JP2005043158A

JP2005043158A - 改良された円盤型遠心分離機および分析用超遠心分離機

Info

Publication number: JP2005043158A
Application number: JP2003201939A
Authority: JP
Inventors: Philip J Wyatt; フィリップ・ジェイ・ワイアット
Original assignee: Wyatt Technology LLC
Current assignee: Wyatt Technology LLC
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: JP4574962B2

Abstract

【課題】分子の質量を直接に求め、その結果として分子置換体積およびすべての関連の量を直接測定することを可能とする。
【解決手段】遠心分離を受けているサンプルから散乱した光を生成および検出するための手段を一体化することにより、放散がある場合でもサブミクロンの範囲の粒子サイズをこのような測定から抽出できる。高速機械処理の環境への光散乱検出器の一体化は、遠心機のサンプル保持領域の透明な表面に変更を加えることで達成される。このような光学的な変更によって、利用可能な短い収集時間中にサンプルにより散乱された光を収集できるように静止の検出器組を配置することが可能となる。
【選択図】図４

Description

【背景技術】
【０００１】
関連出願および特許
以下に記載の特許および出願は、分子および粒子の質量およびサイズを測定するための光散乱方法に関するものである。
【０００２】
Ｐ．Ｊ．ワイアット（P. J. Wyatt）による米国特許特許第６，４１１，３８３Ｂ１号
（２００２年６月２５日）「第２ビリアル係数の測定方法（Method for measuring the 2^nd virial coefficient）」、
Ｓ．トレイノフおよびＰ．Ｊ．ワイアット（S. Trainoff and P. J. Wyatt）による現在出願中の出願「注入方法による巨大分子の平均溶解特性の判定方法（Method for determining average solution properties of macromolecules by the injection method）」。
【０００３】
背景
ナノメートル範囲の粒子サイズを測定するのに用いられ得る装置のうち、高い分解能での分離を最もよく提供できるものとして、円盤型遠心分離機および超遠心分離機がある。そのような分解能にもかかわらず、このような遠心分離機の動作は一般にかなりの不明確さを伴っている。これらの問題はそのほとんどが、導き出す分子サイズの不確定さに関するものであるが、それはこのようなサイズが、分離される粒子の検出器への到着時間に完全に基づくからである。未知のサンプル粒子と、サイズが精密に知られている粒子との混合物を用いることで、この到着時間は或る程度まで較正可能である。しかし残念ながらそのような較正にもかかわらず、いわゆる流動現象に加え温度およびロータ速度の小さなばらつきのため、そのような較正はしばしば疑わしいものとなってしまう。別の大きな問題は、想定した同質な球状の粒子構造の密度と、分離を行なう流体環境の密度とを精密に知る必要があることに関するものである。勾配を用いる場合は常に、密度についてもまた明確なばらつきを知っておく必要がある。検出器への到着時間を測定して粒子サイズを求めることに関する別の問題には、０．５％を超えるレイノルズ数の偏り、ブラウン運動によるサンプル分散の影響とその結果としての同一の粒子の到着時間の拡散、分離速度に依存する帯の広がり、流動を防ぐのに好適な勾配の確立、サンプル濃度の過剰供給、サンプルの粒子サイズの範囲、デコンボリューション解析に関する問題などが含まれる。これらの問題は、そのほとんどすべてがこれら装置が抱える１つの基本的な欠点と関連している。すなわち遠心分離は、ほとんどの粒子クラスについて絶対的な測定方法ではないのである。換言すると、検出器への同質の球の理論的到着時間以外、１組の粒子が一旦到着する時、そのサイズは直接測定不可能である。当然のことながら、粒子が同質の球でない、すなわち未知の構造のものであれば、先行技術による最良の較正手順ですら、大きな解釈の不確定さを招くおそれがある。
【０００４】
遠心分離は、サンプルに接近できないことさえなければ、後に行なわれる多角度光散乱（ＭＡＬＳ）分析の適用に対して理想的のように思われる。したがって、たとえばコロイド界面科学報（J. Colloid and Interface Science）第１９７巻、９〜２０頁に掲載された、ワイアットによる１９９８年の論文「分別後の多角度光散乱によるサブミクロンの粒子サイズ評価（Submicrometer particle sizing by multiangle light scattering following fractionation）」に記載のような直交流れ場流れ分別を用いると、分離後の溶離剤サンプルの多角度光散乱分析によって、詳細かつ正確なサイズ情報および分布情報が得られる。
【０００５】
この概念は、たとえばサイズを除いた色層分析や毛管流体力学分別を含む他の方法によって分離されたサンプルの分析にもまた適用されてきた。分離後の接近可能な溶離サンプルを伴う遠心分離装置がＪ．カルビン・ギディングズ（J. Calvin Giddings）により開発されており、沈降場流れ分別、略してＳｄＦＦＦと呼ばれている。たとえばサイエンス（Science）第２６０巻、１４５６頁以降に掲載されているギディングズによる１９９３年の論文などに記載されたこの方法は、１組の精巧なスリップリングおよび毛管を必要としていた。ギディングズの論文ではその他の種類のＦＦＦ分離技術もまた論じられている。ＭＡＬＳと組合されると、溶離サンプルの分析は、放散効果とは独立に粒子の各抽出分を正確に特徴付けることを可能にした。しかしＳｄＦＦＦ装置には、より従来からある遠心分離装置の分解能もダイナミックレンジもなく、また新たな封止を設ける短時間のうちに漏れが生じやすかった。
【０００６】
より従来の円盤型遠心装置および分析用遠心装置からの結果は、遠心力を受けているサンプル体積物内の小さな領域の光学的検査に基づく。遠隔の、すなわち回転するサンプルに対して静止している光源が、入射光ビームを通るサンプルの運動と同期され、これにより、「審問（interrogate）」されている特定の領域における粒子の存在について或る測定値をもたらす。これには吸収および順方向散乱の測定値、さらに装置によっては蛍光性も含まれ得る。通常、粒子サンプルのサイズ分布をこのような測定値から導き出すためにさらなる試みが行なわれるが、これはローレンツ・ミー散乱理論に関して、すなわち粒子が球であると仮定して、検出器における透過光ビームの散乱および／または暗化を解釈することによって行なわれる。既知の半径ａを有するそのような球が入射光ビームに入ったので、順方向の散乱光強度が生じると想定される。しかしそのような「既知の」サイズは、以下の関係に基づき粒子の到着時間から導き出されていた。
【０００７】
【数１】

