WO2005121802A1 - Proteindifferenzierung - Google Patents

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WO2005121802A1
WO2005121802A1 PCT/DE2005/001008 DE2005001008W WO2005121802A1 WO 2005121802 A1 WO2005121802 A1 WO 2005121802A1 DE 2005001008 W DE2005001008 W DE 2005001008W WO 2005121802 A1 WO2005121802 A1 WO 2005121802A1
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mold
receiving
extract
recess
antibody preparation
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PCT/DE2005/001008
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Inventor
Heinz Voigt
Berthold Zwerger
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Heinz Voigt
Berthold Zwerger
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Definitions

  • the present invention relates to a method, a device and a test kit for protein differentiation, a medicament for the prevention and / or treatment of cancer and / or precancerous diseases, a medicament for targeted tissue dissolution, a medicament with an immunomodulating effect, a food supplement for prevention and / or curing cancer and / or precancerous diseases or a food supplement with an immunomodulating effect, and the use of mold extracts for the production of such medicaments or food supplements.
  • Methods and devices for the determination of proteins in an antigen sample by means of immunoelectrophoresis are known from US Pat. No.
  • FIG. 4 shows a typical device for immunoelectrophoresis according to US-A-4,244,803.
  • US-A-4,244,803 (column 2, lines 15-26) describes a method in which the antigens and antibodies are placed in suitable wells, the migration of the antigens and antibodies towards one another being accelerated by an applied electric field which also forms precipitation lines.
  • the protein differentiation according to the invention in particular the differentiation of the proteome of a healthy test person from the proteome of a patient suffering from cancer and / or precancerous diseases, is not mentioned.
  • Precancerosis and for assessing the drug sensitivity and / or chemical sensitivity of a test person are achieved by the method according to the invention, the device according to the invention and the test kit according to the invention for protein differentiation according to the independent pending patent claims solved.
  • the dependent claims indicate preferred embodiments.
  • the present invention thus relates to a method for protein differentiation, which comprises the steps of providing an antibody preparation, providing a differentiating agent, providing at least one antigen-containing fluid sample and providing a carrier medium which has at least one recess for receiving of the antibody preparation and a recess for receiving the fluid sample has that the fluid sample is placed in the recess for receiving the fluid sample and the antigens contained in the fluid sample are electrophoretically separated and that the antibody preparation with those contained in the fluid sample Antigens are reacted in the presence of the differentiating agent.
  • the differentiating agent can be used before electrophoresis, for example by adding it directly to the fluid sample, after which it is preferably incubated, or it is already present in the carrier medium, or it can be used after the electrophoresis, for example by adding it to a additionally provided and appropriately arranged recess of the carrier medium is given.
  • the embodiment is treated that the differentiating agent is added to the fluid sample before electrophoresis, ie before the fluid sample is added to the wells provided for this purpose.
  • a special embodiment of this method is that the antibody preparation is added to the well for receiving the antibody preparation before the electrophoretic separation of the antigens, the well for receiving the antibody preparation and the well for receiving the fluid sample being arranged such that during the electrophoretic Separation of the antigens, a reaction of the antibody preparation with the antigens takes place.
  • the advantage of this special embodiment is that the reaction of the antibody preparation with the antigens is then accelerated.
  • the practical configuration preferably corresponds to the method described in the literature as migration electrophoresis.
  • a further special embodiment of this method consists in that the antibody preparation after the electrophoretic separation of the antigens is added to the well for receiving the antibody preparation, the well for receiving the antibody preparation and the well for receiving the fluid sample being arranged and designed in this way that after the electrophoretic separation of the antigens, a reaction of the antibody preparation with the antigens takes place.
  • One way of training design corresponds to the method described in the literature as Grabar and Williams immunoelectrophoresis.
  • the embodiment is treated that the differentiating agent is added after the electrophoresis. In this embodiment, it is of great advantage if the carrier medium has an additional recess for receiving the differentiating agent.
  • the antibody preparation and the differentiating agent are then introduced essentially simultaneously into the wells provided for this purpose, the well for receiving the antibody preparation, the well for receiving the fluid sample and the well for receiving the differentiating agent being so arranged that after the electrophoretic separation of the antigens, a reaction of the antibody preparation with the antigens takes place in the presence of the differentiating agent.
  • One possible embodiment corresponds to the method described in the literature as Grabar and Williams immunoelectrophoresis, with an additional recess (groove) being provided for receiving the differentiating agent.
  • Figure 5 shows a photograph of a suitable gel configuration.
  • the carrier medium is preferably a medium which is selected from the group consisting of agar gel, agarose gel, polyacrylamide gel and nitrocellulose.
  • the antigen-containing fluid sample is preferably a protein-containing biological sample which is expediently selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, saliva, cerebrospinal fluid, tissue fluid and material obtained from smears, biopsies and / or resections. This list is, however, only to be regarded as an example, since the method according to the invention can also be transferred to other suitable samples.
  • the antibody preparation expediently contains one or more types of antibodies directed against the antigens contained in the fluid sample and is preferably a polyclonal antiserum, in particular an antihuman serum.
  • the antibody preparation is particularly preferably an antihuman serum obtained by immunizing a mammal.
  • the differentiating agent is preferably an active ingredient suitable for protein differentiation, which is selected in particular from active ingredients or chemical agents with chemotherapeutic, cytostatic, antitumoral, proteolytic, mitotic, metastasis-inhibiting and / or angiogenesis-inhibiting effects. Plant extracts, mold extracts, mold, mold spores, hyphae, mycelium and mold biosynthesis products and mixtures thereof have proven to be very suitable.
  • any medicament or active ingredient that can be used in the method according to the invention can be used, an interesting use of the method being that the drug sensitivity or chemical sensitivity of a test person against this active ingredient is estimated.
  • mold extracts can also be used for in v / vo protein differentiation or tissue differentiation, ie as a component of medicaments and / or nutritional supplements, which will be discussed further below.
  • the above-mentioned mold extract is preferably obtained from a mold of the genus Penicillium, in particular of the species Penicillium candidum, Penicillium camemberti and / or Penicillium roqueforti.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the diagnosis of cancer and / or precancerous diseases. Furthermore, it is suitable for estimating the chances of success and / or for controlling a therapy of cancer diseases and / or precancerous diseases and, as mentioned above, for estimating the drug sensitivity and / or the chemical sensitivity of a test person.
  • Another object of the present invention is a device for protein differentiation, which is particularly suitable for carrying out the above-mentioned immuno-electrophoresis according to Grabar and Williams, an additional recess (groove) being provided for receiving the differentiating agent.
  • This device preferably comprises a carrier medium with a recess for receiving an antibody preparation, a recess for receiving a differentiation agent and at least one recess for receiving an antigen-containing fluid sample, the carrier medium, the antibody preparation, the differentiation agent and the fluid sample having the meanings given above.
  • the carrier medium is preferably designed as a rectangular plate with a larger and a smaller side length.
  • the recess for receiving the antibody preparation is preferably an elongated, parallel to the larger side length running, centrally arranged gutter, the recess for receiving the differentiation agent as an elongated, parallel to the larger side length and spaced from the recess for receiving the antibody preparation, preferably of equal dimensions and the recess for receiving the fluid sample as a circular recess, which between the Well for receiving the antibody preparation and the well for receiving the differentiating agent is arranged.
  • This device is particularly preferred in an embodiment according to which two recesses are provided for receiving fluid samples, which are essentially equally spaced from the recess for receiving the antibody preparation, the one recess for receiving the one fluid sample between the recess for receiving the antibody preparation and the recess for receiving the differentiating agent is arranged.
  • FIG. 5 shows a photographic illustration of a suitable gel configuration.
  • Another object of the present invention is a test kit for protein differentiation, which comprises the carrier medium, the antibody preparation and the differentiating agent according to at least one of the preceding definitions.
  • the test kit of this type the user can be provided with all the materials necessary for carrying out the method described above.
  • the mold extracts can also be used for in vivo protein differentiation or tissue differentiation, ie as a component of medication and / or nutritional supplements. Cancer is a frequently occurring, often fatal disease which, through the degenerate growth of malignant tumor cells, penetrates the organism with uncontrollably overgrowth and metastatic malignant tumors, thereby destroying vital organs or components of the organism.
  • Pre-cancerous diseases are morphologically detectable precursors of malignant tumors.
  • Chemical agents so-called cytostatics, which inhibit cell growth and, as a result of the rapid, disorderly growth of malignant tumors, attack them more strongly than healthy tissue.
  • cytostatics often do not lead to a permanent cure of the cancer, but rather to a temporary containment and delay of tumor growth, so that the successful use of cytostatics in the fight against cancer is only possible to a limited extent.
  • these cytostatics due to their growth inhibition, these cytostatics also damage the healthy cells of the organism and especially the immune system, so that their use has serious side effects. is bound.
  • the use of cytostatics has only shown promise for certain types of tumor.
  • the object on which the present invention is based was to provide a natural agent for the prevention and / or treatment of cancer and / or precancerous diseases.
  • This agent should be as effective as possible with as few side effects as possible.
  • the agent should not cause damage to the immune system, but should have a beneficial effect on the immune system if possible. It should preferably be usable both as a medicament and as a food supplement. Another task was to find the cheapest possible production for such a product.
  • Another object of the present invention is therefore a medicament for the prevention and / or treatment of cancer and / or precancerous diseases, which contains a mold extract and optionally pharmacologically acceptable carriers and / or fillers.
  • the medicament according to the invention is able, owing to its mitotic inhibiting properties, to prevent the growth of manifest tumors based on rapid cell division. inhibit or counteract further degeneration of precancerous diseases.
  • due to its proteolytic properties it is particularly suitable for dissolving existing tumors and precancerous lesions when administered locally. It is therefore characterized by an anti-tumor effect.
  • molds of the genera Penicillium, Aspergillus and / or Fusarium and in particular molds of the species Penicillium candidum, Penicillium camemberti and / or Penicillium roqueforti are preferred according to the invention.
  • Suitable mold strains can be obtained, for example, from Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Germany (e.g.
