DE2150581A1

DE2150581A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Trennen der Lymphozyten von einer Blutprobe

Info

Publication number: DE2150581A1
Application number: DE19712150581
Authority: DE
Inventors: Bernard Lichtenstein; Jacques Padawer; Lynn Paseltiner; R M Widmark
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-10-12
Filing date: 1971-10-11
Publication date: 1972-04-13
Also published as: DE2150581C3; BE772462A; DE2150581B2; NL168431B; IT961514B; NL168431C; AU452017B2; AU3360771A; US3700555A; CA957980A; FR2120670A5; JPS5727421B1; CH553409A; GB1341509A; SE373212B; NL7113902A

Description

Patentanwälte

Dr.-Ing. Wilhelm ßeiahel
DipL-Ing. Woligang Mühel

6 Frankfurt a. M. 1
Parksiraße 13

6792

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, VStA

Verfahren und Vorrichtung zum Trennen der Lymphozyten von einer Blutprobe

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Trennen der Lymphozyten von einer Blutprobe, insbesondere einer Gesamtblutprobe.

Die Trennung der Lymphozyten von einer Gesamtblutprobe mit einem sehr hohen kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit ist bei der Diagnose und Behandlung von zahlreichen Krankheiten des Menschen von großer Bedeutung.

Da ein Lymphozyt eine Zelle mit einem Kern ist, der, sofern er richtig angeregt wird, der Mytose bzw. Zellteilung un- ' terliegt, ermöglicht die Zugabe eines geeigneten Stoffs in Form von beispielsweise PHA zu den getrennten Lymphozyten die Durchführung einer chromosomen Analyse. Da die Lymphozytenzellwand Antigene enthält, kann man die getrennten Lymphozyten zur Herstellung von hochwertigen antilymphozytischen Seren zur therapeutischen Verwendung, zum Prüfen von immunosuppresiven Arzneimitteln und zur Untersuchung invitro der Histokompatibilität bei der Gewebeuntersuchung

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und wechselseitigen Gewebebestimmung für Transplantationen verwenden, wobei man sowohl vom Spender als auch Empfänger Lymphozyten benötigt.

Weiterhin ermöglicht die Antikörperbildungsfunktion der getrennten Lymphozyten ihre Verwendung bei der labormäßigen Untersuchung von unmittelbaren und verzögerten Überempfindlichkeitsformen, beispielsweise von Heuschnupfen, und von Tuberkulose. Allgemein kann man sagen, daß die getrennten Lymphozyten bei der Diagnose von zahlreichen besonderen Krankheiten verwendet werden können, wobei die Lymphozyten mit dem Krankheitserreger gemischt werden und die besondere Reaktion der Lymphozyten beobachtet wird.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren und Vorrichtungen zum Trennen der Lymphozyten von Blutproben bekannt. Keine dieser bekannten Anordnungen ist jedoch in der Lage, die Lymphozytentrennung mit einem sehr hohen kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute· und Lebensfähigkeit vorzunehmen, was zur erfolgreichen Verwendung der getrennten Lymphozyten bei den meisten wichtigen diagnostischen und therapeutischen Zwecken erforderlich ist. Wenn beispielsweise die Lebensfähigkeit der Lymphozyten gering ist, also das Verhältnis der lebenden Lymphozyten zu der Gesamtanzahl der getrennten Lymphozyten klein ist, kann man mit diesen getrennten Lymphozyten praktisch keine wirksamen antilymphozytischen Seren herstellen.

Weiterhin ist es bei vielen "bekannten Verfahren und Vorrichtungen notwendig, die Gesamtblutprobe zur Erhaltung und Aufbewahrung abzukühlen, und zwar von dem Zeitpunkt an, zu dem die Probe dem Patienten entnommen wird, bis zu demjenigen Zeitpunkt, zu dem die Lymphozyten von der Probe getrennt werden. Durch diese Maßnahme ist die Speicherung und Verschickung der Blutproben teuer und mühsam. Ferner ist bei den meisten bekannten Verfahren und Vorrichtungen

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eine verhältnismäßig aufwendige Vorbehandlung der Gesamtblutprobe notwendig. So wird beispielsweise die Gesamtblutprobe zentrifugiert oder dgl., um vor der Lymphozytentrennung einen Leukozytenfilm zu bilden. Dadurch erhöhen sich nicht nur die Kosten, sondern auch der zeitliche Gesamtaufwand zum Trennen der Lymphozyten.

Demzufolge sind die bekannten Verfahren und Vorrichtungen zum Trennen der Lymphozyten außerordentlich kompliziert und bezüglich der Zeit und Kosten aufwendig. Ferner benötigt man ein besonders geschultes und ausgewähltes Laborpersonal. Darüberhinaus ist die Bearbeitungsgeschwindigkeit gering. Davon abgesehen müssen die bekannten Vorrichtungen laufend überwacht und überprüft werden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß Fehler durch das Laborpersonal hervorgerufen werden können. Alles dies führt zu einer unzureichenden und unzulänglichen Lymphozytentrennung.

Weiterhin können nach den bekannten Verfahren und Vorrichtungen lediglich von Hand größere Mengen verarbeitet werden. Es ist weder ein Verfahren noch eine Vorrichtung bekannt, mit denen vollkommen automatisch aus einem Strom von Gesamtblutproben von mehreren verschiedenen Patienten die Lymphozyten kontinuierlich getrennt werden können. Es ist daher mit den bekannten Mitteln unmöglich, von sehr vielen Gesamtblutproben verschiedener Patienten die Lymphozyten in einer schnellen und wenig aufwendigen Weise zu trennen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit denen die Lymphozyten von Gesamtblutproben mit einem bisher nicht erreichten kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit getrennt werden können. Nur auf diese Weise ist es möglich, Lymphozyten bereitzustellen, die mit großem Erfolg für sehr viele verschiedenartige diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden können.

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Weiterhin soll die Vorbehandlung der Gesaratblutproben äußerst einfach und wirkungsvoll sein.

Ferner soll die Möglichkeit bestehen, die Trennung der Lymphozyten vollautomatisch mit einem minimalen Aufwand an Überwachung durch geschultes Personal vorzunehmen.

Dabei soll noch berücksichtigt werden, daß die Vorrichtung aus einfachen und zuverlässig arbeitenden Teilen mit einer hohen Lebensdauer besteht.

Zudem soll die Trennung schnell durchgeführt werden können. Dabei sollen die Kosten gering sein.

Weiterhin" sollen das Verfahren und die Vorrichtung in der Lage sein, aufeinanderfolgend auf der Grundlage des kontinuierlichen Strömungsprinzips die Lymphozyten von Gesamtblutproben vieler verschiedener Patienten vollautomatisch zu trennen.