【０００８】
ここでＤ＝２ａは粒子直径、ωはロータの角速度、Ｒ₀は、サンプル粒子が時間ｔ＝０で注入された際の半径、Ｒはこれらが検出される際の半径、ηは流体粘度、そしてρ_pおよびρ_fはそれぞれ粒子および流体についての特定の重力である。式（１）の項における誤差の考えられる原因は重大であり得る。より重要なことに、厳密に式（１）が当てはまるのは同質な球状構造の場合についてのみである。
【考案の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
おそらく式（１）から粒子サイズを導き出す際の誤差の最も大きな原因は、粒子密度が媒体の密度に近い場合に生じるものであり、これはたとえばタンパク質、および乳化重合で生じるさまざまな粒子に当てはまる。ρ_pとρ_fとが極めて近い場合、ρ_pのわずかな誤差もその結果として、導き出す粒子直径Ｄの顕著な誤差を引起すおそれがある。加えて、当然のことながら式（１）は球状の粒子にのみ当てはまる。球状でない粒子については、導き出した流体力学半径ｒ_hは単に等価の球のそれにすぎない。この発明の目的は、検出ビームを通過する粒子の流体力学半径をはるかに正確に、かつ遠心分離較正でしばしば用いられる既知の粒子標準を参照せずに、求めることができる手段を提供することである。流体力学半径の測定に加えて、この発明の特に有益な目的はいわゆる平均平方半径の測定である。これら半径の両方を知ることによって、しばしば粒子構造もまた導き出すことが可能となる。
【００１０】
この発明のさらなる目的は、較正なしに約１０〜１０００ｎｍの範囲の球状粒子の半径の絶対的測定を可能にすることである。この発明のさらなる目的は、ブラウン運動が引起す顕著な放散がある場合でも、遠心分離手段により分離した粒子の粒子サイズ分布を正確に導くことを可能にすることである。この発明の別の目的は、ロータ速度の系統的変動、流体温度および粘度の変化など、検出器で見られる分離粒子帯を広げる傾向にある他の影響により引起される、導き出されたサイズ分布の歪みを可能な限り回避することである。この発明のさらなる目的は、個々の密度のばらつきが先験的には知られ得ない広範囲の非同質の粒子についてサイズおよびサイズ分布を測定できるようにすることである。円盤型遠心機および超遠心機のいくつかの実現例は極小粒子の濃度を直接測定できることを目的とすることから、この発明の別の目的は、遠心分離手段で分離した分子のうち或るクラスについてのモル質量を測定できるようにすることとなる。この発明がこれらの目的を達成するのに成功するかどうかは、ＭＡＬＳ検出システムを遠心分離装置と一体化させ、遠心装置の既存のフィーチャを用いて測定サンプルをより正確に分析可能にできるかに決定的にかかっている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
この発明により、較正のための標準を用いなくても、円盤型遠心機または分析用遠心機などの沈降手段で分離する粒子のサイズ評価が可能となる。この能力によって、分離機構自体に関する問題が容易に見極められる。ほとんどの遠心分離およびその後のサイズ評価方法は、沈降分離を受けているサンプルを通過した光の極めてコリメートされたビームの強度測定に基づく。透過した光ビームによって、サンプル吸収および順方向散乱の測定が可能となる。順方向散乱の寄与を補正し、粒子が同質の球であると仮定してローレンツ・ミー散乱理論を用い、かつ式（１）に示すようなサイズ／時間関係を適用すれば、粒子の実質的なサイズが求められる。このようなビーム構成を用いるほとんどの装置、たとえばコーラー（Koehler）他の米国特許第４，３１１，０３９号では、さらに光源および検出器をコリメートして、照明されている粒子の小片とよく相互関連させる必要性が強調される。
【００１２】
この発明は、光学要素、マスクおよび１組の検出器を追加することで、サンプルを通る光の検出を修正し、或る範囲の角度にわたってサンプルで散乱した光を測定できるようにする。この多角度光散乱検出装置は、広範囲にわたる粒子形状について、実質的な粒子サイズとして表わされ得る散乱粒子の平均平方半径を求めることを可能にする。多角度光散乱はしばしば頭字語ＭＡＬＳと称される。このように入射光ビームを通る各断片を測定することで、絶対的な、かつ検出器へのサンプルの到着時間から独立したサイズ分布を導くことができる。サブミクロンのサイズ範囲にある粒子の多くの種類について、これら測定は粒子密度および屈折率の両方からほぼ独立している。
【００１３】
ここに開示する発明概念は、遠心力を分離に用いる他の装置にも直接適用され得る。このような分離プロセスの多くの従事者は較正標準の使用に頼っており、さらにはサンプルおよび関連の流体の物理的パラメータについて、しばしば極度に精密な測定を行なわなければならなかったのに対し、この発明に従えば測定プロセスおよびこの後の解釈全体が大幅に単純化されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
図１に、円盤型遠心分離機の、典型的なロータおよびサンプルを含む要素を示す。これらは透明な側板１，２を含み、これら側板は、間にある流体が入ったサンプル室の側部を形成し、上記要素はさらに、側板のうち一方に取付けられた中心ロータハブ３を含む。コリメートした細光源は４で表わされ、検出器セルは５で表わされる。サンプルは一般に流路７を介して１の中心開口部６を通じて導入される。このような構造、およびこれと類似の構造がたとえば、コーラー他による米国特許第４，３１１，０３９号、およびフィッツパトリック（Fitzpatrick）による米国特許第５，７８６，８９８号で開示されている。
図２は、動作中のサンプル室の断面図（end-on view）を示す。粒子サンプルは、ロータ３を通る回転軸８と同心である開口部６を通じて挿入され、流体メニスカス９と一旦接触すると分離を開始する。遠心力によってサンプルは外方向に移り、最終的には室の最も外にある境界１０に達し、ここにサンプルは室が洗浄されるまで留まる。サンプルの各断片は検出領域１１に達すると、光源４からの入射光ビーム１２を通過するが、この光源は検出器５で監視される。光ビームは一般によくコリメートされ、たとえば光源がレーザであればしばしば単色性である。また一方で光ビームは、制御された可変波長のビームを生じさせるモノクロメータで生成してもよい。このようなモノクロメータはしばしば分析用遠心機の装置の一部として提供されている。粒子のクラスによっては、紫外光源からのよくコリメートした光ビームが好ましい。
【００１５】
このような遠心機を用いて、上述の減衰した透過光測定の種類に基づく粒子サイズおよび粒子サイズ分布を求めることは、一般に「光沈降法（photosedimentation method）」と呼ばれる。これに関連する分離理論は特に球状の粒子に関するため、この方法の多用性は極めて制限されており、最終的にはほとんどの測定のために「較正した」標準を導入する必要がある。このような測定に基づく文献または特許では、恣意的な形状の粒子の理論および解釈の両方の脱却はほとんど論じられていない。
【００１６】
式（１）は、粒子直径Ｄと到着時間ｔとの関係を示すために一般的に提示した形ではあるが、その原理を考察することは有益である。室が角速度ωで回転し、Ｒが回転軸３からの距離であるとすると、質量ｍの粒子は遠心力ｍＲω²によって外方向へ動かされる。しかし粒子密度がρ_p、流体密度がρ_fであり、かつ粒子が体積Ｖを占める場合、遠心力は（ρ_p−ρ_f）ＶＲω²となる。半径ａの球状の粒子の場合、遠心力は単に４πａ³（ρ_p−ρ_f）Ｒω²/3となる。径方向の運動にいわゆるストークス力が対抗し、これは球について単に６πηａｄＲ／ｄｔであり、ここでａは球の半径、ηは流体の粘度である。なおこの後者の式は球にのみ当てはまるため、閉じた形で導くことができる唯一の結果である。したがって球状の粒子に対する正味の径方向の力は単にこれら２つの力の差であり、すなわち
【００１７】
【数２】