  • the mold extract contained in the medicament according to the invention is expediently a cell-free, preferably a sterile-filtered and in particular a pyrogen-free extract. Furthermore, the mold extract is expediently an aqueous extract. Alternatively, a dry extract and preferably a lyophilized extract is also possible.
  • the medicament according to the invention is characterized in that the
  • Mold extract contains a mold biosynthesis product, in particular a mycotoxin and / or a protease.
  • mold biosynthesis products in synthetic form and natural mold biosynthesis products are to be regarded as equivalent.
  • the said medicament does not damage the immune system.
  • it is able to synergistically enhance the effect of these known chemical agents or to weaken their harmful effect.
  • a significantly higher degree of efficiency can be achieved with the same dosage of the cytostatics or the same degree of efficiency with a lower dosage. This can significantly reduce the side effects of chemotherapy.
  • a preferred embodiment of the present invention thus consists in that the medicament according to the invention additionally contains, in particular, at least one chemical agent known per se for the treatment of cancer and / or precancerous diseases a cytostatic, which is selected for example from cyclophosphamide, fluorouracil, endoxane, cisplatin and mixtures thereof.
  • a cytostatic which is selected for example from cyclophosphamide, fluorouracil, endoxane, cisplatin and mixtures thereof.
  • a further object of the present invention is a food supplement for the prevention and / or healing of cancer and / or precancerous diseases, which is characterized in that it contains a mold extract as defined above , optionally together with pharmacologically acceptable carriers and / or fillers.
  • a food supplement with an immunomodulating effect which is characterized in that it contains a mold extract as defined above, optionally together with pharmacologically acceptable carriers and / or fillers, is a further subject of the invention.
  • Further subjects of the present invention are the uses of a mold extract according to The above definition for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of cancer and / or precancerous diseases, for the manufacture of a medicament for targeted tissue dissolution, the mitosis-inhibiting and metastasis-inhibiting properties mentioned above being advantageous in the event of tumor resolution, for the manufacture of a Medicament with an immunomodulating effect, for the production of a food supplement for the prevention and / or healing of cancer and / or precancerous diseases and for the production of a food supplement fertilizer with immunomodulating effect.
  • the extraction of the mold extract is not restricted to specific production processes. However, it is advisable to choose a method in which a sufficient effectiveness of the mold extract is guaranteed without the extract must then be concentrated. The necessary cleaning measures should also be kept to a minimum. Furthermore, the mold extract, which also has proteolytic properties, should not decompose itself during storage, which may require a sufficiently long maturation of the mold extract. In the manufacturing process described below, all steps must be carried out under sterile conditions in order to prevent foreign bacteria from colonizing. The use of a sterile workplace according to the current state of the art is therefore absolutely necessary.
  • a mold lawn is first grown in a suitable nutrient medium. This mold lawn is then suspended in an extraction medium. The cell walls of the mold cells are then broken open.
  • the suspension obtained is then optionally ripened, preferably using shear forces.
  • the extract is then filtered.
  • the extract obtained in this way can be used directly for the production of the pharmaceuticals and dietary supplements described above.
  • any nutrient medium is suitable for growing the mold lawn, provided that it contains usable carbon, nitrogen and energy sources from the mold.
  • the inoculation with molds is expediently carried out by adding lyophilized mold spores to the selected nutrient medium. If necessary, the mold lawn can be inoculated later (once or more) on a new medium.
  • the molds are preferably grown first in a Sabouraud-glucose broth and then on a Sabouraud-glucose agar to form a mold lawn.
  • any medium is suitable for suspending the mold lawn, in order to subsequently break open the mold cells, as long as it is ensured that the suspension medium does not destroy the pharmacologically active ingredients of the mold.
  • An aqueous medium is preferably used.
  • an alcoholic or aqueous-alcoholic medium can be used.
  • Isotonic saline is particularly suitable.
  • Mold cells have very resistant cell walls. Breaking open the cell walls is therefore difficult.
  • any method is suitable with which the cell walls can be broken open effectively if the pharmacologically active ingredients of the mold are spared at the same time. According to the invention walls of the mold cells broken up in a cell disruption bomb.
  • the suspension of the mold cells in the cell disruption bomb is preferably repeatedly pressurized with nitrogen up to a suitable pressure of approx. 100 bar, equilibrated in each case for approx. 30 minutes and relaxed to normal pressure, this cycle preferably being carried out at least ten times. It makes sense to work with ice cooling when breaking open the cell walls.
  • the modalities of maturing the cell suspension vary from case to case and must be tailored to the individual case. It has, however, been shown that the suspension can expediently be matured by subjecting the suspension to an ultrasound treatment every day for one hour under sterile conditions for at least 8 months.
  • an adequate purity of the extract is required.
  • the extract is expediently first filtered through glass wool and / or Celite, then cell-free filtered through a filter with a maximum pore size of 0.4 ⁇ m and / or preferably sterile filtered through a filter with a maximum pore size of 0.2 ⁇ m.
  • the extract should then be filtered, if necessary, using pyrogen-free ultrafiltration.
  • 1 shows a device for immunoelectrophoresis according to the prior art
  • 2 shows the course of the optical extinction of a Penicillium candidum extract in the range from approximately 300 nm to approximately 750 nm;
  • Figure 3 is a photographic image of an Aga l plate after the end of the immunoelectrophoresis of a tumor tissue fluid.
  • FIG. 4 shows a photographic illustration of an agar plate after completion of the immunoelectrophoresis of a tissue fluid of a healthy tissue
  • 5 is a photographic image of an agar plate after the completion of the immunoelectrophoresis of a serum sample from a tumor patient;
  • 6 is a photographic illustration of an aga plate after the end of the immunoelectrophoresis of a serum sample from a healthy test person; 7 shows a photographic illustration of an agaplate after completion of a migration electrophoresis of serum samples from a tumor patient;
  • FIG. 8 shows a photomicrograph of a blood culture smear without mold extract
  • 9 shows a photomicrograph of a blood culture smear with Penicillium roqueforti extract
  • FIG. 10 shows a photomicrograph of a biopsy sample of a precancerous type Bowen disease
  • 13 shows a chromosome representation for determining the mitotic rate in a blood culture without Penicillium candidum extract
  • 14 shows a chromosome representation for determining the mitotic rate in a blood culture with Penicillium candidum extract
  • FIG. 16 shows a photomicrograph of a mouse liver cell culture without Penicillium candidum extract.
  • the following steps were carried out in a sterile workplace with laminar air flow.
  • An ampoule of spore lyophilisate of the mold Penicillium candidum type SA (Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Germany) was dissolved in 500 ml Sabouraud glucose broth (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). The solution was aerated for two days using a sterile filter and a sparkling insert.
  • the mycelium formed was inoculated on Sabouraud glucose agar (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). After five days, a continuous, about 3 mm thick mushroom lawn had formed, which could be easily removed with a sterile scalpel. 60 g of the fungal mycelium were placed under sterile
  • the suspension obtained was then placed in a sterile Erlenmeyer flask, the air was displaced with protective gas (nitrogen), the flask was sealed with a stopper made of sterile silicone rubber, eight months left for long at room temperature and subjected to ultrasonic treatment in an ultrasonic bath for one hour daily. It was then sterile filtered first over glass wool, Celite and finally through a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • the extract obtained in this way had the following properties: To determine the optical rotation, a polarimeter was filled with isotonic saline and the zero point was checked. The measurement of the extract showed a left turn of 0.3 °.
  • the measurement of the dry residue of the extract showed a value of 1.08%.
  • the measurement of the extract with a glass electrode showed a pH of 4.83.
  • the results of the measurement of the optical extinction in the range from approximately 300 nm to approximately 750 nm are shown in FIG. 2.
  • calf serum Newborn Bovine Serum, Flow Laboratories, Irvine, UK
  • One sample was mixed with 1 ml of isotonic saline, the other with 1 ml of the extract. After a one-hour incubation period at room temperature (21 ° C), the total protein was determined in both samples.
  • Example 2 .. Preparation eJ
  • Example 1 was essentially made using spore lyophilizate of the blue mold Penicillium roqueforti (Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Germany) identical results repeated, but the extract obtained was not subjected to detailed analytical characterization.
  • Example . 3; .... Immune! Eto with mold spores Approx. 1 ml of tissue fluid was obtained by cutting and squeezing tumor tissue (surgically removed tumor secured by histology). Hyphae were removed from a turf of the blue mold Penicillium roqueforti grown on Sabouraud glucose agar according to Example 2 using a sterile lancet, with which the tissue fluid was contaminated. The sample was then incubated at 37 ° C. for one hour and then homogenized by trituration with a pestle in a small agate mortar. Approximately 20 ⁇ l of this suspension were placed in the right circular depression of the agar gel according to FIG. 3.
  • healthy tissue namely abdominal wall muscles
  • healthy tissue was treated in the same way by the same patient and presented in the right circular depression of the agar gel according to FIG. 4.
  • about 20 ⁇ l of uncontaminated tissue fluid of both types of tissue were initially placed in the two left-hand circular depressions of the Aga ⁇ latten, ie tumor tissue in the plate from FIG. 3 and healthy tissue in the plate from FIG. 4.
  • the proteins contained in these samples were then added a voltage of approx. 200 V and a current of approx. 15 mA for a period of approx. 90 minutes electrophoretically separated.
  • Fig. 3 shows a photographic image of the Aga ⁇ latte after completion of the immunoelectrophoresis of the tumor tissue
  • Fig. 4 is a photographic image of the Aga ⁇ latte after completion of the immunoelectrophoresis of the healthy tissue, with the anodes at the top and the cathodes at the bottom of the agar plates were. The evaluation showed that with the contaminated tissue fluid from tumor tissue practically all protein fractions with the exception of one presumably
  • Example 4 Immunoelectrophoresis according to Grabar and Williams with pretreatment of the samples. ⁇ Schimm . eJ jJzsppren Example 3 was repeated using hyphae from a Penicillium camemberti mold lawn used according to Example 1 with essentially identical results.
  • Example 5i .. MQdjfiz Example 3 was no contamination with fungal hyphae repeated.
