DE69432563T2

DE69432563T2 - Vorrichtung zur zelltrennung

Info

Publication number: DE69432563T2
Application number: DE69432563T
Authority: DE
Inventors: Peter Roman Slowiaczek; Robert Ernest Nordon; Klaus Schindhelm; Bruce Milthorpe
Original assignee: Unisearch Ltd
Current assignee: Unisearch Ltd
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 1994-10-31
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2014-11-01
Also published as: EP0730639A4; US5763194A; ATE238410T1; EP0730639B1; DE69432563D1; WO1995011960A1; EP0730639A1; JPH09504943A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Trennung von Zellen. Die Vorrichtung umfasst ein semipermeables Substrat, an dessen Oberfläche ein Ligand gebunden ist, der angepasst ist, um einen gewünschten Zelltyp zu binden. Die Erfindung betrifft auch Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung getrennt werden.
Die Trennung spezifischer Zellen aus einer gemischten Zellpopulation ist für zellbiologische und immunologische Studien und zur Verwendung in der medizinischen Zelltherapie wichtig. Trenntechniken auf Ligandenbasis in kleinem Maßstab (weniger als 10⁹ Zellen), die eine Fluoreszenz-aktivierte Zell-Tröpfchensortierung und ein Zell-Panning umfassen, sind für medizinische Therapien ungeeignet. Trenntechniken, die nicht auf Liganden basieren, wie z. B. Kunstfaserleukozytenfilter und Gegenstrom-Elutriation sind zur Trennung spezifischer Zellsubtypen nicht selektiv oder adaptiv. Gegenwärtige Trenntechniken auf Ligandenbasis in großem Maßstab, wie z. B. die Säulenchromatographie, Magnetkügelchen- oder Mikrokügelchenabsorption können gereinigte Zellsubtypen für klinische Therapien nicht einfach und schnell trennen.
Zellabreicherungstechniken für klinische Anwendungen waren für die Entfernung pathogener Zellsubtypen in großem Maßstab angemessen, während Zellanreicherungs- und Expansionskulturtechnologien nach wie vor einer Weiterentwicklung bedürfen. Zellaffinitätstrennungen basieren auf der selektiven Absorption eines Zellphänotyps unter Verwendung von Antikörpern, Lektinen oder anderen Resten, die für Zelloberflächenmarker spezifisch sind. Affinitätstechniken umfassen Platten-Panning, Säulenchromatographie und Magnetkügelchenoder Mikroteilchenabsorption. Die Abreicherung von Zell-Subsätzen (>1000-fach) ist unter Verwendung von Magnetkügelchen möglich. Die Gewinnung anhaftender Zellen umfasst den Einsatz eines mechanischen Rührens und kann proteolytische Enzyme erfordern. Die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) kann Zellpopulationen um mehr als das 100-fache anreichern. Magnetische Mikroteilchen (<80 nm), die an der positiven Zellpopulation haften bleiben, stören die Proliferationstests oder die Durchflusszytometrie nicht. Affinitätsverfahren bieten die Selektivität von Trennungen auf der Basis monoklonaler Antikörper und sind für klinische Anwendungen im großen Maßstab erforderlich.
Affinitätstrenntechniken im großen Maßstab (>10⁹ Zellen) haben bei der Entwicklung von Knochenmarktransplantaten und der adoptiven Zellimmuntherapie eine wichtige Rolle ge spielt. Wenn eine homogene Expression von Tumormarkern vorliegt, dann kann die Magnetkügelchenabsorption Tumorzellen von autologen Transplantaten entfernen. Anreicherungsstrategien sind für die Reinigung autologer hämopoetischer Vorläuferzellen unter Verwendung des CD34-Markers oder zum Sammeln von lymphoiden Subsätzen für die adoptive Immuntherapie geeignet. Etwa 1% eines Knochenmarktransplantats ist CD34-positiv. Reinheiten der CD34-positiven Zellen, die 90% überschreiten, erfordern Anreicherungsfaktoren von mehr als 900-fach. Die Arbeit hat sich daher auf die Verbesserung der Effizienz der Zellanreicherung unter Verwendung einer Affinitätszelltrennung konzentriert.
Ein Verfahren zur Trennung von Zellen aus einer gemischten Population von Zellen wurde von Bigalow et al., 1989, Journal of Immunological Methods 117, 289–293 beschrieben. Diese Autoren haben über die Entwicklung einer Kombination aus zwei Trennverfahren berichtet, nämlich der Zelladhäsionschromatographie (AC) und der Feldflussfraktionierung (FFF), die eine effektive Trennung mesenterialer B- und T-Lymphozyten der Ratte ermöglicht. Dieses Verfahren kombiniert die selektive Adhäsion der AC und die gesteuerten Verdrängungskräfte der FFF und erbringt auch eine quantitative Abschätzung der Bindungskräfte von Bund T-Lymphozyten an die Adhäsionsoberfläche des Systems. Bei diesem Verfahren wird eine Vorrichtung verwendet, die zwei parallele Glasplatten umfasst und die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten unterschiedlicher Zelltypen an diese Platten nutzt. Dieses Verfahren weist ein Hauptproblem dahingehend auf, dass es die inhärenten Bindungseigenschaften von Zellen an die jeweiligen Glasoberflächen nutzt, und dass der Maßstab nicht vergrößert werden kann, um eine große Anzahl von Zellen zu trennen.
Die EP 0 323 829 A2 beschreibt ein mehrstufiges, positives Selektionsverfahren zum Trennen spezifischer biologischer Zellen aus einem Zellgemisch. Es werden mehrere Stufen des In-Kontakt-Bringens verwendet. Ein Zellgemisch wird mit einer Oberfläche mit einer hohen Affinität für die gewünschte Zellpopulation oder die Zielpopulation in Kontakt gebracht. Die Affinitätsoberfläche enthält einen immobilisierten Liganden mit hoher Affinität für die Zielzellen. Anhaftende Zellen werden von der Affinitätsoberfläche entfernt und dann erneut in einer zweiten Stufe einer zweiten Affinitätsoberfläche mit hoher Affinität für die gleiche Zielzelle ausgesetzt. Die Anzahl der Stufen wird erhöht, bis die erforderliche Zellreinheit erreicht worden ist.
Die EP 0 480 497 A1 beschreibt eine Vorrichtung und die Verwendung der Vorrichtung zum Nachweisen und/oder Bestimmen eines Analyten in einer Testflüssigkeit und ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen eines Analyten in der Testflüssigkeit. Die Vorrichtung umfasst einen Weg für den Flüssigkeitstransport, der zumindest teilweise durch eine semi permeable Membranschicht abgegrenzt ist. Während des Tests und entlang der semipermeablen Schicht wird in dem Weg ein bewegbares Festphasenmaterial transportiert, das einen Liganden trägt. Der Ligand kann den Analyten binden und/oder einen Reaktanten für den Analyten binden. Die semipermeable Schicht kann das bewegbare Festphasenmaterial nicht hindurchlassen.
D. Merlet et al., C. R. Acad. Sci. Paris, t.310, Reihe III, Seiten 565 bis 570 (1990) beschreiben eine Affinitätschromatographietechnik unter Verwendung eines Lektins, das von Lotus Tragonolobus stammt, als Liganden, der in einem Sepharose 6MB-Träger gebunden ist, um eine Zellpopulation in röhrenförmigen proximalen Zellen anzureichern.
Die EP 0 395 355 beschreibt ein Verfahren zur Freisetzung lebensfähiger Zellen von Zell-Rezeptor-Affinitätskomplexen. Ein Ligand, der an der jeweiligen Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beteiligt ist, die für eine Affinitätsreinigung eingesetzt wird, wird selektiv von einem oder mehreren abbauenden Enzymen angegriffen, die für diesen Liganden spezifisch sind. Insbesondere beschreibt das Dokument die Verwendung von Papain oder Chymopapain zur Freisetzung von Mikrokügelchen aus isolierten CD34-positiven Zellen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren zur Trennung eines gewünschten Zelltyps von einer Population von Zellen entwickelt, das einen beliebigen gegebenen Zelltyp selektieren kann und das zur Verwendung in klinischen Anwendungen in größerem Maßstab eingesetzt werden kann.