【００１８】
ωが２π１０⁴のオーダであり、流体が水である典型的な分離の場合、球の直径は１００ｎｍであり、粒子と流体との密度差は５×１０^-2のオーダであり、量２ω／ｂ＜＜１である。よって式（６）は単に以下のようになる。
【００１９】
【数３】

【００２０】
ホフマン（Hoffman）による米国特許第４，８７１，２４８号では、日本国・京都の株式会社堀場製作所（Horiba, Ltd）製造の円盤型遠心分離機の一応用例が開示されている。堀場製円盤型遠心機たとえばＣＡＰＡ５００では、水平面で回転する円盤構造内に装着したキュベットが利用される。これら小さなキュベットは、回転方向におけるあらゆる運動を制限することによって、系の角速度がどれほど大きくてもあらゆるコリオリ効果をなくす。こうしてサンプルはキュベット内に均一な分散物となるように入れられ、円盤の回転中に特定の集団へと分離する。
【００２１】
光散乱はおそらく、粒子サイズを測定するための最もよく知られた手段であろう。散乱角度の関数としての散乱光強度の測定値を用いて、多くの異なった種類の粒子についてこのようなサイズを導き出すことが可能である。球状の粒子の場合、このような多角度光散乱パターンの測定によって、球の直径および屈折率の両方を導き出すことができる。このことをフィリップス（Phillips）、ワイアットおよびバークマン（Berkman）は、たとえば「コロイドおよび界面科学報（Journal of Colloid and Interface Science）」第３４巻、１５９〜１６２頁に掲載の１９７０年の論文で示している。球状の対称性を呈する粒子構造は、場合によってはその光散乱特性の測定によっても導くことができる。このような構造を求めるのにＭＡＬＳ測定を応用する例がたとえば以下の論文に記載されている。
【００２２】
「生体バクテリア（スタフィロコックス・アウレウス）の細胞壁厚、サイズ分布、屈折率、および乾重量（Cell Wall Thickness, Size Distribution, Refractive Index Ratio, and Dry Weight Content of Living Bacteria (Staphylococcus aureus)）」ネイチャー（Nature）第２２６号、２７７頁（１９７０年）、
「差分光散乱からの胞子の誘電構造（Dielectric Structure of Spores from Differential Light Scattering）」胞子（Spores）第Ｖ号、米国微生物学協会（American Society for Microbiology）（１９７１年）、
「光散乱からの単一のバクテリアの構造（Structure of Single Bacteria from Light Scattering）」、Ｄ．Ｔ．フィリップス（D. T. Phillips）と共著、理論生物学報（J. Theor. Biol）第３７号、４９３頁（１９７２年）、
「フライアッシュ粒子のいくつかの化学的、物理的および光学的特性（Some Chemical, Physical and Optical Properties of Fly Ash Particles）」応用光学（Applied Optics）第１４号、９７５頁（１９８０年）。
【００２３】
半径が約１０ｎｍ未満の極めて小さな粒子の場合、そのサイズは目に見える入射光についてのＭＡＬＳで求めることができない。この制限は、測定に用いられる波長での分解能がないことから全く由来している。したがって、たとえばタンパク質のサイズを導き出すのにＭＡＬＳを用いることはできないが、それはタンパク質のサイズが典型的に数ｎｍのオーダだからである。しかしながら、さまざまな遠心機、たとえばベックマン・インストルメンツ（Beckman Instruments）製の分析用超遠心機などは高度な吸収光学系を備えているので、これらは原理的にサンプルのどの点においても絶対的な濃度測定ができる。この発明によるＭＡＬＳの能力があれば、濃度結果と光散乱データとを直接組合せることによりタンパク質モル質量を導き出すことができる。歴史的に、対象となっている粒子またはタンパク質が球でない場合に伝統的な超遠心機の結果をよりよく理解するために、超遠心機による測定を他の測定、たとえば光散乱、準弾性光散乱および粘度測定などと組合せていたことに触れておかなければならない。
【００２４】
ＭＡＬＳ測定を行なう粒子の屈折率が懸濁流体の屈折率に近い場合、散乱粒子のいわゆるｒｍｓ半径を求めることができるようにするＭＡＬＳ測定の理論的解釈においていくらかの単純化がある。球、棒、円盤、楕円など多くの単純な構造については、ｒｍｓ半径はより特徴的なサイズパラメータ、たとえば半径または長さなどと直接関係付けることができる。粒子の形状についての先験的な知見がいくらかあれば、粒子が球でない場合でも、この発明によって多くのクラスの粒子についてそのサイズを求めることができる。加えて、かなり広範囲の屈折率および対応する密度について、この発明の基幹となる特徴を組込む遠心分離装置では、球状の粒子のサイズもまたその測定から正確に求めることができる。式（１）から明らかであるように、粒子密度の判定のわずかな誤差も、遠心分離に基づく装置を用いると大きなサイズ評価の誤差を結果として生じさせるおそれがある。水に対する単純なポリスチレンの球の密度は５×１０^-2のオーダにすぎず、この値のいかなる誤差も、式（１）に基づく対応する粒子サイズの判定に対して大きな影響を及ぼすであろうことは明らかである。この発明によってこの依存性が大部分なくなる。
【００２５】
この発明が教示する方法に従い遠心分離を受けるサンプルからＭＡＬＳ測定を行なうには、遠心装置に特別の光学的能力および検出器能力を組込む必要がある。図３（ａ）はこの発明の或る要素の好ましい実施例を示す。透明な縁側肩部（berm）１２が円盤型遠心機の透明な外板に組込まれている。図３（ｂ）に、円筒状の縁側肩部が組込まれた外板の断面図を示す。好ましい実施例で縁側肩部の湾曲半径の中心は、照明されるサンプルにあるようにされる。
