DE19707508A1 - Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von HämoglobinInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin,
das durch dieses Verfahren erhaltene Hämoglobin und seine Verwendung sowie
eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Mit Hämoglobin wird der rote Blutfarbstoff der Wirbeltiere bezeichnet, der in den
Erythrozythen des Blutes enthalten ist. Hämoglobin ist ein tetrameres Eisen
protein, dessen Monomere aus je einer Globin-Kette mit einem Molekül Häm als
prostetischer Gruppe bestehen. Hämoglobin hat seine Funktion darin, den einge
atmeten Sauerstoff in der Lunge aufzunehmen und ihn zu den Muskeln sowie zu
anderen atmenden Geweben zu transportieren. Ferner wird ein großer Teil des
Kohlendioxids, das als Stoffwechsel-Endprodukt im peripheren Gewebe entsteht,
durch Bindung an das Hämoglobin zur Lunge geführt und dort ausgeschieden.
Zur Herstellung von Hämoglobin sind Verfahren bekannt. Vielfach wird Hämoglo
bin aus Erythrozyten durch Lyse dieser mit destilliertem Wasser oder Lösungen
niedriger Ionenstärke gewonnen. Dabei werden auch Glykoproteine und Glykoli
pide von den Erythrozyten freigesetzt, die dann das Hämoglobin kontaminieren.
Zur Beseitigung der Kontamination werden organische Lösungsmittel, wie Toluol
oder Chloroform, eingesetzt. Diese beeinflussen allerdings die Struktur von
Hämoglobin, wodurch dieses häufig nicht in nativer Form erhalten wird. Auch
erweist sich ein solches Hämoglobin oft als nicht stabil.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, mit dem ein stabiles Hämoglobin in nativer Form bereitgestellt
werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung
von Hämoglobin, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:
- (a) Sammeln eines Erythrozyten-haltigen Stoffes,
- (b) Waschen der Erythrozyten mit einer physiologischen Pufferlösung,
- (c) Behandeln der Erythrozyten unter osmotischen Schockbedingungen, wodurch eine Lösung von aus Erythrozyten ausgetretenem Hämoglobin erhalten wird,
- (d) Filtrieren der Hämoglobin-Lösung durch eine Membran mit Porengröße im Bereich von 1-0,1 µm, und
- (e) Filtrieren der Hämoglobin-Lösung durch Membranen, welche die Abtren nung von Kontaminationen < 300 kD bzw. < 30 kD erlauben.
In Schritt (a) werden Erythrozyten-haltige Stoffe gesammelt. Dies können
jegliche Stoffe sein, die Erythrozyten enthalten können. Insbesondere sind dies
Blut, Blutkonserven und Zellkonzentrate. Die Stoffe können frisch isoliert sein
oder älter als das jeweilige Verfalldatum sein. Der Ausdruck "Sammeln" betrifft
jegliche Verfahren, Erythrozyten-haltige Stoffe zu vereinigen bzw. die Erythrozy
ten daraus anzureichern, wobei für letzteres insbesondere die Zentrifugation zu
nennen ist.
In Schritt (b) werden die Erythrozyten mit einer physiologischen Pufferlösung
gewaschen. Dies dient insbesondere dazu, Konservierungsmittel, wie CPDA und
Restplasma, zu entfernen. Der Ausdruck "physiologische Pufferlösung" umfaßt
jegliche Pufferlösung, die den gleichen osmotischen Druck wie Blutserum auf
weist. Günstig ist eine Pufferlösung, die 5 mM Tris, pH 8,2 in 150 mM NaCl
aufweist, besonders günstig ist eine 5 mM Pufferlösung, die 20% Natriumdihy
drogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl umfaßt.
Ferner ist es vorteilhaft, den Waschvorgang unter sterilen, apyrogenen Bedin
gungen bei 2-8°C durchzuführen. Besonders günstig ist es, wenn das Volu
men der physiologischen Pufferlösung etwa 5-20fach von jenem der Erythrozy
ten ist.