Demgemäß besteht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt aus einem Verfahren zur Entfernung eines gewünschten Zelltyps von einer Probe, die Zellen einschließlich des gewünschten Zelltyps enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Einbringen der Probe in eine Vorrichtung, die ein semipermeables Substrat umfasst, das mit einem Liganden ausgestattet ist, der eine Reaktivität mit einem gewünschten Zelltyp aufweist,
(b) Inkubieren zum Ermöglichen des Ablagerns und des Bindens des gewünschten Zelltyps an den Liganden,
(c) Behandeln des semipermeablen Substrats durch Eluieren eines Puffers durch die Vorrichtung zur Erzeugung einer Scherspannung, derart, dass die nicht an den Liganden gebundenen Zellen entfernt werden, und gegebenenfalls
(d) Behandeln des semipermeablen Substrats durch Eluieren eines Puffers durch die Vorrichtung zur Erzeugung einer Scherspannung, derart, dass die an den Liganden gebundenen Zellen entfernt werden, wobei die Permeabilität des semipermeablen Substrats derart ist, dass der Fluidverlust über das semipermeable Substrat kleiner als 5% ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist das semipermeable Substrat Zellulose und liegt in Form einer Hohlfaser oder von Hohlfasern vor.
Es können auch andere Arten von Hohlfasern verwendet werden, einschließlich Ultrafiltrationshohlfasermembranen, die aus Polyamid hergestellt sind. Wenn solche Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden, wird es typischerweise erforderlich sein, die Membranen unter Bedingungen zu verwenden, die derart sind, dass die Permeabilität der Membran unter ihr normales Niveau vermindert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist der Ligand aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Lektin, einem Wachstumsfaktor und einem Rezeptor ausgewählt. Insbesondere ist der Ligand ein Antikörper und noch mehr bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zellen, die nicht an das semipermeable Substrat gebunden sind, durch eine niedrige Scherspannung entfernt, und die Zellen, die an das semipermeable Substrat gebunden sind, werden durch eine höhere Scherspannung entfernt. Nach der Entfernung der ungebundenen Zellen können die an das semipermeable Substrat gebundenen Zellen vor der Entfernung durch Behandlung mit einer Scherspannung mit einem Zellfreisetzungsmittel vorbehandelt werden. Vorzugsweise ist das Zellfreisetzungsmittel ein Enzym und insbesondere ist das Enzym Chymopapain. Wenn die gebundenen Zellen vorbehandelt werden, dann kann die zur Entfernung der vorbehandelten gebundenen Zellen eingesetzte Scherspannung niedriger, gleich oder höher sein als die Scherspannung, die eingesetzt wird, um die ungebundenen Zellen zu entfernen. Die Scherspannung kann durch Erhöhen der Strömung eines Fluids durch die Faser oder durch Erhöhung der Viskosität des Fluids oder durch die Verwendung einer Mischung beider Verfahren erzeugt werden.
Die Zellen, die nicht an das semipermeable Substrat gebunden sind, werden durch eine niedrige Scherspannung eluiert und die Zellen, die an das semipermeable Substrat gebunden sind, werden durch eine hohe Scherspannung eluiert. Alternativ werden die Zellen, die nicht an das semipermeable Substrat gebunden sind, durch eine niedrige Scherspannung entfernt und die Zellen, die an das semipermeable Substrat gebunden sind, werden vor der Entfer nung durch die Behandlung mit einer Scherspannung mit einem Zellfreisetzungsmittel vorbehandelt.
Vorzugsweise ist das Zellfreisetzungsmittel ein Enzym und insbesondere ist das Enzym Chymopapain. Die zur Entfernung der vorbehandelten gebundenen Zellen eingesetzte Scherspannung kann niedriger, gleich oder höher sein als die Scherspannung, die zur Entfernung der ungebundenen Zellen verwendet wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren das Wachsenlassen der gewünschten Zellen in der Vorrichtung nach der Trennung. In dieser Ausführungsform werden nach dem Schritt (c) die gebundenen Zellen unter Bedingungen gehalten, bei denen sich die Zellen teilen und vermehren können.
In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einer Vorrichtung zum Entfernen eines gewünschten Zelltyps von einer Probe, die den gewünschten Zelltyp umfasst, wobei die Vorrichtung ein semipermeables Substrat in Form einer Gruppierung von Hohlfasern umfasst, die im Inneren mit einem Liganden ausgestattet sind, der eine Reaktivität mit dem gewünschten Zelltyp aufweist, wobei die Permeabilität des semipermeablen Substrats derart ist, dass während der Entfernung der Zellen durch die Elution eines Puffers zur Erzeugung einer Scherspannung der Fluidverlust über das semipermeable Substrat kleiner als 5 % ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts ist der Ligand aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Lektin, einem Wachstumsfaktor und einem Rezeptor ausgewählt. Insbesondere ist der Ligand ein Antikörper und noch mehr bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
Es können auch andere Arten von Hohlfasern verwendet werden, einschließlich Ultrafiltrationshohlfasermembranen, die aus Polyamid hergestellt sind. Wenn solche Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden, wird es typischerweise erforderlich sein, die Membranen unter Bedingungen zu verwenden, die derart sind, dass die Permeabilität der Membran unter ihr normales Niveau vermindert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts sind die Hohlfasern innerhalb eines zylindrischen Moduls gehalten. Das Modul enthält Öffnungen, die es ermöglichen, dass ein Puffer um die äußeren Seiten der Fasern umgewälzt wird, und auch Einlassund Auslassöffnungen, die ein Strömen durch die Fasern ermöglichen. Diese Anordnung der Hohlfasern ermöglicht die Abdichtung der Innenseite gegenüber der Außenseite, so dass eine Strömung entlang der Innenseite der Faser unabhängig von dem Fluss über die Wände der Faser gesteuert werden kann. Die Fluidströmung zu dem Hohlfasermodul wird vorzugsweise mit einem Pumpmittel erreicht.
In weiteren Aspekten besteht die vorliegende Erfindung aus Zellen, die unter Verwendung des Verfahrens des ersten Aspekts der vorliegenden Endung oder der Vorrichtung des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden bevorzugte Formen derselben nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen beschrieben.
1 zeigt eine schematische Darstellung einer laminaren Strömung, die in einem porösen Rohr beobachtet wird;
2 zeigt die Stromlinien, die für die laminare Strömung in einem porösen Rohr bestimmt worden sind;
3 zeigt die Ergebnisse der Fraktionierung von Zellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
4 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche die Ventilnummerierung zeigt, wie sie in Tabelle 2 angegeben ist;
5 ist eine schematische Darstellung einer Zellselektion und einer nachfolgenden Expansion der Zellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Hohlfaservorrichtung;
6 zeigt die unspezifische Absorption einkerniger Zellen durch ein Immunadsorptionsmodul;
7 zeigt die Trennung von KG1a (CD34⁺) von NALM-6 (CD4^–) Zellen unter Verwendung der in Tabelle 7 dargestellten experimentellen Details;
8 zeigt die Ergebnisse der Trennung und Gewinnung von KG1a Zellen aus weißen Blutzellen, die über einen Dichtegradienten getrennt worden sind;
9 zeigt die Ergebnisse der Gewinnung gebundener CD34⁺ Zellen unter Verwendung einer Fluidscherspannung;
10a und 10 b zeigen die Reinheit bzw. den Anreicherungsfaktor von Zellen im Experiment Nr. 3 gemäß den in Tabelle 9 angegebenen Details;
11 zeigt eine Durchflusszytometrieanalyse einkerniger Zellen, bevor die Trennung im Experiment 3 durchgeführt worden ist;
12 zeigt die Durchflusszytometrieanalyse einer hoch angereicherten Zellfraktion von dem Experiment 3, wobei das Sammeln der Fraktionen zwischen 15 und 20 Pa (150 bis 200 dyn/cm²) stattfand; und
13 zeigt die Durchflusszytometrieanalyse einer CD34-Antigenexpression in gesammelten Fraktionen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine mathematische Modellierung zur Bestimmung der bevorzugten Permeabilitätserfordernisse der semipermeable Substrate verwendet, die am besten in der Erfindung eingesetzt werden können. Insbesondere wurde die Permeabilität von Hohlfasern berechnet, um eine effiziente Zellablagerung und Gewinnung sicherzustellen.
Ablagerung von Zellen innerhalb permeabler Hohlfasermodule und Gewinnung unter Verwendung einer einheitlichen Scherspannung.
Das Trennverfahren mit permeablen Hohlfasern kann in drei Stufen eingeteilt werden.

1. Zellablagerung innerhalb der Vorrichtung unter Verwendung entweder einer Filtration mit geschlossenem Ende oder einer Strömung mit offenem Ende.