Um den gewünschten Zweck zu erreichen, wird nach der Erfindung die Gesamtblutprobe praktisch gleichzeitig mit der Entnahme beim Patienten mit einem physiologischen Stabilisierungsmittel in Form eines Chelatbildners gemischt. Bei dem Chelatbildner kann es sich um ein Natrium- oder Kaliumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure handeln, für die im folgenden die Kurzbezeichnung EDTA verwendet wird. Durch die Zugabe des Chelatbildners werden die Leukozyten der Gesamtblutprobe stabilisiert, so daß eine Koagulation vermieden wird. Das dabei entstehende Blut wird im folgenden "EDTA"-Blut genannt. Zum Trennen der Lymphozyten von der in obiger Weise stabilisierten Gesamtblutprobe wird der Probe ein Trennungsmittel beigemengt, das sensibilisierte magnetische Teilchen enthält. Die magnetischen Teilchen markieren oder kennzeichnen die phagozytisehen Leukozyten, also die neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten. Die Kennzeichnung

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durch die magnetischen Teilchen geschieht durch Leukoadhäsion, Phagozytose und Zellenzusammenballung. Die Lymphorzyten bleiben von diesen Vorgängen verschont. Weiterhin ist in dem Trennungsmittel ein Sedimentierungsmittel enthalten, das die Erythrozyten zur Zusammenballung anregt, so daß sich die Erythrozyten niederschlagen.

Nach der Zugabe des Trennungsmittels wird das Gesamtblutproben-Trennungsmittel-Gemisch einem Inkubationsvorgang unterzogen. Im Anschluß an die Inkubation wird der Gemischstrom durch eine Absetzeinrichtung geleitet, wobei sich der größte Teil der Erythrozyten am Boden absetzt und dadurch sehr leicht durch Dekantierung abgeführt werden kann.

Danach wird der interessierende Gemischstrom durch eine magnetische Trennungseinrichtung geleitet, die ein ungleichförmiges Magnetfeld aufweist, das dazu dient, die mit den magnetischen Teilchen gekennzeichneten Leukozyten in einer solchen Weise aus dem Gemisch herauszulösen, daß die Anzahl der eingefangenen Lymphozyten äußerst gering ist. Die. nicht gekennzeichneten Lymphozyten werden dann mit einem Teil der Resterythrozyten und Blutplasma sowie einer geringen Menge nichtlymphozytischer Leukozyten, die eine Verunreinigung darstellen, abgezogen. Danach kann man durch Hämolyse die restlichen Erythrozyten trennen und die Lymphozyten in üblicher Weise auswaschen.

Obwohl die im einzelnen beschriebenen Ausführungsbeispiele der Erfindung zur vollkommen automatischen Trennung der Lymphozyten von einer großen Anzahl von Gesamtblutproben verschiedener Patienten auf der Grundlage des kontinuierlichen Strömungsprinzips dienen, kann man die erfindungsgemäße Lehre gleichermaßen zum Trennen von Lymphozyten aus einer großen Blutprobenmenge verwenden.

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Bevorzugte Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung werden an Hand von Figuren beschrieben.

Die Fig. 1 zeigt die Leukoadhäsion zwischen den phagocytischen Leukozyten einer Gesamtblutprobe und sensibilisierten magnetischen Teilchen.

Die Fig. 2 zeigt die Phagocytose von sensibilisierten magnetischen Teilchen durch lebende phagocytische Zellen.

Die Fig. 3 zeigt eine Form von Leukozytenzusammenballung, einschließlich von Blutplättchen.

Die Fig. 4 zeigt eine andere Art von Leukozytenzusammenballung, einschließlich von Blutplättchen.

Die Fig. 5 ist ein schematisches Strömungsdiagramm einer nach der Erfindung aufgebauten und arbeitenden Vorrichtung mit einer ersten Ausfuhrungsform einer Einrichtung zur magnetischen Lymphozytentrennung.

Die Fig. 6 ist ein senkrechter Querschnitt durch die in der Fig. 5 dargestellte magnetische Trennungseinrichtung .

Die Fig. 7 ist ein schematisches Strömungsdiagramm einer zweiten Ausführungsform einer magnetischen Lymphozytentrennungseinrichtung, die in der in der Fig. 5 dargestellten Vorrichtung Verwendung findet.

Das Blut des Menschen enthält eine Mischung aus roten Blutkörperchen oder Erythrozyten, weißen Blutzellen oder Leukozyten,- Blutplättchen oder Thrombozyten und Blutplasma. Die

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Leukozyten bestehen aus einem Zellengemisch, beispielsweise mit etwa 63% bis 72% neutrophileaGranulozyten, etwa 2% bis 5/0 eosinophilenGranulozyten, etwa 0% bis 1% basophilei Granulozyten, etwa 4% bis 8% Monozyten und etwa 20% bis 30% Lymphozyten. Diese Angaben gelten für die meisten gesunden erwachsenen Menschen.

Die Gesamtaufgabe des Verfahrens und der Vorrichtung nach der Erfindung besteht darin, auf der Grundlage eines kontinuierlichen Strömungsprinzips aus aufeinanderfolgenden Gesamtblutproben von Menschen sehr schnell und automatisch die Lymphozyten herauszutrennen, und zwar mit einem sehr hohen, bisher nicht erreichten kombinierten Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit. Unter der Reinheit wird die Anzahl 'der in dem Verarbeitungsausgang vorhandenen Lymphozyten geteilt durch die Gesamtanzahl der darin enthaltenen Leukozyten verstanden. Unter der prozentualen Ausbeute wird die Anzahl der Lymphozyten/mm der Ausgangsprobe geteilt durch die Anzahl der Lymphozyten/mm der ursprünglichen Gesamtblutprobe verstanden. Dabei werden etwaige Verdünnungen in Betracht gezogen. Untei· der Lebensfähigkeit wird die Anzahl der lebenden Lymphozyten im Ausgang geteilt durch die Gesamtanzahl der Lymphozyten in diesem Ausgang verstanden.

Für jede Gesamtblutprobe wird die Lymphozytentrennung nach der Erfindung dadurch vorgenommen, daß die phagozytischen Leukozyten oder neutrophilen Granulozyten, Monozyten, eosinophilen Granulozyten und basophilen Granulozyten einer Gesamtblutprobe praktisch unter Ausschluß der Lymphozyten mit sensibilisierten magnetischen Teilchen gekennzeichnet werden, daß der Hauptanteil der Erythrozyten einem Absetzvorgang unterworfen und anschließend entfernt wird und daß die auf diese Weise gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten zusammen mit dem Hauptanteil der Thrombozyten, die an den phagozytischen Leukozyten anhaften, aus der Gesamtblutprobe entfernt v/erden, so daß praktisch alle Lymphozyten zusammen

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mit den Resterythrozyten und dem Blutplasma übrig bleiben, wobei anschließend durch einfache Hämolyse und durch Auswaschen oder dgl. eine Lymphozytenextraktion vorgenommen wird.