【００２６】
図４はよくコリメートされた光ビーム１３を示し、この光ビームは光ビーム源４から出て縁側肩部構造１２を通過し、１４で射出して透過光検出器１５に入る。光学的縁側肩部の好ましい構成では、ビーム１６は平坦な反射防止塗装表面１４を通って法線上で射出する。図にはさらに１組のよくコリメートされた検出器１７が示され、その各々は、出てくるビーム１６に対する特有の角度方向１９でサンプル領域１８により散乱された光を受ける。なお、サンプル領域１８から散乱された光は、光学的縁側肩部の表面に対する法線上で光学的縁側肩部から離れる。検出器１７をコリメートして、小さな立体角内でサンプル領域１８から散乱された光を受入れるようにする。粒子の分離は一般に小さな範囲の遠心半径距離２０にわたるため、検出器のコリメートが径方向に関して高い程度のサンプル／溶質分解能をもたらすことが本質的である。このことは、別個の各検出器において極めて局所化した一致する視野を可能にするようにコリメートすることによって達成される。検出器の前方に光学レンズを追加することでさらに視野の深さを制限し、これにより検出する寄与散乱体積を制限する。縁側肩部を完全になくして、その結果として平坦な外部板表面を通じて散乱光が現われるようにすることは可能だが、同じ極めて制限された散乱領域から散乱された光を検出するのに必要な特定の遮蔽および検出器の配向のため、かなりの複雑さが装置に加わることになる。すべての界面における内部反射が増加し、これに関連して、迷光の検出器への通過を防ぐのに好適な遮蔽を設けなければならないことで、さらなる構造的な要素がかなり加わる可能性がある。この発明の好ましい実施例では、光はレーザ源からのものであり、図示する検出器１７を含む平面に対して垂直に平面偏光されることになる。このような同一平面の検出器は、測定される分子／粒子をこの後で分析するための基礎となる特徴付けデータをもたらすのに十分ではあるが、測定のクラスによっては、または幾何学的制限のため、このような好ましい平面の外側にある検出器を採用することがあり得る。このような検出器は、規定された平面に対する方位角および散乱角の両方により分類される。
【００２７】
円盤型遠心機サンプルからの散乱光を検出するための図４に示す構造は、図１に示す従来の透過ビーム検出と全く異なっている。最も重要なことには、照明領域１８にある粒子は、透過したビームを監視することで達成される従来の吸収手段ではなく、それが散乱させる光によって検出される。透明な縁側肩部であって、その断面が、散乱光に対する法線上にある光学表面をもたらす縁側肩部を、円盤構造と一体化させることによって、他で表面が平面である場合よりも大きな範囲の角度にわたって、散乱光強度を測定することが可能となる。典型的にこの範囲は１０度から８０度であり得る。散乱光が通過する表面上に反射防止塗装を加えれば、光学的縁側肩部構造の透過特性はさらに向上するだろう。順方向に透過されたビーム１６は検出器１５で測定され、この検出器はまた光閉込め部としても働いて、隣接する構造体によりＭＡＬＳ検出器１７内へと散乱され得る迷光が生じるのを防ぐことができる。ここに組込まれた閉込め部はレーリー（Rayleigh）ホーンからなっても、あるいは鏡またはプリズム構造体からなってもよく、これによって入射ビームを除去して、このような逸れたビームから散乱したあらゆる光が、コリメートした検出器１７のいずれにとっても検出不可能であろう領域へと送る。閉込め部はまた、光学的に密であり反射しない媒体、たとえば反射防止塗装黒色ガラスからなってもよい。しかしながら、多くの光沈降法の実現例において関連の粒子／分子濃度を算出するのに必要となる、透過ビーム１６の強度測定のためには、ビーム強度検出器とビーム閉込め部とを組合せることが必要となるであろう。
【００２８】
図５は、先に論じた堀場製円盤型遠心機の基本要素を示す。それぞれサンプルおよび対照流体が入った２つのキュベットが、水平方向の円盤２３内の２１および２２に置かれる。光源および検出器は先に論じたコーラー他の装置で用いられるものと類似しているが、セルまたはキュベット、および関連したサンプルは、円盤の回転の際、光源の生成するビームによって追跡される円周２４のうちごく小さな部分しか占めない。光源４および／または検出器５にパルスまたは変更を与えて、サンプルまたは対照キュベットがビーム内にある期間中にのみオンになるようにしてもよい。沈降するサンプルの分解能を高くするには、光ビームの直径をできるだけ小さくすることが必要である。堀場製の装置でビーム直径は、この発明で好ましい現在入手可能なレーザ源の直径よりも２〜３ｍｍだけ大きい大きさのオーダである。
【００２９】
ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレイテッド（Inc.）が販売している種類の分析用超遠心機は、先に論じた円盤型遠心機とは全く別種の装置である。これは最大毎分６０，０００回転とはるかに大きな速度に達することができるため、はるかに小さな粒子を分離可能である。実際、このようなシステムの主な用途の１つはタンパク質の研究である。このような分子は、数ｎｍをほとんど超えることがない小さなサイズ、および関連する大きな放散係数を特徴とする。分子量、分子の形状、サイズ、分布、および純度の判定は原理的に、沈降するサンプルのさまざまな特徴を注意深く測定することから直接導き出すことができる。このような測定は、分離するサンプルにおけるはっきりした境界領域を観察および検出する必要性を含む。たとえばモル質量を導き出すのに用いられる分析用超遠心機の関係は、分離する粒子の直径を導き出すのに用いる式（１）とは全く異なる。分子の形状に関して仮定を行なって、ストークスの法則が粘性抗力を記述し得ると仮定する代わりに、摩擦力を以下の式と仮定する。
【００３０】
【数４】

