WO2004113559A1 - Verfahren zum aufschluss und zur derivatizierung biologischer proben sowie verfahren zum bakteriellen nachweis - Google Patents

Verfahren zum aufschluss und zur derivatizierung biologischer proben sowie verfahren zum bakteriellen nachweis Download PDF

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WO2004113559A1
WO2004113559A1 PCT/EP2004/006699 EP2004006699W WO2004113559A1 WO 2004113559 A1 WO2004113559 A1 WO 2004113559A1 EP 2004006699 W EP2004006699 W EP 2004006699W WO 2004113559 A1 WO2004113559 A1 WO 2004113559A1
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sample
pyridine
derivatization
lid
acid
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PCT/EP2004/006699
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Inventor
Günter Merkel
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Universität Rostock
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for the digestion and derivatization of biological samples and a method for the detection of bacteria in these samples.
  • the invention provides for the first time a simple, quickly executable chemical method for the detection of bacterial contamination or infections in biological samples, in particular in blood samples, with dead bacteria also being included.
  • the possibility of being able to detect microorganisms present in biological samples is an important and important problem in many areas, in particular in medical and food chemical analysis.
  • the question of the type of infection ie whether a patient is is infected with bacteria, viruses or fungi, of fundamental importance, which decides on the further treatment strategy. Therapies are often started at the beginning of a disease, although the actual pathogen has not yet been identified.
  • the detection of bacterial infections or contaminations is generally carried out using biological material such as blood and urine samples and smears, whereby the methods used to date take a period of several days due to the required cultivation conditions or digestion processes before they make a final statement about the Provide the type of pathogen or allow a statement as to whether the type of pathogen is bacteria.
  • K. Bai and L. Larsson J. Chromatography B, 738 (2000) 57-65
  • GC-MS-MS gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry
  • the method is based on the fact that muramic acid is a marker of bacterial peptidoglycan and can be used to detect bacterial contamination in clinical samples.
  • the samples used are first subjected to a digestion process in methanolic hydrochloric acid at 85 ° C for a period of 16 to 20 hours. After cooling and adding two internal standards, after hexane extraction, the samples are finally derivatized using pyridine and acetic anhydride at 60 ° C. for one hour.
  • the detection of the muramic acid derivative is carried out by means of GC-MS-MS.
  • the method described has the essential disadvantage that a relatively long time is required for the digestion. Approaches to accelerate this process step would consist in the application of higher pressure and higher temperatures, for which purpose special vessels are required. It is generally known that a temperature increase of 10 ° C roughly doubles the reaction rate.
  • the invention thus relates in particular to a method for the digestion and derivatization of biological samples for the detection of bacterial contamination or infections, in which a biological sample is placed in a tube which can be closed with a lid, a sample digestion in the presence of a liquid disintegrant by heating the sample while cooling the lid to a temperature of about 30-50 ° C above the boiling point of the disintegrant and then removing the condensate from the lid of the tube, the sample to remove fat-soluble substances with a lipophilic Solvent (preferably n-hexane) washes and mixed with an agent suitable for the derivatization of muramic acid and suitable conditions for the derivatization, the sample being heated again to accelerate the derivatization while simultaneously cooling the lid to a temperature above the boiling point of the derivatizing agent and then the condensate is suctioned off from the lid of the tube and concentrated to dryness in a stream of nitrogen.
  • a lipophilic Solvent preferably n-hexane
  • the heating in the closed tube which is, for example, a polypropylene tube, takes place externally under normal pressure, i.e. no increased pressure is applied to the reaction vessel from the outside.
  • Alcoholic acid is preferably used as the disintegrant, preferably hydrochloric acid, in particular methanolic hydrochloric acid.
  • hydrochloric acid in particular methanolic hydrochloric acid.
  • anhydrous methanolic hydrochloric acid is used, which is produced by passing HCl gas into ice-cooled methanol (approx. 0.13 g / ml). An alkaline digestion is also conceivable.
  • An acylating agent preferably acetic anhydride and pyridine, is used, for example, as a means of further derivatizing the monoalkyl muramate formed, in particular the monomethyl mura acid.
  • a method in which the sample is a blood sample and the sample is first frozen in the tube before digestion to destroy red blood cells, immersed in a cooled liquid for acceleration (temperature, for example - 18 ° C., -80 ° C or -195 ° C, whereby the heat removal is accelerated by immersion in the cooled liquid), then thaws again and centrifuged.