2. Elution von Marker-negativen Populationen bei einer niedrigen Scherspannung (Strömung mit offenem Ende).
3. Elution anhaftender Populationen (Marker-positiv) bei einer höheren Scherspannung (Strömung mit offenem Ende).

Zur Zellablagerung unter Verwendung einer Strömung mit offenem Ende sind sehr niedrige Strömungsgeschwindigkeiten erforderlich. Die Filtration mit geschlossenem Ende hat den Vorteil höherer Volumenströmungsgeschwindigkeiten und eines vollständigeren Einfangens von Zellen durch die Vorrichtung. Die hydraulische Permeabilität muss sorgfältig ausgewählt werden, so dass angemessene Volumenströmungsgeschwindigkeiten unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende während der Zellablagerungsphase erzeugt werden können (Stufe 1) und während der Zellgewinnungsphase während der Strömung mit offenem Ende eine einheitliche Scherspannung erzeugt wird (Stufen 2 und 3).
Vergleich der Strömung mit offenem Ende und mit geschlossenem Ende für die Zellablagerung
Bei einer Strömung mit offenem Ende ist der Auslass der Hohlfasergruppierung gegenüber dem Atmosphärendruck offen. Zellen werden direkt durch das Hohlfasersystem hindurchtreten und können an den Wänden der Fasern haften, wenn die Scherspannung sehr niedrig ist (< 0,02 Pa = 0,2 dyn/cm²). Eine Vorrichtung mit 1 m² weist 8000 Fasern auf (Faserinnendurchmesser 200 μm, Länge 20 cm), die parallel angeordnet sind. Die Wandscherspannung kann unter Verwendung des Gesetzes von Poiseuille-Hagen für eine laminare Röhrenströmung berechnet werden.
worin Q die Strömungsgeschwindigkeit, μ die Fluidviskosität, r der Radius der Röhre und n die Anzahl der Fasern in der parallelen Gruppierung ist. Unter Verwendung der Abmessungen einer 1 m²-Vorrichtung sind Strömungen von weniger als 0,1 ml/s für die Zellablagerung erforderlich. Zur Verarbeitung klinischer Proben, wie z. B. von Blut-Apheresesammlungen (> 200 ml) ist das Ablagerungsverfahren zeitaufwändig (>30 Minuten).
Größere Flüsse für die Zellablagerung können erzeugt werden, wenn die Fasern gegenüber Wasser permeabel sind und das Ende der Hohlfasergruppierung unter Verwendung eines Stop-Flow-Ventils abgeschlossen ist. Eine "Bioflux"-Cuprophanmembran (von AKZO FASER AG, Obernburg, Deutschland, geliefert; 63785) weist einen hydraulischen Fluss von mehr als 50 ml/(min·m²·100 mm Hg) auf. Ein Volumen von 200 ml könnte innerhalb einer Vorrichtung innerhalb von 2 Minuten abgelagert werden (Filtrationsdruck = 200 mm Hg).
Auswahl einer hydraulischen Permeabilität einer Hohlfaser für eine Elution mit einheitlicher Scherung
Die Auswahl hydraulischer Faserpenneabilitäten für eine Elution mit einheitlicher Scherung bei der Affinitätszelltrennung wird ein Kompromiss sein. Stark permeable Fasern können für eine schnelle Beladung von Zellen unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende verwendet werden. Wenn die Faser zu permeabel ist, dann wird während des Modus mit offenem Ende und der Zellgewinnung der Nennradialfluss zu einem Abfall bei der Axialströmung und bei der Oberflächenscherspannung entlang der Faser führen. Eine nicht einheitliche Scherspannung wird zu einer verminderten Trennungsreinheit und einer verminderten Gewinnung führen.
Nachstehend ist eine Zusammenfassung der Ableitung des Geschwindigkeitsfelds für ein poröses hohles Rohr (1) angegeben. Diese Ableitung kann zur Berechnung der Fluidverluste über die Fasermembran bei einer Filtration mit offenem Ende verwendet werden. Um einen Wert der Fluidverluste über die Membran von weniger als 5% zu erreichen, muss MXL < 0,3 gelten, wobei M die dimensionslose hydraulische Permeabilität und X_L die dimensionslose Faserlänge ist.
Für Hohlfasermodulabmessungen im großen Maßstab (Faserinnenradius = 100 μm, Faserlänge = 20 cm), sollte die hydraulische Permeabilität weniger als 1,4 × 10^–11 cm betragen. Typische Cuprophan-Dialysemembranen weisen eine hydraulische Permeabilität von etwa 1,5 × 10^–12 cm auf, was weit unter der maximalen hydraulischen Permeabilität liegt, die für eine Elution mit einheitlicher Scherung erforderlich ist (<5% Abfall entlang der Faser). Während diese Membranen für eine Elution mit einheitlicher Scherung unter Verwendung einer Strömung mit offenem Ende geeignet sind, ist ein rasches Beladen von Zellen unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende nicht möglich. Die Cuprophan-Membran mit hohem Fluss „Bioflux" ist für diesen Zweck besser geeignet (hydraulische Permeabilität >6,4 × 10^–12 cm). Eine solche Membran kann Filtrationsströmungen von >50 ml·min^–1·m^–2·100 mm Hg erzeugen und sie wird während der Strömung mit offenem Ende im Allgemeinen eine einheitliche Scherspannung entlang der Faserlänge (<5% Abfall) erzeugen.
Geschwindigkeitsfeld für ein poröses hohles Rohr
Die Lösung der Navier-Stokes Gleichung für eine laminare Strömung in einem porösen Rohr wurde von Granger und Mitarbeitern (1) abgeleitet. Das Strömungsfeld kann verwendet werden, um Trajektorien für Teilchen abzuleiten, die Stromlinien folgen. Eine Diffusion, eine Se dimentation und Trägheitseffekte werden zu einer Abweichung von diesem rein konvektiven Modell führen.
Das ungestörte Geschwindigkeitsströmungsfeld U wird durch Anwenden der Navier-Stokes Gleichungen abgeleitet. Die Symmetrie führt zu einer Vereinfachung des Problems zu einem zweidimensionalen Problem, wobei die Axialgeschwindigkeit und die Radialgeschwindigkeit (u_x, u_y) mit der axialen Position und der radialen Position (x, y) variieren (vgl. 1). Der Druck p bildet innerhalb des Rohrs ein skalares Feld, während p₀, bei dem es sich um den Druck außerhalb des Rohrs handelt, konstant ist.
Die Grenzbedingungen werden wie folgt angenommen: Die Radialfluidgeschwindigkeit über die Wand des Rohrradius R ergibt sich aus dem Gesetz von Darcy.
worin k die hydraulische Permeabilität und μ die Viskosität des Fluids ist.
Ferner wird angenommen, dass an der Wand „gleitfreie" Bedingungen vorliegen (u_x(y=R)= 0). Die Radialgeschwindigkeit in der Mitte des Rohrs ist 0 (u_x(y=R)= 0). Hydrodynamische End-Effekte des Rohrs werden vernachlässigt.
Die Navier-Stokes-Gleichungen unter Verwendung zylindrischer Koordinaten vereinfachen sich zu
wobei p die Fluiddichte und μ die Fluidviskosität ist.
Die mathematische Formulierung wird mit dimensionslosen Variablen vereinfacht:
wobei t die Zeit ist.
Granger erhielt eine iterative Lösung durch die Annahme, dass das Geschwindigkeitsprofil parabolisch ist und dann unter Verwendung des Ausdrucks für U_x, um eine erste Iteration für U_y, aus der Stetigkeitsgleichung zu erhalten. Die Ausdrücke für P wurden unter Verwendung der Gleichung für das y-Moment gefunden. Ein neuer Ausdruck für U_x wurde unter Verwendung des Ausdrucks für das x-Moment abgeleitet und anschließend in einer iterativen Weise wieder in die Stetigkeitsgleichung eingesetzt, usw. Es ergibt sich eine Entwicklung in M, wobei die Koeffizienten Polynome in Y sind.
wobei G = –(B cosh MX + sinh MX), K = cosh MX + B sinh MX,
Mikrofiltrations- und Ultrafiltrationsmembranen weisen hydraulische Permeabilitäten auf, die im Bereich von 10^–8 cm < k < 10^–12 cm liegen. M ist relativ klein und nur der erste Term jeder Entwicklung ist signifikant.
wobei U der Strömungsgeschwindigkeitsvektor ist und i und j Einheitsvektoren in der X- und Y-Richtung sind.