Gemäß der Erfindung wird die Gesamtblutprobe dem Patienten mit einer Injektionskanüle entnommen und unmittelbar in einen Vacutainer gegeben. Vacutainer sind von der Firma Becton, Dickinson & Company of Rutherford, New Jersey, für solche Zwecke hergestellte Gefäße. Die Gesamtblutprobe kann aber auch von einer geeigneten sterilen Spritzenröhre aufgenommen werden, in der sich eine vorgegebene gemessene Menge eines geeigneten physiologischen Stabilisators und eines Antikoagulationsmittels befindetj und zwar in Form eines Dinatrium- oder Trikaliumsalzes des Chelatbildners EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure), so daß sich unmittelbar "EDTA"-Blut bildet, um die Leukozyten der Gesamtblutprobe physiologisch zu stabilisieren und eine Zusammenballung der Erythrozyten zu verhindern. Die leukoadhäsiven phagozytischen und zusammenballenden Funktionen der phagozytischen Leukozyten, die deren Kennzeichnung durch die sensibilisierten magnetischen Teilchen vorsehen, benötigen die Gegenwart von freien positiven Ionen in der Form von Calcium- und Magnesiumionen. Zusätzlich zur Verhinderung der Koagulation des Bluts hat die unmittelbare Bildung des EDTA-Bluts zur Folge, daß die freien positiven Ionen durch das EDTA gebunden werden, so daß die Ionen in freier Form nicht mehr verfügbar sind, demzufolge die leukoadhäsiven, phagozytischen und zusammenballenden Funktionen mit diesem Zeitpunkt unterbunden werden. Dies bedeutet, daß bei Nichtzugabe des Chelatbildners in Form von Äthylendiamintetraessigsäure _t EDTA zur Gesamtblutprobe oder, als Alternative, bei Nichtvornahme einer aufwendigen und unbequemen Abkühlung der Gesamtblutprobe auf eine tiefe Temperatur von demjenigen Zeitpunkt an, bei dem die Blutprobe dem Patienten entnommen wird, bis zu demjenigen Zeitpunkt, bei dem die Lymphozyten

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von der Gesamtblutprobe entfernt werden* sollen, die leukoadhäsiven, phagozytischen und zusammenballenden Funktionen der phagozytischen Leukozyten unkontrolliert auftreten, mit dem Ergebnis, daß weiße Blutzellen zerstört werden und die Zellenlebensfähigkeit erheblich vermindert wird. Dadurch tritt eine erhebliche Verunreinigung der Lymphozyten durch tote Zellen auf, die dann die nachfolgende Leukoadhäsion und Phagozytose sperren, die notwendigerweise vorgenommen werden müssen, um gemäß der Erfindung die Lymphozytentrennung mit einem hohen Grad an Reinheit, Ausbeute und Lebensfähigkeit durchzuführen. Als weitere Alternative kann es sich bei dem physiologischen Stabilisator und dem Antikoagulationsmittel beispielsweise um die Natriumsalze der CHEL-DPTA- und CHEL-DM-Säure handeln.

Die Trennung der Lymphozyten von dem EDTA-Blut wird durch die Zugabe eines Trennungsraittels eingeleitet, das die folgenden Substanzen enthält, um ein Gesamtblutproben-Trennungsmittel-Gemisch zu bilden:

(a) Magnetische Teilchen, beispielsweise Carbonyleisenteilchen, Ferritteilchen oder Magnetitteilchen mit . einer Korngröße von 1 bis 4/um. Nach ihrer Aktivierung bzw. Sensibilisierung bewirken diese Teilchen die Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten und damit deren nachfolgende magnetische Spülung in bezug auf die Erythrozyten, das Blutplasma und die Lymphozyten, wobei von den letzten so wenig wie möglich eingefangen werden,

-(b) Freie Magnesium- und Calciumionen in Form von aufgelösten Salzen an Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, die den rlonengehalt des EDTA-Bluts auf seinen ursprünglichen Wert zurückbringen, indem sie die positiven freien

.■ -· Ionen, die in der oben beschriebenen Weise durch die Äthylendiamintetraessigsäure EDTA gebunden werden, ersetzen, um somit für die Leukoadhäsion und Phagozytoae eine optimale Ionenkonzentration vorzusehen.

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(c) Eine geringe Menge eines geeigneten Antikoagulationsmittels in Form von Heparin, um während der für die Lymphozytentrennung erforderlichen Zeit die Blutprobenzusammenballung bzw. -gerinnung zu verhindern.

(d) Ein Sensibilisiermittel mit positiv geladenen Molekülen, beispielsweise Von einer basischen Polyaminosäure oder Polypeptiden in Form der D-, DL- oder L-Arten von Polylysin, Polyarginin, Polyornithin, Polycitrullin oder dgl., um die Leukoadhäsion und Phagozytose durch Sensibilisierung oder Erhöhen der positiven Oberflächenladung an den magnetischen Teilchen durch Adsorption zu erhöhen.

(e) Eine Dextroselösung zum Liefern von Energie für die Phagozytose.

(f) Eine isotonische Lösung in Form von Hanks BSS mit demselben osmotischen Druck wie das Blutplasma, um für den Trennungsprozeß ein physiologisches Lösungsmedium bereitzustellen.

(g) Ein Sedimentierungsmittel für die roten Blutkörperchen mit einem Senkungsmittel von hohem Molekulargewicht, beispielsweise in Form von Dextran, Ficoll, PHA oder dgl. in Kombination mit, beispielsweise, einer geringen Menge des Mononatrium- oder Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure EDTA, um die Erythrozytenabsenkung zu fördern, und zwar dadurch, daß die Erythrozyten zur Zusammenballung veranlaßt werden und dadurch leichter zum Boden des Gemischstroms absinken.

Die Trennung der Lymphozyten von der Gesamtblutprobe wird dann durch Inkubation des sich ergebenden Gesamtblutproben-Trennungsmittel-Gemischs vorgenommen, um durch Leukoadhäsion, Phagozytose und Zusammenballung die Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten, und zwar praktisch unter Ausschluß

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der Lymphozyten, mit den sensibillsierten magnetischen ■Teilchen vorzunehmen. Die weitere Trennung geschieht durch Zusammenballung, Absenkung und Entfernung, beispielsweise durch Dekantierung, des Hauptteils der Erythrozyten und durch eine nachfolgende magnetische Spülung der in der obigen Weise gekennzeichneten phagozytxschen Leukozyten und des Hauptanteils der Thrombozyten aus der Gesamtblutprobe.

In der Fig. 1 ist die Leukoadhäsion im einzelnen dargestellt. Dabei sind die magnetischen Teilchen mit 10, die phagozytischen Leukozyten in Form von neutrophilen Granulozyten, Monozyten, eosinophilen Granulozyten oder basophilen Granulozyten mit 12 und die Thrombozyten oder Blutplättchen mit 1.4 bezeichnet. Bei Anwesenheit der sensibili-

sierten magnetischen Teilchen 10 und der freien positiven Ionen, die durch Zugabe von Calciumchlorid- und Magnesiumchloridlösungen erzeugt werden, werden die äußeren Zellwände der phagozytischen Leukozyten klebrig und adhäsiv, so daß die magnetischen Teilchen 10 an ihnen haften bleiben. In ähnlicher Weise verkl^tizi die Thrombozyten 14 sowohl mit den Leukozyten 12 als auch mit den magnetischen Teilchen 10.

