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Die
Erfindung betrifft die Identifizierung von Infektionserregern, insbesondere
von Viren, Bakterien und anderen Mikroorganismen,.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die Erreger aus Körperflüssigkeiten
nach Abscheiden anhand einer massenspektrometrischen Messung ihrer
Proteinprofile mit Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) direkt identifiziert werden können,
ohne sie vorher in fremden Nährmedien zu kultivieren. Mit
diesem Verfahren lassen sich Erreger akuter Infektionen in der Regel
in weniger als einer Stunde bestimmen.
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Stand der Technik
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Viele
Arten von Mikroorganismen (im Folgenden auch Mikroben genannt),
insbesondere Bakterien und einzellige Pilze, lassen sich nach einem jüngst
eingeführten Verfahren sehr leicht massenspektrometrisch
identifizieren, indem von einer Kolonie, die in üblicher
Weise auf einem Nährmedium gezüchtet wurde, kleine
Mengen von Mikroben auf eine massenspektrometrischen Probenträgerplatte übertragen
und dort direkt massenspektrometrisch vermessen werden. Das Massenspektrum
gibt insbesondere die verschieden schweren Proteine wieder, soweit
sie mit genügender Konzentration in den Mikroben vorhanden
sind. Aus diesem Proteinprofil der Mikroben wird über Spektrenbibliotheken
mit Tausenden von Referenzspektren ihre Identität festgestellt.
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Das
Nährmedium befindet sich gewöhnlich in einer feuchten
Gelatine in einer Petrischale, wodurch in üblicher Weise
je nach Wachstumskraft der Mikroben in etwa sechs bis zwanzig Stunden
eine Züchtung von jeweils reinen Stämmen in getrennten Mikrobenkolonien
erreicht wird. Überlagern oder mischen sich die Kolonien,
so können in wiederum üblicher Weise in einer
zweiten Züchtung reine Kolonien gewonnen werden. Die mit
einem kleinen Spatel aus einer ausgewählten Kolonie auf
den massenspektrometrischen Probenträger übertragene
Mikrobenmenge wird dann mit einer Lösung einer fachüblichen
Matrixsubstanz für eine Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) beträufelt. In der Regel dringt
das organische Lösungsmittel der Matrixlösung
in die mikrobiellen Zellen ein und zerstört diese. Anschließend
erfolgt die Trocknung der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels,
wodurch eine Kristallisation des gelösten Matrixmaterials
eintritt. Lösliche Proteine, in geringem Umfang auch andere
Substanzen der Zelle, werden dabei in die Matrixkristalle eingebaut.
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Die
Matrixkristalle mit den eingebauten Analytmolekülen werden
in einem Massenspektrometer mit Laserlichtblitzen beschossen, wobei
Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer
nach Ionenmassen getrennt gemessen werden können. Vorzugsweise
werden zu diesem Zweck Flugzeitmassenspektrometer verwendet. Das
Massenspektrum ist das Profil der Massenwerte dieser Analytionen.
Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um Proteinionen, wobei sich
die nützlichste Information im Massenbereich von etwa 3000
Dalton bis 15000 Dalton findet. Die Proteinionen sind in aller Regel
bei diesem Verfahren nur einfach geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb
hier auch einfach von der Masse m der Ionen gesprochen werden kann,
statt immer nur den Begriff der „ladungsbezogenen Masse"
m/z zu verwenden, wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig
und üblich ist.
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Dieses
Profil der Proteine ist sehr charakteristisch für die betreffende
Mikrobenart, weil jede Mikrobenart ihre eigenen, genetisch vorgegebenen Proteine
mit jeweils charakteristischen Massen produziert. Die Proteinprofile
sind ähnlich charakteristisch für die Mikroben
wie Fingerabdrücke für den Menschen. Heute wird
an vielen Orten an zuverlässigen, medizinisch und rechtlich
verwendbaren (so genannt „validierten") massenspektrometrischen
Bibliotheken der Massenspektren von Proteinprofilen der Mikroben
gearbeitet, darunter auch an zentralen staatlichen Einrichtungen
für Krankheitsüberwachung und -Prävention.
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Dieses
Verfahren der Identifizierung hat sich als außerordentlich
erfolgreich erwiesen. Die Sicherheit für eine richtige
Identifizierung ist weit größer als diejenige
der bisher angewandten mikrobiologischen Identifizierungsverfahren.
Es konnte nachgewiesen werden, dass über Hunderte von verschiedenartigen Mikroben
hinweg die Sicherheit der Identifizierung bei weit über
95 Prozent lag. Dabei hat sich herausgestellt, dass diese Sicherheit
schwer richtig zu bestimmen ist, weil die Mikroben aus Sammlungen
bekannter Sammelstellen in nicht wenigen Fällen falsch identifiziert
sind. Letztendlich hilft nur die genetische Sequenzierung, eine
zweifelsfrei richtige Identifizierung durchzuführen, und
diese bestätigt ganz überwiegend die massenspektrometrische
Identifizierung.
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Es
können mit diesem einfachen Verfahren sogar in vielen Fällen
eng verwandte Unterarten von Mikroben auseinander gehalten werden,
da die Ausstattung der Mikroben mit Proteinen genetisch vorgegeben
ist und in den Unterarten eindeutig variieren kann. Kleine Veränderungen
im genetischen Bauplan erzeugen zwingend anders aufgebaute Proteine,
deren Massen verschieden sind von den genetisch unverändert
gebauten Proteinen; sie ergeben somit ein anderes Proteinprofil,
wenn ihre Konzentration in den Mikroben hoch genug ist für
ein massenspektrometrisch verwertbares Signal. Es konnten bereits
taxonomisch neue Einordnungen von Mikroben auf diese Weise vorgenommen
werden.