Ein Teilchen, das Stromlinien folgt, wird den gleichen Geschwindigkeitsvektor V aufweisen wie das Strömungsfeld.
Das Einsetzen der Gleichung A4.6 in A4.7 ergibt
Eine Trennung der Variablen und eine Integration ergibt die Trajektoriengleichung in K und Y.
wobei c = K_pY² _p(2 – Y² _p) und (K_p(X_p), Y_p) ein Punkt auf der Trajektorie ist.
2 zeigt das Stromlinienmuster für Membranen mit niedriger (k = 10^–12 cm) und hoher (k = 10^–8 cm) Permeabilität mit U _L = 0 (Filtration mit geschlossenem Ende). Die Stromlinien sind bei einer stark permeabeln Faser proximal näher beabstandet. Ein wichtiges Ergebnis dieses Modells ist der Effekt der Permeabilität des Transmembran-Fluidflusses entlang der Länge des Rohrs. Wenn die Faser eine hohe Permeabilität aufweist, dann ist der Druckabfall entlang des Rohrs aufgrund der viskosen Strömung groß genug, um proximal einen größeren Transmembranfluss zu bewirken.
Auswahl der Faserpermeabilität durch eine Elution mit einheitlicher Scherung
Zur Zellgewinnung ist das Ende des porösen Rohrs zum Aussendruck p₀ hin offen. Obwohl das Ende des Rohrs offen ist, wird entlang des Rohrs ein Druckgradient vorliegen (aufgrund des viskosen Widerstands) und dies wird die Filtration bewirken (Filtration mit offenem Ende).
Daher wird die Auswahl hydraulischer Faserpermeabilitäten für eine Elution mit einheitlicher Scherung bei der Affinitätszelltrennung ein Kompromiss sein. Für eine Zellablagerung unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende können Zellen schnell in Fasern beladen werden, die eine hohe hydraulische Permeabilität aufweisen. Andererseits wird eine hohe Faserpermeabilität bei der Zellgewinnung (Filtration mit offenem Ende) zu einem signifi kanten Abfall der axialen Strömung entlang der Faser bei einem Abfall der Fluid-Oberflächenscherspannung führen.
Granger et al. (1) leiten einen Ausdruck für den dimensionslosen mittleren Druck P als Funktion eines dimensionslosen axialen Abstands X ab.
Wenn eine Strömung mit offenem Ende vorliegt, dann ist bei x = L p = P₀. Die mittlere dimensionslose Teilausflussgeschwindigkeit U_L kann aus B mit P = 0 bei X_L berechnet werden.
Wenn die Fluidverluste über die Membran weniger als 5% U_L > 0,95) betragen sollen, dann gilt MXL < 0,3 ... A4.12
Für typische Hohlfasermodulabmessungen (R = 100 μm, L = 20 cm) ist k < 1,4 × 10^–11 cm. Eine typische Cuprophandialysemembran hat einen Wert von k ≅ 1,5 × 10^–12 cm. Eine geeignete Membran weist eine hydraulische Permeabilität auf, die etwa zehnmal so groß ist, wie die einer Cuprophandialysemembran.

1. J. Granger, J. Dodds, N. Midoux, Laminar flow in Channels with Porous Walls, The Chemical Engineering Journal, 1989, 42, 193–204.

Die Verwendung von Ultrafiltrations-Hohlfasermembranen für eine Elution mit einheitlicher Scherung bei der Affinitätszelltrennung
Für eine Zellfraktionierung unter Verwendung einer einheitlichen Scherspannung muss entlang der Faserlänge eine einheitliche Axialströmungsgeschwindigkeit vorliegen. Die vorstehende Diskussion definiert eine Permeabilität, unterhalb derer eine minimale Leckage über die Fasermembran stattfindet. Während Ultrafiltrationsmembranen eine Permeabilität weit über diesem Wert aufweisen, wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Membranporen zeitweise für eine Elution mit einheitlicher Scherung verschlossen werden können.
Das Trennverfahren läuft wie folgt ab:

1. Beladen von Zellen unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende.
2. Ablassen von Fluid, dass die Hohlfasern umgibt (Raum außerhalb der Kapillare).
3. Ausüben eines Gasdrucks außerhalb der Kapillare, der größer ist als der Druck innerhalb der Kapillare und kleiner als der Blasenbildungspunkt oder der Druck zum Zusammendrücken der Faser. Membranporen werden durch die Bildung einer Gas-Wasser-Grenzfläche verschlossen. Die Oberflächenspannung verhindert, dass Gas in das Lumen der Faser eindringt.
4. Gewinnen von Zellen, die nicht an den Liganden gebunden sind, durch Behandeln mit einer niedrigen Scherspannung.
5. Gewinnen von Zellen, die an den Liganden gebunden sind, durch Behandeln mit einer höheren Scherspannung.

Die Technik zum Verschließen von Membranporen unter Verwendung eines Gasdrucks außerhalb der Kapillare und einer Abdichtung aus einer Gas-Wasser-Grenzfläche wurde unter Verwendung von mikroporösen Nylon-Hohlfasermodulen gezeigt. Tabelle 1 zeigt die relevanten Spezifikationen dieser Faserart (von AKZO Faser, Faserabteilung, Wuppertal, Deutschland geliefert).
Ohne Ausübung eines Gasdruckes außerhalb der Kapillare führt der Fluss entlang dieser Faser zu einer signifikanten Leckage von Fluid über die Membran (hydraulische Permeabilität > 1,4 × 10^–12 cm). Das Ausüben eines Gasdrucks von 50 kPa auf den Raum außerhalb der Kapillare verhinderte eine Leckage von Fluid über die Membran. Dieser Druck liegt weit un terhalb des Blasenbildungspunkts und des Drucks zum Zusammendrücken dieser Hohlfasermembran.
Ein Fluss vom Raum innerhalb der Kapillare zum Raum außerhalb der Kapillare wird durch einen positiven Druck in dem Raum außerhalb der Kapillare verhindert. Ein Fluss vom Raum außerhalb der Kapillare in den Raum innerhalb der Kapillare wird enden, sobald sich eine Gas-Flüssigkeit-Grenzfläche am Eingang der Membranpore ausbildet. Die Oberflächenspannung verhindert, das ein Gas in die Faser eintritt.
Der Druckabfall innerhalb des Rohrs aufgrund der viskosen Strömung kann mit dem Gesetz von Hagen-Poiseuille berechnet werden:
wobei Δp der Druckabfall, τ die Wandscherspannung, L die Rohrlänge und R der Rohrradius ist. Daher wird ein Fluss, der 10 Pa (10 dyn/cm²) (ausreichend für die Zellgewinnung) erzeugt, zu einem Druckabfall von 25 kPa entlang einer 20 cm-Faser führen. Dies liegt unterhalb des ausgeübten Gasdrucks außerhalb der Kapillare (50 kPa), des Blasenbildungspunkts (320 kPa) und des Drucks zum Zusammendrücken (100 kPa) dieser Faserart.
Insgesamt können Ultrafiltrationsmembranporen unter Verwendung einer Gas-Fluid-Grenzfläche verschlossen werden, mit der Maßgabe, dass

1. sich Gas auf der Außenseite der Hohlfaser und Fluid auf der Innenseite derselben befindet,
2. der Gasdruck außerhalb der Kapillare größer ist als der Druck innerhalb der Kapillare,
3. der Blasenbildungspunkt der Faser geringer ist als der Gasdruck außerhalb der Kapillare, und
4. der Gasdruck außerhalb der Kapillare geringer ist als der Druck zum Zusammendrücken der Hohlfaser.

Trennung von NALM-6 Zellen von CEM Zellen
Eine positive Zellpopulation wurde durch Beschichten von NALM-6 Zellen mit einem monoklonalen Mausantikörper durch Inkubieren der Zellen mit dem Anti-CD9-Antikörper FMC56 gebildet. Negative Zellen waren CEM Zellen, die mit der Kernfluoreszenzfärbung H33342 vorgefärbt wurden, so dass sie mittels UV-Fluoreszenz von den positiven Zellen unterschie den werden konnten. Vor der Trennung wurden gleich viele negative und positive Zellen gemischt.