Die- sich daran anschließende Phagozytose ist in der Fig. 2 dargestellt. Dabei werden eins oder mehrere der sensibilisierten magnetischen Teilchen 10 durch die phagozytischen Leukozyten 12 in Form von neutrophilen Granulozyten, Monozyten, eosinophilen Granulozyten oder basophilen Granulozyten aufgenommen.

Die Kennzeichnung der phagozytisohen Leukozyten wird durch die Leukozytenzusammenballung beendet, wie es in der Fig. dargestellt ist. Die Kennzeichnung umfaßt noch das Verkleben der äußeren Zellwand eines phagozytischen Leukozyts in Form eines neutrophilen Granulozyts, Monozyts, eosinophilen

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Granulozyts oder basophilen Granulozyts mit der äußeren Zellwand eines ähnlichen phagozytischen Leukozyts, das ein magnetisches Teilchen 10 aufgenommen hat. Wie es in der Fig. .4 dargestellt ist, kann aber auch die äußere Zellwand eines phagozytischen Leukozyts in Form eines neutrophilen Granulozyts oder Monozyts, das ein magnetisches Teilchen aufgenommen hat und an dem durch. Leukoadhäsion noch ein -anderes magnetisches Teilchen 10 klebt, mit der äußeren Zellwand eines eosinophilen oder basophilen Granulozyts verklebt sein, an dem wiederum ein neutrophiles Granulozyt ; oder ein Monozyt haftet, mit dem durch Leukoadhäsion ein weiteres magnetisches Teilchen 10 verklebt ist.

In der Fig. 5 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Diese Vorrichtung dient zur schnellen und vollkommen automatischen Trennung der Lymphozyten von aufeinanderfolgenden Gesamtblutproben verschiedener Patienten, wobei die Vorrichtung "nach dem kontinuierlichen Ströraungsprinzip arbeitet. Die dargestellte Vorrichtung enthält eine Zufuhreinrichtung 20 zum Zuführen der Gesamtblutproben. Die Zufuhreinrichtung 20 kann in der gleichen Weise aufgebaut sein, wie es aus der US-PS 3 134 263 bekannt ist.

Die Zufuhreinrichtung 20 enthält einen Drehteller 22, auf dem eine kreisförmige Reihe von Gesamtblutprobenbehältern 24 angeordnet ist. Eine Probenentnahmeeinrichtung 26 enthält ein Probenentnahmerohr 28 und eine mit dem Probenentnahmerohr verbundene Betätigungseinrichtung 30. Ein Waschflüssigkeitsbehälter 32' ist neben dem Drehteller 22 angeordnet. Eine Antriebseinrichtung 34» dient, wie es durch gestrichelte Linien angedeutet ist, zum Antrieb des Drehtellers -22 und der Probenentnahmerohrbetätigungseinrichtung 30. Jeder der Gesamtblutprobenbehälter ist mit einer Gesamtblutprobe eines anderen Patienten gefüllt. Diese Gesamtblutproben sind, wie es oben beschrieben ist_? mit

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Äthylendiamintetraessigsäure EDTA behandelt, so daß die Probenbehälter EDTA-Blut enthalten.

Beim Betrieb der Vorrichtung wird der Drehteller 22 schrittweise weitergedreht, um die Blutprobenbehälter 24 nacheinander dem * obenentnahmerohr 28 darzubieten. Das Probenentnähme ro... wird dabei derart betätigt, daß sein Einlaßende zur'lwiist für eine vorgegebene Zeitspanne in den dargebotenen Gesamtblutprobenbehälter eintaucht, um ein vorgegebenes Blutprobenvolumen anzusaugen. Im Anschluß daran wird das Einlaßende des Probenentnahmerohrs durch die Umgebungsluft zu dem Waschflüssigkeitsbehälter 32' geschwenkt, um für eine vorgegebene Zeitspanne ein Umgebungsluftvolumen und im Anschluß daran ein vorgegebenes Volumen der Waschflüssigkeit anzusaugen. Die Umgebungsluft und die Waschflüssigkeit dienen als Trennungs- und Reinigungsschübe. Danach wird das Einlaßende des Probenentnahmerohrs wiederum durch die Umgebungsluft zu dem nächsten Blutprobenbehälter 24 geschwenkt, um während einer vorgegebenen Zeitspanne ein weiteres Umgebungsluftvolumen anzusaugen. Diesem Umgebungsluftvolumen folgt dann die aus dem nächsten Probenbehälter angesaugte Blutprobe.

Auf diese Weise entsteht ein Fluidstrom aus aufeinanderfolgenden Gesamtblutproben mit vorgegebenem Volumen, die jeweils durch einen Luftschub, einen Waschflüssigkeitsschub und einen weiteren Luftschub voneinander getrennt sind.

Eine Dosierpumpe 32, die beispielsweise den gleichen Aufbau haben kann, wie es aus der US-PS 3 227 001 bekannt ist, enthält zusammendrückbare Pumpenschläuche 34, 35, 36 und 38, die von mehreren nicht dargestellten Pumpenwalzen bei der Darstellung nach der Fig. 5 von links nach rechts fortschreitend gleichzeitig zusammengedrückt werden, um in dieser Richtung Fluide durch die Pumpenschläuche zu pumpen.' Die Beziehung der Durchflüsse durch die einzelnen Pumpen-

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schläuche hängt von dem Innendurchmesser der Pumpenschläuche ab.

Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 34 ist an das Auslaßende des Entnahmerohrs 28 angeschlossen. Der Gesamtblutprobenstrom· wird daher von der Pumpe durch den Pumpenschlauch 34 gepumpt.

Der Auslaß des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 34 ist mit dem Einlaß 41 eines VerzweigungsStücks 39 verbunden. Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 35 ist auf der linken Seite gegenüber der Atmosphäre offen, so daß über diesen Schlauch Umgebungsluft angesaugt wird. Das Auslaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 35 ist an den anderen Einlaß 37 des Verzweigungsstücks 39 angeschlossen, um in dem Verzweigungsstück den Gesamtblutprobenstrom mit der angesaugten Umgebungsluft zusammenzuführen. Dadurch werden Luftzwischenschübe gebildet, die die einzelnen Gesamtblutproben und in ähnlicher Weise die einzelnen Waschflüssigkeitsschübe unterteilen.