  • a cooled liquid for acceleration temperature, for example - 18 ° C., -80 ° C or -195 ° C, whereby the heat removal is accelerated by immersion in the cooled liquid
  • the invention further relates to a method for the detection of bacterial contaminations or infections, in which one carries out a aforementioned digestion / derivatization method, one forms formed muramic acid derivative after being concentrated to dryness in chloroform or the like, with dilute hydrochloric acid (for example 0.05 N hydrochloric acid) and Washes water, centrifuges and sucks off the aqueous wash phase.
  • the detection of the muramic acid derivative is preferably carried out by means of a gas chromatography / mass spectrometry combination (GC / MS).
  • the method comprises the following steps:
  • the substantial simplification of the digestion / derivatization process compared to the prior art is achieved by cooling the lid of the reaction tubes.
  • This can be achieved, for example, by means of a pre-cooled metal plate, for example an aluminum plate (aluminum plate), preferably with a thickness of at least 30 mm be stored in the refrigerator compartment for a sufficient time, e.g. at - 18 ° C.
  • a pre-cooled metal plate for example an aluminum plate (aluminum plate)
  • aluminum plate preferably with a thickness of at least 30 mm be stored in the refrigerator compartment for a sufficient time, e.g. at - 18 ° C.
  • Other possibilities are a plate cooled by a cryostat or a vessel with a smooth bottom which contains a pre-cooled liquid, a cold mixture or a substance which absorbs heat when it melts.
  • the method according to the invention can be used with any biological samples, e.g. Smears, blood and urine samples, cerebrospinal fluid, tissue homogenates, samples from cell cultures, house dust or the like can be carried out.
  • biological samples e.g. Smears, blood and urine samples, cerebrospinal fluid, tissue homogenates, samples from cell cultures, house dust or the like can be carried out.
  • red blood cells and other cells e.g. at -18, -80 ° C or -195 ° C
  • the pellet is subjected, if appropriate after carrying out one or more washing steps to remove existing hemoglobin and other soluble substances (for example with water, methanol and / or methanolic hydrochloric acid), to the digestion or derivatization process mentioned.
  • the product of the digestion and derivatization process which is a muramic acid derivative, preferably the methyl tetraacetyl derivative, is then detected.
  • the detection is carried out by means of a gas chromatography / mass spectrometry combination (GC / MS).
  • kits according to the invention contain in particular the reagents or chemicals necessary for carrying out the digestion and derivatization process, ie a metal plate, preferably made of aluminum, which according to a particular whose embodiment of the invention has a thickness of at least 30 mm, which are placed on the closed tubes for cooling the lids, closable tubes, such as Eppendorf tubes with a plastic closure (so-called Ependorf tubes, type Safe-Lock, made of polypropylene ), required disintegrating and derivatizing agents and / or solvents (chloroform or the like, non-polar lipophilic solvent such as n-hexane) and / or detergents (such as water or dilute hydrochloric acid; see above), as well as closable tubes such as Eppendorf tubes with plastic Closure (so-called Eppendorf tubes, type Safe-Lock, made
  • the following is also preferably required: • 2 ml tubes for blood collection with anticoagulant (EDTA, citrate, heparin) if the biological sample is a
  • the method according to the invention sensitive detection of gram-positive and gram-negative bacteria is provided, which can be carried out very quickly, as a result of which, within a period of time which is significantly shorter than in the prior art (already after about two hours), a statement can be made as to whether the tested biological Sample was contaminated with bacteria or not.
  • the advantage of the method according to the invention is not only that bacteria which have already died can also be detected, but that certain diagnostic problem cases, such as the detection of sepsis, in which there are usually problems with bacterial growth, can also be detected.
  • sample digestion and sample derivatization can be accomplished in a very short time, and without the need for expensive special equipment. Rather, the methods according to the invention can be carried out using equipment and consumables which are usually already present in laboratories.
  • n-hexane 300 ⁇ l n-hexane are added and the tubes are shaken on the gyrator for approx. 10 seconds. After the n-hexane has been suctioned off, the samples are dried in a heating block at 100 ° C. in a stream of nitrogen. Then 10 ⁇ l of internal standard heptadecanoic acid methyl ester (16 ng / ⁇ l) are added and the samples are dried analogously to previously.
  • the subsequent derivatization is carried out by adding 30 ⁇ l acylating agent (acetic anhydride and pyridine), briefly shaking on the gyrator, possibly stirring the pellet with a 10 ⁇ l pipette tip and 15 min. Warming up to 100 ° C in the heating block (while cooling the lid with a second, cooled aluminum plate).
  • acylating agent acetic anhydride and pyridine
  • the drop on the lid is sucked off analogously and the sample is evaporated to dryness in a heating block (100 ° C.) while introducing nitrogen.