Ein Zellulose-Hohlfaserzelltrennungsmodul wurde durch Koppeln eines polyklonalen Antikörpers (in Schafen gezüchtet) gegen ein Mausimmunglobulin an die Innenfläche der Hohlfasern unter Verwendung der Periodat-Reaktion aufgebaut. Die Kopplungsreaktion wurde durch Aktivieren der Zellulosehohlfasern mit 0,5 M Natriumperiodat zwei Stunden bei Raumtemperatur und anschließendem Binden des polyklonalen Antimaus-IgG-Antikörpers bei 200 μg/ml über Nacht bei 4°C durchgeführt. Das Hohlfasermodul wurde dann mit Puffer gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper und alle Spuren der Kopplungschemikalien zu entfernen.
Die Zellen wurden durch Aufbringen eines 20 μl-Tropfens der Zellsuspension auf das offene Ende des Moduls in die Hohlfasern eingebracht. Die Zellen wurden unter der Wirkung der Schwerkraft in das Faserlumen gezogen und die Oberflächenspannung verhinderte ein Eindringen von Luft in die Fasern. Die Kopföffnung wurde ersetzt und verschlossen und die Vorrichtung wurde in eine horizontale Position gedreht, um den Kontakt zwischen den Zellen und der Innenfläche der Fasern zu erleichtern. Die Zellen sedimentierten unter der Schwerkrafteinwirkung bei etwa 4 μm-Sekunde, so dass eine vollständige Ablagerung in 60 Sekunden abgeschlossen war. Die Bindungskinetik war schnell und 4 Minuten reichten für ein vollständiges Binden aus. Die Vorrichtung wurde um weitere 90° gedreht (invertiert) und die negativen Zellen wurden von den positiven Zellen unter Verwendung einer Scherspannung (proportional zur Strömungsgeschwindigkeit) fraktioniert. Eine Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 mm/min (0,15 Pa = 1,5 dyn/cm²) war ausreichend, um den größten Teil der negativen Zellen von der Vorrichtung zu entfernen. Eine Strömung von mehr als 50 ml pro Minute (3 Pa = 30 dyn/cm²) war ausreichend, um alle gebundenen positiven Zellen zu gewinnen.
2 zeigt die absolute Anzahl positiver und negativer Zellen, die von aufeinanderfolgenden Fraktionen eluiert worden sind. Fraktion 0 zeigt eine Gesamtzahl an positiven und negativen Zellen, die von der Vorrichtung eluiert worden sind, und diese weisen ein ähnliches Verhältnis wie das ursprüngliche Gemisch auf. Alle auf die Vorrichtung aufgebrachten Zellen wurden unter Verwendung der Strömungselution gewonnen. Der größte Teil der negativen Zellen (gefüllter Balken) und einige der positiven Zellen wurden in Fraktion 1 bei niedrigeren Scherwerten (2,5 ml pro Minute) eluiert. Die Fraktionen 2 bis 6 weisen relativ wenige Zellen auf und die verbleibenden gebundenen positiven Zellen wurden in Fraktion 7 gewonnen, bei der höhere Strömungsgeschwindigkeiten (mehr als 50 ml pro Minute) angewandt wurden. Etwa 70% der positiven Zellen wurden in dieser Fraktion gewonnen. Diese Fraktion hatte eine Reinheit von 99,7%. Die Entfernung des Vorlaufs und die tropfenweise Elution von Zellen von der invertierten Vorrichtung verminderten die Strömungsdispersion dramatisch, und zwar ohne wesentliche Verbesserungen der Anreicherungsreinheit.
Eine schematische Darstellung der Vorrichtung zur Entfernung eines gewünschten Zelltyps von einer Probe, die eine gemischte Zellpopulation enthält, einschließlich des gewünschten Zelltyps, ist in 3 angegeben. Die Vorrichtung kann chargenweise betrieben werden, wie es in Tabelle 2 zusammengefasst ist.
Die Zellen werden unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende beladen (Strömung von Ventil 1 zu Ventil 4). Der größte Teil der Zellpopulation ist innerhalb der Hohlfasern konzentriert. Der Einlassvortexkopf wird gespült (Fluss vom Ventil 2 zum Ventil 1). Für die Zellablagerung und -haftung sind alle Ventile geschlossen (Vorrichtung in der horizontalen Position). Die negative Zellpopulation wird bei einer niedrigen Scherung eluiert (Fluss vom Ventil 1 zum Ventil 5). Die restlichen negativen Zellen werden von dem Auslassvortexkopf ausgespült (Fluss vom Ventil 6 zum Ventil 5). Schließlich wird die positive Zellpopulation unter Verwendung einer hohen Scherung gewonnen (Fluss vom Ventil 1 zum Ventil 5).
Die Vortexköpfe verhindern eine Kontamination gereinigter negativer und positiver Zellpopulationen. Das Einbringen von Zellen in das Hohlfasermodul unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende minimiert die Zellverluste in dem Kopfraum.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Trennung von Zellen bereit. Es wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu den Techniken, die gegenwärtig in Gebrauch sind, ein einfacheres und sehr selektives Verfahren zur Zelltren nung bietet. Die vorliegende Erfindung kann auch für eine automatisierte Herstellung gegebener Zellpopulationen in großem Maßstab durch eine Vorrichtung angepasst werden, die eine ähnliche Konfiguration wie ein Hohlfaserhämodialysegerät aufweist.
Anwendung einer Hohlfaserzellabtrennvorrichtung auf Zellexpansionskultursysteme
Anstelle der Gewinnung der selektiv absorbierten Zellpopulation können Zellen, die an der Lumenoberfläche der Hohlfaser absorbiert worden sind, in situ belassen und vermehrt werden. Die Hohlfasermembran ist gegenüber Wachstumsfaktoren und Metaboliten permeabel, so dass die Zellen durch die Perfusion von Kulturmedien um die Außenseite der Fasern versorgt werden können. Sobald Zellen zu einer optimalen Dichte herangewachsen sind, können sie durch eine Fluidströmung entlang des Lumens der Fasern geerntet werden.
Zellen werden Anaboliten (z. B. Sauerstoff, Glukose, Aminosäuren) verbrauchen und Kataboliten (Laktat, CO₂, H⁺) erzeugen. Darüber hinaus werden sie Zellenwachstumsfaktoren verbrauchen und inhibierende Faktoren erzeugen. Folglich muss das Kulturmedium für ein maximales Wachstum kontinuierlich durch frisches Medium ersetzt werden. Hohlfaserperfusionssysteme können zum kontinuierlichen Austausch von Komponenten dieses Kulturmediums verwendet werden.
Niedermolekulare Substanzen (<5000), die am Metabolismus der Zelle beteiligt sind (z. B. Glukose, Aminosäuren, O₂, CO₂, H⁺, Laktat, usw.) werden mit einer höheren Geschwindigkeit verbraucht und erzeugt, als höhermolekulare Substanzen, wie z. B. Wachstumsfaktoren und inhibitorische Faktoren (Molekulargewicht 5000 bis 25000). Die niedermolekulare Fraktion kann unter Verwendung von Dialysemembranen (für Moleküle mit einem Molekulargewicht > 5000 impermeabel) ausgetauscht werden. Die Fraktion, die Wachstumsfaktoren enthält, kann unabhängig von der erstgenannten Fraktion unter Verwendung von semipermeablen Membranen mit einer höheren Molekulargewichtsgrenze ausgetauscht werden. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Systems, bei dem eine Hohlfaserzellselektion und -expansion kombiniert ist.
Dieses System kann zur Entwicklung von Zelltherapien angewandt werden, bei denen eine Zellselektions- und Expansionskultur beteiligt ist. Beispielsweise könnte die Dauer der lebensbedrohenden Panzytopenie, die bei einer herkömmlichen Knochenmarktransplantation auftritt (2 bis 3 Wochen) auf wenige Tage verkürzt werden, und zwar durch Verabreichen von Granulozyten und Plättchenvorläufern, die von Knochenmarkstammzellen abgeleitet sind. Hämopoetische Stammzellen können unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD34 (Stammzellenmarker) isoliert werden. Diese Zellen können in Kultur zur Erzeugung von Granulozyten und Plättchenvorläufern expandiert und reifen gelassen werden. Sowohl primitive hämopoetische Zellen als auch reifere Vorstufen würden unmittelbar nach einer myeloablativen Chemostrahlentherapie für Krebs verabreicht werden, was zu einer Kurzzeit- und Langzeitregenerierung der Hämopoese führen wird.