Ein Behälter 40 enthält das bereits beschriebene Trennungsmittel mit den oben erwähnten Substanzen. Der Behälter 40 enthält also ein Gemisch aus magnetischen Teilchen, die durch die positiv geladene basische Polyaminosäure oder das Polypeptid in einer Lösung aus Dextrose sensibilisiert sind, die in der folgenden Weise hergestellt werden kann. Eine Lösung mit etwa 5% Dextrose in destilliertem Wasser wird mit der basischen Polyaminosäure oder dem Polypeptid in einem Verhältnis von etwa 1 Gewichtsteil des letzten Stoffs zu etwa 10000 Gewichtsteilen des ersten Stoffs gemischt, um etwa eine 0,01 %±ge Lösung der basischen Polyaminosäure in der Dextroselösung zu bilden. Dazu werden dann etwa 100 Gewichtsteile der magnetischen Teilchen zugegeben. Da sich ergebende Gemisch wird beispielsweise bei etwa 4 ⁰C für etwa ■ 30 Minuten inkubiert und anschließend zentrifugiert, um die

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magnetischen Teilchen zu konzentrieren. Die überschüssige Flüssigkeit wird weggegossen, land die magnetischen Teilchen in etwa 1OOOO Gewichtsteilen der Dextroselösung erneut suspendiert, um schließlich eine Suspension zu erhalten, die sich in dem Behälter 40 befindet. Die beschriebene Inkubation bewirkt die Adsorption der basischen Polyaminosäure oder des Polypeptide auf der Oberfläche der magnetischen Teilchen, um diese durch Erhöhen der positiven Oberflächenladung zu sensibilisieren, um dadurch die oben beschriebene Leukoadhäsion und Phagozytose zu verstärken, wozu die Dextrose die Energie liefert.

Weiterhin ist in dem Trennungsmittel in dem Behälter 40 eine isotonische Salzlösung aus einer Calciumchlorid- und Magnesiumchloridlösung enthalten, die die zur Leukoadhäsion und Phagozytose notwendigen positiven freien Ionen liefern. Weiterhin enthält der Behälter 40 Hanks BSS, um ein physiologisches Lösungsmittel bereitzustellen. Der Behälter 40 enthält eine weitere Menge der Dextroselösung, die geringe Menge Heparin, das während der Lymphozytentrennung die Zusaramenballung verhindert, und Ίι r. Sedimentierungsmittel» das eine Kombination aus dem Erythrozytensenkungsmittel und den Mononatrium- oder Dinatriumsalzen der Äthylendiamintetraessigsäure EDTA enthält, die den Trennungsprozeß nicht behindert.

Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 36 ist in den Behälter 40 eingetaucht. Das Trennungsmittel wird in Richtung des eingezeichneten Pfeils durch diesen Pumpenschlauch gefördert.

Die Einlaßenden 52' und 54 eines Verzweigungsstücks 50 sind in der gezeigten Weise an den Auslaß 53 des Verzweigungs-.Stücks 39 bzw. den Auslaß des zusämmendrückbaren Pumpenschlauchs 36 angeschlossen. Auf diese Weise werden in dem Verzweigungsstück 50 das aus dem Behälter 40 stammende Tr en-

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nungsmittel und die luftunterteilten Gesamtblutproben des Probenstroms aus den Probenbehältern 24 zusammengeführt. Ein Dreiwegventil 47 befindet sich im Einlaßende 54 des Verzweigungsstücks 50. Eine Rückleitung 49 verbindet das Ventil 47 mit dem das Trennungsmittel enthaltenden Behäl-·', ter 40. In einer ersten Stellung des Ventils 47 verläuft der Strömungsweg durch das Einlaßende des Verzweigungs- . Stücks. In einer zweiten Stellung des Ventils 47 verläuft der Strömungsweg von dem zusammendrückbaren Pumpenschlauch 36 über die Rückleitung 49 zurück zum Behälter 40. Durch geeignete Wahl der Innendurchmesser der zusammendrückbaren Pumpenschläuche 34, 36 und 38 kommen etwa 4 Volumenteile des Trennungsraittels auf 1 Volumenteil des Gesamtblutprobenstroms in dem Verzweigungsstück 50.

Der Auslaß 55 des Verzweigungsstücks 50 ist an einen Inku- ■ batormischer 52 angeschlossen. In dem Inkubatorraischer 52 wird der Blutproben-Trennungsmittel-Gemischstrom vollkommen durchmischt und inkubiert. Vorzugsweise wird der Inkubatormischer auf einer Inkubationstemperatur von etwa 37 ⁰C gehalten. Der Durchfluß des endgültigen Gemischs ist derart gewählt, daß die Verweilzeit des Gemischs in dem Inkubatormischer etwa 30 Minuten beträgt. Während dieser Inkubationszeit geschieht der Hauptanteil der Kennzeichnung der phagozytischen Leukozyten durch Leukoadhäsion der sensibilisierten magnetischen Teilchen an den neutrophilen Granulozyten, Monozyten, eosinophilen Granulozyten und basophilen Granulozyten, sowie der Hauptanteil der Phagozytose der sensibilisierten magnetischen Teilchen durch die phagozytischen Leukozyten und der Zusammenballung der phagozy tischen Leukozyten.

Eine Sedimentierungseinrichtung 56 enthält eine Reihe von ' praktisch horizontal angeordneten Windungen einer Absetzschlange 58. Das Einlaßende 60 der Sedimentierungseinrichtung 56 ist an das Auslaßende des Inkubatormischers 52 an-

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■geschlossen, so daß der gemischte und inkubierte BlutprobenTrennungsmittel-Gemischstrom durch die Sedimentierungseinrichtung strömt. Dadurch setzen sich die infolge des Sedimentierungsmittels zusammengeballten Erythrozyten im unteren Teil des Gemischstroms ab. Weiterhin setzen sich in dem unteren Teil des Stroms die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten ab, die infolge des Anhaftens der sensibilisierten magnetischen Teilchen etwas schwerer und darüberhinaus mit einigen Thrombozyten zusammengeballt sind.

Wie gezeigt, befindet sich in der Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung 56 ein quer zur Strömungsrichtung verlaufendes Dekantierstück 59. Das Einlaßende des zusammendrückbaren Pumpenschlauchs 38 ist an den Auslaß 63 des Dekantierstücks 59 angeschlossen, um daraus Fluide abzupumpen. Wenn daher das einem Absetzvorgang unterworfene Blutproben-Trennungsmittei-Gemisch durch die Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung 56 strömt, wird der Hauptanteil der abgesetzten Erythrozyten zusammen mit einem Anteil der größeren gekennzeichneten Leukozytenklumpen und der Thrombozyten über das Dekantierstück 59 und den angeschlossenen zusammendrückbaren Pumpenschlauch 38 aus dem Strom entfernt. Der über das Dekantierstück 59 entfernte Anteil des Blutproben-Trennungsmittel-Gemischstroms kann beispielsweise etwa'25 Vol.% des Gemischstromvolumens betragen.

Eine magnetische Lymphozytentrennungseinrichtung 62 enthält eine praktisch horizontal verlaufende Leitung 64 mit einem Einlaß 66 und einem Auslaßnippel 68, der sich in der gezeigten Weise erstreckt. Das Auslaßende 70 der Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung ist an den Einlaß 66 der Leitung 64 angeschlossen, so daß durch die magnetische Trennungsöinrichtung 62 ein abgesetzter Strom aus einem Gemisch strömt, das gekennzeichnete phagozytische Leukozyten und Thrombozyten, nicht gekennzeichnete Lymphozyten, Rest-Erythrozyten und Blutplasma enthält.