  • Approximately 20 ⁇ l of the serum to be examined of a tumor patient was first separated electrophoretically. After the separation, 100 ⁇ l of the goat antihuman serum were introduced into the middle groove of the gel plate according to FIG. 5.
  • 100 ⁇ l of the Penicillium candidium extract from Example 1 were introduced into a second groove cut out on the left edge of the gel carrier.
  • Fig. 5 shows a photographic image of the Aga ⁇ latte after completion of the immunoelectrophoresis of this serum sample. A separation, which was carried out with the serum of a healthy test person, served as a cross-check.
  • Fig. 5 shows a photographic image of the Aga ⁇ latte after completion of the immunoelectrophoresis of this serum sample.
  • Example 6 Modified Bussard Migration Electrophoresis
  • serum samples of a tumor patient which had been mixed with the additives specified below one hour before pipetting in, were subjected to a modified Bussard migration electrophoresis, in which the antibodies were in principle dependent on the electroendosmotic properties of the gel in Move towards the cathode and the antigens towards the anode and form visible precipitation lines when they meet.
  • Polyclonal antihuman serum was pipetted into the starting holes marked Kl, 2, 3, 4 in the gel plate according to FIG. 7.
  • the serum samples were pipetted into the opposite starting holes, namely a serum sample (K1) diluted accordingly with isotonic saline solution, two serum samples (2 and 4) spiked with a Penicillium candidum extract according to Example 1, the extract beforehand with isotonic saline solution in a ratio of 1 : 3 had been diluted (ie the protein breakdown of the diluted extract was 5% per hour), and a serum sample mixed with the undiluted Penicillium candidum extract according to Example 1 (3).
  • Fig. 7 shows a photograph of the gel after completion of the migration electrophoresis. As can be seen, in the samples (2, 3 and 4) treated with the Penicillium candidum extracts, the precipitation lines are partially erased compared to the untreated sample (C1). This effect is particularly pronounced in the undiluted candidum extract according to Example 1.
  • Example 7 Standardization of a Penicillium candidum extract. Example 1 was repeated. It was determined in clinical self-experiments that this concentration was still too high for injective applications of the extract; strong necrosis formed at the injection site, which was probably due to the high protease content. After a dilution of the above extract in a ratio of 1: 3 with isotonic saline (corresponding to a protein reduction of approx. 5% in the diluted extract), there was practically no necrosis after a subcutaneous injection of 1 ml. Only slight reddening of the skin was observed, so that this concentration was considered to be practicable. In this diluted Penicillium candidum extract, the L-gamma-glutamyl
  • the blood culture of venous blood was made non-coagulable with heparin solution (heparin novo, 25000 IU / 5 ml).
  • the blood was centrifuged and the leukocytes, part of the erytrocytes and 2 ml of plasma each were transferred to 2 centrifuge tubes containing 7 ml of McCoy's 5A medium (Flow Laboratories, Irvine, UK).
  • 70 mg of a Penicillium roqueforti extract, which had been prepared according to Example 2 were added to a culture. Only 2 ml of isotonic saline was added to the other culture. Both cultures were then incubated at 37 ° C for 6 hours.
  • EXAMPLE 9 Detection of the Mitosis-Inhibiting Effect of the Penicillium Candidum Extract in a Blood Culture
  • the extract of the mold Penicillium candidum according to Example 1 was tested for the mitosis-inhibiting effect.
  • the result was essentially identical to that of the Penicillium roqueforti mushroom extract.
  • One of the inventors contracted Bowen's disease (precancerous disease) on the right tibia. After confirming the diagnosis by biopsy (cf. FIG. 10), the inventor treats himself by injecting 2 ml of the diluted Penicillium candidum extract according to Example 7 about 1 cm next to the diseased area of the skin. After two weeks of treatment, the swelling of the skin had decreased and only one scar was visible. A repetition of the biopsy showed a completely unsuspicious cell image (see Fig. 11).
  • Example 11 Chromosome representation (standardized method) Two vials of chromosome medium 1A (company Gibco, California, USA (now Invitrogen Co ⁇ oration): unpublished mixture of Eagle's Minimum Essential Medium, fetal calf serum, heparin, antibiotics and phytohaemagglutinin) were each with 5 ml of attached solvent dissolved. 0.2 ml was placed in one of the vials the diluted Penicillium candidum extract according to Example 7, into which the other is sterile pipetted the same amount of isotonic saline. After both vials were warmed to 37 ° C, 0.2 ml of venous blood was added to each. Then both samples were incubated at 37 ° C for 70 hours.
  • FIG. 12 shows an enlarged detail
  • FIG. 13 the blood culture without Penicillium candidum extract
  • FIG. 14 the blood culture with Penicillium candidum extract.
  • Example 12 Mitosis inhibition in cell culture of the mouse liver
  • MCM nutrient medium

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Proteindifferenzierung, welches die Schritte umfasst, dass eine Antikörperzubereitung bereitgestellt wird, dass ein Differanzierungsmittel bereitgestellt wird, dass zumindest eine antigenhaltige fluide Probe bereitgestellt wird und dass ein Trägermedium bereitgestellt wird, welches zumindest eine Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und eine Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe aufweist, dass die fluide Probe in die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe gegeben wird und die in der fluiden Probe enthaltenen Antigene elektrophoretisch aufgetrennt werden, und dass die Antikörperzubereitung mit den in der fluiden Probe enthaltenen Antigenen in Gegenwart des Differenzierungsmittels reagieren gelassen wird. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, zur Abschätzung der Erfolgsaussichten und/oder zur Kontrolle einer Therapie von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen sowie zur Abschätzung der Medikamentensensitivität und/oder der chemischen Sensitivität einer Testperson. Weiterhin wird eine Vorrichtung zur Proteindifferenzierung vorgeschlagen. Als Differenzierungsmittel wird u.a. ein Schimmelpilzextrakt vorgeschlagen, welcher zudem prophylaktische, therapeutische und immunmodulierende Eigenschaften aufweist.

Description

PROTEINDIFFERENZIERUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, eine Vorrichtung und einen Testkit zur Proteindifferenzierung, ein Arzneimittel zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, ein Arzneimittel zur gezielten Gewebeauflösung, ein Arzneimittel mit immunmodulierender Wirkung, ein Nahrungsergänzungs- mittel zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen bzw. ein Nahrungsergänzungsmittel mit immunmodulierender Wirkung, sowie die Verwendung von Schimmelpilzextrakten zur Herstellung solcher Arzneimittel bzw. Nahrungsergän- zungsmittel. Aus US-A-4,244,803 (Spalte 1, Z. 37-67) sind Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung von Proteinen in einer Antigenprobe mittels Immunelektrophorese bekannt, bei denen die Proteine in der zu analysierenden Mischung zunächst durch eindimensionale Elektrophorese auf einem geeigneten Gelträger aufgetrennt und anschließend senkrecht zur Elektrophoreserichtung einer Doppeldiffusion gegen ein Antiserum unterzogen werden, worauf sich im Bereich zwischen der Antiserumrinne und den fraktionierten Proteinen sogenannte Präzipitationslinien bilden, die dann einer quantitativen Auswertung unterzogen werden. Fig. 1 zeigt eine typische Vorrichtung zur Immunelektrophorese nach US-A-4,244,803. Alternativ wird in US-A-4,244,803 (Spalte 2, Z. 15-26) ein Verfahren beschrieben, bei welchem die Antigene und Antikörper in geeigneten Vertiefungen vorgelegt werden, wobei die aufeinander zu gerichtete Wanderung der Antigene und Antikörper durch ein angelegtes elektrisches Feld beschleunigt wird, wodurch sich ebenfalls Präzipitationslinien bilden. Allerdings wird in dieser zum Stand der Technik zählenden Patentschrift die erfindungsgemäße Proteindifferenzierung, insbesondere die Differenzierung des Proteoms einer gesunden Testperson vom Proteom eines an Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen leidenden Patienten, nicht erwähnt. Es wird daher schon seit langem nach Alternativen zu derartigen Verfahren und Vorrichtungen gesucht, welche eine einfache und sichere Proteindifferenzierung ermöglichen, insbesondere zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, zur Abschätzung der Erfolgsaussichten und/oder zur Kontrolle einer Therapie von Krebserkrankungen und/oder
Präkanzerosen sowie zur Abschätzung der Medikamentensensitivität und/oder chemischen Sensitivität einer Testperson. Diese Aufgaben werden durch das erfindungsgemäße Verfahren, die erfindungsgemäße Vorrichtung und den erfindungsgemäßen Testkit zur Proteindifferenzierung nach den unab- hängigen Patentansprüchen gelöst. Die abhängigen Ansprüche geben bevorzugte Ausfuhrungsformen an. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Proteindifferenzierung, welches die Schritte umfasst, dass eine Antikörperzubereitung bereitgestellt wird, dass ein Differenzierungsmittel bereitgestellt wird, dass zumindest eine antigenhaltige fluide Probe bereitgestellt wird und dass ein Trägermedium bereitgestellt wird, welches zumindest eine Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und eine Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe aufweist, dass die fluide Probe in die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe gegeben wird und die in der fluiden Probe enthaltenen Antigene elektrophoretisch auf- getrennt werden und dass die Antikörperzubereitung mit den in der fluiden Probe enthaltenen Antigenen in Gegenwart des Differenzierungsmittels reagieren gelassen wird. Prinzipiell kann das Differenzierungsmittel vor der Elektrophorese zur Anwendung kommen, indem es z.B. direkt zur fluiden Probe gegeben wird, wonach vorzugsweise inkubiert wird, oder bereits im Trägermedium vorhanden ist, oder es kann im Anschluss an die Elektrophorese zur Anwendung kommen, indem es z.B. in eine zusätzlich vorgesehene und zweckmäßig angeordnete Vertiefung des Trägermediums gegeben wird. Zunächst wird die Ausfuhrungsform behandelt, dass das Differenzierungsmittel vor der Elektrophorese, d.h. noch vor der Zugabe der fluiden Probe in die dafür vorgesehene Vertiefungen), zur fluiden Probe gegeben wird. Eine spezielle Ausfuhrungsform dieses Verfahrens besteht darin, dass die Antikörperzubereitung vor der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene in die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung gegeben wird, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe so angeordnet sind, dass während der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antikör- perzubereitung mit den Antigenen stattfindet. Der Vorteil dieser speziellen Ausfuhrungsform besteht darin, dass die Reaktion der Antikörperzubereitung mit den Antigenen dann beschleunigt abläuft. Die praktische Ausgestaltung entspricht vorzugsweise