【００３１】
が得られ、ここでＲは境界の中点であり、Ｒ_mはメニスカス位置である。式（１０）と、式（７）の円盤型遠心機についての対応する結果との類似性に注目されたい。ｌｎ（Ｒ）対ｔのグラフは、ｓが算出され得る傾斜ω²ｓの直線をもたらす。次に境界拡散のレート測定を用いて、対応する摩擦係数ｆを通じ、放散する分子の実質的なサイズに依存する放散係数Ｄを算出できる。よって
【００３２】
【数５】

【００３３】
上付き文字は、算出した放散係数および沈降係数が、ゼロ溶質濃度に外挿されたことを示す。各々は、異なった濃度で溶質を用いて行なわれた測定から一般的に算出される。
【００３４】
【数６】

【００３５】
分析用超遠心機を用いて直接にモル質量を知ることに関連する大きな困難にもかかわらず、このような小さな分子を分離し、かつ同時に広範囲にわたる他の現象、たとえば異質性、関連反応およびさまざまな熱力学的特性を調べることができるこの器具の力のため、分析用遠心機は最も有用な分析器具となっている。ベックマン製の装置は、器具がこの発明の要素と組合されると直接に濃度を測定するので、その有用性はかなり拡張されるであろう。したがってモル質量は、調べるサンプルにより散乱する光の絶対的測定値と濃度測定値とを組合せることによって直接算出できるであろう。モル質量が一旦このように容易に得られると、沈降定数および放散定数の両方についてのより正確な値を簡単に導き出すことができる。この発明の好ましい実施例を分析用超遠心機に適用し得る方法を以下に論じる。
【００３６】
図６（ａ）はベックマン製分析用超遠心機の光学系の概略図である。サンプル保持ロータ２５が真空室内でシャフト３について回転する。図５の堀場製の構造と同様、ロータにはサンプルキュベットおよび対照キュベットが入っている。しかしながら、正反対に対向する場所２６および２７に２つの対が含まれる。図６（ｂ）は、サンプルキュベット２８および対照キュベット２９が入っているこれら場所のうち１つ、たとえば２６の上面図を示す。これにより、実験のたびごとに２つの別個のサンプルを処理できる。なお各キュベットは、或る半径に沿った一方の側部境界が、ロータの主径に沿った他方の側部と或るわずかな角度をなすように構成される。この構造は、分離の際の内部サンプルの流れを減少させる助けとなる。キセノンフラッシュランプ源３０を操縦回折格子３１および入射光モニタ３２とともに示し、このモニタはビームスプリッタ３３を用いて入射強度に比例する小さな信号を受取る。焦点合わせしたビーム３４はサンプルそして対照セルを順に通過するが、これはセルが入った領域２６または２７がビーム内にあるときに行なわれる。一般に入射光源は点滅させられ、ビームはサンプルセルまたは対照セルを通る間にのみオンにされる。回折格子はまた光源、この場合はキセノンランプと関連付けられた範囲の可能性にわたり入射ビームの波長の選択を許す。一般には近紫外線の波長を選択するが、それはこのような装置による研究の多くが、紫外線下で強く吸収するタンパク質材料に関わるからである。２６または２７内のサンプルを通じて透過した光は、沈降するサンプル内の放射状の小領域から光学結像系３５によって収集される。照明されたサンプルにおけるマスク３６の像がこの狭い視野を定める。光電子倍増管３７などの光検出器がこの透過光を検出するが、その他の検出システムを用いてもよい。
【００３７】
ビーム３４、結像系３５、および光検出器３７からなる構造体はユニットとして径方向に動くように制御され、こうして異なる径方向の距離でサンプルを測定することが可能となる。一方で円盤型遠心機の場合、ビーム／検出器対は測定中ずっと単一の径方向の距離に置かれる。分離すべき粒子／分子の種類に依存して、径方向の走査を多数回繰返し、時間の関数としての沈降プロファイルを得る。この発明の好ましい実施例では、弾性散乱した光の測定が実現される場合、好ましい光源はレーザであろう。光学系は点滅する紫外光源およびレーザの両方を収容でき、こうして濃度およびいわゆる静的光散乱の測定をほとんど同時に行なうことができる。
【００３８】
図１から図４の円盤型遠心機とは異なり、分析用超遠心機およびキュベットを用いた円盤型遠心機は、先に開示した円形縁側肩部レンズ構造の利益を享受できない。個々のキュベット自体が、必要な円筒状のレンズ構造を組込まなければならない。図７にこの発明で用いられ得るキュベットの断面を示す。光ビームが通過する側部が平坦である代わりに、ビームが射出する平坦な表面に変更を加えて、この実施例で湾曲半径の中心が照明サンプルである円筒状の構造３８をもたらす。超遠心機では、ビームはやはりキュベットの長さに沿って、増加する半径の方向３９で径方向に走査され得る。一方、このようなキュベットを組込む円盤型遠心機では、ビームは固定位置に制限されることになる。好ましい実施例のこの円筒表面は、縁側肩部についての類似の構造に対応する平坦な頂部４０を有することもある。さらに領域全体が反射防止塗装され得る。
【００３９】
図８は、分析用超遠心分離機の好ましい実施例の瞬間的な断面図を示す。さらに、図６（ａ）の従来の構造の結像系３５および光電子倍増検出器３７もまた示される。この結像系３５とロータハウジング２５との間の領域には、図４の検出器１７と類似する１組のコリメートした散乱光検出器４１がある。これらの検出器および図４に示す検出器は一般に平面上にあり、キュベット／セル２８内の照明される小体積物３８からの散乱光を受ける。検出器は結像系の他の要素とともに動き、図の平面に対して横断する径方向の走査全体にわたり散乱光を収集する。したがって、走査されるキュベット全体にわたるサンプル粒子質量およびサイズ分布プロファイルは、散乱測定で求められ記載の発明のシステムで記録され得る。したがって、光ビーム３４は常に結像系３５および光電子倍増管３７に対し垂直であり、これに散乱光検出器４１が付加される。したがってすべての検出、光源および光学要素は、ロータに対して固定のプラットホーム上にある。プラットホームは径方向に動いて、分析用超遠心機の径方向の走査能力をもたらす。従来の円盤型遠心機の動作中における径方向走査の実行能力は、このような装置で見られる特徴ではないが、比較的容易に実現可能である。サンプルキュベット２８が先に占めていた位置に対照キュベット２９が達すると、その溶液によって散乱された光が類似の態様で収集されることになる。
【００４０】
サンプルキュベットおよび対照キュベットに入射するビームを生成する光源は、レーザ源またはこれに代えて可変紫外光／可視光源、たとえば分析用超遠心分離機で一般に用いられるものからなることができる。逆に、可変光源およびレーザ源の両方を逐次または同時に作動させることもできる。図９では、光ビームを生成してサンプルを審問するのに用いられるレーザ源４２を、操縦回折格子３１と並置して装着したものとして示している。両方とも同じ径方向の距離にあるが、回転角でずらされている。キュベットは、キュベットに入っている分離サンプル２８に対して同じ径方向の位置を通じて逆時計回りに回転するため、入射レーザビーム４３がキュベット２８を通過した後、図８のキセノンフラッシュランプ３０からの紫外光源ビーム３４がここに当たる。サンプル吸収を算出するのに用いられる、対応する透過紫外光／可視光ビーム３４の強度と、レーザビーム４３から散乱されて検出器１７に入る光とを組合せて、サイズおよび質量を算出する。紫外線およびレーザビームとサンプルとの相互作用についての信号は、サンプルの同じ径方向の位置で逐次的に収集される。なお、紫外光／可視光源自体は、サンプルからの散乱光を検出するための、関連付けられた１組の散乱光検出器４１を有する。紫外光／可視光源の代わりに、その他どの光源も等価に用いることができ、さらにたとえば光ダイオードアレイ検出器とともに用いることができる。
