DE2150581C3

DE2150581C3 - Verfahren und Vorrichtung zum Abtrennen der Lymphozyten aus einer Blutprobe

Info

Publication number: DE2150581C3
Application number: DE2150581A
Authority: DE
Inventors: Bernard Yorktown Heights N.Y. Lichtenstein; Jacques Yonkers N.Y. Padawer
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-10-12
Filing date: 1971-10-11
Publication date: 1981-10-22
Also published as: JPS5727421B1; BE772462A; CH553409A; IT961514B; NL168431C; SE373212B; CA957980A; AU452017B2; AU3360771A; NL7113902A; GB1341509A; DE2150581B2; DE2150581A1; NL168431B; US3700555A; FR2120670A5

Description

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit in ein Transportleitungssystem eingeschalteten Einrichtungen zum fortlaufenden Verarbeiten aufeinanderfolgender Blutproben, gekennzeichnet durch

a) eine Mischeinrichtung (50), welche die ihr zugeführte Blutprobe mit den ihr zugeführten Trennungsmitteln mischt,

b) eine sich daran anschließende Inkubationseinrichtung (52) für das Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch,

c) eine nachgeschaltete Erythrozytensedimentierungseinrichtung (56) danach

d) eine Erythrozytenabführeinrichtung(59,63)und schließlich

e) eine magnetische Trennungseinrichtung (62; 90), welche die magnetisch gekennzeichneten Leukozyten abtrennt, wobei die magnetische Trennungseinrichtung eine horizontal angeordnete Leitung (64) und einen Magneten (80, 82) enthält, der ein praktisch senkrecht ausgerichtetes, die Leitung durchsetzendes ungleichförmiges Magnetfeld erzeugt.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Abtrennen der Lymphozyten aus einer Blutprobe, insbesondere einer Gesamtblutprobe.

Die Abtrennung der Lymphozyten aus einer Gesamtblutprobe mit sehr hoher Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit ist bei der Diagnose und Behandlang von zahlreichen Krankheiten des Menschen von großer Bedeutung.

Da Lymphozyten Zellen mit einem Kern sind, der,

ίο sofern er richtig angeregt wird, der Mitose bzw. Zellteilung unterliegt, ermöglicht die Zugabe eines geeigneten Stoffs in Form von beispielsweise Phythämagglutinin zu den abgetrennten Lymphozyten die Durchführung einer Chromosomenanalyse. Da ferner die Lymphozytenzellwand Antigene enthält, kann man die abgetrennten Lymphozyten zur Herstellung von hochwertigen antilymphozytischen Seren zur therapeutischen Verwendung, zum Prüfen von immunosuppressiven Arzneimitteln und zur In-vitro-Untersuchung der Histokompatibilität bei der Gewebeuntersuchung und wechselseitigen Gewebebestimmung für Transplantationen verwenden, wobei man sowohl vom Spender als auch Empfänger Lymphozyten benötigt.

Weiterhin, ermöglicht die Antikörperbildungsfunktion dsr abgetrennten Lymphozyten ihre Verwendung bei der labormäßigen Untersuchung von unmittelbaren und verzögerten Überempfindlichkeitsreaktionen, beispielsweise von Heuschnupfen, und von Tuberkulose. Allgemein kann man sagen, daß die abgetrennten Lymphozyten bei der Diagnose von zahlreichen besonderen Krankheiten verwendet werden können, wobei die Lymphozyten mit dem Krankheitserreger gemischt werden und die besondere Reaktion der Lymphozyten beobachtet wird.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren und Vorrichtungen zum Abtrennen der Lymphozyten aus Blutproben bekannt. So ist es beispielsweise aus der Literaturstelle »Blood« 7, 891 (1952) bekannt, Eisenteilchen durch Phagozytose in bestimmte Blutzellen einzubringen und die gesamte Blutprobe der Einwirkung eines magnetischen Feldes auszusetzen. Keine dieser bekannten Anordnungen ist jedoch dazu geeignet, die Lymphozytenabtrennung mit einem sehr hohen kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit vorzunehmen, was zur erfolgreichen Verwendung der abgetrennten Lymphozyten für die meisten wichtigen diagnostischen und therapeutischen Zwecke erforderlich ist. (Unter der Reinheit wird die Anzahl der in dem Verarbeitungsausgang vorhandenen Lymphozyten geteilt durch die Gesamtanzahl der darin enthaltenen Leukozyten verstanden. Unter der prozentualen Ausbeute wird die Anzahl der Lymphozyten/mm³ der Ausgangsprobe geteilt durch die Anzahl der Lymphozyten/mm³ der ursprünglichen Gesamtblutprobe verstanden. Dabei werden etwaige Verdünnungen in Betracht gezogen. Unter der Lebensfähigkeit wird die Anzahl der lebenden Lymphozyten im Ausgang geteilt durch die Gesamtanzahl der Lymphozyten in diesem Ausgang verstanden.) Wenn beispielsweise die Lebensfähigkeit der Lymphozyten gering ist, also das Verhältnis der lebenden Lympho/yten /u der Gesamtanzahl der abgetrennten Lymphozyten klein ist, kann man mit diesen abgetrennten Lymphozyten praktisch keine wirksamen antilymphozytischen Seren herstellen.