  • the gyrator is shaken briefly (approx. 10 seconds) and, if necessary, the pellet is stirred with a 10 ⁇ l pipette tip.
  • 200 ⁇ l of 0.05 M HCl are added, shaken on the gyrator for 10 seconds and at 14,000 rpm for 1 minute. centrifuged. After the supernatant has been suctioned off, this washing process is repeated with 200 ⁇ l of water (Merck).
  • the chloroform phases are transferred to GC tubes with a pointed bottom insert and the tubes are closed.
  • a GC / MS device GC-17A / QP- 5050A from Shimadzu
  • Figures 1 to 4 show sample chromatograms.
  • the GC / MS chromatograms were obtained using a split / splitlos injector with 2 min high pressure injection (50 kPa) and 2 min. Sampling time (splitless), injection volume: 4 ⁇ l of approx. 25 ⁇ l sample, i.e. approx. 16% of the sample.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufschluss und zur Derivatisierung biologischer Proben sowie ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in diesen Proben. Insbesondere stellt die Erfindung erstmals ein einfaches, schnell durchführbares chemisches Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen in biologischen Proben, insbesondere Blutproben, bereit, wobei auch abgestorbene Bakterien miterfasst werden.

Description

Verfahren zum Aufschluss und zur Derivatisierung biologischer Proben sowie Verfahren zum bakteriellen Nachweis
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufschluss und zur Derivatisierung biologischer Proben sowie ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in diesen Proben. Insbesondere stellt die Erfindung erstmals ein einfaches, schnell durchführbares chemisches Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen in biologischen Proben, insbesondere in Blutproben, bereit, wobei auch abgestorbene Bakterien miter- fasst werden. Die Möglichkeit, in biologischen Proben vorhandene Mikroorganismen nachweisen zu können, stellt in vielen Bereichen, insbesondere in der medizinischen und lebensmittelchemischen Analytik, ein wesentliches und wichtiges Problem dar. Für den Arzt ist beispielsweise die Frage nach der Art einer Infektion, d.h. , ob ein Patient mit Bakterien, Viren oder Pilzen infiziert ist, von grundsätzlicher Bedeutung, die über die weitere Behandlungsstrategie entscheidet. Es werden oftmals zu Beginn einer Erkrankung Therapien begonnen, obwohl der eigentliche Krankheitserreger noch nicht identifiziert ist. Der Nachweis bakterieller Infektionen bzw. Kontaminationen wird im allgemeinen anhand von biologischem Material wie Blut- und Urinproben sowie Abstrichen durchgeführt, wobei die bislang angewandten Verfahren aufgrund der erforderlichen Kultivierungsbedingungen oder Aufschlussverfahren einen Zeitraum von mehreren Tagen in Anspruch nehmen, bevor sie eine endgültige Aussage über die Art des Erregers liefern bzw. eine Aussage darüber zulassen, ob es sich bei der Art des Krankheitserregers um Bakterien handelt.
Vor diesem Hintergrund besteht ein Bedarf, ein schnelles, zuverlässiges und leicht durchführbares Verfahren bereitzustellen, mit dem bakterielle Erreger in biologischen Proben nachgewiesen werden können. Ein solches Verfahren sollte dazu beitragen, dass sich der Umfang der Verschreibung von Antibiotika auf das unbedingt notwendige Maß zurückschrauben läßt und dadurch ein Beitrag zur Eindämmung der zunehmenden Resistenzentwicklung geleistet werden kann.
Im Stand der Technik wurde von K. Bai und L. Larsson (J. Chromatography B, 738 (2000) 57-65) ein Verfahren zur Bestimmung von Muraminsäure mittels Gas-Chromatographie- Ionenfalle-Tandem-Massenspektrometrie (GC-MS-MS) entwickelt. Das Verfahren basiert darauf, dass Muraminsäure ein Marker des bakteriellen Peptidoglykans ist und zum Nachweis bakterieller Kontaminationen in klinischen Proben verwendet werden kann. Die verwendeten Proben werden zunächst einem Aufschlussverfahren in methanolischer Salzsäure bei 85°C für eine Dauer von 16 bis 20 Stunden unterzogen. Nach Abkühlung und Zugabe zweier interner Standards erfolgt nach Hexan-Extraktion schließlich eine Deri- vatisierung der Proben unter Verwendung von Pyridin und Essigsäureanhydrid bei 60°C für eine Stunde. Nach Aufarbeitung der Reaktionsmischung erfolgt der Nachweis des Muraminsäure- Derivats mittels GC-MS-MS. Das beschriebene Verfahren weist den wesentlichen Nachteil auf, dass für den Aufschluss eine relativ lange Zeit benötigt wird. Ansätze, diesen Verfahrensschritt zu beschleunigen, würden in der Anwendung von höherem Druck und höheren Temperaturen bestehen, wozu jedoch Spezialgefäße benötigt werden. Es ist allgemein bekannt, dass eine Temperaturerhöhung um 10 °C die Reaktionsgeschwindigkeit etwa verdoppelt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein vereinfachtes, schnelles Aufschluss- und Derivatisierungsverfahren bereitzustellen und damit die Möglichkeit zu eröffnen, bakterielle Kontaminationen bzw. Infektionen schneller und einfacher durchführen zu können, ohne dass es der Verwendung aufwendiger Spezialapparaturen bedarf.
