のために記憶手段に格納するステップと、
f)前記散乱光の信号の前記デジタル表現および伝達されたビーム信号を処理し、処理した信号から、前記溶液の一部の中の前記小粒子の特徴を導出するステップとを備え、
第2の光源が第2の細い光ビームを生成し、前記第2の細い光ビームは、前記回転機手段が前記第2の細い光ビームの中で前記透明封じ込め手段を動かすとき、前記溶液の一部を、第1の細い光ビームの次に、前記回転軸からの径方向距離は同一であるが前記回転機手段上の角位置が異なる場所で、照射し、前記第2の細い光ビームは、前記溶液の一部を通過し前記溶液の一部から出射した後、検出器に入射する、方法。 - 前記第2の光源が細い光ビームを生成することにより、前記溶液の一部を通過した後出射した前記ビームの前記検出器は、前記第2の細い光ビームが通過した前記粒子の濃度を表わす信号を生成することができる、請求項14に記載の方法。
- 前記第2の光源は紫外線波長の前記第2の細い光ビームを生成する、請求項15に記載の方法。
- 光源および前記複数の検出器手段が、同時に径方向に移動することにより、前記光ビームが、封じ込められている前記溶液の一部の異なる径方向領域をサンプリングできるようにするとともに、前記複数の検出器手段が、対応する、前記異なる径方向領域から散乱した光を検出できるようにする、請求項14に記載の方法。
- 前記遠心回転機手段は円盤型遠心機の構成部品である、請求項14に記載の方法。
- 前記遠心回転機手段は分析超遠心機の構成部品である、請求項14に記載の方法。
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