Weiterhin ist es bei vielen bekannten Verfahren und Vorrichtungen notwendig, die Gesamtblutprobe zur Erhaltung und Aufbewahrung abzukühlen, und zwar von dem Zeitpunkt an, zu dem die Probe dem Patienten

entnommen wird, bis zu demjenigen Zeitpunkt, zu dem die Lymphozyten aus der Probe abgetrennt werden. Durch diese Maßnahme ist die Speicherung und Verschickung der Blutproben teuer und mühsam. Ferner ist bei den meisten bekannten Verfahren und Vorrichtungen eine verhältnismäßig aufwendige Vorbehandlung der Gesamtblutprobe notwendig So wird beispielsweise die Gesamtblutprobe zentrifugiert od. dgl., um vor der Lymphozytenabtrennung einen Leukozytenfilm zu bilden. Dadurch erhöht sich auch der zeilüche Gesamtaufwand zum Abtrennen der Lymphozyten.

Die bekannten Verfahren und Vorrichtungen zum Abtrennen der Lymphozyten sind somit außerordentlich kompliziert und *n jeder Hinsicht aufwendig. Ferner benötigt man besonders geschultes und ausgewähltes Laborpersonal. Darüber hinaus ist die Bearbeitungsgeschwindigkeit gering. Ferner müssen die bekannten Vorrichtungen laufend überwacht und überprüft werden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß Fehler durch das Laborpersonal hervorgerufen werden können. Alles dies führt zu einer unzureichenden und unzulänglichen Lymphozytenabtrennung.

Weiter können nach den bekannten Verfahren und Vorrichtungen lediglich von Hand größere Mengen verarbeitet werden. Es ist weder ein Verfahren noch eine Vorrichtung bekannt, mit denen vollkommen automatisch aus einem Strom von Gesamtblutproben von mehreren verschiedenen Patienten die Lymphozyten kontinuierlich abgetrennt werden können. Es ist daher mit den bekannten Mitteln unmöglich, aus sehr vielen Gesamtblutproben verschiedener Patienter die Lymphozyten in einer schnellen und wenig aufwendigen Weise abzutrennen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit denen die Lymphozyten aus Gesamtblutproben mit einem bisher nicht erreichten kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit abgetrennt werden können. Nur auf diese Weise ist es möglich, Lymphozyten bereitzustellen, die mit großem Erfolg für sehr viele verschiedenartige diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden können.

Weiterhin soll die Vorbehandlung der Gesamtblutproben äußerst einfach und wirkungsvoll sein.

Ferner soll die Möglichkeit bestehen, die Trennung der Lymphozyten vollautomatisch mit einem minimalen Aufwand an Überwachung durch geschultes Personal vorzunehmen.

Dabei soll noch berücksichtigt werden, daß die Vorrichtung aus einfachen und zuverlässig arbeitenden Teilen mit einer hohen Lebensdauer besteht.

Zudem soll die Trennung schnell und mit geringen Kosten durchgeführt werden können.

Weiterhin sollen das Verfahren und die Vorrichtung geeignet sein, aufeinanderfolgend auf der Crundlage des kontinuierlichen Strömungsprinzips die Lymphozyten aus Gesimtblutproben vieler verschiedener Patienten vollautomatisch abzutrennen.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren und die in Anspruch 2 gekennzeichnete Vorrichtung.

Gemäß der Erfindung wird die Gesamtblutprobe praktisch gleichzeitig mit der Entnahme beim Patienten mit einem physiologischen Stabilisierungs- und Antikoagulationsmittel vermischt, das ein Natrium- oder Kaliumsalz, vorzugsweise das Dinatrium- oder Trikaliumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure sein kann, für die im folgenden die Kurzbezeichnung EDTA verwendet wird. Bei dem physiologischen Stabilisierungs- und Antikoagulationsmittel kann es sich auch um die Natriumsalze der CHEL-DPTA- und CHEL-DM-Säure (Diäthylentriaminpenta- und Hydroxyäthylethylendiamintriessigsäure) handeln. Durch die Zugabe dieses Mittels werden die Leukozyten der Gesamtblutprobe stabilisiert, so daß eine Koagulation vermieden wird. Das dabei entstehende Blut wird im folgenden »EDTA«-Blut genannt Die leukoadhäsiven phagozytischen und zusammenballenden Funktionen der phagozytischen Leukozyten, die zu deren Kennzeichnung durch die sensibilisierten magnetischen Teilchen führen, benötigen die Gegenwart von freien positiven Ionen in der Form von Calcium- und Magnesiumionen. Zusätzlich zur Verhinderung der Koagulation des Bluts hat die unmittelbare Bildung des EDTA-Bluts zur Folge, daß die freien positiven Ionen durch das EDTA sequestriert werden, so daß die Ionen in freier Form nicht mehr verfügbar sind, weshalb die leukoadhäsiven, phagozytischen und zusammenballenden Funktionen mit diesem Zeitpunkt unterbunden werden. Dies bedeutet, daß bei Nichtzugabe des Chelatbildner in Form von Äthylendiamintetraessigsäure EDTA zur Gesamtblutprobe oder, als Alternative, bei Nichtvornahme einer aufwendigen und unbequemen Abkühlung der Gesamtblutprobe auf eine tiefe Temperatur von demjenigen Zeitpunkt an, bei dem die Blutprobe dem Patienten entnommen wird, bis zu demjenigen Zeitpunkt, bei dem die Lymphozyten von der Gesamtblutprobe entfernt werden sollen, die leukoadhäsiven, phagozytischen und zusammenballenden Funktionen der phagozytischen Leukozyten unkontrolliert auftreten, mit dem Ergebnis, daß weiße Blutzellen zerstört werden und die Zellenlebensfähigkeit erheblich vermindert wird. Dadurch tritt eine erhebliche Verunreinigung der Lymphozyten durch tote Zellen auf, die dann die nachfolgende Leukoadhäsion und Phagozytose sperren, die notwendigerweise vorgenommen werden müssen, um gemäß der Erfindung die Lymphozytenabtrennung mit einem hohen Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit durchzuführen. Die Abtrennung der Lymphozyten aus der in obiger Weise stabilisierten Gesamtblutprobe wird durch die Zugabe eines Trennungsmittels eingeleitet, das die folgenden Substanzen enthält:

(a) Magnetische Teilchen, beispielsweise Carbonyleisenteilchen, Ferritteilchen oder Magnetitteilchen mit einer Korngröße von 1 bis 4 μηι. Nach ihrer Aktivierung bzw. Sensibilisierung bewirken diese Teilchen die Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten mit einer Korngröße von 1 bis 4 μηι, also der neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten. Die Kennzeichnung durch die magnetischen Teilchen geschieht durch Leukoadhäsion, Phagozytose und Zellenzusammenballung. Die Lymphozyten bleiben von diesen Vorgängen verschont.

(b) Freie Magnesium- und Calciumionen, beispielsweise in Form von aufgelösten Salzen an Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, die den Ionengehalt des EDTA-Bluts auf seinen ursprünglichen Wert zurückbringen, indem sie die positiven freien Ionen, die in der oben beschriebenen Weise durch die Äthylendiamintetraessigsäure EDTA gebunden werden, ersetzen, um somit für die Leukoadhäsion und Phagozytose eine optimale Ionenkonzentration vorzusehen.

(c) Eine geringe Menge eines geeigneten Antikoagula-

tionsmittels in Form von Heparin, um während der für die Lymphozytentrennung erforderlichen Zeit die Blutprobenzusammenballung bzw. -gerinnung zu verhindern.

(d) Eine sensibilisierende Verbindung mit positiv geladenen Molekülen in Form einer basischen Polyaminosalze oder von Polypeptiden in Form der D-, DL- oder L-Formen von Polylysin, Polyarginin, Polyornithin, Polycitrullin od. dgl., um die Leukoadhäsion und Phagozytose durch Sensibilisierung oder Erhöhen der positiven Oberflächenladung an den magnetischen Teilchen durch Adsorption zu erhöhen.

(e) Eine Dextroselösung zum Liefern von Energie für die Phagozytose.

(f) Eine mit dem Blutplasma isotonische Salzlösung, beispielsweise in Form von Hanks BSS (balanced salt solution), um für den Trennungsprozeß ein physiologisches Lösungsmedium bereitzustellen.

(g) Einen sedimentierenden Stoff für die roten Blutkörperchen aus einem Senkungsmittel von hohem Molekulargewicht, beispielsweise in Form von Dextran, synthetischem Polysaccharid, Phytämagglutinin od. dgl. in Kombination mit, beispielsweise, einer geringen Menge des Mononatrium- oder Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure EDTA, um die Erythrozentensenkung zu fördern, und zwar dadurch, daß die Erythrozyten zur Zusammenbailung veranlaßt werden und dadurch leichter zum Boden des Gemischstroms absinken.

Nach der Zugabe des Trennungsmittels wird das Gesamtblutproben-Trennungsmittel-Gemisch zur Unterstützung und Intensivierung der Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten einem Inkubationsvorgang unterzogen. Im Anschluß an die Inkubation wird der Gemischstrom durch eine Absetzeinrichtung geleitet, wobei sich der größte Teil der Erythrozyten am Boden absetzt und dadurch sehr leicht, beispielsweise durch Dekantierung abgeführt werden kann.

Danach wird der Gemischstrom durch eine magnetische Abtrennungseinrichtung geleitet, die ein ungleichförmiges Magnetfeld aufweist, das dazu dient die mit den magnetischen Teilchen gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten zusammen mit dem Hauptanteil der Thrombozyten, die an den phagozytischen Leukozyten anhaften, in einer solchen Weise aus dem Gemisch abzutrennen, daß die Anzahl der mitgerissenen Lymphozyten äußerst gering ist (Leukozyten bestehen bei den meisten gesunden Erwachsenen aus einem Zellengemisch, beispielsweise aus etwa 63% bis 72% neutrophiien Granuiozyten, erwa 2% bis 5% eosinophilen Granuiozyten. etwa 0% bis 1% basophilen Granuiozyten, etwa 4% bis 8% Monozyten und etwa 20% bis 30% Lymphozyten.) Die nicht gekennzeichneten Lymphozyten werden dann mit einem Teil der Resterythrozyten und Blutplasma sowie einer geringen Menge nichtlymphozytischer Leukozyten, die eine Verunreinigung darstellen, abgezogen. Danach kann man durch Hämolyse die restlichen Erythrozyten abtrennen und die Lymphozyten in üblicher Weise auswaschen.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden an Hand der Zeichnungen beschrieben. Es stellt dar:

F i g. 1 die Leukoadhäsion zwischen den phagozytischen Leukozyten einer Gesamtblutp^robe und sensibilisierten magnetischen Teilchen,

Fig.2 die Phagozytose von sensibilisicrten magnetischen Teilchen durch lebende phagozytische Zellen,

Fig.3 eine Form von Leukozytenzusammenballung, einschließlich von Blutplättchen,

F i g. 4 eine andere Art von Leukozytenzusammenballung, einschließlich von Blutplättchen,

Fig.5 ein schematisches Strömungsdiagramm einer nach der Erfindung aufgebauten und arbeitenden Vorrichtung mit einer ersten Ausführungsform einer Einrichtung zur magnetischen Lymphozytenabtrennung,

F1 g. 6 einen senkrechten Querschnitt durch die in der Fig. 5 dargestellte magnetische Abtrennungseinrichtung,

F i g. 7 ein schematisches Strömungsdiagramm einer zweiten Ausführungsform einer magnetischen Lymphozytenabtrennungseinrichtung, die in der in der Fig.5 dargestellten Vorrichtung Verwendung findet.