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Sind
für die exakten Spezies (Arten) der untersuchten Mikroben
keine Referenzmassenspektren in einer Bibliothek vorhanden (was
wegen der Millionen von Mikrobenarten und der beschränkten
Größe der bisherigen Spektrenbibliotheken immer
wieder vorkommt), so können Bibliothekssuchen mit geringeren Ähnlichkeitsanforderungen
zumindest Hinweise auf die Ordnung, Familie oder Gattung der Mikroben
geben, da für verwandte Mikroben häufig eine Anzahl
der darin enthaltenen Proteinarten identisch ist.
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Für
die Proteinionen identischer Mikrobenarten sind naturgemäß die
Massen immer gleich und daher streng reproduzierbar, die Intensitäten
der Proteinsignale dagegen nur grob. Die Verwendung verschiedener
Nährmedien für die Züchtung ist von Einfluss
auf den Stoffwechsel der Mikroben und damit von Einfluss auf die
Erzeugung der verschiedenen Proteine, damit auf ihre Konzentration
und ihre Intensität im Proteinprofil. Der Einfluss ist
allerdings nicht stark. Die Intensitätsschwankungen stören
die Identifizierung nicht, wenn die Computerprogramme darauf abgestimmt
sind. Ebenso wirkt sich der Reifegrad der Kolonien nur auf die Intensitäten
der Proteinsignale zueinander in den Massenspektren aus, allerdings
auch hier nur geringfügig. Charakteristisch verschiedenartige
Massenspektren für die gleiche Mikrobenart gibt es eigentlich
nur bei solchen Mikroben, die verschiedene Lebensformen ausbilden
können wie beispielsweise Sporenbildner: die Sporen zeigen andere
Proteinprofile als die normalen Zellen. Bei der Verwendung frisch
gezüchteter Mikroben fällt dieser Unterschied
jedoch nicht ins Gewicht.
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Die
Computerprogramme zur Bibliothekssuche durch Spektrenvergleiche
nehmen Intensitätsschwankungen in Kauf, die Intensitäten
spielen hier eine nur untergeordnete Rolle. Wie schon oben angemerkt,
ist die Identifizierung der Mikroben mit diesen Programmen sehr
sicher,. Die Programme arbeiten ohne eine individuelle Identifizierung
der beteiligten Proteine (die über Fragmentionenspektren
vorgenommen werden könnte) nur über die Ähnlichkeit
der Massenspektren, wobei die Massen streng und die Intensitäten
weit weniger streng in die Ähnlichkeitssuche eingehen.
Im Einzelnen können sogar einige Proteine in Massenspektren
fehlen (sehr geringe Intensität), ohne dass dies die Ähnlichkeitsbestimmung stört:
Es genügt für die Identifizierung die Übereinstimmung
der Massenwerte für eine überwiegende Anzahl an
Proteinen, wobei die Bibliotheksspektren dabei auch Auskünfte
darüber speichern können, welche Proteinsignale
auf jeden Fall vorhanden sein müssen, beispielsweise über
die Speicherung von Schwellenwerten für die Intensitäten
oder auch über Auftrittswahrscheinlichkeiten der betreffenden
Proteinsignale bei häufig wiederholten Spektrenaufnahmen.
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Die
Referenzspektren in den Spektrenbibliotheken können für
die einzelnen Proteinsignale jeweils beispielsweise Massen, Massentoleranzen, mittlere
Intensitäten, Streuung der Intensitäten und Auftrittswahrscheinlichkeiten
enthalten. Die Referenzspektren werden für gewöhnlich
aus häufig durchgeführten Rohmessungen, möglichst
an verschiedenen Züchtungen, durch automatische Computerauswertung
gewonnen; sie können jedoch auch unter Zuziehung weiteren
Wissens über die Mikroben weiter reduziert werden (siehe
beispielsweise die Offenlegungsschriften
DE 100 38 694 A1 und
DE 103 00 743 A1 ,
W. Kallow et al.).
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Das
oben kurz geschilderte Verfahren des Aufschmierens von einigen Mikroben
aus einer Kolonie mit einem kleinen Spatel auf einen reservierten Fleck
eines massenspektrometrischen Probenträgers mit anschließendem
Beträufeln mit einer Matrixlösung ist die einfachste
und bisher schnellste Art der Probenvorbereitung. Für die
Verwendung in Routinelabors kann das Verfahren mit Hilfe von bild-erkennenden
Pipettierrobotern auch automatisiert werden. Nach dem Züchten
einer gerade eben sichtbaren Kolonie dauert es nur ein bis zwei
Stunden bis zur vollständigen Identifizierung, selbst wenn
gleichzeitig Hunderte von Proben analysiert werden. Es sind massenspektrometrische
Probenträger für jeweils 96 oder 384 Proben im
Handel; die Aufnahme dieser Massenspektren dauert etwa eine halbe
bis zwei Stunden. Für Eilaufträge können
einzelne Mikrobenproben (allerdings nach der stets zeitraubenden
Kultivierung) in wenigen Minuten identifiziert werden.