【００４１】
代替的にレーザビームは、紫外光／可視光源と共線上にあるように、または、濃度検出手段を用いてモル質量を求める必要がない場合には、その代わりとなるようにできる。多波長レーザ源または光源もまた選択可能であり、ここでさまざまなフィルタが透過ビーム波長を選択するように選ばれる。さらに特定の散乱波長の検出をなくすために、他のフィルタを選択して散乱光検出器に取付けることもできる。光学設計における当業者には明らかであるように、このようなビームを生成するにはその他多くの手段がある。
【００４２】
分析用超遠心機の場合における上述の二光源構成であって、２つの異なる光源によって、サンプルが入った領域がここを過ぎて回転する際にサンプルが逐次的に照明される二光源構成は、先に論じた円盤型遠心機構成にもまた適用可能である。したがって、図２および／または図５の構造に逐次的二照明を用いることができる。実際、多数の照明源はどの遠心分離装置についても常に使用可能である。このような多数の光源は２つに限定されない。
【００４３】
レーザ源および紫外光／可視光源が、単一の入射ビームを形成するように配向付けられる場合、散乱光検出器１７にフィルタを設けて、溶液で散乱された紫外光／可視光をなくすことが好ましい。このようなフィルタは、検出すべきレーザ波長での弾性散乱光のみを通す干渉フィルタであることが好ましい。蛍光が引起こすものなどの非弾性散乱レーザ光を検出する場合、対応する検出器フィルタはそれに対応して選択されることになる。採用する光源のうちいずれかが偏光される場合、選択された散乱光検出器に偏光検知分析器を取付けて、減偏光散乱効果の量的測定を可能にすることもある。
【００４４】
以上の議論から、この発明の主な要素は、与えられた遠心力によって引起される沈降現象を測光手段で監視するさまざまな種類の器具に対して等しく適用されることが明らかである。この発明の目的は、このような手段により分離されているサンプルの領域からの散乱光の測定を可能にすることである。或る範囲の散乱角度にわたって行なわれるこのような測定から、放散現象にかかわらず粒子サイズを直接導き出すことが可能となる。遠心手段で分離を受けているのが溶媒化した分子の場合、差分屈折率増分ｄｎ／ｄｃに加えて分子の濃度が知られていれば、重量平均モル質量を直接導き出すことができる。このような量の詳細は、この明細書の冒頭で参照したワイアットおよびトレイノフによる同時係属の特許に記載されている。ほとんどの遠心分離装置および確実には分析用超遠心機では光ビームを用い、溶液によるその吸収を用いて、存在する分子の濃度を直接算出できる。したがって溶媒化した分子の場合には、サンプルの吸光係数から分子濃度を求めるのに十分な吸収データをもたらすには、存在するだけの紫外光／可視光源でしばしば十分である。逆により大きな粒子については、粒子散乱が有する役割のためこのような吸収技術は粒子濃度の算出にはほとんど用いられ得ない。加えて、このような粒子散乱の角度変動は、実質的な粒子サイズを算出するのにほぼ十分である。サンプルを直接通過する順方向透過ビームは、分子濃度と、おそらくは或る粒子についてはビーム透過とを求めるのに有益であるので、この発明の好ましい実施例はそのような測定を引続いて使用することになる。
【００４５】
この発明についての別の重要な要素は、サンプルが入った領域の出射表面で求められる変更に関する。ビームはサンプルから離れると、サンプルを制限している透明な領域に対する法線上で射出することが好ましい。したがって、逸れていない入射光が通過する法線上の表面は、このような遠心分離装置で現在採用されているものと同じである。サンプルから散乱した光もまた測定できるには表面領域の大きな変更が必要である。先に言及したようにこの発明は、照明されたサンプル内の小体積物から或る範囲の散乱角度にわたり散乱する光の測定を可能にすることを意図している。したがって散乱光はサンプルが入った表面から、その通過の際これに対し法線上で離れ、好ましくは散乱した小体積物から等距離の径方向の位置で位置付けられる１組の検出器に至る。これら検出器のコリメートは、視野、すなわち散乱体積物の横方向の寸法を定める。先に記載したような頂部が平坦にされた円筒状レンズを一般に形成する光学表面自体の湾曲半径の中心は、照明されるサンプル体積物にあるようにされる。
【００４６】
光散乱に関する当業者には明らかであるように、発明者が発明し記載した変更された遠心分離機については、発明者がその実施のために列挙した基本的な要素から逸脱しない多くの明らかな変形例がある。このような変形例はすべてここに記載した発明の明らかな実現例にすぎず、引用により前掲の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】透明な壁を有する円盤型遠心機の一般的な構造を示す図である。
【図２】液体メニスカスと径方向で増加するサンプル帯とを示す、円盤型遠心機の断面図である。
【図３】光学的縁側肩部を含む１枚の壁を有する、変更を加えた円盤型遠心機を示す図である。
【図４】図３の縁側肩部構造に基づき、或る範囲の角度にわたりサンプルにより散乱される光の測定を可能にする、検出器構成を示す図である。
【図５】サンプルが別個のサンプルセルまたはサンプルキュベットに入っている、円盤型遠心機の代替形に対応する図である。
【図６】ベックマン製オプティマＸＬ−Ａ分析用遠心機（Optima XL-A Analytical Centrifuge）用の光学系を示す概略図である。
【図７】別個のサンプルキュベットを組込んだ超遠心機で用いられる、円筒状レンズを組込んだサンプルキュベットの好ましい実施例を示す図である。
【図８】ベックマン製分析用遠心機用の検出システムの好ましい実施例を示す図である。
【図９】サンプルの逐次的照明を可能にするのに用いられる、並置したレーザおよび紫外光／可視光源の装着を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１側板、２側板、３ロータハブ、４細光源、５検出器セル、６中心開口部、７流路、９流体メニスカス、１０境界、１１検出領域、１２入射光ビーム、１３光ビーム、１４反射防止塗装表面、１５透過光検出器、１６ビーム、１７検出器、１８サンプル領域、１９特有の角度、２０遠心半径距離、２３円盤、２４ビーム、２５ロータハウジング、２８サンプルキュベット、２９対照キュベット、３０キセノンフラッシュランプ源、３１操縦回折格子、３２入射光モニタ、３３ビームスプリッタ、３４ビーム、３５結像系、３６マスク、３７光電子倍増管、３８小体積物、４０縁側肩部の頂部、４１散乱光検出器、４２レーザ源、４３レーザビーム。

