DE202006007867U1 - Probengefäß - Google Patents
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Abstract
Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Probengefäß zur Zentrifugation einer Zellsuspension mit einem Messbereich, in dem sich nach Zentrifugation in der Probe vorhandenes, festes Material als verdichteter Zellkuchen ablagert, und mit einem Aufnahmebereich, in dem sich nach Zentrifugation flüssiger Überstand sammelt, wobei der Messbereich als wenigstens sektorweise transparente Kapillare ausgebildet ist, deren lichte Weite wesentlich geringer ist als die lichte Weite des Aufnahmebereichs.
- Aus dem Bereich der medizinischen Diagnostik ist das so genannte PCV-Verfahren bekannt. PCV steht für „packed cell volume" und beschreibt den Anteil an Feststoffen in Form eines verdichteten Zellkuchens an dem Gesamtvolumen einer Probe. Weithin bekannt ist der als Hämatokrit bezeichnete PCV-Wert des Blutes. Zu seiner Bestimmung wird eine Blutprobe in einem meist zylindrischen Probenröhrchen zentrifugiert bis sich der Festbestandteil des Blutes als verdichteter Zellkuchen am Röhrchenboden abgesetzt hat. Der auch als überstand bezeichnete Flüssiganteil schwimmt auf dem Zellkuchen. Zur Bestimmung des Hämatokrit wird das Volumen des Zellkuchens bestimmt und in ein prozentuales Verhältnis zum Gesamtvolumen der Probe gesetzt.
- Typische Messwerte, die sich bei dem oben beschriebenen Hämatokrit-Messverfahren ergeben, bewegen sich im Bereich von 30-50%. Bei typischen Zellkulturen sind die zu erwartenden Gesamtfeststoffwerte deutlich geringer, typischerweise im Bereich von 1% oder darunter. Dies bedeutet, dass bei Verwendung der üblichen Probengefäße für PCV-Messungen an solchen Zellkulturen die Höhe der Überstandssäule etwa ein Hundertfaches der Höhe des Zellkuchens beträgt. Dies kann leicht zu großen Ablesefehlern führen.
- Es sind hier als PCV-Röhrchen bezeichnete Probengefäße bekannt, die diesen Nachteil dadurch beseitigen, dass jedes Probengefäß einen Aufnahmebereich und einen sich an diesen anschließenden, als Kapillare ausgebildeten Messbereich aufweist, dessen lichte Weite wesentlich kleiner als die lichte Weite des Aufnahmebereichs ist. Hierdurch wird eine Maßstabstransformation erreicht, sodass ein gegebenes Volumen einer sehr viel größeren Höhe im Messbereich als im Aufnahmebereich entspricht. Dies bedeutet eine relative Skalenspreizung im Bereich des Zellkuchens, sodass ein Ablesefehler, d.h. eine falsche Bestimmung der Höhe des Zellkuchens, nur zu einem kleinen Fehler der Volumenbestimmung führt. Andererseits führen diese PCV-Röhrchen auch zu einer relativen Skalenstauchung im Aufnahmebereich. Das bedeutet, dass der absolute, durch einen Ablesefehler eingeführte Fehler in der Volumenbestimmung des Überstandes zwar größer ist als der absolute Fehler der Zellkuchenvolumenbestimmung; aufgrund des sehr großen Überstands-Gesamtvolumens bleibt der entscheidende, relative Fehler jedoch im akzeptablen Bereich, insbesondere ist er nicht größer als bei der Verwendung von ansonsten üblichen Probengefäßen.
- Zur optischen Detektion der Höhen von Zellkuchen und/oder Überstand ist eine angemessene Beleuchtung des Probengefäßes erforderlich. Die Merkmale der Beleuchtung hängen dabei insbesondere vom gewählten Detektionsmodus, d.h. Transmission, Reflexion, Streuung, Fluoreszenz etc. ab. Ein häufiger Detektionsmodus ist die Reflexion. Hierbei ist jedoch nachteilig, da sich Reflexe der Röhrchenwand dem von dem Zellkuchen bzw. dem Überstand reflektierten Licht überlagern, was insbesondere bei einer automatisierten Detektion zu Fehlern führen kann.
- Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein bekanntes PCV-Röhrchen derart weiterzuentwickeln, dass eine verbesserte Bestimmbarkeit der Höhen von Zellkuchen und/oder Überstand gewährleistet ist.
- Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass wenigstens eine Lichteinkoppelfläche vorgesehen ist, über die Licht in die Wandung der Kapillare und/oder des Aufnahmebereichs einkoppelbar ist. Bevorzugt wird, dass am geschlossenen Ende der den Messbereich umfassenden Kapillare eine Lichteinkoppelfläche vorgesehen ist. Diese kann z.B. als eine transparente Abflachung der Kapillarenspitze ausgebildet sein, die zu den Flächen der Kapillarenwandung in einem solchen Winkel steht, dass sich in die Einkoppelfläche eingeleitetes Licht durch Totalreflexion in der Kapillarenwandung fortpflanzt. Das Probengefäß selbst bzw. seine Wandung dient so als ein Lichtleiter.
- Der Brechungsindex des Wandmaterials ist dabei vorzugsweise so zu wählen, dass zum Gefäßäußeren hin die Totalreflexion möglichst perfekt realisiert ist, während zum Gefäßinneren, d.h. zum Zellkuchen bzw. zum Überstand hin, Lichtanteile ausgekoppelt werden. Dieses ausgekoppelte Licht wird vom Zellkuchen bzw. dem Überstand charakteristisch gestreut und durchdringt die transparente Gefäßwand, um dort vom Auge oder einem Detektor erfasst werden zu können.
- Die Auskopplung des Lichtes in das Gefäßinnere kann an besonderen vorgesehenen Auskoppelstellen oder entlang bestimmter Auskoppellinien erfolgen, die sich z.B. durch Aufrauung ihrer Oberfläche und/oder spezielle Auskoppelprismen auszeichnen. Solche Auskoppelflächen sind jedoch vorzugsweise außerhalb des beobachteten Wandbereichs der Kapillare anzuordnen, um die Messung nicht zu behindern. Häufig wird jedoch schon die geringere Brechungsindexdifferenz zwischen Kapillarenwand und Zellkuchen/Überstand im Vergleich zur Umgebungsluft ausreichen, um eine effiziente Auskopplung zu gewährleisten.
- Vorzugsweise ist bei dem erfindungsgemäßen Probengefäß vorgesehen, dass seine Wandung aus einem transparenten Material, insbesondere einem transparenten Kunststoff, vorzugsweise aus einem transparentem Polycarbonat besteht. Die Transparenz ist wichtig, damit eine optische Detektion der Höhe des Zellkuchens bzw. der Überstandssäule ermöglicht wird. Die Begriffe "optisch" und "transparent" sind dabei nicht auf den häufig als optischen Spektralbereich bezeichneten Bereich zwischen ca. 400 und 800 Nanometer Wellenlänge des elektromagnetischen Spektrums beschränkt. Insbesondere bei Verwendung von Farbstoffen zur Verbesserung der Kontrastierung zwischen Zellkuchen und Überstand und/oder zwischen unterschiedlichen Bereichen des Zellkuchens kann auch Licht des infraroten oder ultravioletten Spektrums zur Detektion eingesetzt werden. Die Begriffe "optisch" und "transparent" sind dann entsprechend zu interpretieren.