dem in der Literatur als Überwanderungselektrophorese bezeichneten Verfahren. Eine weitere spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens besteht darin, dass die An- tikörperzubereitung nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene in die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung gegeben wird, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe so angeordnet und ausgestaltet sind, dass nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antikörperzubereitung mit den Antigenen stattfindet. Eine Möglichkeit der Aus- gestaltung entspricht dem in der Literatur als Immunelektrophorese nach Grabar und Williams bezeichneten Verfahren. Als Nächstes wird die Ausfuhrungsform behandelt, dass das Differenzierungsmittel im Anschluss an die Elektrophorese zugegeben wird. Bei dieser Ausführungsform ist es von großem Vorteil, wenn das Trägermedium eine zusätzliche Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels aufweist. Die Antikörperzubereitung und das Differenzierungsmittel werden dann nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene im Wesentlichen gleichzeitig in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung, die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe und die Vertie- fung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels so angeordnet sind, dass nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antikörperzubereitung mit den Antigenen in Gegenwart des Differenzierungsmittels stattfindet. Eine Möglichkeit der Ausgestaltung entspricht dem in der Literatur als Immunelektrophorese nach Grabar und Williams bezeichneten Verfahren, wobei eine zusätzliche Vertiefung (Rinne) zur Aufnahme des Differen- zierungsmittels vorgesehen ist. Fig. 5 zeigt eine photographische Aufnahme einer geeigneten Gelkonfiguration. Es ist leicht einzusehen, dass alle hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen so ausgestaltet werden können, dass zusätzlich zur antigenhaltigen fluiden Probe zumindest eine Blindprobe bzw. Gegenprobe analysiert wird. Als Trägermedium ist prinzipiell jedes Medium einsetzbar, das zur Elektrophorese und
Immundiffusion geeignet ist. Vorzugsweise ist das Trägermedium ein Medium, welches aus der Gruppe, bestehend aus Agargel, Agarosegel, Polyacrylamidgel und Nitrocellulose, ausgewählt ist. Die antigenhaltige fluide Probe ist vorzugsweise eine proteinhaltige biologische Probe, die zweckmäßigerweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Gewebsflüssigkeit sowie aus Abstrichen, Biop- sien und/oder Resektionen gewonnenem Material. Diese Aufzählung ist indessen nur als exemplarisch anzusehen, da das erfindungsgemäße Verfahren auch auf andere geeignete Proben übertragen werden kann. Die Antikörperzubereitung enthält zweckmäßig eine oder mehrere Sorten von gegen die in der fluiden Probe enthaltenen Antigene gerichteten Antikörpern und ist vorzugsweise ein polyklonales Antiserum, insbesondere ein Antihumanserum. Besonders bevorzugt ist die An- tikö erzubereitung ein durch Immunisierung eines Säugetiers gewonnenes Antihumanserum. Das Differenzierungsmittel ist vorzugsweise ein zur Proteindifferenzierung geeigneter Wirkstoff, der insbesondere aus Wirkstoffen bzw. chemischen Mitteln mit chemotherapeutischer, zyto statischer, antitumoraler, proteoly tischer, mitosehemmender, metastasenhemmender und/oder angiogenesehemmender Wirkung ausgewählt ist. Als gut geeignet haben sich Pflanzenextrakte, Schimmelpilzextrakte, Schimmelpilze, Schimmelpilzsporen, Hyphen, My- cel und Schimmelpilz-Biosyntheseprodukte sowie Mischungen davon erwiesen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann indessen jedes Medikament bzw. jeder Wirkstoff verwendet werden, der sich im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen lässt, wobei eine interessante Verwendung des Verfahrens darin besteht, dass die Medikamentensensitivität bzw. chemische Sensitivität einer Testperson gegen diesen Wirkstoff abgeschätzt wird. Weiterhin hat es sich herausgestellt, dass Schimmelpilzextrakte auch zur in v/vo-Pro- teindifferenzierung bzw. Gewebsdifferenzierung, d.h. als Bestandteil von Medikamenten und/oder Nahrungsergänzungsmitteln, verwendet werden können, worauf noch weiter unten eingegangen wird. Der vorbezeichnete Schimmelpilzextrakt wird vorzugsweise aus einem Schimmelpilz der Gattung Penicillium, insbesondere der Arten Penicillium candidum, Penicillium camem- berti und/oder Penicillium roqueforti gewonnen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen. Weiterhin ist es zur Abschätzung der Erfolgsaussichten und/oder zur Kontrolle einer Therapie von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen sowie, wie oben erwähnt, zur Abschätzung der Medikamentensensitivität und/ oder der chemischen Sensitivität einer Testperson geeignet. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Proteindifferenzierung, welche insbesondere zur Durchführung der oben erwähnten Immunelektro- phorese nach Grabar und Williams geeignet ist, wobei eine zusätzliche Vertiefung (Rinne) zur Aufnahme des Differenzierungsmittels vorgesehen ist. Diese Vorrichtung umfasst vorzugsweise ein Trägermedium mit einer Vertiefung zur Aufnahme einer Antikörperzubereitung, einer Vertiefung zur Aufnahme eines Differenzierungsmittels und zumindest einer Vertiefung zur Aufnahme einer antigenhaltigen fluiden Probe, wobei das Trägermedium, die Antiköφerzubereitung, das Differenzierungsmittel und die fluide Probe die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen. In dieser Vorrichtung ist das Trägermedium vorzugsweise als rechteckige Platte mit einer größeren und einer kleineren Seitenlänge ausgebildet. Die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung ist vorzugsweise als langgestreckte, parallel zur größeren Seitenlänge verlaufende, mittig angeordnete Rinne ausgebildet, die Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels als langgestreckte, parallel zur größeren Seitenlänge verlaufende und von der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung beabstandete, vorzugsweise gleich dimensionierte Rinne und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe als kreisförmige Vertiefung, welche zwischen der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung und der Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels angeordnet ist. Besonders bevorzugt wird diese Vorrichtung in einer Ausgestaltung, wonach zwei Vertiefungen zur Aufnahme fluider Proben vorgesehen sind, die von der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung im Wesentlichen gleich beabstandet sind, wobei die eine Vertiefung zur Aufnahme der einen fluiden Probe zwischen der Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und der Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels angeordnet ist. Fig. 5 gibt eine photographische Abbildung einer geeigneten Gelkonfiguration wieder Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur Proteindifferen- zierung, welcher das Trägermedium, die Antiköφerzubereitung und das Differenzierungsmittel nach mindestens einem der vorausgehenden Definitionen umfasst. Mit einem derartigen Testkit können dem Anwender alle zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens notwendigen Materialien an die Hand gegeben werden. Wie bereits weiter oben erwähnt wurde, können die Schimmelpilzextrakte auch zur in v vo-Proteindifferenzierung bzw. Gewebsdifferenzierung, d.h. als Bestandteil von Medikamenten und/oder Nahrungsergänzungsmitteln, verwendet werden. Krebs ist eine häufig auftretende, oft tödlich endende Krankheit, die durch ein entartetes Wachstum maligner Tumorzellen den Organismus mit unkontrolliert wuchernden und meta- stasierenden bösartigen Tumoren durchdringt und dadurch zur Zerstörung lebenswichtiger Or- gane oder Bestandeile des Organismus führt. Präkanzerosen sind moφhologisch nachweisbare Vorstufen maligner Tumoren. Es sind chemische Mittel, sogenannte Zytostatika, bekannt, die das Zellwachstum hemmen und infolge des schnellen ungeordneten Wachstums maligner Tumoren diese stärker angreifen als das gesunde Gewebe. Doch führen diese Zytostatika oft nicht zu einer dauer- haften Heilung der Krebserkrankung, sondern zu einer vorübergehenden Eindämmung und Verzögerung des Tumorwachstums, so dass ein erfolgreicher Einsatz von Zytostatika bei der Krebsbekämpfung nur eingeschränkt möglich ist. Außerdem schädigen diese Zytostatika infolge ihrer Wachstumshemmung auch die gesunden Zellen des Organismus und insbesondere das Immunsystem erheblich, so dass ihre Anwendung mit schweren Nebenwirkungen ver- bunden ist. Überdies hat sich die Anwendung von Zytostatika nur bei bestimmten Tumorarten als erfolgversprechend erwiesen. Insgesamt sind also bisher keine chemischen Mittel für eine dauerhaft wirksame Krebsbekämpfung bekannt. Es wird daher schon seit langem nach Alternativen zu derartigen chemischen Mitteln gesucht. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, ein natürliches Mittel zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/ oder Präkanzerosen bereitzustellen. Dieses Mittel sollte eine möglichst gute Wirksamkeit bei möglichst geringen Nebenwirkungen aufweisen. Weiterhin sollte das Mittel keine Schädigung des Immunsystems bewirken, sondern nach Möglichkeit eine günstige Wirkung auf das Immunsystem entfalten. Es sollte vorzugsweise sowohl als Arzneimittel als auch als Nahrungsergänzungsmittel einsetzbar sein. Eine weitere Aufgabe bestand darin, eine möglichst günstige Herstellung für ein solches Mittel aufzufinden. Diese Aufgaben werden durch die erfindungsgemäßen Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel bzw. durch die erfindungsgemäße Verwendung der Schimmelpilzextrakte zur Herstellung solcher Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel nach den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Die abhängigen Ansprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an. Speisepilze, insbesondere Schitake, werden in der fernöstlichen Medizin traditionell zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebserkrankungen sowie zur Stärkung des Immunsystems eingesetzt. Demgegenüber stehen Schimmelpilze im Verdacht, aufgrund der von ih- nen produzierten Mykotoxine wie z.B. Aflatoxin krebserregend zu sein. In der Lebensmittelindustrie werden daher sogenannte Edelpilz-Kulturen eingesetzt. Aber auch den von diesen Edelpilzkulturen produzierten Mykotoxinen wird mit Argwohn begegnet. In WO02/11563 wird ein Nahrungsergänzungsmittel zur Vorbeugung und Behandlung von Krebserkrankungen beschrieben, welches ein Biosyntheseprodukt von Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 enthält. Es wurde nun überraschend gefunden, dass es möglich ist, aus Schimmelpilzen Extrakte herzustellen, die in Form von Arzneimitteln bzw. Nahrungsergänzungsmitteln zur Lösung der obigen Aufgaben eingesetzt werden können. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Arzneimittel zur Vor- beugung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, welches einen Schimmelpilzextrakt und gegebenenfalls pharmakologisch akzeptable Träger und/oder Füllstoffe enthält. Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist in der Lage, aufgrund seiner mitosehemmenden Eigenschaften das auf einer raschen Zellteilung beruhende Wachstum von manifesten Tumo- ren zu hemmen bzw. einer weiteren Entartung von Präkanzerosen entgegenzuwirken. Zudem eignet es sich aufgrund seiner proteolyti sehen Eigenschafen insbesondere bei lokaler Verabreichung dazu, bestehende Tumoren und Präkanzerosen aufzulösen. Es zeichnet sich mithin durch eine antitumorale Wirkung aus. Außerdem weist es insbesondere bei systemischer Ver- abreichung eine metastasenhemmende sowie vorbeugende Wirkung auf. Es wird vermutet, dass es darüber hinaus auch eine angiogenesehemmende Wirkung aufweist. Obwohl die Gewinnung der besagten Schimmelpilzextrakte prinzipiell nicht auf bestimmte Schimmelpilze beschränkt ist, werden erfindungsgemäß Schimmelpilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus und/oder Fusarium und insbesondere Schimmelpilze der Arten Penicillium candidum, Penicillium camemberti und/oder Penicillium roqueforti bevorzugt. Geeignete Schimmelpilzstämme können z.B. von der Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Deutschland (z.B. Penicillium candidum) bzw. von der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland (z.B. Penicillium roqueforti und Penicillium camemberti) bezogen werden. Der im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltene Schimmelpilzextrakt ist zweckmäßig ein zellfreier, vorzugsweise ein steril filtrierter und insbesondere ein pyrogen- freier Extrakt. Weiterhin ist der Schimmelpilzextrakt zweckmäßig ein wässriger Extrakt. Alternativ ist auch ein Trockenextrakt und vorzugsweise ein lyophilisierter Extrakt möglich. Allgemein ist das erfindungsgemäße Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass der