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Es
sind auch andere Verfahren der Probenvorbereitung untersucht worden,
wie Extraktion der Proteine nach Zerstörung der Mikroben
durch Beschallung, oder Extraktionsverfahren für die Proteine nach
Auflösung der manchmal harten Zellwände durch
scharfe Säuren. Diese Aufschlussverfahren werden angewendet,
wenn das normale Verfahren des Aufschmierens versagt, weil die Zellwände
der Mikroben durch das Auftröpfeln der Matrixlösung nicht
zerstört werden. Lassen sich mit den Aufschmierverfahren
genügend gute Massenspektren für einen Vergleich
erzeugen, so liefern die Aufschlussverfahren durchweg sehr ähnliche
Spektren wie die Aufschmierverfahren, sie zeigen häufig
sogar einen geringeren Störuntergrund in den Massenspektren.
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Die
Massenspektren der Mikroben-Proteine werden heute aus Gründen
besonders hohen Nachweisvermögens im linearen Betrieb von
Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, obwohl die Massenauflösung
und die Massenrichtigkeit der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern
im Reflektorbetrieb deutlich besser ist. Im Reflektorbetrieb erscheinen
aber nur etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, und das Nachweisvermögen
ist um ein bis zwei Zehnerpotenzen schlechter. Die hohe Empfindlichkeit beruht
darauf, dass im linearen Betrieb eines Flugzeitmassenspektrometers
nicht nur die stabilen Ionen nachgewiesen werden, sondern auch die
Fragmentionen aus so genannten „metastabilen" Zerfällen
der Ionen. Für die Messung der Ionen werden Sekundärelektronenverstärker
(SEV) eingesetzt, wodurch sogar die Neutralteilchen, die unterwegs
aus Ionenzerfüllen entstanden sind, mit dem Ionendetektor
gemessen werden, da auch sie beim Aufprall Sekundärelektronen
erzeugen. Alle diese Fragmentionen und Neutralteilchen, die aus
einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit
wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen
Zeit. Die Ankunftszeit ist ein Maß für die Masse
der ursprünglich unzerfallenen Ionen.
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Das
erhöhte Nachweisvermögen ist für viele Anwendungen
so entscheidend, dass man viele der Nachteile des linearen Betriebsmodus
der Flugzeitmassenspektrometer, wie beispielsweise eine wesentlich
geringere Massenauflösung, in Kauf nimmt. Für
diese Anwendungen erhöht man die Energie des desorbierenden
und ionisierenden Lasers, wodurch die Ausbeute an Ionen steigt,
aber auch ihre Instabilität, die jedoch hier nicht stört.
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Die
Aufnahme von Massenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern erfordert
im Allgemeinen die zeitlich schnell aufeinander folgende Aufnahme
und Digitalisierung sehr vieler Einzelspektren, die üblicherweise
durch Addition flugzeitgleicher Messpunkte zu einem Summenspektrum
aufaddiert werden. Die Ionen für jedes Einzelspektrum werden
jeweils durch einen Laserschuss eines UV-Pulslasers erzeugt. Dieses
Vorgehen der Erzeugung von Summenspektren wird durch die geringe
Messdynamik im Einzelspektrum erzwungen. Es werden dabei mindestens
etwa 50, in einigen Fällen auch 1000 und mehr Einzelspektren
aufgenommen; im Allgemeinen besteht ein Summenspektrum aus einigen
Hundert Einzelspektren, die in modernen Massenspektrometern in wenigen
Sekunden aufgenommen und addiert sind. Die Gesamtdauer für
die Aufnahme eines Summenspektrums hängt von der Anzahl
der Einzelspektren und der Schussfrequenz des verwendeten Lasers
ab. Es sind heute Laser mit 20 Hertz bis 2 Kilohertz für
diesen Zweck im Einsatz, bei Anwendung mittelschneller Verfahren
dauert die Aufnahme eines guten Summenspektrums etwa 2 bis 20 Sekunden.
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In
den oben geschilderten Anwendungsgebieten werden Massenspektren
von etwa 1000 Dalton an bis in hohe Massenbereiche von beispielsweise
20 000 Dalton gemessen, wobei sich zeigt, dass die Massensignale
im unteren Massenbereich bis zu etwa 2500 Dalton nicht gut verwertbar
sind, weil sie von außen angelagerten Hüllpeptiden
und anderen eher zufällig und variabel vorhandenen Substanzen stammen.
Die besten Identifizierungsergebnisse erhält man, wenn
man nur die Massensignale im Massenbereich von etwa 3000 bis 15
000 Dalton auswertet. Aus den genannten Gründen geringer
Massenauflösung können in diesem Massenbereich
die Isotopengruppen nicht mehr aufgelöst werden. Die Isotopengruppen
bestehen aus Ionensignalen, die sich jeweils um ein Dalton unterscheiden.
Es werden daher nur die Einhüllenden der Isotopengruppen
gemessen. Es sind aber auch massenspektrometrische Messver fahren
bekannt geworden, die eine höhere Auflösung und
eine höhere Massengenauigkeit bieten; es ist aber noch
nicht bekannt, ob sich damit vergleichbare Empfindlichkeiten erzielen
lassen.
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Dieses
Verfahren der Identifizierung von Mikroben verlangt für
gewöhnlich eine reine Kultur von Mikroben, um ein Massenspektrum
ohne Überlagerungen mit Signalen anderer Mikroben zu erhalten. Es
hat sich jedoch gezeigt, dass auch Massenspektren von Mischungen
aus zwei Mikrobenarten ausgewertet werden können, und dass
beide Mikrobenarten identifiziert werden. Die Identifizierungssicherheit leidet
nur geringfügig. Sind mehr als zwei Mikrobenarten am Massenspektrum
beteiligt, so sinken Identifizierungswahrscheinlichkeit und Identifizierungssicherheit
sehr stark ab.