Zur Lösung der Aufgabe wird ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 bzw. 6 und 7 vorgeschlagen sowie ein Kit zur Durchführung dieser Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 16.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere ein Verfahren zum Aufschluss und zur Derivatisierung biologischer Proben für einen Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen, bei dem man eine biologische Probe in ein mit einem Deckel verschließbares Röhrchen gibt, man einen Probenaufschluß in Gegenwart eines flüssigen AufSchlußmittels durchführt, indem man die Probe unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels auf eine Temperatur von etwa 30-50°C über dem Siedepunkt des AufSchlussmittels erwärmt und man anschließend das Kondensat vom Deckel des Röhrchens entfernt, man die Probe zur Entfernung fettlöslicher Substanzen mit einem lipophilen Lösungsmittel (vorzugsweise n-Hexan) wäscht und sie mit einem zur Derivatisierung von Muraminsäure geeigneten Mittel versetzt und zur Derivatisierung geeignete Bedingungen einstellt, wobei man die Probe zur Beschleunigung der Derivatisierung wiederum unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels auf eine über dem Siedepunkt des Derivatisierungsmittels liegende Temperatur erwärmt und man anschließend das Kondensat vom Deckel des Röhrchens absaugt und im Stickstoffstrom zur Trockne einengt.
Die Erwärmung im geschlossenen Röhrchen, bei dem es sich beispielsweise um ein Polypropylen-Röhrchen handelt, erfolgt äußerlich unter Normaldruck, d.h. es wird von außen kein erhöhter Druck an das Reaktionsgefäß angelegt.
Als Aufschlußmittel wird vorzugsweise alkoholische Säure verwendet, vorzugsweise Salzsäure, insbesondere methanolische Salzsäure. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird wasserfreie methanolische Salzsäure eingesetzt, die durch Einleiten von HCl-Gas in eisgekühltes Methanol (ca. 0,13 g/ml) hergestellt wird. Denkbar ist auch ein alkalischer Aufschluß.
Als Mittel zur weiteren Derivatisierung des gebildeten Muramin- säuremonoalkylesters, insbesondere des Mura insäure- monomethylesters, wird beispielsweise ein Acylierungsmittel verwendet, bevorzugt Essigsäureanhydrid und Pyridin. Möglich sind auch Trifluoressigsäureanhydrid/Pyridin Trichlores- sig-säureanhydrid/Pyridin, Trimethylsilylchlorid/Pyridin und Bis(trimethylsilyl) trifluoracetamid (BSTFA) und weitere Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die Probe eine Blutprobe ist und man die Probe im Rδhrchen vor dem Aufschluß zunächst zur Zerstörung von roten Blutkörperchen einfriert, zur Beschleunigung in eine gekühlte Flüssigkeit eintaucht (Temperatur z.B. - 18°C, -80°C oder -195°C, wobei durch Eintauchen in die gekühlte Flüssigkeit der Wärmeentzug beschleunigt wird) , anschließend wieder auftaut und zentrif giert .
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen, bei dem man ein vorgenanntes Aufschluß-/Derivatisierungsverfahren durchführt, man gebildetes Muraminsäurederivat nach dem Einengen zur Trockne in Chloroform oder dergleichen aufnimmt, mit verdünnter Salzsäure (z.B. 0,05 N Salzsäure) und Wasser wäscht, zentrifugiert und die wässrige Waschphase absaugt. Der Nachweis des Muraminsäure- derivats erfolgt vorzugsweise mittels einer Gaschromatogra- phie/Massenspektrometrie-Kombination (GC/MS) .