Schimmelpilzextrakt ein Schimmelpilz-Biosyntheseprodukt, insbesondere ein Mykotoxin und/oder eine Protease enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Schimmelpilz- Biosyntheseprodukte in synthetischer Form und natürliche Schimmelpilz-Biosyntheseprodukte als äquivalent anzusehen. Das besagte Arzneimittel schädigt im Gegensatz zu den chemischen Mitteln des Standes der Technik das Immunsystem nicht. Darüber hinaus ist es in der Lage, die Wirkung dieser an sich bekannten chemischen Mittel in synergistischer Weise zu verstärken bzw. deren schädliche Wirkung abzuschwächen. Mit anderen Worten kann bei gleicher Dosierung der Zytostatika ein deutlich höherer Wirkungsgrad bzw. bei niedrigerer Dosierung der gleiche Wirkungs- grad erzielt werden. Dadurch können die Nebenwirkungen einer Chemotherapie erheblich reduziert werden. Somit besteht eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darin, dass das erfindungsgemäße Arzneimittel zusätzlich mindestens ein an sich bekanntes chemisches Mittel zur Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen enthält, insbesondere ein Zytostatikum, welches beispielsweise aus Cyclophosphamid, Fluoruracil, Endoxan, Cis- platin und Mischungen daraus ausgewählt ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass hier ein sogenannter Carrier-Effekt vorliegt. Das bedeutet, dass das Zytostatikum besser in die Zellen eingeschleust wird. Ebenso scheint es, dass die Kombination Zytostatikum/Schimmel- pilzextrakt eine wesentlich längere Verweildauer im Köφer besitzt. In v tro-Untersuchungen der Mitoserate in einer Zellkultur haben gezeigt, dass die Mitoserate beim Kombinationspräparat deutlich niedriger ist als beim Zytostatikum alleine. Analoges gilt für die Chromosomendarstellung. Das besagte Arzneimittel schädigt also, wie schon gesagt, im Gegensatz zu den chemischen Mitteln des Standes der Technik das Immunsystem nicht. Vorzugsweise weist es eine immunmodulierende Wirkung auf, die auf seinem Gehalt an Schimmelpilzextrakt beruht. Ein derartiges Arzneimittel mit immunmodulierender Wirkung stellt daher einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nahrungsergänzungsmittel zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Schimmelpilzextrakt gemäß obiger Definition, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält. Desgleichen stellt ein Nahrungsergänzungsmittel mit immunmodulierender Wirkung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Schimmelpilzextrakt gemäß obiger Definition, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält, einen weiteren Erfindungsgegenstand dar. Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die Verwendungen eines Schimmelpilzextraktes gemäß obiger Definition zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeu- gung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur gezielten Gewebeauflösung, wobei im Falle der Auflösung von Tumoren die oben erwähnten mitosehemmenden und metastasehemmenden Eigenschaften von Vorteil sind, zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunmodulierender Wirkung, zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebser- krankungen und/oder Präkanzerosen sowie zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels mit immunmodulierender Wirkung. Prinzipiell ist die Gewinnung des besagten Schimmelpilzextraktes nicht auf bestimmte Herstellungsverfahren beschränkt. Allerdings ist es ratsam, ein Verfahren zu wählen, bei welchen eine ausreichende Wirksamkeit des Schimmelpilzextraktes gewährleistet ist, ohne dass der Extrakt anschließend aufkonzentriert werden muss. Auch sollten sich die erforderlichen Reinigungsmaßnahmen zweckmäßigerweise auf ein Minimum beschränken. Weiterhin sollte der Schimmelpilzextrakt, der ja ebenfalls proteolytische Eigenschaften aufweist, sich bei der Lagerung nicht selbst zersetzen, was gegebenenfalls eine ausreichend lange Reifung des Schimmelpilzextraktes erfordert. Bei dem nachfolgend beschriebenen Herstellungsverfahren müssen alle Schritte unter Sterilbedingungen durchgeführt werden, um eine Besiedlung mit Fremdkeimen auszuschließen. Die Verwendung eines Sterilarbeitsplatzes nach dem derzeitigen Stand der Technik ist daher unbedingt erforderlich. Hierbei wird in einem geeigneten Nährmedium zunächst ein Schimmelpilzrasen herangezogen. Dieser Schimmelpilzrasen wird dann in einem Extraktionsmedium suspendiert. Anschließend werden die Zellwände der Schimmelpilzzellen aufgebrochen. Die erhaltene Suspension wird dann gegebenenfalls, vorzugsweise unter Anwendung von Scherkräften, einer Reifung unterzogen. Anschließend wird der Extrakt filtriert. Der so gewonnene Extrakt ist direkt zur Herstellung der oben beschriebenen Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel verwendbar. Prinzipiell ist jedes Nährmedium zur Anzucht des Schimmelpilzrasens geeignet, sofern es von den Schimmelpilzen verwertbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequellen enthält. Die Inokulierung mit Schimmelpilzen erfolgt zweckmäßig, indem lyophilisierte Schimmel- pilzsporen in das ausgewählte Nährmedium gegeben werden. Gegebenenfalls kann der Schimmelpilzrasen später (einmal oder öfter) auf ein neues Medium übergeimpft werden. Vorzugsweise werden die Schimmelpilze zunächst in einer Sabouraud-Glucose-Bouil- lon und anschließend auf einem Sabouraud-Glucose-Agar zu einem Schimmelpilzrasen herangezogen. Prinzipiell eignet sich jedes Medium zur Suspension des Schimmelpilzrasens, um anschließend die Schimmelpilzzellen aufzubrechen, solange gewährleistet ist, dass das Suspensionsmedium die pharmakologisch wirksamen Inhaltsstoffe der Schimmelpilze nicht zerstört. Vorzugsweise wird ein wässriges Medium verwendet. Alternativ ist z.B. ein alkoholisches oder wässrig-alkoholisches Medium verwendbar. Besonders gut geeignet ist isotonische Kochsalzlösung. Schimmelpilzzellen weißen sehr widerstandsfähige Zellwände auf. Das Aufbrechen der Zellwände ist daher schwierig. Prinzipiell ist jedes Verfahren geeignet, mit dem die Zellwände wirksam aufgebrochen werden können, wenn gleichzeitig die pharmakologisch wirksamen Inhaltsstoffe der Schimmelpilze geschont werden. Erfindungsgemäß werden die Zeil- wände der Schimmelpilzzellen in einer Zellaufschlussbombe aufgebrochen. Hierzu wird die Suspension der Schimmelpilzzellen in der Zellaufschlussbombe vorzugsweise wiederholt mit Stickstoff bis zu einem geeigneten Druck von ca. 100 bar beaufschlagt, jeweils ca. 30 Minuten äquilibriert und auf Normaldruck entspannt, wobei dieser Zyklus vorzugsweise min- destens zehn Mal durchgeführt wird. Es ist sinnvoll, beim Aufbrechen der Zellwände unter Eiskühlung zu arbeiten. Die Modalitäten der Reifung der Zellsuspension sind von Fall zu Fall verschieden und müssen auf den Einzelfall abgestimmt werden. Es hat sich indessen gezeigt, dass eine Reifung der Suspension zweckmäßig durchgeführt werden kann, indem die Suspension unter Sterilbe- dingungen mindestens 8 Monate lang täglich eine Stunde lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen wird. Bei der Verwendung des besagten Schimmelpilzextraktes zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels und insbesondere eines Arzneimittels ist eine angemessene Reinheit des Extraktes erforderlich. Der Extrakt wird dazu zweckmäßig zunächst über Glaswolle und/oder Celite vorfiltriert, danach über ein Filter mit einer Porengröße von maximal 0,4 μm zellfrei filtriert und/oder vorzugsweise über ein Filter mit einer Porengröße von maximal 0,2 μm steril filtriert. Zur Herstellung eines Arzneimittels zur innerlichen Anwendung sollte der Extrakt anschließend gegebenenfalls mittels Ultrafiltration pyrogenfrei filtriert werden. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Die in den Beispielen verwendeten Agargele wiesen eine Agarkonzentration von ca. 1 % auf und waren mit TRIS-Puffer auf einen pH- Wert von ca. 8,5 gepuffert. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine Vorrichtung zur Immunelektrophorese nach dem Stand der Technik; Fig. 2 den Verlauf der optischen Extinktion eines Penicillium candidum-Extraktes im Bereich von ca. 300 nm bis ca. 750 nm;
Fig. 3 eine photographische Abbildung einer Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese einer Tumorgewebsflüssigkeit;
Fig. 4 eine photographische Abbildung einer Agarplatte nach Beendigung der Immunelek- trophorese einer Gewebsflüssigkeit eines gesunden Gewebes;
Fig. 5 eine photographische Abbildung einer Agarplatte nach Beendigung der Immunelektrophorese einer Serumprobe eines Tumorpatienten;
Fig. 6 eine photographische Abbildung einer Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese einer Serumprobe einer gesunden Testperson; Fig. 7 eine photographische Abbildung einer Agaφlatte nach Beendigung einer Überwanderungselektrophorese von Serumproben eines Tumorpatienten;
Fig. 8 eine mikrophotographische Aufnahme eines Blutkulturausstrichs ohne Schimmelpilzextrakt; Fig. 9 eine mikrophotographische Aufnahme eines Blutkulturausstrichs mit Penicillium roqueforti-Extrakt;
Fig. 10 eine mikrophotographische Aufnahme einer Biopsieprobe einer Präkanzerose vom Typ Morbus Bowen;
Fig. 11 wie Fig. 4, jedoch nach einer medizinischen Behandlung mit Penicillium candidum- Extrakt;
Fig. 12 eine Ausschnittvergrößerung einer Chromosomendarstellung zur Bestimmung der Mitoserate;
Fig. 13 eine Chromosomendarstellung zur Bestimmung der Mitoserate in einer Blutkultur ohne Penicillium candidum-Extrakt; Fig. 14 eine Chromosomendarstellung zur Bestimmung der Mitoserate in einer Blutkultur mit Penicillium candidum-Extrakt;
Fig. 15 eine mikrophotographische Aufnahme einer Mäuseleber-Zellkultur mit Penicillium candidum-Extrakt;
Fig. 16 eine mikrophotographische Aufnahme einer Mäuseleber-Zellkultur ohne Penicillium candidum-Extrakt.