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Die magnetische Trennungseinrichtung 62 enthält weiterhin eine Magneteinrichtung 76, beispielsweise in Form eines Stern-Gurlach-Magneten mit Magnetteilen 80 und 82, die in der gezeigten Yfeise oberhalb und unterhalb der praktisch horizontal verlaufenden Leitung 64 angeordnet sind. Die Magneteinrichtung 76 erzeugt ein praktisch senkrecht gerichtetes Magnetfeld, das die Leitung"64 durchsetzt, wie es in der Fig. 6 durch gestrichelte Linien angedeutet ist. Das Magnetfeld hat einen hohen Feldgradienten, ist also nicht gleichförmig.

Y/enn die Gemischstromschübe durch die Leitung 64 strömen, werden infolge des höheren Magnetfeldgradienten im unteren Leitungsteil die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten nach unten gezogen, so daß eine solche Gesamtleukozytenverteilung entsteht, daß im oberen Abschnitt jedes Schubs ein wesentlich höherer Prozentsatz an Lymphozyten als im unteren Abschnitt jedes Schubs enthalten ist. Jedes Gemischstromsegment wird demzufolge in einen unteren Schubanteil mit gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten und Thrombozyten sowie vielen Resterythrozyten und in einen oberen Schubanteil 86 geteilt, der übermäßig viele nicht gekennzeichnete lebende Lymphozyten und sehr wenig Resterythrozyten enthält.

Demzufolge, und weil der unterteilte Strom immer noch unter dem Einfluß der Magneteinrichtung 76 steht, wird praktisch der gesamte obere Schubanteil 86 jedes Stromsegments über den Auslaßnippel 68 mittels einer Pumpe 87' abgesaugt, während der Rest des unterteilten Stroms, wie es gezeigt ist, durch das Auslaßende der Leitung 64 strömt.·

Das ungleichförmige Magnetfeld mit dem hohen Feldgradienten verhindert eine Brückenbildung der magnetischen Teilchen oder dgl., so daß die magnetischen Teilchen oder Blutzellen in der Leitung 64 nicht eingefangen werden, wodurch die .

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Trennungsausbeute erhöht wird.

Derjenige Anteil jedes Schubs, der über den Auslaßnippel 68 abgesaugt wird, enthält in Suspension in dem Blutplasma einen sehr hohen Prozentsatz der lebenden Lymphozyten der betreffenden Gesamtblutprobe, und zwar infolge der erzwungenen Wanderung der gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten zum Boden der Leitung 64, was, wie beschrieben, auf die Wirkung des praktisch vertikal ausgerichteten ungleichförmigen Magnetfelds mit dem hohen Feldgradienten der Magneteinrichtung 76 zurückzuführen ist. Weiterhin enthält der über den Ablaßnippel 68 abgesaugte Anteil eine äußerst geringe Restmenge an Erythrozyten von der Gesamtblutprobe, was darauf zurückzuführen ist, daß ein Großteil der Erythrozyten bereits über das Dekantierstück 59 abgeführt worden ist, und viele der Resterythrozyten von den gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten eingefangen sind. Die verbleibenden Resterythrozyten sind in dem Blutplasma suspendiert. Das Aufsammeln der Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspension wird für jede Gesamtblutprobe eines Probenbehälters 24 des Drehtellers 22 unabhängig vorgenommen, und zwar beispielsweise durch Anordnung und Betätigung eines zweiten Drehtel-. lers 87 mit einer kreisförmigen Reihe von Suspensionssammelbehältern 88. Der Drehteller 87 ist wie gezeigt am Auslaßende des Auslaßnippels 68 angeordnet. Für jede Gesamtblutprobe ist ein getrennter Sammelbehälter vorgesehen. Der Drehteller 87 wird in Abhängigkeit von der Strömung der Lymphoz/ten-Erythrozyten-Plasmasuspension von einer Antriebseinrichtung 89 schrittweise weitergeschaltet. Dieses Weiterschalten erfolgt bezüglich des Auslaßendes des Auslaßnippels derart, daß die einzelnen Suspensionen unabhängig und getrennt voneinander aufgesammelt werden. Zum unabhängigen Aufsammeln der interessierenden Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspensionen kann man auch andere verschiedenartige Sam- . meleinrichtungen vorsehen.

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Die Trennung der Lymphozyten von jeder der in obiger Weise aufgesammelten Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspensionen, die eine geringe Menge von Verunreinigungszellen in Form von Thrombozyten, eosinophilen Granulozyten und bzw. oder basophilen Granulozyten enthalten können, kann in jedem Fall. mit einem hohen Wirkungsgrad durch einfache Hämolyse und anschließender Lymphozytenauswaschung sowie durch Wiedersuspension in an sich bekannter Weise vorgenommen werden.

Dem durch die magnetische Trennungseinrichtung 62 strömenden luftsegmentierten Gemisch aus dem Trennungsmittel und jeder Gesamtblutprobe eines Behälters 24 folgt ein luftunterteilter Waschflüssigkeitsschub vom Behälter 32, der irgendwelche Rückstände der vorangegangenen Probe in dem Leitungssystem der Vorrichtung entfernt und dadurch eine Verseuchung der nachfolgenden Blutprobe durch die vorangegangene verhindert. Wenn die Waschflüssigkeit durch die. Vorrichtung strömt, wird das Ventil 47 in seine zweite Stellung gebracht, um das aus dem Behälter 40 angesaugte Trennungsmittel in den Behälter zurückzuführen. Dadurch wird zum einen die Wirksamkeit des Auswaschens erhöht, und zum anderen der Trennungsmittelverbrauch so gering wie möglich gehalten. Weiterhin wird, wenn der luftunterteilte Waschflüssigkeitsschub durch die magnetische Trennungseinrichtung 62 strömt,- das die Leitung 64 durchsetzende magnetische Feld der magnetisehen Trennungseinrichtung 62 abgeschaltet. Dies kann dadurch geschehen, daß die Erregung von den Magneten abgeschaltet oder die Leitung 64 zwischen den Magneten herausbewegt wird, Auf diese Weise wird eine höhere Wirksamkeit des Auswaschvorganges erzielt, und zwar dadurch, daß die restlichen magnetischen Teilchen sowie roten Blutkörperchen und weißen Blutzellen, die gekennzeichnet sein können, leichter, von dem luftunterteilten Waschflüssigkeitsschub mitgenommen werden können.