- Als besonders praxistauglich hat sich die Verwendung einer Kapillare mit einem inneren Durchmesser im Bereich von 500 Mikrometern und einem Volumen von einem bis zu zehn Mikrolitern, insbesondere zwei bis sieben Mikrolitern und besonders bevorzugt von etwa fünf Mikrolitern als Messbereich erwiesen. Der Aufnahmebereich, dessen Durchmesser in der Größenordnung von einigen Millimetern bis zu einigen Zentimetern betragen kann, weist vorzugsweise ein Volumen in der Größenordnung von Millilitern, insbesondere zwei Milliliter oder weniger, bevorzugt etwa ein Milliliter, auf. Diese Dimensionierung führt dazu, dass sich bei der Untersuchung typischer Zellkulturen ein verdichteter Zellkuchen nur im Messbereich ausbildet, wohingegen der Aufnahmebereich nach der Zentrifugation ausschließlich mit Überstand gefüllt ist. Bei nicht vollständig mit Zellkuchen gefülltem Messbereich wird zusätzlich zum Aufnahmebereich auch der obere Teil des Messbereichs mit Überstand gefüllt sein. Dieses Volumen ist jedoch in Kenntnis der Geometrie des erfindungsgemäßen Probengefäßes leicht bestimmbar und wird in vielen Fällen im Ergebnis sogar vernachlässigbar sein.
- Die Volumenbestimmung erfolgt vorzugsweise durch Ermittlung der Höhen des Zellkuchens bzw. der Überstandssäule, aus denen bei Kenntnis der Geometrie des Probengefäßes das entsprechende Volumen ermittelt werden kann. Dies ist besonders einfach, wenn der Messbereich und vorzugsweise auch der Aufnahmebereich, wie bei einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, einen über ihre Höhe im Wesentlichen gleich bleibenden Querschnitt aufweisen. Die Höhenverteilung der einzelnen Abschnitte entspricht dann direkt der Volumenverteilung. Zur Erreichung dieses Vorteils ist es ausreichend, wenn sich die gleich bleibenden Querschnitte über den jeweils wesentlichen Teil des Mess- bzw. Aufnahmebereichs erstrecken. Querschnittsänderungen im Übergang zwischen Aufnahmebereich und Messbereich und/oder am unteren Ende des Messbereichs tun dem keinen Abbruch, da diese Bereiche stets mit Überstand bzw. Zellkuchen gefüllt sein werden und somit nur einen konstanten, additiven Beitrag zu den jeweils durch Höhenmessung ermittelten Volumina liefern.
- Wie erläutert, ist die den Messbereich bildende Kapillare ein sehr filigranes Gebilde, das entsprechend leicht beschädigt werden kann. Um dem entgegenzuwirken, ist bei einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass seitlich an den Messbereich ein oder mehrere Stabilisierungskörper angeformt sind. Diese sind vorzugsweise einstückig mit der Kapillare und dem Aufnahmebereich ausgebildet. Der oder die Stabilisierungskörper müssen jedoch stets so beschaffen sein, dass in wenigstens einer Orientierung des Probengefäßes eine senkrechte Sichtlinie auf den Messbereich und vorzugsweise auch auf den Aufnahmebereich unverstellt ist. Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, dass als Stabilisierungskörper eine Mehrzahl von Stabilisierungsflügeln vorgesehen ist, die sich längs der Kapillarachse erstrecken. Vorzugsweise werden genau zwei einander gegenüber stehende Stabilisierungsflügel verwendet, wobei jedoch andere Anzahlen von Stabilisierungsflügeln ebenfalls realisierbar sind. Alternativ kann als Stabilisierungskörper auch eine sektorweise, axiale Fortsetzung des zylindrisch geformten Aufnahmebereichs vorgesehen sein.
- Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden, speziellen Beschreibung sowie den Zeichnungen.