Trennung von CD34⁺-Zellen
Antikörper-Kopglungschemie
Ein Verfahren zur Antikörperoxidation und die Derivatisierung von Cuprophan-Hohlfasermodulen mit Adipinsäuredihydrazid wurde zur Kopplung der monoklonalen Anti-CD34-Antikörper # 9069 (Klon 9 C5) oder # 9079 (Klon HPCA-2) an Cuprophan-Hohlfasermodule verwendet. Die Hydrazid-Derivatisierung von Cuprophan-Modulen mit einer Filtration mit geschlossenem Ende wurde verwendet, um Zellen innerhalb von Modulen abzulagern, und daher sollte das Antikörperkopplungsverfahren die hydraulische Permeabilität von Cuprophan-Modulen nicht signifikant vermindern.
Ein Tempern der Module war erforderlich, um einen Alkali-induzierten Belastungsbruch der Polycarbonatmodulhülsen zu verhindern. Die Dehydrierung der Cuprophanmembran war mit einem signifikanten Abfall der hydraulischen Permeabilität verbunden (vgl. Tabelle 3). Daher wurden Polycarbonatmodule im hydratisierten Zustand durch Autoklavieren derselben in Wasser bei 121°C für 20 Minuten getempert.
Auch die Umsetzung mit 50% Ethylenglykoldiglycidylether (EGDGE) führte zu einem signifikanten Abfall der hydraulischen Permeabilität (vgl. Tabelle 3). Das Ausmaß der Vernetzung wurde durch Absenken der Konzentration von EGDGE (10%) vermindert.
Verfahren
Module wurden vor der Reaktion mit einer 10%igen EGDGE-Lösung in vollständig hydratisiertem Zustand in einem Autoklaven getempert (121°C für 20 Minuten). Nach einem gründlichen Waschen der Cuprophanmodule in destilliertem Wasser werden 20 ml der EGDGE-Lösung durch die in ein 50°C warmes Wasserbad eingetauchten Cuprophanfasermodule eine Stunde lang umgewälzt (5 ml/min). Die Module wurden dann sorgfältig mit destilliertem Wasser gewaschen. 20 ml filtriertes 10%iges Adipinsäuredihydrazid werden bei 1 ml/min über Nacht umgewälzt. Am nächsten Tag wird das Modul gewaschen und in PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) + 0,1% Natriumazid gelagert.
Antikörperoxidation und Kopplung an Module
Antikörperkohlenhydratreste wurden unter Verwendung von Natriumperiodat oxidiert. Die oxidierte Antikörperlösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur oder über das Wochenende bei 4°C durch Hydrazid-derivatisierte Module umgewälzt. Die beiden unterschiedlichen Oxidations- und Kopplungsvorschriften sind nachstehend gezeigt:
Verfahren 1
Eine Antikörperlösung (0,5 bis 2 mg Ig) wird gegen 0,2 M Natriumacetatpuffer pH 5,0 unter Verwendung einer PD10 Säule (Pharmacia) entsalzt. 40 μl einer 1 M NaIO₄ Lösung werden 2 ml der Antikörperlösung zugesetzt, so dass eine Endkonzentration von 20 mM NaIO₄ erhalten wird. Der Antikörper wird eine Stunde bei 4°C im Dunkeln unter schwachem Rühren oxidiert. Die Reaktion wird mit Glyzerin gequencht (Endkonzentration 15 mM). Die gequenchte Lösung wird sofort gegen Natriumacetatpuffer entsalzt. Die optische Dichte der oxidierten Antikörperlösung bei 280 nm wird gemessen und 6 ml werden durch die Bohrung von Hydrazidderivatisierten Modulen bei 4°C über das Wochenende umgewälzt (bei 200 μl/min). Die optische Dichte der Oxidationslösung wird nach dem Abschluss des Koppelns erneut gemessen. Die Module werden gewaschen und in PBS + 0,1 % Natriumazid bei 4°C gelagert.
Verfahren 2
Der Antikörper wird eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln oxidiert. 20 μl 1 M NaIO₄, Konzentration 10 mM. Nach dem Quenchen wird die Lösung gegen 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) entsalzt und über Nacht durch die Bohrung Hydrazid-derivatisierter Module bei Raumtemperatur umgewälzt.
Strömungsvorschriften für die Zelltrennung
Zur Erzeugung einer Strömung zur Scherfraktionierung von Zellpopulationen wurde ein mikrocomputergesteuertes System verwendet. Die Strömungsvorschriftdatei wird durch eine Software gelesen, die Schrittmotorgeschwindigkeiten sowie Bildschirmanweisungen für Trennexperimente erzeugt. Tabelle 4 zeigt die Trennvorschrift, die in den anschließenden Experimenten verwendet wurde.
Bei einer vertikalen Position des Moduls werden Zellen langsam in die Auslassöffnung des Hohlfasermoduls injiziert (etwa 2,5 ml in 4 Minuten), wobei das Einlassventil geschlossen ist (Filtration mit geschlossenem Ende). Etwa 2 Hohlraumvolumina sind ausreichend, um das Modul mit Zellen zu füllen, was zu einer gleichmäßigen Verteilung von Zellen entlang der Länge des Moduls führt, wobei sich keine Zellen in dem Einlasskopf und relativ wenige Zellen in dem Auslasskopf befinden.
Das Modul wird dann zur Zellsedimentation und -bindung in die horizontale Position gedreht. Die Ablagerungsabstände sind kleiner als 200 μm (Ablagerungszeit < 60 Sekunden), und nach 120 Sekunden wird das Modul langsam um seine Längsachse gedreht (90°-Schritte alle 120 Sekunden). Dies führt zu einer Wahrscheinlichkeit der Zellbindung entlang des gesamten Innenumfangs der Fasern. Nach der Inkubation mit der Membranoberfläche wird das Modul in die vertikale Position zurückgebracht und 10 ml-Zellfraktionen werden nacheinander eluiert, wobei die Strömungsgeschwindigkeit für jede nachfolgende Fraktion auf einen höheren Wert eingestellt wird.
Die Wandscherspannung τ der Hohlfaser wird unter Verwendung von
berechnet, wobei Q die Strömungsgeschwindigkeit der Vorrichtung, μ die Fluidviskosität, n die Anzahl der Fasern pro Vorrichtung und r der Innenradius der Faser ist. Die Abmessungen der verwendeten Module sind in der Tabelle 5 gezeigt.
Die Elutionsscherspannungen für diese Strömungsvorschrift betrugen 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10, 15, 20 Pa (1, 2, 5, 10 , 25, 50, 75, 100, 150, 200 dyn/cm²).
Absorption einkerniger Zellen durch Immunadsorotionsmodule
Das Ausmaß der unspezifischen Adsorption einkerniger Zellen durch Immunadsorptionsmodule wurde gemessen. Die Zellen wurden mittels Apherese von einem Patienten gewonnen, bei dem eine Stammzellenmobilisierung durchgeführt wurde. Erythrozyten wurden aus dem Konzentrat durch Zentrifugation von Zellen über eine Ficolschicht entfernt. Die Zellen wurden innerhalb von 24 Stunden nach dem Sammeln verwendet und Tabelle 6 zeigt die experimentellen Details.
Die Anzahl der in jeder Fraktion gesammelten Zellen wurde unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Die Zellen wurden mit Anti-CD45-FITC und Anti-CD14-PE doppelt gefärbt (Leukogate, Becton Dickinson), um das relative Verhältnis von Lymphozyten und Monozyten zu erhalten. Zur Analyse von Zellfraktionen wurde ein Becton Dickinson Facstar plus verwendet.
6 zeigt die Gewinnung einkerniger Zellen als Funktion der Wandscherspannung. Die Zellen wurden vor der Scherfraktionierung mit der Membran 8 min inkubiert. Die Gewinnung wurde durch Dividieren der Anzahl von Zellen, die in einer Fraktion gewonnen worden sind, durch die Gesamtzahl von Zellen berechnet, die in allen Fraktionen eluiert worden sind (d. h. 0 bis 20 Pa = 0 bis 200 dyn/cm²), und als prozentualer Anteil ausgedrückt. Etwa 98% der gesamten injizierten Population wurden bei 0,1 Pa (1 dyn/cm²) (10 ml) gewonnen. Das relative Verhältnis von Lymphozyten zu Monozyten betrug etwa 4 : 6. In anschließenden Fraktionen kehrte sich dieses Verhältnis um, was nahe legt, dass Monozyten eine relativ größere Affinität für die Membran aufweisen.