Claims

分離を受けるサンプルから複数の角度で散乱される光を測定できる、改良された円盤型遠心機であって、
ａ）回転軸のまわりで発生器によって回転するように駆動される対称の円筒室を備え、前記室は前記室の円形壁手段内に、円筒状の、流体を収容する空所手段を組込み、前記空所は、前記回転軸から或る範囲の径方向の距離にわたって延在し、前記壁は、或る範囲の径方向の距離にわたって光に対して透明の領域を組込み、前記遠心機はさらに
ｂ）サンプル導入手段を備え、前記サンプルは、前記円形壁手段の間にある前記円筒状の流体を収容する空所内に導入可能であり、こうして前記サンプルは、前記円筒状の室に対して前記回転軸のまわりに駆動される回転を行なう間に、結果としての遠心力によって分離を受け、前記遠心機はさらに、
ｃ）前記壁手段のうち１つにある透明な領域に一体化された、透明な対称の円筒状光学的縁側肩部（berm）手段と、
ｄ）細光ビームを生成する静止の外部光源手段とを備え、前記細光ビームは、非光学的な縁側肩部を含む円形の壁の透明の領域、分離を受ける前記サンプル、および前記光学的縁側肩部手段の頂部を連続的に通過し、前記遠心機はさらに、
ｅ）静止の順方向透過光ビーム閉込め手段を備え、前記閉込め手段には、前記細光ビームが前記透明縁側肩部の前記頂部から離れた後に入り、前記遠心機はさらに
ｆ）複数の静止の検出器手段を備え、前記検出器手段は、前記光ビームのまわりに、ここからさまざまな角度で配置され、前記検出器手段の各々は、前記入射光ビームにより照明され前記透明縁側肩部手段を通過する、前記サンプルの領域から前記サンプル手段により散乱された光のみを受入れるように、コリメート手段により遮蔽され、前記遠心機はさらに、
ｇ）時間について連続的に前記散乱光検出器からの信号を変換するための電子的手段を備え、前記電子的手段は、前記信号をデジタル表現に変換して、結果として得られる前記デジタル信号を、後の処理および分析のためにコンピュータ手段に送信する、遠心機。
分離を受けるサンプルから複数の角度で散乱する光を測定できる、改良された円盤型遠心機であって、
ａ）回転軸のまわりで発生器によって回転するように駆動される円筒構造を備え、前記円筒構造は、透明のキュベット（cuvette）を組込むための空所手段を含み、前記キュベットは、
ｉ．サンプルを含み、前記サンプルの各々は、前記回転軸のまわりに駆動される回転を前記円筒構造に対して行なう際に、結果としての遠心力によって分離を受け、前記キュベットはさらに、
ii．入射光ビームが通過できる平面状の透明な光学表面と、対向する光学表面とを有し、こうして前記２つの表面間に前記サンプルを有する構造をもたらし、前記キュベットはさらに、
iii．前記結果としての遠心力が径方向で粒子を分離するように径方向に配向付けられ、前記遠心機はさらに、
ｂ）前記サンプルを含むキュベットの前記光学表面の透明の領域を通じて連続的に通過する前記細光ビームを生成する、静止の外部光源手段と、
ｃ）静止の順方向透過光ビーム閉込め手段とを備え、前記閉込め手段には、前記細光ビームが前記透明キュベットの前記頂部から離れた後に入り、前記遠心機はさらに、
ｄ）複数の静止の検出器手段を備え、前記検出器手段は、前記光ビームのまわりに、ここからさまざまな角度で配置され、前記検出器手段の各々は、前記入射光ビームによって照明され前記光表面手段を通過する、前記サンプルを含むキュベットの領域から前記サンプル手段によって散乱された光のみを受入れるように、コリメート手段により遮蔽され、前記遠心機はさらに、
ｅ）時間について連続的に前記散乱光検出器からの信号を変換するための電子的手段を備え、前記電子的手段は、前記信号をデジタル表現に変換して、結果として得られる前記デジタル信号を、後の処理および分析のためにコンピュータ手段に送信する、遠心機。
分離を受けるサンプルから複数の角度で散乱光を測定できる、改良された分析用超遠心機であって、前記超遠心機は、
ａ）回転軸のまわりで発生器によって回転するように駆動される円筒構造を備え、前記円筒構造は、透明のキュベットを組込むための空所手段を含み、前記キュベットは、
iv．サンプルを含み、前記サンプルの各々は、前記回転軸のまわりに駆動される回転を前記円筒構造に対して行なう際に、結果としての遠心力によって分離を受け、前記キュベットはさらに、
ｖ．入射光ビームが通過できる平面状の透明な光学表面と、対向する光学表面とを有し、こうして前記２つの表面間に前記サンプルを有する構造をもたらし、前記キュベットはさらに、
vi．前記結果としての遠心力が径方向に粒子を分離するように径方向に配向付けられ、前記超遠心機はさらに、
ｂ）前記回転円筒構造に対する法線上に向けられ、前記サンプルを含むキュベットの前記光学表面の透明な領域を通じて連続的に通過する前記細光ビームを生成する、第１の光源手段と、
ｃ）順方向透過光ビーム閉込め手段とを備え、前記閉込め手段には、前記細光ビームが前記透明なキュベットの前記頂部から離れた後に入り、前記超遠心機はさらに
ｄ）複数の光散乱検出器手段を備え、前記検出器手段は、前記光ビームのまわりに、ここからさまざまな角度で配置され、前記光散乱検出器手段の各々は、前記入射光ビームに照明され前記光学表面手段を通過する、前記サンプルを含むキュベットの領域から前記サンプル手段により散乱された光のみを受入れるように、コリメート手段によって遮蔽され、前記超遠心機はさらに、