- Es zeigen:
-
1 : eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines Probengefäßes; -
2 : eine um 90° um die Symmetrieachse rotierte Ansicht eines Probengefäßes gemäß1 ; -
3 : eine vergrößerte Darstellung des Messbereichs eines Probengefäßes gemäß1 ; -
4 : eine vergrößerte Darstellung des geschlossenen Endes des Messbereichs zur Veranschaulichung der bevorzugten Lichteinkopplung. -
1 und2 zeigen eine schematische Darstellung einer besonders bevorzugten Ausführungsform eines Probengefäßes, nämlich eines so genannten PCV-Röhrchen10 . Das PCV-Röhrchen10 kann in zwei Hauptbereiche unterteilt werden. Ein erster, großvolumiger Bereich I wird hier als Aufnahmebereich I bezeichnet. Ein zweiter, als Kapillare ausgebildeter Bereich II wird hier als Messbereich bezeichnet. Der Aufnahmebereich ist bei der in1 und2 dargestellten Ausführungsform in zwei Unterbereiche unterteilt: einen im Wesentlichen zylindrischen Hauptbereich Ia und einen keglig zulaufenden Übergangsbereich Ib. Typische Abmessungen für den Aufnahmebereich I liegen in der Größenordnung von Zentimetern, sein typisches Volumen in der Größenordnung von etwa 1 ml. Der Messbereich II ist als Kapillare mit einer typischen lichten Weite von etwa 500 μm ausgebildet. Sein typisches Volumen liegt bei etwa 5 μl. Es sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass diese Maßangaben lediglich in der Praxis bewährte Beispielmaße darstellen. Diese können, ohne sich vom Kern der vorliegenden Erfindung zu entfernen, vom Fachmann in Anbetracht der konkreten Anwendung angepasst werden. Insbesondere in Fällen, in denen hohe PCV-Werte zu erwarten sind, kann das Volumen des Messbereichs II größer gestaltet werden. In Fällen, in denen Kulturen besonders großer Zellen untersucht werden sollen, kann beispielsweise die lichte Weite der Kapillare des Messbereichs II entsprechend groß gestaltet werden. Umgekehrtes gilt selbstverständlich analog für Fälle besonders kleiner Zellen und/oder geringer erwarteter PCV-Werte. - Das PCV-Röhrchen ist wenigstens in seinem Messbereich II aus transparentem Material, vorzugsweise aus transparentem Kunststoff, insbesondere aus einem transparenten Polycabonat gefertigt. Bei der in
1 und2 dargestellten, besonders vorteilhaften Ausführungsform sind angrenzend an den Messbereich II und den Übergangsbereich Ib zwei Stabilisierungsflügel12 vorgesehen. Die Stabilisierungsflügel12 sind vorzugsweise einstückig mit den Außenwänden des Messbereichs II und des Übergangsbereichs Ib ausgebildet und verlaufen so, dass wenigstens bei einer gegebenen Orientierung des PCV-Röhrchens10 ein unverstellter Blick auf den Messbereich II möglich ist. Obgleich bei der in den1 und2 dargestellten Ausführungsform zwei Stabilisierungsflügel12 dargestellt sind, ist ihre Anzahl grundsätzlich nicht beschränkt. Auch könnte es sich anstelle von Flügeln12 um einen oder mehrere Stabilisierungskörper, beispielsweise in zylindrischer Fortsetzung des Hauptsaufnahmebereichs Ia handeln. Wichtig ist jedoch die unverstellte Einsichtmöglichkeit in wenigstens einer Orientierung des PCV-Röhrchens10 . - Zur Durchführung einer PCV-Bestimmung wird zunächst eine ggf. geeignet angefärbte Zellsuspension in dem PCV-Röhrchen
10 zentrifugiert. Als besonders günstig hat sich eine Zentrifugation bei etwa 2500 g über ca. 1 min ergeben. Deutlich geringere relative Zentrifugalkräfte und/oder kürzere Zentrifugationszeiten führen zu einer nicht ausreichenden Verdichtung des Zellkuchens. Bei deutlich größeren relativen Zentrifugalkräften beobachtet man dagegen eine Reexpansion des Zellkuchens nach Abschluss des Zentrifugationsschrittes. Dies führt zu unerwünschten Messungenauigkeiten. Deutlich längere Zentrifugationszeiten führen zu keiner nennenswerten Verdichtungsverbesserung oder Reproduzierbarkeit des Ergebnisses und sind daher aufgrund der unmittelbar mit ihnen verbundenen Verlängerung der Verfahrensdauer nicht sinnvoll. Es sei allerdings erwähnt, dass besondere Zelltypen zur Ergebnisoptimierung andere Zentrifugationsparameter erfordern. Eine entsprechende Auswahl zu treffen, liegt im Bereich des durchschnittlichen Fachmannkönnens. -