In Fig. 1 ist die Leukoadhäsion im einzelnen dargestellt. Dabei sind die magnetischen Teilchen mit 10, die phagozytischen Leukozyten in Form von neutrophiien Granuiozyten, Monozyten, eosionophilen Granuiozyten oder basophilen Granuiozyten mit 12 und die Thrombozyten oder Blutplättchen mit 14 bezeichnet Bei Anwesenheit der sensibilisierten magnetischen Teilchen 10 und der freien positiven Ionen, die durch Zugabe von Calciumchlorid- und Magnesiumchloridlösungen erzeugt werden, werden die äußeren Zellwände der phagozytischen Leukozyten klebrig und adhäsiv, so daß die magnetischen Teilchen 10 an ihnen haften bleiben. In ähnlicher Weise verkleben die Thrombozyten 14 sowohl mit den Leukozyten 12 als auch mit den magnetischen Teilchen 10.

Die sich daran anschließende Phagozytose ist in Fig.2 dargestellt. Dabei werden eines oder mehrere der sensibilisierten magnetischen Teilchen 10 durch die phagozytischen Leukozyten 12 aufgenommen.

Die Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten wird durch die Leukozytenzusammenballung beendet wie es in der F i g. 3 dargestellt ist Die Kennzeichnung umfaßt noch das Verkleben der äußeren Zellwand einer phagozytischen Leukozyte mit der äußeren Zellwand einer anderen phagozytischen Leukozyte, die ein magnetisches Teilchen 10 aufgenommen hat. Wie in F i g. 4 dargestellt kann aber auch die äußere Zellwand einer phagozytischen Leukozyte in Form einer neutrophiien Granulozyte oder Monozyte, die ein magnetisches Teilchen 10 aufgenommen hat und an der durch Leukoadhäsion noch ein anderes magnetisches Teilchen 10 klebt mit der äußeren Zellwand einer eosinophilen oder basophilen Granulozyte verklebt sein, an der wiederum eine neutrophile Granulozyte oder eine Monozyte haftet mit der durch Leukoadhäsion ein weiteres magnetisches Teilchen 10 verklebt ist.

In Fig.5 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt Diese Vorrichtung dient der schnellen und vollkommen automatischen Abtrennung der Lymphozyten aus aufeinanderfolgenden Gesamtblutproben verschiedener Patienten, wobei die Vorrichtung nach dem kontinuierlichen Strömungsprinzip arbeitet Die dargestellte Vorrichtung enthält eine Zufuhreinrichtung 20 zum Zuführen der Gesamtblutproben. Die Zufuhreinrichtung 20 kann in der gleichen Weise aufgebaut sein, wie aus der US-PS 31 34 263 bekannt

Die Zufuhreinrichtung 20 enthält einen Drehteller 22, auf dem eine kreisförmige Reihe von Gesamtblutpro-

benbehältern 24 angeordnet ist. Eine Probenentnahmeeinrichtung 26 enthält ein Probenentnahmerohr 28 und eine mit dem Probenentnahmerohr verbundene Betätigungseinrichtung 30. Ein Waschflüssigkeitsbehälter 32' ist neben dem Drehteller 22 angeordnet. Eine Antriebseinrichtung 34' dient, wie durch gestrichelte Linien angedeutet, zum Antrieb des Drehtellers 22 und der Probenentnahmerohrbetätigungseinrichtung 30. Jeder der Gesamtblutprobenbehälter ist mit einer Gesamtblutprobe eines anderen Patienten gefüllt. Diese ι ο Gesamtblutproben sind, wie oben beschrieben, mit Äthylendiamintetraessigsäure EDTA behandelt, so daß die Probenbehälter EDTA-Blut enthalten.

Beim Betrieb der Vorrichtung wird der Drehteller 22 schrittweise weitergedreht, um die Blutprobenbehälter 24 nacheinander dem Probenentnshmerchr 28 darzubieten. Das Probenentnahmerohr wird dabei derart betätigt, daß sein Einlaßende zunächst für eine vorgegebene Zeitspanne in den dargebotenen Gesamtblutprobenbehälter eintaucht, um ein vorgegebenes Blutprobenvolumen anzusaugen. Im Anschluß daran wird das Einlaßende des Probenentnahmerohrs durch die Umgebungsluft zu dem Waschflüssigkeitsbehälter 32' geschwenkt, um für eine vorgegebene Zeitspanne ein Umgebungsluftvolumen und im Anschluß daran ein vorgegebenes Volumen der Waschflüssigkeit anzusaugen. Die Umgebungsluft und die Waschflüssigkeit dienen als Trennungs- und Reinigungsschübe. Danach wird das Einlaßende des Probenentnahmerohrs wiederum durch die Umgebungsluft zu dem nächsten Blutprobenbehälter 24 geschwenkt, um während einer vorgegebenen Zeitspanne ein weiteres Umgebungsluftvolumen anzusaugen. Diesem Umgebungsluftvolumen folgt dann die aus dem nächsten Probenbehälter angesaugte Blutprobe.

Auf diese Weise entsteht ein Fluidstrom aus aufeinanderfolgenden Gesamtblutproben mit vorgegebenem Volumen, die jeweils durch einen Luftschub, einen Waschflüssigkeitsschub und einen weiteren Luftschub voneinander getrennt sind.