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Das
Verfahren der einfachen Identifizierung von Mikroben kann Anwendungen
in vielen Gebieten finden, so beispielsweise in der Trinkwasserüberwachung
oder der Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelherstellung.
Bei der Nahrungsmittelherstellung entscheiden die Arten der vorhandenen
Mikroorganismen über die schadlose Genießbarkeit
der Nahrungsmittel. Es sei hier nur an schädliche Staphylokokken,
Streptokokken oder Salmonellen erinnert, die durch stete Kontrollen
gefunden werden müssen. Andererseits können Bier,
Wein, Käse oder Joghurt nicht ohne den nützlichen
Einsatz von Milliarden von Mikroben erzeugt werden. Die Reinheit
der Stämme ist für diesen Einsatz entscheidend.
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Eine
strenge Überwachung ist auch auf medizinischem Gebiet erforderlich.
Infektionserreger müssen aus Hospitälern ferngehalten
werden. Für Operationsräume ist beispielsweise
eine ständige Überwachung der vorkommenden Mikroben
mit Identifizierung zwingend gesetzlich vorgeschrieben.
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Eine
besondere Rolle spielt die Identifizierung der Mikroben bei infektiösen
Krankheiten. Hier ist es wichtig, die Identifizierung von Erregertypen sehr
schnell vornehmen zu können, damit sofort medizinisch richtig
reagiert werden kann. Das Verfahren der massenspektrometrischen
Identifizierung ist trotz der vorgeschalteten Kultivierung der Mikroben
um ein bis zwei Tage schneller als das der bisher angewandten mikrobiologischen
Verfahren. Es nimmt aber immer noch etwa 12 bis 24 Stunden in Anspruch,
und kann, wenn eine zweite Kultivierung notwendig werden sollte,
sogar noch wesentlich länger dauern. Für viele
Anwendungen, besonders bei akuten Infektionen, ist diese Zeit zu
lang, und es wird dringend nach schnelleren Verfahren gesucht.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit
dem sich Infektionserreger in Körperflüssigkeiten
sehr viel schneller als bisher, möglichst innerhalb von
nur etwa einer Stunde, identifizieren lassen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung beruht auf der an sich erstaunlichen Erkenntnis, dass
akute mikrobielle Infektionen in Körperflüssigkeiten
in den weitaus meisten Fällen (weit über 70 Prozent)
auf nur eine einzige Mikrobenart zurückgehen, die alle
anderen Mikrobenarten überwuchert hat, und dass diese Mikroben
durchwegs in sehr hohen Konzentrationen von etwa 104 bis 108 Mikroben pro Milliliter vorhanden sind.
In einem geringen Prozentsatz von etwa 15 Prozent sind zwei Mikrobenarten
so beteiligt, dass beide in den Massenspektren zu erkennen sind.
Diese Artenreinheit der Erreger akuter Infektionen steht im scharfen
Gegensatz zum sonstigen Vorkommen von Mikroben in oder auf dem menschlichen
Körper, so sind beispielsweise die etwa 1014 Bakterien
der Darmflora in einem menschlichen Darm auf mindestens 400 Bakterienarten
verteilt, die miteinander in einem Gleichgewicht leben.
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Die
Erfindung besteht nun darin, diese akuten Erreger der Infektion
direkt aus dieser Körperflüssigkeit auszuscheiden,
beispielsweise durch 5- bis 10-minütiges Zentrifugieren
bei etwa mindestens 10 000 rpm, und, gegebenenfalls nach einem optionalen Waschschritt
mit nochmaligem Zentrifugieren, die Mikroben des abgeschiedenen
Pellets der massenspektrometrischen Analyse zuzuführen.
Man hat es dann aus obig dargelegten Gründen überwiegend
mit Massenspektren einer einzigen Mikrobenart zu tun, seltener mit
Spektren von Mischungen aus zwei Mikrobenarten; nur in wenigen Fällen
sind die Massenspektren wegen des Vorkommens von mehr als zwei Mikrobenarten
nicht mehr auswertbar. Die Massenspektren lassen sich daher in der
Regel gut auswerten; das Verfahren ist extrem schnell. Es kann bei
sofortiger Verfügbarkeit eines Massenspektrometers und
zeitoptimiertem Arbeiten in etwa zwanzig Minuten durchgeführt
werden.
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Dieses
Verfahren kann unmittelbar und mit gutem Erfolg auf alle klaren
Körperflüssigkeiten wie Urin, Tränenflüssigkeit,
Nasenausfluss, Lymphe, Gelenkflüssigkeit oder Liquor angewandt
werden. Bei Körperflüssigkeiten, die Humanpartikel
enthalten, wie beispielsweise Vollblut oder Abszesssekret, kann ein
Zwischenschritt zur Zerstörung der Partikel eingeschaltet
werden.
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Bei
akuten Infektionen sind die Mikroben meist in großer Zahl
vorhanden, beispielsweise gibt es bei einer Harnwegs- oder Nierenentzündung
etwa 105 bis 107 Mikroben
in einem Milliliter Urin. Da für eine massenspektrometrische
Analyse nur etwa 103 bis 104 Mikroben
benötigt werden, können hier durch Zentrifugieren
sofort genügende Mengen an Mikroben für eine massenspektrometrische
Identifizierung gewonnen werden.