ｅ）前記回転軸から、前記第１の光源と同じ径方向の距離にあり、前記キュベットが第２の角度位置に動いた際に前記回転円筒構造に対する法線上に向けられて前記キュベットを通過する第２の光ビームを生成する、第２の光源と、
ｆ）第２の順方向透過光ビーム閉込め手段とを備え、前記閉込め手段には、前記第２の細光ビームが前記透明なキュベットの前記頂部から離れた後に入り、前記超遠心機はさらに、
ｇ）第２の複数の光散乱検出器手段を備え、前記検出器手段は、前記第２の光ビームのまわりに、ここからさまざまな角度で配置され、前記光散乱検出器手段の各々は、前記入射光ビームにより照明され前記光学表面手段を通過する、前記サンプルを含むキュベットの領域から前記サンプル手段により散乱される光のみを受入れるように、コリメート手段により遮蔽され、前記超遠心機はさらに
ｈ）機械的支持手段を備え、前記支持手段によって、前記２つの光ビーム源と、前記２つの複数の光散乱検出器手段が、その間で回転する前記回転円筒構造に対して空間について固定され、前記機械的構造はその動きを径方向の位置にのみ許し、前記超遠心機はさらに、
ｉ）時間について連続的に前記２つの複数の散乱光検出器からの信号を変換するための電子的手段を備え、前記電子的手段は、前記信号をデジタル表現に変換して、結果として得られる前記デジタル信号を、後の処理および分析のためにコンピュータ手段に送信する、分析用超遠心機。
前記順方向透過光ビーム閉込め手段の各々は、前記入射透過ビームの強度を監視するための検出手段を含む、請求項３に記載の改良された分析用超遠心機。
前記第１の光源は、請求項４の前記サンプル手段を透過した前記光ビームの前記検出器
監視手段により前記サンプル吸収の測定を許す波長で光ビームを生成する、請求項３に記載の改良された分析用超遠心機。
前記第２の光源はレーザである、請求項３に記載の改良された分析用超遠心機。
前記レーザ源は、前記サンプルキュベットを保持する前記回転構造の半径と平行な平面上で平面偏光される、請求項６に記載の改良された分析用超遠心機。
前記細光ビームが前記サンプルの通過後に通過する前記キュベット光学表面は、前記キュベットのこの領域に沿って延在する円形の断面であり、こうして前記細光ビームが進む前記回転構造に沿う選択された範囲の径方向の位置を含み、かつ前記細光ビームで照明される前記サンプル領域に湾曲半径の中心を有する、請求項３に記載の改良された分析用超遠心機。
前記照明されるサンプル領域を中心とする前記円形の断面を有する表面は平坦な頂部を有し、こうして透過した細光ビームは、これに対する法線上を通過して静止の順方向透過光ビーム閉込め手段内に入る、請求項８に記載のキュベット。
入射ビームおよび散乱光が通過するすべての光学表面は、すべての空気界面で散乱および反射を減少させるための透明な光学物質で塗装される、請求項８に記載のキュベット。
前記光ビームのまわりにここから異なる角度で配置された前記複数の光散乱検出器手段は、前記ビームに対して垂直の平面にある、請求項３に記載の改良された分析用超遠心機。
前記順方向透過光ビーム閉込め手段は、前記入射透過ビームの強度を監視するための検出手段を含む、請求項２に記載の改良された円盤型遠心機。
前記細光ビームが前記サンプルの通過後に通過する前記キュベット光学表面は、前記キュベットの長さに沿って延在する円形の断面であり、こうして選択された範囲の径方向の位置を含み、かつ前記細光ビームで照明される前記サンプル領域に湾曲半径の中心を有する、請求項３に記載の改良された円盤型遠心機。
前記照明されるサンプル領域を中心とする前記円形の断面である表面は平坦な頂部を有し、こうして透過した細光ビームはこれに対する法線上を通過して静止の順方向透過光ビーム閉込め手段内に入る、請求項１３に記載のキュベット。
入射ビームおよび散乱光が通過するすべての光学表面は、すべての空気界面で散乱および反射を減少させるための透明な光学材料で塗装される、請求項１３に記載のキュベット。
前記光ビームのまわりにここからさまざまな角度で配置された前記複数の光散乱検出器手段は、前記ビームに対して垂直の平面にある、請求項２に記載の改良された円盤型遠心機。
前記順方向透過光ビーム閉込め手段は、前記入射透過ビームの強度を監視するための検出手段を含む、請求項１に記載の改良された円盤型遠心機。
前記透明な対称の円筒状光学的縁側肩部手段は、前記細光ビームで照明される前記サンプル領域に湾曲半径の中心を有する、請求項１に記載の改良された円盤型遠心機。
前記照明されるサンプル領域を中心とする前記円形の断面である表面は平坦な頂部を有し、こうして透過した細光ビームはこれに対して法線上を通過して静止の順方向透過光ビーム閉込め手段内に入る、請求項１８に記載の透明な対称の円筒状光学的縁側肩部手段。
入射光および散乱光が通過するすべての光学表面は、すべての空気界面で散乱および反射を減少させるための透明な光学材料で塗装される、請求項１に記載の改良された円盤型遠心機。
前記光ビームのまわりにここからさまざまな角度で配置された前記複数の光散乱検出器手段は、前記ビームに対して垂直な平面にある、請求項１に記載の改良された円盤型遠心機。