Eine Dosierpumpe 32, die beispielsweise den gleichen Aufbau haben kann, wie aus der US-PS 32 27 0Oi bekannt, enthält zusammendrückbare Pumpenschläuche 34, 35, 36 und 38, die von mehreren nicht dargestellten Pumpenwalzen bei der Darstellung nach der F i g. 5 von links nach rechts fortschreitend gleichzeitig zusammengedrückt werden, um in dieser Richtung Fluide durch die Pumpenschläuche zu pumpen. Die Beziehung der Durchflüsse durch die einzelnen Pumpenschläuche hängt von dem Innendurchmesser der Pumpenschläuche ab.

Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 34 ist an das Auslaßende des Entnahmerohrs 28 angeschlossen. Der Gesamtblutprobenstrom wird daher von der Pumpe durch den Pumpenschlauch 34 gepumpt.

Der Auslaß des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 34 ist mit dem Einlaß 41 eines Verzweigungsstücks 39 verbunden. Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 35 ist auf der linken Seite gegenüber der Atmosphäre offen, so daß über diesen Schlauch Umgebungsluft angesaugt wird. Das Auslaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 35 ist an den anderen Einlaß 37 des Verzweigungsstücks 39 angeschlossen, um in dem Verzweigungsstück den Gesamtblutprobenstrom mit der angesaugten Umgebungsluft zusammenzuführen. Dadurch werden Luftzwischenschübe gebildet, die die einzelnen Gesamtblutproben und in ähnlicher Weise die einzelnen Waschflüssigkeitsschübe unterteilen.

Ein Behälter 40 enthält das bereits beschriebene Trennungsmittel mit den oben erwähnten Substanzen. Der Behälter 40 enthält also ein Gemisch aus magnetischen Teilchen, die durch die positiv geladene basische Polyaminosäure oder das Polypeptid in einer Lösung aus Dextrose sensibilisiert sind, die in der folgenden Weise hergestellt werden kann. Eine Lösung mit etwa 5% Dextrose in destilliertem Wasser wird mit der basischen Polyaminosäure oder dem Polypeptid in einem Verhältnis von etwa 1 Gewichtsteil des letzten Stoffs zu etwa 10 000 Gewichtsteilen des ersten Stoffs gemischt, um etwa eine 0,01 %ige Lösung der basischen Polyaminosäure in der Dextroselösung zu bilden. Dazu werden dann etwa iOO Gewichtsteile der magnetischen Teilchen zugegeben. Das sich ergebende Gemisch wird beispielsweise bei etwa 4^CC für etwa 30 Minuten inkubiert und anschließend zentrifugiert, um die magnetischen Teilchen zu konzentrieren. Die überschüssige Flüssigkeit wird weggegossen, und die magnetischen Teilchen in etwa 10 000 Gewichtsteilen der Dextroselösung erneut suspendiert, um schließlich eine Suspension zu erhalten, die sich in dem Behälter 40 befindet. Die beschriebene Inkubation bewirkt die Adsorption der basischen Polyaminosäure oder des Polypeptids auf der Oberfläche der magnetischen Teilchen, um diese durch Erhöhen der positiven Oberflächenladung zu sensibilisieren, um dadurch die oben beschriebene Leukoadhäsion und Phagozytose zu verstärken, wozu die Dextrose die Energie liefert.

Weiterhin ist in dem Trennungsmittel in dem Behälter 40 eine isotonische Salzlösung aus einer Calciumchlorid- und Magnesiumchloridlösung enthalten, die die zur Leukoadhäsion und Phagozytose notwendigen positiven freien Ionen liefern. Weiterhin enthält der Behälter 40 Hanks BSS, um ein physiologisches Lösungsmittel bereitzustellen. Der Behälter 40 enthält eine weitere Menge der Dextroselösung, die geringe Menge Heparin, das während der Lymphozytenabtrennung die Zusammenballung verhindert, und das Sedimentierungsmittei, das eine Kombination aus dem Erythrozytensenkungsmittel und den Mononatrium- oder Dinatriumsalzen der Äthylendiamintetraessigsäure EDTA enthält, die den Abtrennungsprozeß nicht behindert.

Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 36 ist in den Behälter 40 eingetaucht. Das Trennungsmittel wird in Richtung des eingezeichneten Pfeils durch diesen Pumpenschlauch gefördert

Die Einlaßenden 52' und 54 eines Verzweigungsstücks 50 sind in der gezeigten Weise an den Auslaß 53 des Verzweigungsstücks 39 bzw. den Auslaß des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 36 angeschlossen. Auf diese Weise werden in dem Verzweigungsstück 50 das aus dem Behälter 40 stammende Trennungsmittel und die luftunterteilten Gesamtblutproben des Probenstroms aus den Probenbehältern 24 zusammengeführt Ein Dreiwegventil 47 befindet sich im Einlaßende 54 des Verzweigungsstücks 50. Eine Rückleitung 49 verbindet das Ventil 47 mit dem das Trennungsmittel enthaltenden Behälters 40. In einer ersten Stellung des Ventils 47 verläuft der Strömungsweg durch das Einlaßende des Verzweigungsstücks. In einer zweiten Stellung des Ventils 47 verläuft der Strömungsweg von dem zusammendrückbaren Pumpenschlauch 36 über die Rückleitung 49 zurück zum Behälter 40. Durch geeignete Wahl der Innendurchmesser der zusammendrückbaren Pumpenschläuche 34, 36 und 38 kommen

etwa 4 Volumenteile des Trennungsmittels auf 1 Volumenteil des Gesamtblutprobenstroms in dem Verzweigungsstück 50.