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Sind
mehr als 105 Mikroben in der zentrifugierten
Probe vorhanden, so sind die Ablagerungs-Pellets mit dem bloßen
Auge sichtbar. Sind weniger Mikroben in der Körperflüssigkeit,
so können mit gutem Erfolg schnelle Extraktionsverfahren
auf die dann nicht sichtbaren Pellets angewandt werden. Die Extraktionsverfahren
(Aufschlussverfahren) für die Proteine der Mikroben sind
ebenfalls sehr schnell, sie addieren nur wenige Minuten zur gesamten
Analysezeit.
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Es
können aber auch die Mikroben mit geeigneten Maßnahmen
und Zusätzen direkt in der Körperflüssigkeit
nachgezüchtet werden, wie es beispielsweise als „Blutkultur"
direkt durch Inkubieren der Vollblutbeutel bekannt ist. Dieses Züchten
ist bedeutend schneller als das Züchten von Kulturen in Petri-Schalen,
und kann, besonders bei starken Infektionen, oft bereits innerhalb
von einer Stunde genügend Mikroben für die Identifizierung
zur Verfügung stellen.
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Akute
Infektionen können aber auch durch Viren, Chlamydien und
Rikettsien erzeugt werden, die sich alle nicht in einer Kultur auf
Nährmedien züchten lassen, weil sie sich nur in
Wirtszellen vermehren können. Bei akuten Infektionen kommen
bestimmte Formen dieser Infekti onserreger in extrem hohen Anzahlen
in Körperflüssigkeiten vor und lassen sich trotz
ihrer Kleinheit gut durch Ultrazentrifugieren abscheiden; es ist
daher zu erwarten, dass sie sich über ihre spezifischen
Proteine auch durch das erfindungsgemäße Verfahren
identifizieren lassen. Die Viren kommen in Körperflüssigkeiten
in Form von Virionen vor, die sehr charakteristische Hüllproteine in
Form eines Kapsids besitzen, innerhalb dessen die eingerollte RNA
oder DNA der Viren aufbewahrt wird. Durch die spezifischen Proteine
des Kapsids und die manchmal zusätzlich vorkommenden Lipoproteine einer
Lipoproteinhülle können sie massenspektrometrisch
identifiziert werden. Chlamydien kommen in der Körperflüssigkeit
in Form so genannter Elementarkörperchen vor; sie und auch ähnliche
Formen der Rikettsien tragen jeweils eigene Proteine.
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Viren
können aber auch durch massenspektrometrischen Nachweis
ihrer RNA oder DNA nachgewiesen werden, wenn diese durch besondere
Verfahren mit enzymatischem Verdau aufgeschlossen werden.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren für die Identifizierung
von mikrobiellen Infektionserregern in Körperflüssigkeiten
zur Verfügung, das wesentlich einfacher und schneller ist
als bisherige Verfahren, die stets über eine Kultivierung
der Mikroben ablaufen. Es ist zu erwarten, dass das erfindungsgemäße Verfahren
sogar für Viren, Chlamydien und Rikettsien angewendet werden
kann, für die eine Züchtung von Kolonien auf Nährmedien
unmöglich ist, weil sie sich nur in Wirtszellen vermehren.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin,
aus einer Körperflüssigkeit, in der eine Infektion
vermutet wird, die Mikroben (einschließlich der Viren)
abzutrennen, zum Beispiel durch Filtrieren oder Zentrifugieren,
und die abgetrennten Mikroben einer massenspektrometrischen Identifizierung
zuzuführen. Dabei können die abgetrennten Mikroben
direkt auf eine vorgegebene Stelle des Probenträgers aufgeschmiert
werden, oder es können die abgetrennten Mikroben vor der
massenspektrometrischen Analyse einem Extraktionsverfahren für
die in ihnen enthaltenen Proteine unterzogen werden. Das Extraktionsverfahren
wird auch Aufschlussverfahren genannt.
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Das
Massenspektrum stellt im Wesentlichen das Profil der löslichen
Proteine der Mikroben dar, die nicht löslichen Zellwandproteine
der Mikroben sind im Allgemeinen nicht im Massenspektrum sichtbar. Die
Löslichkeit schwerer löslicher Proteine, beispielsweise
der Hüllproteine von Viren, kann durch besondere Lösungsmittel
erhöht werden. Es können dabei durchaus auch einige
Substanzen im Massenspektrum wiedergegeben werden, die nicht Proteine
sind; im Folgenden wird aber der Einfachheit halber von „Proteinprofilen"
gesprochen, die hier in den Massenspektren der Mikroben dargestellt
werden.
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Das
Abtrennen der Mikroben geschieht am einfachsten über ein
kurzes 5- bis 10-minütiges Zentrifugieren. Viren bedürfen
dabei der höheren Kraft einer Ultrazentrifuge. Der abgesetzte
Mikrobenkuchen (das „Pellet") kann dann noch ein- oder
zweimal gewaschen werden, um assoziierte Proteine aus der Körperflüssigkeit
und andere Verunreinigungen weitgehend zu entfernen, wobei nach
jedem Waschschritt ein weiteres Zentrifugieren eingeschaltet wird. Ist
das Pellet mit dem bloßen Auge sichtbar, so kann man davon
ausgehen, dass mindestens etwa 100 000 Mikroben enthalten sind,
und dass ein einfaches Aufschmieren der Probe auf den Probenträger
bereits zu einer erfolgreichen Identifizierung führt. Die abgetrennten
Mikroben können dann mit einem kleinen Spatel auf einen
massenspektrometrischen Probenträger aufgebracht, mit Matrixlösung
beträufelt und nach Trocknung und Auskristallisieren der
Matrixsubstanz dem Massenspektrometer zugeführt werden.