3 zeigt den Messbereich II eines PCV-Röhrchen10 in vergrößerter, schematischer Darstellung. Im unteren Bereich der Kapillare hat sich während der Zentrifugation ein Zellkuchen13 abgesetzt. Der Zellkuchen13 ist in drei Abschnitte unterschiedlicher Höhen unterteilt. In einem ersten Zellkuchenabschnitt131 , der sich aufgrund der hohen Dichte des ihn bildenden Materials im unteren Bereich der Kapillare11 absetzt, befinden sich die vollständig intakten Zellen. In einem weiteren Bereich133 , der aufgrund der besonders niedrigen Dichte des ihn bildenden Materials den obersten Bereich des Zellkuchens13 bildet, sind abgestorbene Zellen und Zellfragmente enthalten. Zwischen den Bereichen131 und133 erstreckt sich ein Bereich132 , der diejenigen Zellen enthält, deren Viabilitätsgrad zwischen vollständig intakt und vollständig abgestorben liegt. Die verschiedenen Bereich lassen sich bei geeigneter Anfärbung der Zellsuspension mit einem sog. Viabilitätsfarbstoff optisch unterscheiden. Allein die Skalenspreizung im Messbereich als Resultat des erfindungsgemäßen Probengefäßes erlaubt es diese Unterschiede auch zu messen. - Da es sich hierbei um z.T. geringe optische Unterschiede handelt, ist eine sehr gute Beleuchtung zweckmäßig. Wie zuvor erläutert kann diese durch einfaches Anleuchten des Probengefäßes mit Beleuchtungslicht erfolgen. Dies birgt jedoch die Gefahr unerwünschter Reflexionen an der äußeren Gefäßwand.
-
4 zeigt ein erfindungsgemäßes Probengefäßes, das eine besonders vorteilhafte Art der Beleuchtung ermöglicht. Dargestellt ist der untere Teil der Kapillare11 , die den Messbereich II bildet. Schematisch gezeigt sind die Kapillarwand110 mit einer Außenfläche111 und einer Innenfläche112 . Die Kapillarwand112 umschließt den Innenbereich114 , der mit dem in4 nicht dargestellten Zellkuchen gefüllt ist. Der Innenbereich114 läuft bei der dargestellten Ausführungsform in einer Spitze aus, was vorwiegend herstellungstechnisch bedingt ist. Die Außenseite der Kapillarwand110 ist im Bereich der Spitze jedoch abgeflacht und bildet eine Lichteinkoppelfläche116 , durch die Licht202 einer Lichtquelle200 in die Kapillarwand110 eindringen kann. Bei korrekter Wahl von Brechungsindex und Einkoppelwinkel, die der Fachmann anhand von bekannten optischen Gesetzmäßigkeiten ableiten kann, erfährt das eingekoppelte Licht202 Totalreflexion. Die Totalreflexion ist an der Außenfläche111 der Kapillarwand aufgrund des großen Brechungsindexunterschiedes zur umgebenden Luft nahezu perfekt. An der Innenfläche112 der Kapillarwand jedoch, die die Grenzfläche zu dem Zellkuchen darstellt, der optisch dichter als die Umgebungsluft ist, werden Teile des Lichtes202 in den Innenraum114 der Kapillare ausgekoppelt. Dies entspricht einer Beleuchtung des Zellkuchens. Das ausgekoppelte Licht204 wird im Zellkuchen gestreut und/oder wenigstens teilweise absorbiert und unter Winkeln, die keine Totalreflexion erzeugen, durch die Kapillarwand nach außen gesendet (in4 nicht dargestellt), wo es mit dem Auge oder einem geeigneten Photodetektor detektiert werden kann. Bei der gezeigten Ausführungsform dient somit die Kapillarwand110 als Lichtleiter für das Beleuchtungslicht, das den Zellkuchen senkrecht zu seiner Höhe beleuchtet. - Dies ist insbesondere bei angefärbten Zellkuchen vorteilhaft, da eine Beleuchtung entlang der Zellkuchenachse wegen der starken Absorbtion zu unterschiedlichen Beleuchtungsstärken in den verschiedenen Zellkuchenabschnitten führen würde. Die Beleuchtung senkrecht zur Zellkuchenachse durch die Kapillarwand hindurch hat hingegen die oben bereits geschilderten Reflexionsnachteile.