Der Auslaß 55 des Verzweigungsstücks 50 ist an einen Inkubatormischer 52 angeschlossen. In dem Inkubatormischer 52 wird der Blutproben-Trennungsmittel-Gemischstrom vollkommen durchmischt und inkubiert. Vorzugsweise wird der Inkubatormischer auf einer Inkubationstemperatur von etwa 37° C gehalten. Der Durchfluß des endgültigen Gemischs ist derart gewählt, daß die Verweilzeit des Gemischs in dem Inkubatormischer etwa 30 Minuten beträgt. Während dieser Inkubationszeit erfolgt der Hauptanteil der Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten durch Leukoadhäsion der sensibilisierten magnetischen Teilchen an den neutrophilen Granulozyten, Monozyten, eosinophilen Granulozyien und basophtlen Granuiozyten, sowie der Hauptanteil der Phagozytose der sensibilisierten magnetischen Teilchen durch die phagozytischen Leukozyten und der Zusammenballung der phagozytischen Leukozyten.

Eine Sedimentierungseinrichtung 56 enthält eine Reihe von praktisch horizontal angeordneten Windungen einer Absetzschlange 58. Das Einlaßende 60 der Sedimentierungseinrichtung 56 ist an das Auslaßende des Inkubatormischeis 52 angeschlossen, so daß der gemischte und inkubierte Blutproben-Trennungsmittel-Gemischstrom durch die Sedimentierungseinrichtung strömt. Dadurch setzen sich die infolge des Sedimentierungsmittels zusammengeballten Erythrozyten im unteren Teil des Gemischstroms ab. Weiterhin setzen sich in dem unteren Teil des Stroms die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten ab, die infolge des Anhaftens der sensibilisierten magnetischen Teilchen etwas schwerer und darüber hinaus mit einigen Thrombozyten zusammengeballt sind.

Wie gezeigt, befindet sich in der Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung 56 ein quer zur Strömungsrichtung verlaufendes Dekantierstück 59. Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 38 ist an den Auslaß 63 des Dekantierstücks 59 angeschlossen, um daraus Fluide abzupumpen. Wenn daher das einem Absetzvorgang unterworfene Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch durch die Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung 56 strömt, wird der Hauptanteil der abgesetzten Erythrozyten zusammen mit einem Anteil der größeren gekennzeichneten Leukozytenklumpen und der Thrombozyten über das Dekantierstück 59 und den angeschlossenen zusammendrückbaren Pumpenschlauch 38 aus dem Strom entfernt Der über das Dekantierstück 59 entfernte Anteil des Blutproben-Trennungsmittel-Gemischstroms kann beispielsweise et-va 25 Vol.-% des Gernischsirörnvolurnens betragen.

Eine magnetische Lymphozytenabtrennungseinrichtung 62 enthält eine praktisch horizontal verlaufende Leitung 64 mit einem Einlaß 66 und einem Auslaßnippel 68, der sich in der gezeigten Weise erstreckt Das Auslaßende 70 der Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung ist an den Einlaß 66 der Leitung 64 angeschlossen, so daß durch die magnetische Abtrennungseinrichtung 62 ein abgesetzter Strom aus einem Gemisch strömt, das gekennzeichnete phagozytische Leukozyten und Thrombozyten, nicht gekennzeichnete Lymphozyten, Rest-Erythrozyten und Blutplasma enthält

Die magnetische Abtrennungseinrichtung 62 enthält weiterhin eine Magneteinrichtung 76, beispielsweise in Form eines Stern-Gurlach-Magneten mit Magnetteilen 80 und 82, die in der gezeigten Weise oberhalb und unterhalb der praktisch horizontal verlaufenden Leitung 64 angeordnet sind. Die Magenteinrichtung 76 erzeugt ein praktisch senkrecht gerichtetes Magnetfeld, das die Leitung 64 durchsetzt, wie es in Fig.6 durch gestrichelte Linien angedeutet ist. Das Magnetfeld hat einen hohen Feldgradienten, ist also nicht gleichförmig.

Wenn die Gemischstromschübe durch die Leitung 64 strömen, werden infolge des höheren Magnetfeldgradienten im unteren Leitungsteil die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten nach unten gezogen, so daß eine solche Gesamtleukozytenverteilung entsteht, daß im oberen Abschnitt jedes Schubs ein wesentlich höherer Prozentsatz an Lymphozyten als im unteren Abschnitt jedes Schubs enthalten ist. Jedes Gemischsiromsegmeni wird demzufolge in einen unteren Schubanteil 84 mit gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten und Thrombozyten sowie vielen Resterythrozyten und in einen oberen Schubanteil 86 geteilt, der übermäßig viele nicht gekennzeichnete lebende Lymphozyten und sehr wenig Resterythrozyten enthält.

Demzufolge, und weil der unterteilte Strom immer noch unter dem Einfluß der Magneteinrichtung 76 steht, wird praktisch der gesamte obere Schubanteil 86 jedes Stromsegments über den Auslaßnippel 68 mittels einer Pumpe 87' abgesaugt, während der Rest des unterteilten Stroms, wie es gezeigt ist, durch das Auslaßende der Leitung 64 strömt.

Das ungleichförmige Magnetfeld mit dem hohen Feldgradienten verhindert eine Brückenbildung der magnetischen Teilchen od. dgl., so daß die magnetischen Teilchen oder Blutzellen in der Leitung 64 nicht eingefangen werden, wodurch die Abtrennungsausbeute erhöht wird.