In Schritt (c) werden die Erythrozyten unter osmotischen Schockbedingungen
behandelt. Mit dem Ausdruck "osmotische Schockbedingungen" sind jegliche
Bedingungen gemeint, unter denen Erythrozyten kontrolliert quellen, nicht aber
lysieren, so daß nur Hämoglobin, nicht aber Glykoproteine bzw. Glykolipide
freigesetzt werden. Vorzugsweise werden hierzu die Erythrozyten mit absteigen
dem Gradienten einer physiologischen Pufferlösung, insbesondere jener von
Schritt (b), behandelt. Ein solcher Gradient kann z. B. durch Zugabe folgender
Puffer erhalten werden: 5 mM Tris, pH 8,2, 150 mM NaCl mit 100% Aus
gangs- und 0% Endanteil, und 5 mM Tris, pH 8,2 mit 0% Ausgangs- und 100%
Endanteil. Günstig ist es, folgende Puffer zu verwenden: 5 mM Pufferlösung,
umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphos
phat in 150 mM NaCl, mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und 5 mM
Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kali
umhydrogenphosphat, mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.
In Schritt (d) wird die Hämoglobin-Lösung filtriert. Hierzu wird eine Membran
verwendet, die eine Porengröße im Bereich von 1-0,1 µm, vorzugsweise 0,8 µm,
aufweist. Günstig kann es sein, Schritt (d) mehrfach und/oder rezirkulär durch
zuführen. Gleiches gilt für die Schritte (b) und (c).
In Schritt (e) wird eine weitere Filtration der Hämoglobin-Lösung durchgeführt.
Hierzu werden Membranen verwendet, welche die Abtrennung von Kontamina
tionen, insbesondere solcher < 300 kD bzw. < 30 kD ermöglichen. Günstig
kann es sein, eine weitere Membran zu verwenden, welche die Abtrennung von
Kontaminationen < 10 kD ermöglicht. Besonders günstig ist es, wenn für die
Verwendung letzterer Membran die Hämoglobin-Lösung in einem 5 mM Tris-
Puffer, pH 6,35 vorliegt.
Durch die Schritte (a)-(e) wird stabiles Hämoglobin in nativer Form erhalten.
Dieses weist auch eine hohe Reinheit auf, die allerdings noch gesteigert werden
kann, wenn nach Schritt (e) eine Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt
wird. Günstig ist es, eine Kationenaustausch-Chromatographie durchzuführen.
Eine solche umfaßt vorzugsweise die folgenden Verfahrensschritte:
- (f) Beladen einer Kationenaustauscher-Säule mit der Hämoglobin-Lösung von Schritt (e),
- (g) Spülen der Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphat-Puffer,
- (h) Eluieren des Hämoglobins durch Gradientenwechsel eines Kaliumphos phat-Puffers,
- (i) Einstellen des Hämoglobin-Eluats auf pH 7.33 mit Kaliumphosphat und auf eine Ionenstärke von 100 mM mit NaCl, und
- (j) Filtrieren des Hämoglobin-Eluats durch eine Membran, welche die Ab trennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.
In Schritt (f) wird eine übliche Kationenaustauscher-Säule verwendet. Diese wird
mit der Hämoglobin-Lösung von Schritt (e) beladen, wobei eine Fließrate von
75-150 cm/h günstig ist.
In Schritt (g) wird die Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphatpuf
fer gespült, um Kontaminationen zu entfernen. Als Kaliumphosphat-Puffer eignet
sich besonders ein solcher, der 20-50 mM Kaliumphosphat enthält und einen pH
von 6,5 aufweist. Günstig ist es auch, den Spülvorgang durch Messung der
optischen Dichte bei 280 und 405 oder 540 nm zu verfolgen.
In Schritt (h) wird das Hämoglobin von der Kationenaustauscher-Säule eluiert.
Hierzu ist es günstig, den Gradienten eines Kaliumphosphat-Puffers zu wechseln.