Die Matrixlösung dringt dabei in die Mikroben ein und bringt
sie durch osmotische Effekte zum Platzen. Beim Trocknen dieser Proben
entstehen kleine Kristalle der Matrixsubstanz, in diese werden bei
der Kristallisation die Analytmoleküle, also die Proteine,
eingebaut.
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Es
gibt einige Mikrobenarten, deren Zellwände so fest sind,
dass sie nicht durch die Osmose unter der Wirkung des organischen
Lösungsmittels der Matrixlösung zerstört
werden. Dann ist auf jeden Fall ein Aufschluss erforderlich, der
auch nur wenige Minuten in Anspruch nimmt. Ein Aufschluss ist ebenfalls erforderlich,
wenn sich die Mikroben des Pellets nicht einfach auf die Probenträgerplatte
aufschmieren lassen, beispielsweise weil die Mikroben einen schleimigen
Brei bilden, der nicht haften will.
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Bei
infektiösem Material ist besondere Vorsicht geboten, wie
dem Laborarzt bekannt ist. Wegen der Infektionsgefahr ist es daher
zweckmäßig, die Mikroben in geeigneter Weise abzutöten,
ohne dabei die Proteine so zu verändern, dass eine Identifizierung
anhand des Proteinprofils nicht mehr möglich ist. Auch
hier ist das nachfolgend geschilderte Extraktionsverfahren ein Weg
zu einer solchen abtötenden Hygienemaßnahme.
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Ist
das Pellet nicht sichtbar, so ist auf jeden Fall ein Aufschluss
empfehlenswert.
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Ein
Aufschluss kann beispielsweise dem folgenden Protokoll folgen: Man
nimmt das Pellet noch im Zentrifugierungsgefäß (beispielsweise
einem Eppendorf-Cup) unter vorsichtigem Umrühren mit einigen
Mikrolitern einer 70-prozentigen Ameisensäure auf, die
die oft sehr widerstandsfähigen Zellwände mindestens
stark schwächt, wenn nicht sogar zerstört. Nach
etwa einer Minute fügt man eine etwa gleiche Menge an Acetonitril
hinzu, wodurch die Zellwände endgültig zerstört
und die Proteine aus dem Inneren der Mikrobe gelöst werden.
Die Lösung wird nochmals zentrifugiert, um die festen Bestandteile wie
beispielsweise Zellwandfetzen abzusetzen. Der Überstand,
der jetzt die Proteine der Mikroben enthält, wird der massenspektrometrischen
Analyse zugeführt, indem er mit einer Pipette auf den massenspektrometrischen
Probenträger aufgetropft wird. Dabei können Probenträger
verwendet werden, die das Matrixmaterial bereits vorgefertigt in
Form dünner Kristallschichten enthalten, die durch das
zugegebene Acetonitril wieder teilweise angelöst werden. Dadurch
werden die Proteine beim Rekristallisieren während des
Trocknens wieder in die Kriställchen eingebaut, wie es
für das Ionisierungsverfahren erforderlich ist. Es kann
aber auch die Matrixlösung auf dem Probenträger
der Probe zugegeben werden, oder sogar in einfacher Weise der Probe
im Zentrifugiergefäß. Die Lösung mit
Probe und Matrixsubstanz wird dann auf vorgegebene Stellen des massenspektrometrischen
Probenträgers aufgeträufelt oder pipettiert, und
in wenigen Minuten an Luft, beispielsweise im warmen Luftstrom,
oder im Vakuumgefäß getrocknet.
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Neben
dieser Art des Aufschlusses durch chemische und physikalisch-chemische
Mittel wie Säuren oder Lösungsmittel kann ein
Aufschluss aber auch völlig anders erfolgen, zum Beispiel
durch eine Zerstörung der Zellwände mit physikalischen
Mitteln. So können die Zellwände durch Bestrahlung
mit akustischen Wellen, beispielsweise in einem Ultraschallbad, zerstört
werden. Auch mechanische Mittel können hier zum Einsatz
kommen, zum Beispiel ein Mikro-Pistill zum Zerdrücken oder
Zermahlen der Mikroben direkt im Zentrifugiergefäß.
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Dieses
Aufschlussverfahren liefert sehr reine und klare Massenspektren
ohne störenden Untergrund und nimmt nur wenige zusätzliche
Minuten in Anspruch, so dass man es leicht als Standardverfahren
verwenden kann, um auf das manchmal etwas lästige und möglicherweise
gefährliche „Aufschmieren" der unzerstörten
und noch lebenden, hoch infektiösen Mikroben völlig
zu verzichten. Bei sofortiger Verfügbarkeit des Massenspektrometers
ist eine Identifizierung in weniger als einer halben Stunde möglich.
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Die
Probenträger mit den trockenen Proben werden über
eine Vakuumschleuse in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers
eingeschleust. Die Matrixkristalle mit den eingebauten Analytmolekülen
werden dann im Massenspektrometer mit Laserlichtblitzen beschossen,
wobei in einem Verdampfungsplasma Ionen der Analytmoleküle
entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen getrennt
gemessen werden können. Vorzugsweise werden zu diesem Zweck
Flugzeitmassenspektrometer mit linearer Flugstrecke ohne Verwendung
eines Reflektors verwendet. Das Flugzeitmassenspektrometer trennt
die elektrisch beschleunigten Ionen auf, weil die schwereren Ionen
bei gleicher Energie durch gleiche Beschleunigung in einem elektrischen Feld
eine langsamere Fluggeschwindigkeit als die leichten Ionen besitzen.