- Alternativ oder zusätzlich ist auch eine entsprechende Beleuchtung von oben möglich, wobei der ringförmige, obere Rand der Aufnahmebereichs I bei geeignet flach ausgebildeter Randfläche als Einkoppelfläche dienen kann.
- Natürlich stellen die in der speziellen Beschreibung diskutierten und in den Figuren gezeigten Ausführungsformen lediglich illustrative Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dar. Dem Fachmann steht ein weites Spektrum an Modifikationsmöglichkeiten zur Verfügung.
Claims (11)
- Probengefäß zur Zentrifugation einer Zellsuspension mit einem Messbereich (II), in dem sich nach Zentrifugation in der Probe vorhandenes, festes Material als verdichteter Zellkuchen (
13 ) ablagert, und mit einem Aufnahmebereich (I), in dem sich nach Zentrifugation flüssiger Überstand sammelt, wobei der Messbereich (II) als wenigstens sektorweise transparente Kapillare (11 ) ausgebildet ist, deren lichte Weite wesentlich geringer ist als die lichte Weite des Aufnahmebereichs (I), dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Lichteinkoppelfläche vorgesehen ist, über die Licht in die Wandung der Kapillare (11 ) und/oder des Aufnahmebereichs einkoppelbar ist. - Probengefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass am geschlossenen Ende der den Messbereich (II) umfassenden Kapillare (
11 ) eine Lichteinkoppelfläche (116 ) vorgesehen ist. - Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an der Innenwand (
112 ) der Kapillare (11 ) eine oder mehrere Lichtauskoppelflächen vorgesehen sind. - Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare (
11 ) einen inneren Durchmesser von etwa 500 Mikrometern aufweist. - Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare (
11 ) ein Volumen von 1 bis 10 Mikrolitern, insbesondere 2 bis 7 Mikrolitern, insbesondere von etwa 5 Mikrolitern aufweist. - Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Messbereich (II) und/oder der Aufnahmebereich (I) jeweils einen über ihre Höhe im Wesentlichen gleich bleibenden Querschnitt aufweisen.
- Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass seine Wandung (
110 ) aus einem transparenten Material, insbesondere einem transparenten Kunststoff, insbesondere aus einem transparenten Polycarbonat besteht. - Probengefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass seitlich an die den Messbereich (II) umfassende Kapillare (
11 ) ein oder mehrere Stabilisierungskörper (12 ) angeformt sind. - Probengefäß nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Stabilisierungskörper eine Mehrzahl von Stabilisierungsflügeln (
12 ) vorgesehen sind. - Probengefäß nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Stabilisierungskörper (
12 ) so angeordnet sind, dass in wenigstens einer Orientierung des Probengefäßes eine senkrechte Sichtlinie auf den Messbereich unverstellt ist. - Probengefäß nach einem der Ansprüche 4 bis 10, soweit rückbezogen auf Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Lichtauskoppelflächen im Bereich der Stabilisierungskörper befinden.
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