Dies kann vorzugsweise durch Zugabe folgender Puffer erreicht werden: 20-50
mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,35-6,5, mit 100% Ausgangs- und 0%
Endanteil und 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5-7,6 mit 0% Ausgangs-
und 100% Endanteil. Günstig ist es auch, die Elution von Hämoglobin durch
Messung der optischen Dichte bei 280 und 405 oder 540 nm zu verfolgen.
In Schritt (i) wird das Hämoglobin-Eluat auf einen pH von 7,33 und eine Ionen
stärke von 100 mM eingestellt. Hierzu ist es günstig, Kaliumphosphat für die
Einstellung des pH und NaCl für die Ionenstärke zu verwenden. Es wird ein
Hämoglobin-Eluat erhalten, das physiologisch ist.
In (j) wird das Hämoglobin-Eluat filtriert. Hierzu wird eine Membran verwendet,
welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.
Durch die Schritte (f)-(j) wird erreicht, daß das Hämoglobin eine Reinheit von
etwa 99% aufweist.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Hämoglobin herzustellen, das
stabil ist. Dies zeigt sich z. B. darin, daß das Hämoglobin ohne Veränderung
seiner Struktur eingefroren und aufgetaut werden kann, selbst wenn keine
Stabilisatoren oder Additive zugesetzt werden. Auch liegt das Hämoglobin in
nativer Form vor. Ferner weist es eine hohe Reinheit auf. Somit kann das Hämo
globin für jegliche Zwecke in der Diagnostik und Therapie verwendet werden.
Insbesondere eignet es sich, zur Herstellung von Blutersatzstoffen verwendet zu
werden. Darüberhinaus kann das Hämoglobin bzw. das erfindungsgemäße
Verfahren bestens eingesetzt werden, Hämoglobin-Standards zu erstellen.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Ein Membranmodul, das eine Membran-Porengröße von 0,8 µm enthält, wird
mit 50 ml abgelaufenem Zellkonzentrat beladen. Dieses wird mit 250 ml einer 5
mM Pufferlösung gewaschen, die 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80%
Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl umfaßt. Durch das Waschen werden
Konservierungsstoffe entfernt.
Durch das Membranmodul werden zwei Puffer gepumpt. Puffer A ist eine 5 mM
Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kalium
hydrogenphosphat in 150 mM NaCl. Puffer B ist eine 5 mM Pufferlösung,
umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphos
phat. Der Anfangsanteil von Puffer A ist 100% und der Endanteil 0%. Der An
fangsanteil von Puffer B ist 0% und der Endanteil 100%. Der Übergang von
Puffer A zu Puffer B verläuft kontinuierlich innerhalb von 2 Stunden. Es wird ein
absteigender Gradient erhalten, wodurch die Erythrozyten zum Schwellen
gebracht werden und Hämoglobin in gelöster Form freigegeben wird. Die Hämo
globin-Lösung wird rezirkulär durch das Modul geschickt, wodurch das Hämoglo
bin angereichert wird.
Die Hämoglobin-Lösung wird filtriert, wobei Membranen mit einem Porendurch
messer von 0,5 µm-0,1 µm verwendet werden. Die erhaltene Hämoglobin-
Lösung wird weiter einer Ultrafiltration unterzogen, wodurch die Abtrennung von
Kontaminationen mit einem Molekulargewicht < 300 kD und < 30 kD ermög
licht wird. Ferner wird die Hämoglobin-Lösung einer Filtration unterzogen,
welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht. Hierzu wird
ein 5 mM Tris-Puffer, pH 6,35 zur Hämoglobin-Spülung verwendet. Die erhalte
ne Hämoglobin-Lösung wird einer Kationenaustausch-Chromatographie unter
worfen, wodurch ein Hämoglobin mit einer Reinheit von etwa 99% erhalten
wird.