Derjenige Anteil jedes Schubs, der über den Auslaßnippel 68 abgesaugt wird, enthält in Suspension in dem Blutplasma einen sehr hohen Prozentsatz der lebenden Lymphozyten der betreffenden Gesamtblutprobe, und zwar infolge der erzwungenen Wanderung der gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten zum Boden der Leitung 64, was, wie beschrieben, auf die Wirkung des praktisch vertikal ausgerichteten ungleichförmigen Magnetfelds mit dem hohen Feldgradienten der Magneteinrichtung 76 zurückzuführen ist Weiterhin enthält der über den Ablaßnippel 68 abgesaugte Anteil eine äußerst geringe Restmenge an Erythrozyten von der Gesamtblutprobe, was darauf zurückzuführen ist daß ein Großteil der Erythrozyten bereits über das Dekantierstück 59 abgeführt worden ist und viele der Resterythrozyten von den gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten mitgerissen sind. Die verbleibenden

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iütpiasrna susp£n«jiert

Das Aufsammeln der Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspension wird für jede Gesamtblutprobe eines Probenbehälters 24 des Drehtellers 22 unabhängig vorgenommen, und zwar beispielsweise durch Anordnung und Betätigung eines zweiten Drehtellers 87 mit einer kreisförmigen Reihe von Suspensionssammelbehältern 88. Der Drehteller 87 ist wie gezeigt am Auslaßende des Auslaßnippels 68 angeordnet. Für jede Gesamtblutprobe ist ein getrennter Sammelbehälter vorgesehen. Der Drehteller 87 wird in Abhängigkeit von der Strömung der Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspension von einer Antriebseinrichtung 89 schrittweise weitergeschaltet Dieses Weiterschalten erfolgt bezüglich des Auslaßendes des Auslaßnippels derart, daß die einzelnen Suspensionen unabhängig und

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getrennt voneinander aufgesammelt werden. Zum unabhängigen Aufsammeln der interessierenden Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspensionen kann man auch andere verschiedenartige Sammeleinrichtungen vorsehen.

Die Abtrennung der Lymphozyten von jeder der in obiger Weise aufgesammelten Lymphozyten-Erythrozyten-Piasmasuspensionen, die eine geringe Menge von Verunreinigungszellen in Form von Thrombozyten, eosinophilen Granulozyten und bzw. oder basophilen Granulozyten enthalten können, kann in jedem Fall mit Einern hohen Wirkungsgrad durch einfache Hämolyse und anschließender Lymphozytenauswaschung sowie durch Wiedersuspension in an sich bekannter Weise vorgenommen werden.

Dem durch die magnetische Abtrennungseinrichtung 62 strömenden iuftsegmentierten Gemisch aus dem Trennungsmittel und jeder Gesamtblutprobe eines Behälters 24 folgt ein luftunterteilter Waschflüssigkeitsschub vom Behälter 32, der irgendwelche Rückstände der vorangegangenen Probe in dem Leitungssystem der Vorrichtung entfernt und dadurch eine Verseuchung der nachfolgenden Blutprobe durch die vorangegangene verhindert Wenn die Waschflüssigkeit durch die Vorrichtung strömt, wird das Ventil 47 in seine zweite Stellung gebracht, um das aus dem Behälter 40 angesaugte Trennungsmittel in den Behälter zurückzuführen. Dadurch wird zum einen die Wirksamkeit des Auswaschens erhöht, und zum anderen der Trennungsmittelverbrauch so gering wie möglich gehalten. Weiterhin wird, wenn der luftunterteilte Waschflüssigkeitsschub durch die magnetische Abtrennungseinrichtung 62 strömt, das die Leitung 64 durchsetzende magnetische Feld der magnetischen Abtrennungseinriehlung 62 abgeschaltet. Dies kann dadurch geschehen, daß die Erregung von den Magneten abgeschaltet oder die Leitung 64 zwischen den Magneten herausbewegt wird. Auf diese Weise wird eine höhere Wirksamkeit des Auswaschvorganges erzielt und zwar dadurch, daß die restlichen magnetischen Teilchen sowie roten Blutkörperchen und weißen Blutzellen, die gekennzeichnet sein können, leichter von dem luftunterteilten Waschflüssigkeitsschub mitgenommen werden können.

Eine weitere Ausführungsform der magnetischen Abtrennungseinrichtung, die in Verbindung mit der Probenzufuhreinrichtung 20, der Pumpe 32, dem Inkubatormischer 52 und der Sedimentierungseinrichtung 56, die alle in F i g. 5 dargestellt sind, verwendet werden kann, ist in F i g. 7 gezeigt. Diese magnetische Abtrennungseinrichtung 90 enthält eine Leitung 92, deren Einlaß in der gezeigten Weise an die Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung angeschlossen ist Arn Ende der Leitung 92 ist eine Enigasungseinrichtung 94 angebracht, die aus dem unterteilten Gesamtblutprobensuspensionsstrom die Gase bzw. Luftschübe entfernt

Ein Abtrennungskammergehäuse 96 bildet eine Abtrennungskammer 98, die praktisch senkrecht unter dem Ende der Leitung 92 angeordnet ist Eine Lymphozytenauslaßieitung 102 und eine Abflußleitung 100 sind in der gezeigten Weise am oberen und unteren Ende der Abtrennungskammer 98 angeordnet

Ein zentrisches Rohr 103 erstreckt sich vom Ende der Leitung 92 mittig in die Abtrennungskammer 98. Das zentrische Rohr 103 endet wie gezeigt in einer begrenzten Öffnung 104, deren Umgebung durch ein ungleichmäßiges magnetisches Feld mit einem hohen Feldgradienten eines Magneten 106 magnetisiert ist der in der gezeigten Weise unmittelbar unter der öffnung 104 in dem Abtrennungskammergehäuse 96 angeordnet ist