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Eine weitere Ausführungsform der magnetischen Trennungseinrichtung, die in Verbindung mit der Probenzufuhreinrichtung 20, der Pumpe 32, dem. Inkubatormischer ξ>2 und der Sedimentierungseinrichtung 56, die alle in der Fig. 5 dargestellt sind, verwendet werden kann, ist in der Fig. gezeigt. Diese magnetische Trennungseinrichtung 90 enthält eine Leitung 92, deren Einlaß in der gezeigten Weise an die Auslaßleitung 61 der Sedimentierungseinrichtung angeschlossen ist. Am Ende der Leitung 92 ist eine Entgasungseinrichtung 94 angebracht, die aus dem unterteilten Gesamtblutprobensuspensionsstrom die Gase bzw. Luftschübe entfernt.

Ein Trennungskammergehäuse 96 bildet eine Trennungskammer 98, die praktisch senkrecht unter dem Ende der Leitung angeordnet ist.. Eine Lymphozytenauslaßleitung Ί02 und eine Abflußleitung 100 sind in der gezeigten V/eise am oberen und unteren Ende der Trennungskammer 98 angeordnet.

Ein zentrisches Rohr 103 erstreckt sich vom Ende der Lei-'tung-92 mittig in die Trennungskammer 98. Das zentrische Rohr 103 endet, wie gezeigt, in einer begrenzten Öffnung 104, deren Umgebung durch ein ungleichmäßiges magnetisches Feld mit einem hohen Feldgradienten eines Magneten 106 magnetisiert ist, der in der gezeigten Weise unmittelbar unter der Öffnung 104 in dem Trennungskammergehäuse 96 angeordnet ist.

Beim Betrieb ist zunächst zur Trennung der Lymphozyten eines segmentierten Gesamtblutprobengemischs des Blutprobenstroms die Abflußleitung 100 durch ein Ventil 108 abgesperrt. Wenn der segmentierte bzw. unterteilte Probenstrom von der Sedimentierungseinrichtung 56 (Fig. 5) über die Leitung 61 zu der Trennungseinrichtung 90 gepumpt wird, werden zunächst von der Entgasungseinrichtung 94 die trennenden Lufteinschübe entfernt. Der sich dabei ergebende kontinuierliche Gemischstrom der interessierenden Gesamt-

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blutprobe fließt dann durch das zentrische Rohr 103 nach unten und durch die magnetische Öffnung 104 hindurch in , die Trennungskammer 98, um diese zu füllen. Dabei werden die gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten, Thrombozyten und viele der restlichen Erythrozyten im unteren Teil 84 der Trennungskammer 98 zurückbehalten, und zwar infolge des darin herrschenden ungleichförmigen Magnetfelds,das in geeigneter Weise polarisiert ist, um die suspendierten magnetischen Teilchen anzuziehen. Die nicht gekennzeichneten Lymphozyten sowie ein Teil der Erythrozyten und das Blutplasma steigen in den oberen Teil 86 der Trennungskammer auf und strömen von dort zum Aufsammeln über die Lymphozytenauslaßleitung 102 ab.

Wenn der interessierende Gesamtblutprobengemischstrom durch die magnetische Trennungseinrichtung 90 beendet ist und jetzt der'erste zwischen zwei Proben befindliche Luftschub, der Waschflüssigkeitsschub und der zweite Luftschub auftreten, bleibt das Ventil 108 zunächst geschlossen, um den oberen Teil der Trennungskammer 98 und die Lymphozytenauslaßleitung 102 vollständig auszuwaschen. Im Anschluß daran wird das Ventil 108 geöffnet, so daß jetzt der Zugang zur.Abflußleitung 100 frei ist. Ferner wird das Magnetfeld abgeschaltet. Die im unteren Teil der Trennungskammer 98 eingefangenen gekennzeichneten phagozytischen Leukozyten sowie ein großer Teil der Thrombozyten und Erythrozyten werden nun ausgewaschen und über die Abflußleitung 100 abgeführt. Dadurch wird die Trennungskammer für die nächste Lymphozytentrennung vorbereitet.

Das Aufsammeln der resultierenden Lymphozyten-Erythrozyten-Plasmasuspension und die hochwirksame Trennung der Lymphozyten aus dieser Suspension kann in der gleichen V/eise vorgenommen werden, wie es im Zusammenhang mit der in der Fig. 5 dargestellten magnetischen Trennungseinrichtung 62 beschrieben ist.

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Die tatsächliche Anwendung" des Verfahrens der Erfindung zum Trennen der Lymphozyten aus Gesamtblutproben erweist sich als äußerst wirkungsvoll, wobei eine bisher unerreichte Kombination von etwa 97% Reinheit, etwa 80% Ausbeute und etwa 99% Lebensfähigkeit erzielt wird.

Obwohl hier die äußerst wirksame Trennung der Lymphozyten aus einer Reihe von Gesamtblutproben geringen Volumens von verschiedenen Patienten beschrieben ist, kann man das Verfahren und die Vorrichtung nach derErfindung gleichermaßen zur Trennung der Lymphozyten aus einer Gruppe einer verhältnismäßig großvolumigen Kombination von Gesamtblutproben verschiedener Patienten verwenden, was von der Art der Verwendung der getrennten gewonnenen Lymphozyten abhängt.

Weiterhin können die verschiedenen Trennungsmittelsubstanzen in mehreren getrennten Behältern untergebracht sein. Die Substanzen können automatisch unter Verwendung von weiteren zusammendrückbaren Pumpenschläuchen und entsprechenden Verzweigungsstücken in vorgegebenen Verhältnissen gemischt werden. Ferner kann man das interessierende Lymphozyten-Erythrozyten-Plasraa noch einmal durch die Vorrichtung strömen lassen, um eine noch größere Reinheit zu erzielen.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Trennen der Lymphozyten von einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe -mit einem sensibilisierte magnetische Teilchen enthaltenden Trennungsmittel gemischt wird, daß das Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch einem Inkubationsvorgang unterzogen wird, wobei die Leukozyten der Blutprobe, mit Ausnahme der Lymphozyten, von den magnetischen Teilchen durch Leukoadhäsion, Phagozytose und Zusammenballung gekennzeichnet werden, und daß das inkubierte Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch einem magnetischen Feld ausgesetzt wird, in dem die Lymphozyten von den gekennzeichneten Leukozyten getrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, · daß die Blutprobe vor dem Mischen mit dem Trennungsmittel zur physiologischen Stabilisierung mit einem physiologischen Stabilisierungsmittel gemischt wird, das eine Zusammenballung verhindert und die freien positiven Ionen der Blutprobe bindet, um dadurch Leukoadhäsion und Phagozytose zu unterbinden.

3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das physiologische Stabilisierungsmittel ein Chelatbildner ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) ' ist.

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5. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner ein Dinatrium- oder Trikaliumsalz der Äthylendiamintetraessxgsäure (EDTA) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner Natriumsalze der CHEL-DPTA- oder CHEL-DM-Säure verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner praktisch gleichzeitig mit der ■ Blutprobenentnahme vom Patienten der Gesamtblutprobe beigemengt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Trennungsmittel freie Magnesium- und Calciumionen enthält, die die durch das physiologische Stabilisierungsmittel gebundenen freien positiven Ionen er- . setzen und dadurch in der Blutprobe einen solchen lonengehalt wiederherstellen, daß Leukoadhäsion und Phagozytose ermöglicht werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß das Trennungsmittel ein Antikoagulationsmittel enthält, das während der Lymphozytentrennung die Blutzusammenballung verhindert.