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Die nachfolgenden Schritte wurden an einem Sterilarbeitsplatz unter laminarer Luftströmung durchgeführt. Eine Ampulle Sporenlyophilisat des Schimmelpilzes Penicillium candi- dum Typ SA (Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Deutschland) wurde in 500 ml Sabouraud- Glucose-Bouillon (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gelöst. Über Sterilfilter und Sprudeleinsatz wurde die Lösung zwei Tage lang belüftet. Das dabei entstandene Mycel wurde auf Sabouraud-Glucose-Agar (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) überimpft. Nach fünf Tagen hatte sich ein durchgehender, ca. 3 mm starker Pilzrasen gebildet, der sich mühelos mit einem sterilen Skalpell im Ganzen abziehen ließ. 60 g des Pilzmycels wurden unter sterilen
Bedingungen in 600 ml isotonische Kochsalzlösung gegeben, mit einem Rührwerk suspendiert und anschließend in eine sterilisierte Zellaufschlussbombe mit 1850 ml Innenvolumen (Modell Nr. 4636, Parr Instrument Company, Moline, 111., USA) überführt. Die Zellaufschlussbombe wurde unter Eiskühlung 10 Mal mit Stickstoff bis zu einem Druck von ca. 100 bar beaufschlagt, 30 Minuten lang äquilibriert und auf Normaldruck entspannt. (Vorsicht! Bei Überdruck-Arbeiten sind unbedingt die einschlägigen Sicherheitsbestimmungen zu beachten!) Die erhaltene Suspension wurde anschließend in einen sterilen Erlenmeyerkolben gegeben, die Luft wurde mit Schutzgas (Stickstoff) verdrängt, der Kolben wurde mit einem Stopfen aus sterilem Silikongummi verschlossen, acht Monate lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und täglich eine Stunde lang einer Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad unterzogen. Anschließend wurde zunächst über Glaswolle, Celite und schließlich über ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm steril filtriert. Der so erhaltene Extrakt wies die folgenden Eigenschaften auf: Zur Bestimmung der optischen Drehung wurde ein Polarimeter mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllt und der Nullpunkt übeφriift. Die Messung des Extraktes ergab eine Linksdrehung von 0,3°. Die Messung des Trockenrückstandes des Extraktes ergab einen Wert von 1,08 %. Die Messung des Extraktes mit einer Glaselektrode ergab einen pH- Wert von 4,83. Die Ergebnisse der Messung des optischen Extinktion im Bereich von ca. 300 nm bis ca. 750 nm (UV-Vis-Spektrum des Extraktes) sind in Fig. 2 wiedergegeben. Zur Messung der proteolyti sehen Wirkung des erhaltenen Extraktes wurde Kälberserum (Newborn Bovine Serum, Flow Laboratories, Irvine, UK) in 2 Proben ä 1 ml portioniert. Eine Probe wurde mit 1 ml isotonischer Kochsalzlösung, die andere mit 1 ml des Extraktes vermischt. Nach Ablauf einer einstündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur (21°C) wurde in beiden Proben das Gesamteiweiß bestimmt. Die Messung erfolgte nach der allgemein anerkannten Biuretmethode mit einem Zeiss-Spektralphotometer. Da die Proben einen Serumanteil von nur 50 % aufwesen, wurde das Probenvolumen verdoppelt (200 μl). Die Berechnung erfolgte nach der Formel: EA - EAB 6 gll ES -ESB wobei EA die Extinktion der Analyse, ES die Extinktion des Standards, EAB die Extinktion des Analysenblindwertes und ESB die Extinktion des Standardblindwertes ist. Es wurden folgende Konzentrationen errechnet: Probe mit isotonischer Kochsalzlösung: 10,4 g/100 ml. Probe mit Penicillium candidum-Extrakt: 8,8 g/100 ml. Demnach betrug die Eiweißreduktion in der Probe mit Penicillium candidum-Extrakt nach einer Stunde ca. 15 %.
Beispiel 2;.. Herstellung eJ Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Sporenlyophilisat des Blauschimmelpilzes Penicillium roqueforti (Wiesby GmbH & Co. KG, Niebüll, Deutschland) mit im Wesentlichen identischen Ergebnissen wiederholt, wobei der erhaltene Extrakt jedoch keiner eingehenden analytischen Charakterisierung unterzogen wurde.
Beispiel.3;....Immune!eto mit Schimmelpilzsporen Durch Einschneiden und Ausdrücken von Tumorgewebe (operativ entfernter, durch Histologie gesicherter Tumor) wurde ca. 1 ml Gewebsflüssigkeit gewonnen. Von einem nach Beispiel 2 auf Sabouraud-Glucose-Agar gewachsenen Pilzrasen des Blauschimmelpilzes Penicillium roqueforti wurden mit einer sterilen Lanzette Hyphen entnommen, mit denen die Gewebsflüssigkeit kontaminiert wurde. Danach wurde die Probe eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert und anschließend durch Verreiben mit einem Pistill in einem kleinen Achatmörser homogenisiert. Ca. 20 μl dieser Suspension wurden in der rechten kreisförmigen Vertiefung des Agargels gemäß Fig. 3 vorgelegt. Als Gegenprobe wurde vom selben Patienten gesundes Gewebe, nämlich Bauchdeckenmuskulatur, in gleicher Weise behandelt und in der rechten kreisförmigen Vertiefung des Agargels gemäß Fig. 4 vorgelegt. Gleichzeitig wurden in den beiden linken kreisförmigen Vertiefungen der Agaφlatten jeweils ca. 20 μl unkontaminierte Gewebsflüssigkeit beider Gewebearten vorgelegt, d.h. Tumorgewebe in der Platte von Fig. 3 und gesundes Gewebe in der Platte von Fig. 4. Anschließend wurden die in diesen Proben enthaltenen Proteine bei einer Spannung von ca. 200 V und einer Stromstärke von ca. 15 m A während einer Zeitdauer von ca. 90 Minuten elektrophoretisch getrennt. Nach Abschluss der Elektrophorese wurden in die mittleren Rinnen der Gelplatten jeweils ca. 100 μl eines poly- klonalen Ziegen-Antihumanserums einpipettiert (gewonnen mittels Immunisierung von Ziegen und anschließender Gewinnung der Immunglobuline aus Blutproben der - ansonsten unbehelligten - Versuchstiere) und die vollständige Ausbildung von Präzipitationslinien abge- wartet (Dauer ca. 48 h). Fig. 3 gibt eine photographische Abbildung der Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese des Tumorgewebes wieder, Fig. 4 eine photographische Abbildung der Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese des gesunden Gewebes, wobei sich die Anoden jeweils am oberen Ende und die Kathoden jeweils am unteren Ende der Agarplatten befanden. Die Auswertung ergab, dass bei der kontaminierten Gewebs- flüssigkeit aus Tumorgewebe praktisch alle Eiweißfraktionen mit Ausnahme einer vermutlich
Albumin darstellenden Fraktion ausgelöscht waren, während bei gesundem Gewebe unabhängig von der Vorbehandlung keine nennenswerte Veränderung auftrat. Dieser Versuch beweist, dass sich die Sporen des Blauschimmelpilzes Penicillium roqueforti (wohl über die Biosyntheseprodukte der Schimmelpilze) als Differenzierungsmittel eignen, d.h. im erfindungsgemäßen Verfahren in der Lage sind, zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe zu differenzieren. (Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können daher sowohl die Sporen, die Hyphen, das Mycel, die Schimmelpilze selbst und die Biosyntheseprodukte der Schimmelpilze als das Differenzierungsmittel angesehen werden.) (Lit: Grabar, P., Williams, CA., Biochim. Biophys. Acta 10: 193-4 (1953)).