Beim Betrieb ist zunächst zur Abtrennung der Lymphozyten eines segmentierten Gesamtblutprobengemischs des Blutprobenstroms die Abflußleitung 100 durch ein Ventil 108 abgesperrt Wenn der segmentierte bzw. unterteilte Probenstrom von der Sedimentierungseinrichtung 56 (Fig.5) über die Leitung 61 zu der Abtrennungseinrichtung 90 gepumpt wird, werden zunächst von der Entgasungseinrichtung 94 die trennenden Lufteinschübe entfernt. Der sich dabei ergebende kontinuierliche Gemischstrom der interessierenden Gesamtblutprobe fließt dann durch das zentrische Rohr 103 nach unten und durch die magnetische öffnung 104 hindurch in die Abtrennungskammer 98, um diese zu füllen. Dabei werden die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten, Thrombozyten und viele der restlichen Erythrozyten im unteren Teil 84 der Abtrennungskammer 98 zurückbehalten, und zwar infolge des darin herrschenden ungleichförmigen Magnetfelds, das in geeigneter Weise polarisiert ist, um die suspendierten magnetischen Teilchen anzuziehen. Die nicht gekennzeichneten Lymphozyten sowie ein Teil der Erythrozyten und das Blutplasma steigen in den oberen Teil 86 der Abtrennungskammer auf und strömen von dort zum Aufsammeln über die Lymphozytenauslaßieitung 102 ab.

Wenn der interessierende Gesamtblutprobengemischstrom durch die magnetische Abtrennungseinrichitung 90 beendet ist und jetzt der erste zwischen zwei !Proben befindliche Luftschub, der Waschflüssigkeitsschub und der zweite Luftschub auftreten, bleibt das Ventil 1Ö8 zunächst geschlossen, um den oberen Teil der Abtrennungskammer 98 und die Lymphozytenauslaßleitung 102 vollständig auszuwaschen. Im Anschluß daran wird das Ventil 108 geöffnet, so daß jetzt der Zugang zur Abflußleitung 100 frei ist Ferner wird das Magnetfeld abgeschaltet Die im unteren Teil der Abtrennungskammer 98 eingefangenen gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten sowie ein großer Teil der Thrombozyten und Erythrozyten werden nun ausgewaschen und über die Abflußleitung 100 abgeführt Dadurch wird die Abtrennungskammer für die nächste Lymphozytentrennung vorbereitet.

Das Sammeln der resultierenden Lymphozyten-Erythrozyten-PIasmasuspension und die nochwirksame Abtrennung der Lymphozyten aus dieser Suspension können in der gleichen Weise vorgenommen werden, wie im Zusammenhang mit der in F i g. 5 dargestellten magnetischen Abtrennungseinrichtung 62 beschrieben.

Die tatsächliche Anwendung des Verfahrens der Erfindung zum Abtrennen der Lymphozyten aus Gesamtblutproben erweist sich als äußerst wirkungsvoll, wobei eine bisher unerreichte Kombination von etwa 97% Reinheit etwa 80% Ausbeute und etwa 99% Lebensfähigkeit erzielt wird.

Obwohl nur die äußerst wirksame Abtrennung der Lymphozyten aus einer Reihe von Gesamtblutproben geringen Volumens von verschiedenen Patienten beschrieben ist kann man das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung gleichermaßen zur Abtrennung der Lymphozyten aus einer verhältnismäßig großvolumigen Kombination von Gesamtblutproben verschiedener Patienten verwenden, was von der Art der Verwendung der abgetrennten Lymphozyten abhängt

Weiterhin können die verschiedenen Trennungsmittelsubstanzen in mehreren getrennten Behältern untergebracht sein. Die Substanzen können automatisch unter Verwendung von weiteren zusammendrückbaren Pumpenschläuchen und entsprechenden Verzweigungsstücken in vorgegebenen Verhältnissen gemischt werden. Ferner kann man das interessierende Lymphozyten-Erythrozyten-Plasma noch einmal durch die Vorrichtung strömen lassen, um eine noch größere Reinheit zu erzielen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Pateritansprüche:

1. Verfahren zum Abtrennen der Lymphozyten aus einer Blutprobe, bei dem die Blutprobe mit einem magnetische Teilchen enthaltenden Trennmittel vermischt und das Blutproben/Trennungsmittel-Gemisch einem magnetischen Feld ausgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß

A. die Blutprobe mit einem physiologischen Stabilisierungs- und Antikoagulationsmittel aus der Reihe der Gelatbildner EDTA bzw. einem Natriumsalz der CHEL-DPTA oder CHEL-DM-Säure vermischt,

B. die Abtrennung der Lymphozyten aus dem stabilisierten Blut durch die Zugabe eines Trennungsmittels eingeleitet wird, das die folgenden Substanzen enthält:

a) magnetische Teilchen mit einer Korngröße von 1 bis 4 μιτι,

b) freie Magnesium- und Calciumionen,

c) Heparin,

d) eine sensibilisierende Verbindung mit positiv geladenen Molekülen in Form einer basischen Polyaminosalze oder von Polypeptiden in Form der D-, DL- oder L-Arten von Polylysin, Polyarginin, Polyornithin oder Polycitrullin,

e) eine Dextroselösung,

f) eine mit dem Blutplasma isotonische Salzlösung,

g) einen sedimentierenden Stoff für die roten Blutkörperchen aus einem Senkungsmittel von hohem Molekulargewicht, wie synthetisches Polysaccharid oder Phythämagglutinin, in Kombination mit dem Mononatrium- oder Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure,und

C. vor der Einwirkung des magnetischen Felds das Blutproben/Trennungsmittel-Gemisch zur Unterstützung der Phagozytose inkubiert wird und die Erythrozyten durch Sedimentieren aus dem Gemisch entfernt werden.