'10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Gesamtblutprobe vorliegt und das Trennungsmittel ein Erythrozytensedimentierungsmittel enthält, das die Zusammenballung und das Absetzen der Erythrozyten fördert,

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und daß, bevor das inkubierte Gemisch dem magnetischen Feld ausgesetzt wird, das Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch einem Sedimentierungsvorgang unterzogen wird, um die Zusammenballung und das Absetzen der Erythrozyten zu fördern, und der Hauptanteil der abgesetzten Erythrozyten dem Gemisch entzogen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Sedimentierungsmittel ein Gemisch aus einem Absetzmittel und einem Chelatbildner ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Chelatbildner des Sedimentierungsmittels um Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) handelt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen durch Erhöhen ihrer positiven Oberflächenladung sensibilisiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die positive Ladung an der Oberfläche der magnetischen Teilchen durch Adsorption einer basischen Polyaminosäure erhöht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der basischen Polyaminosäure um die D-, DL- oder L-Konfiguration von Polylysin, Polyarginin, Polyornithin oder PolycitruHin handelt.

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16. Verfahren nach Anspruch 13,.
dadurch gekennzeichnet, daß die positive Ladung an der Oberfläche der magnetischen Teilchen durch Adsorption eines Polypeptids erhöht wird.

17. r Verfahren nach Anspruch 16,"
dadurch gekennzeichnet, daß--das Polypeptid ein Polylysin ist.

18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischeinrichtung (50) die ihr zugeführte Blutprobe mit dem ihr zugeführten Trennungsmittel mischt, daß eine sich daran anschließende Inkubationseinrichtung (52) das Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch inkubiert und daß eine magnetische Trennungseinrichtung (62; 90) die gekennzeichneten Leukozyten von den Lymphozyten in dem durch sie geleiteten inkubierten Blutproben-Trennungsmittel-Gemisch trennt.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer Gesamtblutprobe vor der magnetischen Trennungseinrichtung (62; 90) eine Erythrozytensedimentierungseinrichtung (56) und eine Erythrozytenabfuhreinrichtung (59, 63) angeordnet sind, die unter der Einwirkung eines in dem Trennungsmittel enthaltenen Erythrozytensedimentierungsmittel die Zusammenballung und das Absetzen der Erythrozyten bewirken und den größten Teil der abgesetzten Erythrozyten aus dem Gemisch abführen.

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20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Trennungseinrichtung eine praktisch horizontal angeordnete Leitung (64) und einen Magneten (80, 82) enthält, der ein praktisch senkrecht ausgerichtetes ungleichförmiges Magnetfeld erzeugt, das die Leitung durchsetzt, wobei eine Brückenbildung von magnetischen Teilchen und eine Ablagerung dieser Teilchen oder von Blutzellen in der Leitung vermieden werden.

21.. Magnetische Teilchen zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Kennzeichnen der phagozytischen Leukozyten der Blutprobe,
dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen durch Erhöhen ihrer positiven Oberflächenladung sensibilisiert sind.

22. Suspension magnetischer Teilchen zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Kennzeichnen der Leukozyten der Blutprobe,

dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension eine basische Polyaminosäure enthält, die durch Adsorption an den magnetischen Teilchen angelagert ist und dadurch die magnetischen Teilchen durch Erhöhen ihrer positiven Oberflächenladung sensibilisiert.

23. Suspension magnetischer Teilchen zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Kennzeichnen der Leukozyten der Blutprobe,

dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension ein Polypeptid enthält, das durch Adsorption an- den magnetischen Teilchen angelagert ist und dadurch die magnetischen Teilchen durch Erhöhen ihrer positiven Oberflächeniadung sensibiiisiert.

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24. Sediraentierungsmittel zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Zusammenballen und Absenken der Erythrozyten der Blutprobe,

dadurch gekennzeichnet, daß das Sedimentierungsmittel ein Geraisch aus einem Absetzmittel und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

25. Physiologisches Stabilisierungsmittel zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zur Stabilisierung der Blutprobe vor dem Trennen der Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel ein Dinatrium- oder Trikaliumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

26. Physiologisches Stabilisierungsmittel zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Stabilisieren der Blutprobe vor dem Trennen der Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel Natriumsalze der CHEL-DPTA- oder CHEL-DM-Säure enthält.

27. Trennungsmittel zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1 zum Trennen der Lymphozyten von einer physiologisch stabilisierten Gesamtblutprobe durch Kennzeichnen der phagozytischen Leukozyten der Blutprobe, mit Ausnahme der Lymphozyten, infolge Leukoadhäsion, Phagozytose und Zusamraenballung sowie durch Aggregation und Absenkung der Erythrozyten der Blutprobe, gekennzeichnet· durch in einem Sensibilisierungsmittel suspendierte magnetische Teilchen, wobei das Sensibilisierungsmittel durch Adsorption an den magnetischen Teilchen haftet und die magnetischen Teilchen durch Erhöhen ihrer positiven Oberflächenladung sensibilisiert, um das Kennzeichnen der

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phagozytischen Leukozyten durch diese magnetische Teilchen infolge Leukoadhäsion, Phagozytose und Zusammenballung zu fördern, durch eine Lösung mit freien Magnesium- und Calciumionen, um in der physiologisch stabilisierten Gesamtblutprobe^ einen derartigen Ionengehalt wiederherzustellen, daß Leukoadhäsion, Phagozytose und Zusammenballung stattfindet, und durch ein Sedimentierungsmittel, um die Aggregation und das Absetzen der Erythrozyten zu bewirken.

28. Trennungsmittel nach Anspruch 27, gekennzeichnet durch eine isotonische Lösung, die ein physiologisches Lösungsmittel zur Lymphozytentrennung darstellt, und durch eine .Energie abgebende Lösung, die die Energie für die Phagozytose liefert.

29. Trennungsmittel nach Anspruch 28, gekennzeichnet durch ein Antikoagulationsmittel, das während der Lymphozytentrennung die Gerinnung der Blutprobe verhindert.

30. Trennungsmittel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß "das Sensibilisierungsmittel eine basische Polyaminosäure ist.

31. Trennungsmittel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Sensibilisierungsmittel ein Polypeptid ist.

32. Trennungsmittel nach Anspruch 30, dadurch gek. ennzeichnet, daß die basische Polyaminosäure ein Poly-L-Lysin, PoIy-BL-Lysin, Poly-D-Lysin und bzw. oder Polyarginin ist.

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33. Trennungsmittel nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polypeptid um ein Polybren handelt.

34. Trennungsmittel nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,-daß das Sedimentierungsmittel ein Absetzmittel und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

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