Der Ionenstrom an einem Detektor am Ende der Flugstrecke registriert
daher direkt ein Massenspektrum von leichten nach schweren Ionen
als Funktion der Zeit, wobei die Zusammenhänge zwischen
Flugzeiten und Massen bekannt sind. Das Massenspektrum ist das Profil
der Massenwerte der genetisch vorgegebenen Proteine mit jeweils
charakteristischen Massen.
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Die
Massenspektren müssen dann mit Referenzspektren aus einer
Spektrenbibliothek verglichen und die Mikroben auf Grund von Ähnlichkeitskriterien zwischen
den Massenspektren identifiziert werden. Diese Verfahren gehören
zum Stand der Technik sind dem Fachmann bekannt. An zuverlässigen,
medizinisch und rechtlich verwendbaren (so genannt „validierten")
massenspektrometrischen Bibliotheken der Proteinprofile von Mikroben
wird an vielen Orten gearbeitet, darunter auch an zentralen staatlichen
Einrichtungen für Krankheitsüberwachung und -Prävention.
So sind inzwischen Bibliotheken mit Referenzspektren für
etwa 1500 Mikrobenarten und etwa 3000 Unterarten bekannt; diese
Bibliotheken werden aber täglich erweitert.
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Die
Erfindung beruht somit auf dem an sich bekannten Verfahren der massenspektrometrischen Bestimmung
der Mikroben, wird aber ohne die sonst stets anzuwendende und zeitaufwändige
Kultivierung der Mikroben auf einem fremden Nährmedium durchgeführt.
Die Erfindung gewinnt die Mikroben direkt aus der Körperflüssigkeit,
in der sie – im Gegensatz zu sonstigen Vorkommen von Mikroben
in oder auf dem menschlichen Körper – in genügender
Artenreinheit vorhanden sind.
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Das
Verfahren ist somit überraschend einfach; es beruht ganz
wesentlich auf der Erkenntnis, dass bei akuten Infektionen in der überwiegenden Anzahl
von Fällen nur eine oder höchstens zwei Arten
von Mikroben als Erreger in der Körperflüssigkeit oberhalb
der Messschwelle zu finden sind. Dadurch werden bei Abscheiden dieser
Mikroben aus der Flüssigkeit Mikrobenmengen gewonnen, die
einerseits genügend Probensubstanz für die Messung
zur Verfügung stellen und andererseits genügend
reine Mikrobenkulturen darstellen. Selbst bei Anwesenheit von zwei
Mikrobenarten arbeitet das Verfahren noch zufriedenstellend.
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Es
wird also mit diesem Verfahren die Reinigung der Mikrobenarten voneinander
eingespart, die sonst durch das zeitaufwändige Kultivieren
auf Nährmedien erzielt wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren hat in einigen Fällen
sogar Vorteile gegenüber der Reinigung von Mikrobenarten
durch Kultivieren, da es Mikrobenarten gibt, die sich nicht auf
den üblichen externen Nährmedien züchten
lassen, wie zum Beispiel die häufig vorkommenden und sehr
infektiösen Chlamydien oder die Rikettsien, die beide nur
in fremden Zellen gedeihen können. Chlamydien oder Rikettsien sind
Mikroben, die sich nur in Wirtszellen vermehren, aber in den Wirtszellen
im Gegensatz zu den Viren einen eigenen Stoffwechsel aufbauen. Chlamydien vermehren
sich nur in ihrer Form als Retikularkörperchen innerhalb
von Wirtszellen; außerhalb von Wirtszellen kommen sie nur
als so genannte Elementarkörperchen praktisch ohne jeden
Stoffwechsel vor. Sie können im Erststrahl des Harns oder
im Ausfluss des Genitalbereichs nachgewiesen werden, wenn sie als
Genital-Infektion vorliegen (weitaus häufigste Geschlechtskrankheit
in Europa). Chlamydien verursachen aber auch Augenkrankheiten (mit
Erblindung; in Afrika häufig) oder Lungenkrankheiten; sie
können in der Kniegelenks-Flüssigkeit und in vielen
anderen Organen als gefährliche Krankheitserreger gefunden werden,
die sich aber nicht einfach nachweisen lassen. Ihr Nachweis gelingt
heute meist nur über eine DNA-Sequenzierung nach PCR-Vervielfältigung; also
in einem zeitaufwändigen Verfahren.
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In
gleicher Weise können Viren in Form der Virionen aus Körperflüssigkeiten
durch Ultrazentrifugieren in so großen Mengen gewonnen
werden, dass sie der massenspektrometrischen Identifizierung zugeführt
werden können. Hier sind es hauptsächlich die
Hüllproteine des Kapsids und der manchmal vorhandenen,
zusätzlichen Lipoproteinhülle, die das Massenspektrum
tragen. Die Hüllproteine werden in der Wirtszelle eigens
durch das genetische Programm der Viren erzeugt, sie sind somit
sehr spezifisch für die einzelnen Virenarten. Es kann sich
dabei um dreißig und mehr verschiedenartige Proteine handeln,
die sich zu einer regelmäßig geformten Hülle
zusammenschließen. Die Hüllproteine bedürfen
eines besonderen Aufschlussverfahrens, um sie für den Einbau
in die Matrixkriställchen in Lösung zu bringen.
Die Lipoproteinhülle, die bei einigen Arten von Virionen
vorhanden ist, entsteht dann, wenn die in der Zelle gebildeten Virionen
durch bestimmte Ausstülpungen der Zellmembran in die Umgebung ausgeschleust
werden; dabei nehmen die Virionen die Lipoproteine mit.