Die unspezifische Absorption in Fraktionen, die über 1,0 Pa (10 dyn/cm²) gewonnen wurden, betrug etwa 0,1 bis 0,15% für Monozyten und weniger als 0,01% für Lymphozyten (1 von 10000). Die Reinheit der CD34⁺-Zellfraktionen wird vom Hintergrund der unspezifischen Adsorption abhängen. Da es sich bei den meisten Zellen, die über 1,0 Pa (10 dyn/cm²) eluieren, um CD14⁺ handelt, kann die Reinheit durch Abreicherung dieses Subsatzes verbessert werden.
Trennung von Zelllinien
Mit anfänglichen Experimenten wurde die Trennung von CD34⁺-Zelllinien untersucht. Eine CD34⁺-Zelllinie (KG1a) wurde von NALM-6 (CD34^–) getrennt. NALM-6 Zellen wurden mit Fluoresceinisothiocyanat gefärbt, bevor sie mit der gleichen Zahl von KG1a-Zellen gemischt wurden. 7 zeigt die Anzahl von KG1a- und NALM-6-Zellen, die durch Scherfraktionierung gewonnen wurden. Tabelle 7 zeigt die experimentellen Details für diesen Trenndurchgang.
Nahezu alle NALM-6 Zellen und nur etwa 2% der KG1a-Zellen wurden mit einer Scherspannung von 0,1 Pa (1 dyn/cm²) gewonnen. In einem Scherspannungsbereich von 0,1 bis 1,0 Pa (1 bis 10 dyn/cm²) wurden nur relativ wenig Zellen gewonnen. Die KG1a-Zellen konnten über 1,0 Pa (10 dyn/cm²) gewonnen werden. Die Reinheit dieser Fraktionen betrug mehr als 99,5%. Selbst bei einem heftigen Spülen des Moduls konnten nicht alle KG1a-Zellen gewonnen werden. Die nach wie vor gebundene Fraktion von KG1a wurde durch Subtraktion der Anzahl der gewonnenen KG1a-Zellen von der abgeschätzten Anzahl der injizierten KG1a-Zellen abgeschätzt.
Die Anzahl der injizierten CD34⁺-Zellen kann unter Verwendung des Verhältnisses von CD34⁺/CD34^– aus dem ursprünglichen Gemisch abgeschätzt werden.
Dieses Experiment zeigt, dass das entwickelte Immunadsorptionsmittel eine hohe spezifische Affinität für KG1a-Zellen aufweist.
Um Knochenmark zu simulieren, wurde KG1a menschlichen weißen Blutzellen zugesetzt, die über einen Dichtegradienten separiert worden sind (ungefähr 1 : 100). Tabelle 8 zeigt die experimentellen Details für diese Trennung. Die Menge des immobilisierten Antikörpers (# 9079) entsprach der Menge, die in dem vorhergehenden Experiment gezeigt worden ist (Tabelle 7), während die Zellbeladungsdichte um eine Größenordnung größer war (290000 Zellen/cm²).
8 zeigt die Gewinnung von KG1a-Zellen. Auch hier fand eine starke Bindung von KG1a-Zellen statt. Die Bindungswahrscheinlichkeit von KG1a war von 0,98 auf 0,85 vermindert. Bei höheren Zellbeladungsdichten ist die Blockierung des Bindens durch CD34^–-Zellen wahrscheinlicher.
Trennung mobilisierter Stammzellen (CD34⁺)
Einkernige Konzentrate wurden von Patienten erhalten, bei denen eine periphere Stammzellenmobilisierung unter Verwendung von Kolonie-stimulierenden Faktoren am Royal Adelaide-Krankenhaus durchgeführt wurde. Die Zellen werden innerhalb von 24 Stunden nach dem Sammeln getrennt. Bei jeder Ernte wurden etwa 200 Millionen einkernige Zellen erhalten (etwa 2 × 10¹⁰Zellen).
Tabelle 9 zeigt die experimentellen Details für die ersten drei Trennvorgänge. In folgenden Experimenten wurde die Immunadsorptionsaffinität durch Absenken der Antikörperkopplungskonzentration und -affinität vermindert. # 9079 (HPCA-2) hat eine Dissoziationskonstante, die etwa zehnmal geringer ist, als die von # 9069 (9 C5).
Die Wahrscheinlichkeit des Bindens von CD34⁺-Zellen ist als der Anteil von CD34⁺-Zellen definiert, der nach dem Aussetzen gegenüber einer Scherspannung von 0,1 Pa (1 dyn/cm²) gebunden bleibt. Dies wird aus dem Auftreten von CD34⁺-Zellen berechnet, die sich in der abgereicherten Fraktion (0 bis 0,1 Pa = 0 bis 1 dyn/cm²) und vor der Trennung finden.
Bei Fraktionen, bei denen eine signifikante Gewinnung von CD34⁺-Zellen vorlag, lag eine Reinheit von 70 bis 80% mit hohen Anreicherungsfaktoren (400- bis 600-fach) vor. CD34⁺-Zellen wurden mit Anti-CD34-PE (HPCA-2, Becton Dickinson) gefärbt.
11 zeigt die Durchflusszytometrieanalyse der ursprünglichen Zellpopulation vom Experiment 3. Die Stammzellenpopulation ist durch die Auftragung der CD34-Fluoreszenz gegen den Side Scatter aufgelöst (vgl. den Bereich 2). Die Bereiche 7 und 6 wurden unter Verwendung von Leukogate (Becton Dickinson) bestimmt und entsprechen den Side- und Forward-Lichtstreuungseigenschaften von Lymphozyten (CD45⁺, CD14^–) und von Monozyten (CD45⁺, CD14⁺). Der prozentuale Anteil der CD34⁺-Zellen wird als prozentualer Anteil der Gesamtzahl der einkernigen Zellen (R6 + R7) ausgedrückt. Das Auftreten von Stammzellen lag bei 0,61%.
12 zeigt die Durchflusszytometrieanalyse einer hochangereicherten Fraktion von dem gleichen Experiment. Die analysierte Fraktion wurde zwischen 15 und 20 Pa (150 bis 200 dyn/cm²) gesammelt. Das Auftreten von CD34⁺-Zellen lag bei 80%. Der Anreicherungsfaktor für dieseFraktion wurde wie folgt berechnet:
Cuprophan ist ein geeignetes Substrat für die Affinitätszelltrennung. Es weist ein geringes Niveau an unspezifischer Zellabsorption auf sowie eine Chemie, die für eine kovalente Immobilisierung eines Antikörpers geeignet ist. Die entwickelten Immunabsorptionsmittel hatten eine selektive Affinität für CD34⁺-Zellen (sowohl Kg1a als auch hämopoetische Stammzellen). Stark angereicherte CD34⁺-Zellpopulationen können unter Verwendung einer Scherfraktionierung gewonnen werden.
Die Bindungswahrscheinlichkeit war bei hohen Zellbeladungsdichten (10⁶-Zellen/cm²) niedriger. Die Wechselwirkung von CD34⁺-Zellen mit der Immunadsorptionsmembran kann mittels CD34^–-Zellen blockiert werden. Die Bindungswahrscheinlichkeit bei hohen Zellbeladungsdichten kann durch Erhöhen der Membrankontaktzeiten und durch langsames Drehen der Vorrichtung entlang ihrer Mittelachse erhöht werden. Die Geschwindigkeit der Antikörper-Antigen-Bindungsbildung kann auch die Zellbindungswahrscheinlichkeit beeinflussen, und ein Antikörper mit hoher Affinität (z. B. HPCA-2) kann zu einer schnelleren Zellbindung führen.
Trennung von Stammzellen (CD34⁺) von mobilisiertem Blut unter Verwendung einer Scherfraktionierung und einer Vorbehandlung mit Chymopapain
Zellen, die an das semipermeable Substrat der vorliegenden Erfindung gebunden sind, können vor der Entfernung durch eine Scherspannung mit einem Zellfreisetzungsmittel vorbehandelt werden. Das proteolytische Enzym Chymopapain wurde zur Unterstützung der Entfernung von CD34⁺-Zellen verwendet, die an eine erfindungsgemäße Hohlfaservorrichtung gebunden waren.
Zellquelle
Ein einkerniges Zellkonzentrat wurde aus einem Patienten gewonnen, bei dem eine periphere Stammzellenmobilisierung mit Cyclophosphamid und G-CSF durchgeführt wurde. Die ursprüngliche Population wies 2,74% CD34⁺-Zellen auf.