Beispiel 4: Immunelektrophorese nach Grabar und Williams mit Vorbehandlung der Proben .^ Schimm.eJ jJzsppren Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Hyphen aus einem nach Beispiel 1 herangezo- genen Penicillium camemberti-Schimmelpilzrasen mit im Wesentlichen identischen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 5i..MQdjfizierte Beispiel 3 wurde ohne Kontamination mit Pilzhyphen, wiederholt. Ca. 20 μl des zu untersuchenden Serums eines Tumoφatienten wurden zunächst elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Auftrennung wurden in die mittlere Rinne der Gelplatte gemäß Fig. 5 100 μl des Ziegen-Antihumanserums eingefüllt. Gleichzeitig wurden in eine am linken Rand des Gelträgers ausgestochene zweite Rille 100 μl des Penicillium candidium-Extraktes von Beispiel 1 eingefüllt. Fig. 5 gibt eine photographische Abbildung der Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese dieser Serumprobe wieder. Als Gegenprobe diente eine Trennung, die mit dem Serum einer gesunden Testperson durchgeführt wurde. Fig. 6 gibt eine photographische Abbildung der Agaφlatte nach Beendigung der Immunelektrophorese dieser Serumprobe mit ebenfalls am linken Rand befindlicher zweiter Rinne wieder. Dieser Versuch beweist, dass sich der Penicillium candidium-Extrakt als Differenzierungsmittel eignet, d.h. im erfindungsgemäßen Verfahren in der Lage ist, zwischen dem Proteom einer gesunden Testperson und dem Proteom eines Tumoφatienten zu differenzieren. Weiterhin beweist dieser Versuch, dass im erfindungsgemäßen Verfahren eine Erkennung von Krebserkrankungen anhand von Serumproben möglich ist.
Beispiel 6: Modifizierte Überwanderungselektrophorese nach Bussard Des Weiteren wurden Serumproben eines Tumoφatienten, welche eine Stunde vor dem Einpipettieren mit den nachfolgend angegebenen Zusätzen versetzt worden waren, einer modifizierten Überwanderungselektrophorese nach Bussard unterzogen, bei welcher im Prinzip in Abhängigkeit von den elektroendosmotischen Eigenschaften des Gels die Antikörper in Richtung Kathode und die Antigene in Richtung Anode wandern und beim Zusammentreffen sichtbare Präzipitationslinien bilden. In die mit Kl, 2, 3, 4 markierten Startlöcher der Gelplatte gemäß Fig. 7 wurde polyklonales Antihumanserum einpipettiert. In die gegenüberliegenden Startlöcher wurden die Serumproben einpipettiert, und zwar eine mit isotonischer Kochsalzlösung entsprechend verdünnte Serumprobe (Kl), zwei mit einem Penicillium candidum-Extrakt nach Beispiel 1 versetzte Serumproben (2 und 4), wobei der Extrakt zuvor mit isotonischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:3 verdünnt worden war (d.h. der Proteinabbau des verdünnten Extraktes betrug 5 % pro Stunde), sowie eine mit dem unverdünnten Penicillium candidum-Extrakt nach Beispiel 1 versetzte Serumprobe (3). Fig. 7 zeigt eine photographische Aufnahme des Gels nach Abschluss der Überwanderungselektrophorese. Wie zu erkennen ist, sind bei der mit den Penicillium candidum-Extrakten behandelten Proben (2, 3 und 4) die Präzipitationslinien im Vergleich zur unbehandelten Probe (Kl) teilweise ausgelöscht. Besonders ausgeprägt tritt dieser Effekt bei dem unverdünnten candidum-Extrakt nach Beispiel 1 in Erscheinung.
Beispiel 7: Standardisierung eines Penicillium candidum- Extraktes Beispiel 1 wurde wiederholt. In klinischen Selbstversuchen wurde ermittelt, dass diese Konzentration für injektive Anwendungen des Extraktes noch zu hoch war; es bildeten sich starke Nekrosen an der Injektionsstelle, die wahrscheinlich auf den hohen Proteasengehalt zurückzuführen waren. Nach einer Verdünnung des obigen Extraktes im Verhältnis 1 :3 mit isotonischer Kochsalzlösung (entsprechend einer Eiweißreduktion von ca. 5 % im verdünnten Extrakt) traten nach einer subkutanen Injektion von 1 ml praktisch keine Nekrosen mehr auf. Lediglich eine leichte Hautrötung wurde beobachtet, so dass diese Konzentration als praktikabel anzusehen war. In diesem verdünnten Penicillium candidum-Extrakt betrug die L-gamma-Glutamyl-
Transferase-Aktivität (gemessen mit dem Monotest "Gamma-GT Neu" der Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland; jetzt Röche Diagnostics GmbH) 8 enzymatische Einheiten pro Liter (8 E/l). (Vgl.: Szasz, G, Persijn, J.P. et al., Clin. Chemie und Clin. Biochem. 12 (1974) 228.) Für klinische Anwendungen ist indessen eine exakte Standardisierung erforderlich. Es wird zweckmäßig auf Cyclopiazonsäre als Leittoxin standardisiert, welche mittels HPLC- Chromatographie (Silica-Säule, wässrig/alkoholisches Laufmittel) bestimmt werden kann. Beis .8...Nachwei in. e er Blutkul ur Venenblut wurde mit Heparinlösung (Heparin Novo, 25000 IE/5 ml) ungerinnbar gemacht. Das Blut wurde zentrifügiert und die Leukozyten, ein Teil der Erytrozyten und je 2 ml Plasma in 2 Zentrifugengläser überführt, die 7 ml McCoy's 5A Medium (Flow Laboratories, Irvine, UK) enthielten. Einer Kultur wurden 70 mg eines Penicillium roqueforti-Extraktes, der nach Beispiel 2 hergestellt worden war, sowie 2 ml isotonische Kochsalzlösung zugesetzt. Der anderen Kultur wurden lediglich 2 ml isotonische Kochsalzlösung zugesetzt. Beide Kulturen wurden anschließend 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubations- zeit wurden von beiden Kulturen Ausstriche angefertigt und mit Hemacolor (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gefärbt. Im unbehandelten Präparat (Fig. 8) wurden auf 100 Leukozyten 63 Zellteilungen gezählt, im behandelten Präparat (Fig. 9) kamen auf 100 Leukozyten lediglich 3 Zellteilungen. Dieser Versuch beweist die mitosehemmende Wirkung des Penicillium roqueforti-Extraktes.
Beispiel 9: Nachweis der mitosehemmenden Wirkung des Penicillium candidum-Extraktes in eineLBlutkultur In gleicher Weise wurde der Extrakt des Schimmelpilzes Penicillium candidum gemäß Beispiel 1 auf mitosehemmende Wirkung geprüft. Das Ergebnis war im Wesentlichen identisch mit dem des Pilzextraktes Penicillium roqueforti.
Figure imgf000018_0001
Einer der Erfinder erkrankte an Morbus Bowen (Präkanzerose) am rechten Schienbein. Nach Sicherung der Diagnose durch Biopsie (vgl. Fig. 10) behandelt sich der Erfinder selbst, indem er täglich 2 ml des verdünnten Penicillium candidum-Extraktes gemäß Beispiel 7 ca. 1 cm neben der erkrankten Hautstelle injizierte. Nach zwei Wochen Behandlungsdauer war die Hautschwellung zurückgegangen und nur noch eine Narbe sichtbar. Eine Wiederholung der Biopsie zeigte ein völlig unverdächtiges Zellbild (vgl. Fig. 11).
Beispiel 11 : Chromosomendarstellung (standardisierte Methode) Zwei Durchstechfläschchen Chromosomenmedium 1A (Firma Gibco, Kalifornien, USA (jetzt Invitrogen Coφoration): unveröffentlichte Mischung aus Eagle's Minimum Es- sential Medium, fötalem Kälberserum, Heparin, Antibiotika und Phytohaemagglutinin) wurden mit je 5 ml des beigefügten Lösungsmittels gelöst. In eines der Fläschchen wurde 0,2 ml des verdünnten Penicillium candidum-Extraktes gemäß Beispiel 7, in das andere die gleiche Menge isotonischer Kochsalzlösung steril einpipettiert. Nachdem beide Fläschchen auf 37°C erwärmt waren, wurde in jedes 0,2 ml Venenblut gegeben. Danach wurden beide Proben 70 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit kam in jede der Pro- ben 0,3 ml Colcemidlösung (10 μg/ml). Nach weiteren zwei Stunden Inkubationszeit bei 37°C wurden die Zellen abzentrifugiert und zweimal mit hypotonischer Kaliumchloridlösung (0,07 M) gewaschen. Danach wurden die Zellen auf einen gekühlten Objektträger aufgetropft und fixiert. Nach Färbung mit gepufferter Giemsalösung (pH 6,8) erfolgte der Einschluss in Entellan®. Die mikroskopische Auswertung ergab eine um ca. 70 % niedrigere Mitoserate bei der mit verdünntem Penicillium candidum-Extrakt gemäß Beispiel 1 behandelten Probe. Fig. 12 zeigt eine Ausschnittvergrößerung, Fig. 13 die Blutkultur ohne Penicillium candidum- Extrakt und Fig. 14 die Blutkultur mit Penicillium candidum-Extrakt.