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Die
Anwendbarkeit des Verfahrens auf Viren, Rikettsien und Chlamydien
gibt der Erfindung eine besondere, herausragende Bedeutung, da sich
diese nur sehr aufwändig mikrobiologisch identifizieren
lassen. Sie lassen sich nicht auf normalen Nährböden züchten,
sondern brauchen Wirtszellen zu ihrer Vermehrung. Die sichere mikrobiologische
Identifizierung läuft über eine DNA-Sequenzierung
und braucht häufig eine Woche und mehr, während
die massenspektrometrische Identifizierung nur Stunden oder weniger
braucht.
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Obwohl
die Viren nach heutigem Stand der Wissenschaft nicht zu den lebenden
Organismen gezählt werden, sollen sie im Folgenden in den
Bezeichnungen „Mikroben" und „Mikroorga nismen"
eingeschlossen sein. Die Rikettsien und besonders die Chlamydien,
die noch bis in die 70er Jahre hinein zu den Viren gezählt
wurden, gelten inzwischen offiziell als Mikroben.
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Als
Körperflüssigkeiten kommen in erster Linie die
klaren Flüssigkeiten zum Tragen. Zu diesen klaren Körperflüssigkeiten
gehören aus dem Körper ausgeschiedene Flüssigkeiten
wie Urin, Tränenflüssigkeit, Sputum und Nasensekret,
aber auch interne Körperflüssigkeiten wie Lymphe,
Gelenkflüssigkeit (durch Gelenkpunktion gewonnene Synovialflüssigkeit)
oder Liquor (durch Lumbalpunktion gewonnene Spinalflüssigkeit).
In diesen Flüssigkeiten befinden sich bei akuten Infektionen
hohe Mengen an Mikroben im Bereich von 104 bis
108 Mikroben pro Milliliter. Enthalten die
Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Nasensekret, Anteile von
schleimigen Substanzen (gewöhnlich Proteinlösungen),
so können sie mit geeigneten Flüssigkeiten verdünnt
werden, um die Abscheidung der Mikroben zu erleichtern.
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Aus
Urin können zum Beispiel die Erreger der Harnwegsentzündungen
erkannt werden. Im Liquor kann man die 20 bis 30 verschiedenartigen
Erreger der Meninghitis (Hirnhautentzündung) finden.
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Partikelreiche
Körperflüssigkeiten, wie Vollblut, Eiter oder
trübe Ausflüsse, sind ebenfalls diesem erfindungsgemäßen
Verfahren zugänglich, erfordern aber zusätzliche
Schritte, um die Partikel zu zerstören und zu entfernen.
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Auf
infiziertes Vollblut lässt sich das Verfahren wie folgt
anwenden: Enthält Vollblut bereits genügend Erreger,
liegt also eine akute Sepsis vor, so können die Erreger
zusammen mit den Blutpartikelchen direkt durch Zentrifugieren absedimentiert
werden. Wird dann das Pellet mit destilliertem Wasser aufgenommen,
so werden die Blutkörperchen, die nur schwache Zellmembranen
besitzen, durch Osmose zerstört, die Mikroben jedoch nicht.
Waschen und weiteres Zentrifugieren setzt nunmehr ein Pellet ab,
das die Mikroben gut angereichert enthält. Aufschluss und
massenspektrometrische Analyse führen hier oft schon zu
einem sehr schnellen Erfolg, wie er bei akuter Sepsis notwendig
ist.
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Ist
die Menge der Erreger im Blut zu klein für dieses direkte
Verfahren, so kann hier eine Züchtung der Mikroben im Vollblut,
das in so genannten Blutbeuteln aufbewahrt wird, erfolgen. Dazu
wird dem Blut etwas Nährmedium zugegeben, und die Blutbeutel
werden in einem Brutschrank auf günstigster Temperatur
inkubiert. Dieses Verfahren kann in einer Stunde die Anzahl der
Mikroben etwa verzehnfachen; gewöhnlich bedarf es allerdings
mehrerer Stunden, um genügende Mengen des Erregers der Infektion
zu züchten. Diese Zeiten sind aber immer noch sehr viel
kürzer als eine Kultivierung auf externem Nährmedium.
Es kann notwendig sein, dem Blut hier geeignete Substanzen beizugeben,
die Antibiotika binden, wie beispielsweise Ionenaustauscherharze,
wenn dem Patienten solche Antibiotika verabreicht worden sind.
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Es
ist zu erwarten, dass sich bei geeigneter Aufbereitung auch die
Mikroben der Abszesssekrete (Eiter) direkt gemessen werden können,
obwohl hier möglicherweise nicht eine einzige Mikrobenart
so vorherrscht, dass ohne eine weitere Reinigung identifiziert werden
kann.
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Ist
zu erwarten, dass sich die zu identifizierenden Mikroben in menschlichen
Zellen aufhalten, die in der Körperflüssigkeit
enthalten sind, so ist so vorzugehen, wie das für Vollblut
bereits geschildert wurde. Die menschlichen Zellen können
nach dem Zentrifugieren durch destilliertes Wasser zerstört werden,
da ihre Membranen durch die Osmose platzen.
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Die
hier geschilderten Verfahren können vom einschlägigen
Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise
abgeändert werden. Einige dieser Abänderungen
sind bereits oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Verfahren,
die auf der grundlegenden Basis der direkten Abscheidung die gewünschten
informationsreichen Massenspektren der Mikroben für ihre
Identifizierung erzeugen können.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 10038694
A1 [0012]
- - DE 10300743 A1 [0012]