Modulchemie
Ein Cuprophan-Hohlfasermodul (Bindungsfläche etwa 500 cm²) wurde mit einem monoklonalen Anti-CD34-Antikörper (Klon 9e5) unter Verwendung des Hydrazidverfahrens derivatisiert, wie es vorstehend beschrieben worden ist, und zwar mit der nachstehenden Änderung der Vorschrift. Cuprophan wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 25%igem Ethylenglykoldiglycidylether derivatisiert.
Zellbeladung
Insgesamt 1,7 × 10⁸ Zellen in 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % zugesetztem menschlichen Ig und 0,5% zugesetztem Rinderserumalbumin wurden in das vertikal ausgerichtete Modul unter Verwendung einer Filtration mit geschlossenem Ende injiziert. Die restlichen Zellen in dem Einlassrohr wurden mit weiteren 0,5 ml des Puffers gespült (Filtration mit geschlossenem Ende). Der gesamte Beladungsvorgang dauerte weniger als 8 Minuten. Die Zellen wurden in einer Menge von etwa 340000 Zellen/cm² beladen.
Zellablagerung
Für die Zellablagerung innerhalb des Faserlumens wurde das Modul in die horizontale Position gedreht. Nach 4 Minuten Absetzzeit wurde das Modul während eines Zeitraums von 12 Minuten um seine Längsachse gedreht (2 volle Drehungen).
Zellgewinnung
Für die Zellgewinnung wurde das Modul in die vertikale Position zurückgeführt. Die CD34-abgereicherte Zellpopulation wurde in aufeinanderfolgenden 10 ml-Fraktionen mit einer ansteigenden Scherspannung bis 10 Pa (100 dyn/cm²) (Fraktionen Nr. 1 bis 5) gewonnen.
Anschließend wurden die gebundenen Zellen mit dem proteolytischen Enzym Chymopapain (DISCASE^TM) bei 400 pKat/ml inkubiert. Die Inkubationsdauer betrug 20 min. Während dieser Zeit wurden die freigesetzten Zellen bei einer niedrigen Scherspannung (0,02 Pa = 0,2 dyn/cm², Fraktion 6) gesammelt. Die Scherfraktionierung wurde dann verwendet, um die behandelten Zellen weiter zu reinigen. 10 ml-Fraktionen wurden bei Scherspannungen von 1,0, 5,0 und 10 Pa (10, 50 und 100 dyn/cm²) gesammelt.
Tabelle 10 zeigt die absoluten Zellzahlen, die in den Fraktionen 1 bis 11 gesammelt worden sind. Die meisten der Zellen wurden in der Fraktion 1 gesammelt. Diese Fraktion war bezüglich der CD34⁺-Zellen abgereichert (CD34⁺ = 0,77 %). Das Auftreten der CD34⁺-Zellen erhöhte sich bei einer Erhöhung der Scherspannung (Fraktionen 2 bis 5). Die meisten CD34⁺-Zellen wurden in den Fraktionen 6 und 7 gesammelt. Die Reinheit dieser Fraktionen betrug mindestens 90%. Die Fraktionen 8 bis 11 weisen alle nur sehr wenig CD34⁺-Zellen auf.
Die Bindungswahrscheinlichkeit der CD34⁺-Zellen lag bei 72%. Wenn die Fraktionen 6 und 7 vereinigt werden, liegt die Abtrennausbeute bei 53% (gewonnene CD34⁺-Zellen/eingesetzte CD34⁺-Zellen).
CD34-Antigenexpression
13 zeigt das Niveau der CD34-Antigenexpression in jeder Fraktion, wie sie mittels Durchflusszytometrie bestimmt worden ist (8G12-PE). Zur Bestimmung des Auftretens von CD34⁺-Zellen wurde ein einheitlich ausgewählter Bereich verwendet (vgl. Tabelle 10). Die in den Fraktionen 4 und 5 gesammelten CD34⁺-Zellen hatten ein niedriges Niveau der Antigenexpression (Kanäle 100 bis 1000). Mit Chymopapain freigesetzte Zellen hatten eine höhere Antigenexpression (Kanäle 150 bis 1600). In der Fraktion 7 lagen zwei getrennte Populationen von CD34⁺-Zellen vor (Kanäle 50 bis 120 und 120 bis 1600). Die geringfügig gefärbte Population scheint von dem typischen Fluoreszenzbereich für CD34⁺-Zellen getrennt zu sein (Kanäle 10 bis 100). Daher könnte die Reinheit der Fraktionen 6 und 7 durch den eingesetzten gleichförmigen CD34-Auswahlbereich unterschätzt worden sein (niedriger Side Scatter und niedrige PE-Fluoreszenz > Kanal 105).

Claims

Ein Verfahren zur Entfernung eines gewünschten Zelltyps von einer Probe, die Zellen einschließlich des gewünschten Zelltyps enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Einbringen der Probe in eine Vorrichtung, die ein semipermeables Substrat umfasst, das mit einem Liganden ausgestattet ist, der eine Reaktivität mit einem gewünschten Zelltyp aufweist, (b) Inkubieren zum Ermöglichen des Ablagerns und des Bindens des gewünschten Zelltyps an den Liganden, (c) Behandeln des semipermeablen Substrats durch Eluieren eines Puffers durch die Vorrichtung zur Erzeugung einer Scherspannung, derart, dass die nicht an den Liganden gebundenen Zellen entfernt werden, und gegebenenfalls (d) Behandeln des semipermeablen Substrats durch Eluieren eines Puffers durch die Vorrichtung zur Erzeugung einer Scherspannung, derart, dass die an den Liganden gebundenen Zellen entfernt werden, wobei die Permeabilität des semipermeablen Substrats derart ist, dass der Fluidverlust über das semipermeable Substrat kleiner als 5% ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das semipermeable Substrat aus der Gruppe bestehend aus Cellulose und Polyamid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das semipermeable Substrat Cellulose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das semipermeable Substrat in Form einer Hohlfaser vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Ligand aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Lektin, einem Wachstumsfaktor und einem Rezeptor ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Ligand ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die nicht an das semipermeable Substrat gebundenen Zellen durch eine niedrige Scherspannung entfernt werden und die an das semipermeable Substrat gebundenen Zellen durch eine höhere Scherspannung entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem vor dem Schritt (d) die an das semipermeable Substrat gebundenen Zellen mit einem Zellfreisetzungsmittel behandelt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Zellfreisetzungsmittel ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Enzym Chymopapain ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Scherspannung durch Erhöhen der Viskosität eines Fluids erzeugt wird, welches über das semipermeable Substrat strömt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem nach dem Schritt (c) die gebundenen Zellen unter Bedingungen gehalten werden, bei denen sich die Zellen teilen und vermehren können.
Eine Vorrichtung zum Entfernen eines gewünschten Zelltyps von einer Probe, die den gewünschten Zelltyp umfasst, wobei die Vorrichtung ein semipermeabies Substrat in Form einer Gruppierung von Hohlfasern umfasst, die im Inneren mit einem Liganden ausgestattet sind, der eine Reaktivität mit dem gewünschten Zelltyp aufweist, wobei die Permeabilität des semipermeablen Substrats derart ist, dass während der Entfernung der Zellen durch die Elution eines Puffers zur Erzeugung einer Scherspannung der Fluidverlust über das semipermeable Substrat kleiner als 5 % ist.
Vorrichtung nach Anspruch 14, bei der das semipermeable Substrat aus der Gruppe bestehend aus Cellulose und Polyamid ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der das semipermeable Substrat Cellulose ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei welcher der Ligand aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Lektin, einem Wachstumsfaktor und einem Rezeptor ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 17, bei welcher der Ligand ein Antikörper ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, bei welcher der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 19, bei der die Hohlfasern innerhalb eines zylindrischen Moduls gehalten sind, das Öffnungen aufweist, die es ermöglichen, dass ein Puffer um die Außenseiten der Fasern umgewälzt wird, und das Einlass- und Auslassöffnungen aufweist, die ein Strömen des Puffers durch die Fasern ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 20, bei der das Modul so angeordnet ist, dass der Fluss des Puffers entlang der Innenseite der Faser unabhängig von dem Fluss über der Faser gesteuert werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 21, bei welcher der Fluss zu dem Hohlfasermodul durch eine Pumpeneinrichtung stattfindet.