Beispiel 12: Mitosehemmung in Zellkultur der Mäuseleber Einer frisch getöteten Feldmaus (Microtus arvalis) wurde unter sterilen Bedingungen die Leber entnommen und mit einer Schere fein zerkleinert. Diese Leberpartikel wurden in einem Trypsinierungskolben mit EDTA-Trypsin (Firma Gibco, Kalifornien, USA (jetzt In- vitrogen Coφoration) und Eagle's Minimum Essential Medium aufgenommen. Diese Zellsuspension wurde homogen gemischt und in zwei gleich große Mengen geteilt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und mit je 5 ml Nährmedium (MEM, 10 % Kälberserum, 1 % NEAA) aufgenommen. Nach gründlichem Mischen wurde diese Lösung in zwei 50 ml-Kulturflaschen aus Kunststoff gefüllt. Einer Flasche wurde zusätzlich 5 μl Penicillium candidum-Extrakt gemäß Beispiel 1 zugegeben. Beide Kulturen wurden in einer Atmosphäre aus 20 % O2, 75 % N2 und 5 % CO2 bei 37°C bebrütet. Die Kulturen wurden alle drei Tage mit neuem Nährme- dium versorgt. Jedes Mal wurde neuer Penicillium candidum-Extrakt hinzugegeben. Nach drei Wochen zeigte sich, dass die Zellteilung in der mit Penicillium candidum-Extrakt vermischten Kultur (Fig. 15) wesentlich langsamer ablief, als in der anderen Kultur (Fig. 16).

Claims

Pate ansprüche
1. Verfahren zur Proteindifferenzierung, welches die Schritte umfasst, dass eine Antiköφerzubereitung bereitgestellt wird, dass ein Differenzierungsmittel bereitgestellt wird, dass zumindest eine antigenhaltige fluide Probe bereitgestellt wird und dass ein Trägermedium bereitgestellt wird, welches zumindest eine Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und eine Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe aufweist, dass die fluide Probe in die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe gegeben wird, dass die in der fluiden Probe enthaltenen Antigene elektrophoretisch aufgetrennt werden und dass die Antiköφerzubereitung mit den in der fluiden Probe enthaltenen Antigenen in Gegenwart des Differenzierungsmittels reagieren gelassen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Differenzierungsmittel zur fluiden Probe gegeben wird, bevor diese in die dafür vorgesehene Vertiefung des Trägermediums gegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφerzubereitung vor der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene in die Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung gegeben wird, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe so angeordnet sind, dass während der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antikörperzubereitung mit den Antigenen stattfindet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, welches als Uberwanderungselektrophorese ausgestaltet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφerzubereitung nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene in die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung gegeben wird, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antikörperzubereitung und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe so angeordnet sind, dass nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antikörperzubereitung mit den Antigenen stattfindet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermedium eine zusätzliche Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels aufweist und die Antiköφerzubereitung und das Differenzierungsmittel nach der elektrophoretischen Auf- trennung der Antigene im Wesentlichen gleichzeitig in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben werden, wobei die Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung, die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe und die Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels so angeordnet sind, dass nach der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene eine Reaktion der Antiköφerzubereitung mit den Antigenen in Gegenwart des Differenzierungsmittels stattfindet.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, welches als Immunelektrophorese nach Grabar und Williams ausgestaltet ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermedium ein Medium, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agargel, Agaro- segel, Polyacrylamidgel und Nitrocellulose, ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die antigen- haltige fluide Probe eine proteinhaltige biologische Probe ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die fluide Probe aus der Gruppe, bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssig- keit, Gewebsflüssigkeit sowie aus Abstrichen, Biopsien und/oder Resektionen gewon- nenem Material, ausgewählt ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφerzubereitung ein gegen die in der fluiden Probe enthaltenen Antigene gerichtetes polyklonales Antiserum ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Antiserum ein Antihumanserum ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Differenzierungsmittel ein zur Proteindifferenzierung geeigneter Wirkstoff ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Differenzierungsmittel aus Wirkstoffen mit chemotherapeutischer, zytostati scher, antitumoraler, proteolyti- scher, mitosehemmender, metastasenhemmender und/oder angiogenesehemmender Wirkung ausgewählt ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Differenzierungsmittel aus Pflanzenextrakten, Schimmelpilzextrakten, Schimmelpilzen, Schimmelpilzsporen, Hyphen, Mycel und Schimmelpilz-Biosyntheseprodukten sowie Mischungen davon ausgewählt ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt aus einem Schimmelpilz der Gattung Penicillium, insbesondere der Arten Penicillium candidum, Penicillium camemberti und/oder Penicillium roqueforti gewonnen wurde.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Abschätzung der Erfolgsaussichten und/oder zur Kontrolle einer Therapie von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Abschätzung der Medikamentensensitivität und/oder chemischen Sensitivität einer Testperson.
20. Vorrichtung zur Proteindifferenzierung, umfassend ein Trägermedium mit einer Vertiefung zur Aufnahme einer Antiköφerzubereitung, einer Vertiefung zur Aufnahme eines Differenzierungsmittels und zumindest einer Vertiefung zur Aufnahme einer antigen- haltigen fluiden Probe, wobei das Trägermedium, die Antiköφerzubereitung, das Differenzierungsmittel und die fluide Probe die in den vorausgehenden Ansprüchen angegebenen Bedeutungen aufweisen.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermedium als rechteckige Platte mit einer größeren und einer kleineren Seitenlänge ausgebildet ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung als langgestreckte, parallel zur größeren Seitenlänge verlaufende, mittig angeordnete Rinne ausgebildet ist, die Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels als langgestreckte, parallel zur größeren Seitenlänge verlaufende und von der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung beabstan- dete Rinne ausgebildet ist und die Vertiefung zur Aufnahme der fluiden Probe als kreis- förmige Vertiefung ausgebildet ist, welche zwischen der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung und der Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels angeordnet ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Vertiefungen zur Aufnahme fluider Proben vorgesehen sind, die von der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung im Wesentlichen gleich beabstandet sind, wobei die eine Vertiefung zur Aufnahme der einen fluiden Probe zwischen der Vertiefung zur Aufnahme der Antiköφerzubereitung und der Vertiefung zur Aufnahme des Differenzierungsmittels angeordnet ist.
24. Testkit zur Proteindifferenzierung, umfassend das Trägermedium, die Antiköφerzubereitung und das Differenzierungsmittel nach mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche.
25. Arzneimittel zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schimmelpilzextrakt, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält.
26. Arzneimittel nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch eine antitumorale, proteolyti- sehe, mitosehemmende und/oder metastasenhemmende Wirkung.
27. Arzneimittel nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt aus einem Schimmelpilz den Gattungen Penicillium, Aspergillus und/oder Fusarium gewonnen wurde.
28. Arzneimittel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilz den Arten Penicillium candidum, Penicillium camemberti und/oder Penicillium roqueforti angehört.
29. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt ein zellfreier, vorzugsweise steril filtrierter und insbesondere pyro- genfreier Extrakt ist.
30. Arzneimittel nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt ein wässriger Extrakt ist.
31. Arzneimittel nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt ein Trockenextrakt, vorzugsweise ein lyophilisierter Extrakt ist.
32. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt ein Schimmelpilz-Biosyntheseprodukt, insbesondere ein Myko- toxin und/oder eine Protease, gegebenenfalls auch in synthetischer Form, enthält.
33. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 25 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens ein an sich bekanntes chemisches Mittel zur Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, insbesondere ein Zytostatikum, enthält.
34. Arzneimittel nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das chemische Mittel aus Cyclophosphamid, Fluoruracil, Endoxan, Cisplatin und Mischungen daraus ausgewählt ist.
35. Arzneimittel mit immunmodulierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schimmelpilzextrakt gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32, gegebenen- falls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält.
36. Nahrungsergänzungsmittel zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schimmelpilzextrakt gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält.
37. Nahrungsergänzungsmittel mit immunmodulierender Wirkung, dadurch gekennzeich- net, dass es einen Schimmelpilzextrakt gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch akzeptablen Trägern und/oder Füllstoffen, enthält.
38. Verwendung eines Schimmelpilzextraktes gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
39. Verwendung eines Schimmelpilzextraktes gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gezielten Gewebeauflösung.
40. Verwendung eines Schimmelpilzextraktes gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32 zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunmodulierender Wirkung.
41. Verwendung eines Schimmelpilzextraktes gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32 zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Vorbeugung und/oder Heilung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
42. Verwendung eines Schimmelpilzextraktes gemäß der Definition eines der Ansprüche 27 bis 32 zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels mit immunmodulierender Wir- kung.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzextrakt hergestellt wurde, indem unter Sterilbedingungen: a) in einem geeigneten Nährmedium ein Schimmelpilzrasen herangezogen wurde, b) dieser Schimmelpilzrasen in einem Extraktionsmedium suspendiert wurde, c) die Zellwände der Schimmelpilzzellen aufgebrochen wurden, d) die erhaltene Suspension gegebenenfalls, vorzugsweise unter Anwendung von Scherkräften, einer Reifung unterzogen wurde, und e) der Extrakt anschließend filtriert wurde.
44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass Schimmelpilze zunächst in einer Sabouraud-Glucose-Bouillon und anschließend auf einem Sabouraud-Glucose- Agar zu einem Schimmelpilzrasen herangezogen wurden.
45. Verwendung nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzrasen in isotonischer Kochsalzlösung suspendiert wurde.
46. Verwendung nach einem der Ansprüche 43 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellwände der Schimmelpilzzellen in einer Zellaufschlussbombe aufgebrochen wurden.
47. Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Schimmelpilzzellen in der Zellaufschlussbombe wiederholt mit Stickstoff bis zu einem Druck von ca. 100 bar beaufschlagt wurden, jeweils ca. 30 Minuten äquilibriert wurden, auf Normaldruck entspannt wurden und dass dieser Zyklus mindestens zehnmal durchgeführt wurde.
48. Verwendung nach einem der Ansprüche 43 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene Suspension unter Sterilbedingungen mindestens 8 Monate lang täglich eine Stunde lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen wurde.
49. Verwendung nach einem der Ansprüche 43 bis 48, dadurch gekennzeichnet, dass der Extrakt zunächst über Glaswolle und/oder Celite vorfiltriert wurde, danach über ein Filter mit einer Porengröße von maximal 0,4 μm zellfrei filtriert wurde, vorzugsweise über ein Filter mit einer Porengröße von maximal 0,2 μm steril filtriert wurde, und an- schließend gegebenenfalls mittels Ultrafiltration pyrogenfrei filtriert wurde.
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