Claims (16)
1. Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin, umfassend die folgenden
Verfahrensschritte:
- (a) Sammeln eines Erythrozyten-haltigen Stoffes,
- (b) Waschen der Erythrozyten mit einer physiologischen Pufferlösung,
- (c) Behandeln der Erythrozyten unter osmotischen Schockbedingun gen, wodurch eine Lösung von aus Erythrozyten ausgetretenem Hämoglobin erhalten wird,
- (d) Filtrieren der Hämoglobin-Lösung durch eine Membran mit Poren größe im Bereich von 1-0,1 µm, und
- (e) Filtrieren der Hämoglobin-Lösung durch Membranen, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 300 kD bzw. < 30 kD erlau ben.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erythrozy
ten-haltige Stoff von (a) Blut, eine Blutkonserve oder ein Zellkonzentrat
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
physiologische Pufferlösung von (b) eine 5 mM Pufferlösung ist, umfas
send 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphos
phat in 150 mM NaCl.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß
die osmotischen Schockbedingungen von (c) ein Behandeln der Erythrozy
ten mit absteigendem Gradienten der physiologischen Pufferlösung von
(b) darstellen.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der
absteigende Gradient der physiologischen Pufferlösung von (b) durch die
Zugabe folgender Puffer erhalten wird:
- (1) 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und
- (2) 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß
die Porengröße der Membran von (d) 0,8 µm ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Schritte (b), (c) und/oder (d) mehrfach und /oder rezirkulär durch
geführt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß
Schritt (e) auch eine Membran umfaßt, welche die Abtrennung von Kon
taminationen < 10 kD ermöglicht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hämoglo
bin-Lösung in einem 5 mM Tris-Puffer, pH 6,35 vorliegt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß
nach Schritt (e) eine Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionen
austausch-Chromatographie folgende Verfahrensschritte umfaßt:
- (f) Beladen einer Kationenaustauscher-Säule mit der Hämoglobin-Lö sung von Schritt (e),
- (g) Spülen der Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphat- Puffer,
- (h) Eluieren des Hämoglobins durch Gradientenwechsel eines Kalium phosphat-Puffers,
- (i) Einstellen des Hämoglobin-Eluats auf pH 7.33 mit Kaliumphosphat und auf eine Ionenstärke von 100 mM mit NaCl, und
- (j) Filtrieren des Hämoglobin-Eluats durch einen Membran, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Gradien
tenwechsel des Kaliumphosphat-Puffers von (h) durch Zugabe folgender
Puffer erreicht wird:
- (1) 20 bis 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6.35-6.5 mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und
- (2) 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7.5-7.8 mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.
13. Hämoglobin, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche
1-12.
14. Verwendung des Hämoglobins nach Anspruch 13 für diagnostische
und/oder therapeutische Zwecke.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Hämoglobin für Blutersatz
stoffe eingesetzt wird.
16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Hämoglobin als Hämoglobin-
Standard eingesetzt wird.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
DE19707508A DE19707508C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-02-25 | Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin und die Verwendung des so isolierten Hämoglobins |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19707508A DE19707508C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-02-25 | Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin und die Verwendung des so isolierten Hämoglobins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19707508A1 true DE19707508A1 (de) | 1998-08-27 |
DE19707508C2 DE19707508C2 (de) | 2000-05-31 |
Family
ID=7821416
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19707508A Expired - Fee Related DE19707508C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-02-25 | Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin und die Verwendung des so isolierten Hämoglobins |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19707508C2 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102007058516A1 (de) * | 2007-11-23 | 2009-06-04 | Bruker Daltonik Gmbh | Identifizierung von Erregern in Körperflüssigkeiten |
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---|---|---|---|---|
EP0356257A2 (de) * | 1988-08-26 | 1990-02-28 | Cobe Laboratories, Inc. | Verfahren zur Lyophilisierung von Zellen Lyophilisierungsmedien und Verfahren zur Wiederherstellung von lyophilisierten Zellen. |
-
1997
- 1997-02-25 DE DE19707508A patent/DE19707508C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE19707508C2 (de) | 2000-05-31 |
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