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren folgende Schritte:
a) Erwärmen der methanolischen Probe auf ca. 100°C in Gegenwart eines zum Aufschluß der Probe geeigneten Mittels, vorzugsweise methanolischer Salzsäure, unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels,
b) Entfernen der am Deckel gebildeten Flüssigkeitstropfen, c) Zugabe eines für die Derivatisierung von Muraminsäure geeigneten Mittels, vorzugsweise Essigsäure- anhydrid/Pyridin, und anschließende Erwärmung auf ca. 100°C unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels,
d) Entfernen der am Deckel gebildeten Flüssigkeitstropfen und Einengung der Probe bis zur Trockne bei ca. 100°C unter Stickstoff-Einleitung,
e) Zugabe von Chloroform und Schütteln der Probe,
f) Zugabe von stark verdünnter Salzsäure, Schütteln der Probe und anschließendes Zentrifugieren,
g) Absaugen des Überstandes und anschließendes analoges Waschen mit Wasser,
h) Nachweis des erhaltenen Mura insäurederivats, vorzugsweise mittels GC/MS .
Unter Verwendung von Essigsäureanhydrid/Pyridin als Derivatisie- rungsmittel wird das Muraminsäurederivat im GC/MS durch die Massezahlen m/z = 88.10 und 213.15 nachgewiesen. Unter Verwendung von Heptadecansäuremethylester als innerer Standard werden beim GC/MS-Nachweis die Massenzahlen m/z = 143.10 und 241.05 gefunden.
Erfindungsgemäß wird die wesentliche Vereinfachung des Aufschluß-/Derivatisierungsverfahrens gegenüber dem Stand der Technik durch Kühlung des Deckels der Reaktionsröhrchen erreicht. Dies kann beispielsweise durch eine vorgekühlte Metallplatte, beispielsweise eine Aluminium-Platte (Alu-Platte) , vorzugsweise mit einer Dicke von mindestens 30 mm, erreicht werden, die man vor Verwendung z.B. bei - 18°C für eine ausreichende Zeit im Kühlfach lagert. Weitere Möglichkeiten sind eine von einem Kryostaten gekühlte Platte oder ein Gefäß mit glattem Boden, das eine vorgekühlte Flüssigkeit, eine Kältemischung oder einen Stoff enthält, der beim Schmelzen Wärme aufnimmt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit beliebigen biologischen Proben, wie z.B. Abstrichen, Blut- und Urinproben, Liquor, Ge- webehomogenisaten, Proben aus Zellkulturen, Hausstaub oder dergleichen, durchgeführt werden. Bei Verwendung von Blutproben ist es zweckmäßig, die Probe vor dem Aufschluss zunächst zur Zerstörung von roten Blutkörperchen und weiteren Zellen einzufrieren (z.B. bei -18, -80°C oder -195°C) , sie anschließend wieder aufzutauen (bei 37°C) und zu zentrifugieren. Das Pellet wird, gegebenenfalls nach Durchführung ein oder mehrerer Waschschritte zur Entfernung vorhandenen Hämoglobins und anderer löslicher Stoffe (beispielsweise mit Wasser, Methanol und/oder methanolischer Salzsäure) dem genannten Aufschluss- bzw. Deri- vatisierungsverfahren unterzogen. Das Produkt des Aufschluss- und Derivatisierungsverfahrens, bei dem es sich um ein Muramin- säurederivat, vorzugsweise das Methyl-Tetraacetyl-Derivat, handelt, wird anschließend nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mittels einer Gaschromatographie/Massenspektrometrie- Kombination (GC/MS) .
Gegenstand des Verfahrens ist ferner ein Kit zur Durchführung des vorgenannten Aufschluss-/Derivatisierungsverfahrens bzw. des Verfahrens zum Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen. Die erfindungsgemäßen Kits enthalten insbesondere die zur Durchführung des Aufschluss- und Derivatisierungsverfahrens notwendigen Reagenzien bzw. Chemikalien, d.h. eine Metallplatte, vorzugsweise aus Aluminium, die gemäß einer beson- deren Ausführungsform der Erfindung eine Dicke von mindestens 30 mm aufweist, die zur Kühlung der Deckel auf die verschlossenen Röhrchen aufgelegt werden, verschließbare Röhrchen, wie z.B. Eppendorf-Röhrchen mit Plastik-Verschluss (sogenannte Ep- pendorf Tubes, Typ Safe-Lock, aus Polypropylen) , benötigte Aufschluss- und Derivatisierungsmittel und/oder Lösungsmittel (Chlorform o.a., unpolares lipophiles Lösungsmittel wie z.B. n- Hexan) und/oder Waschmittel (wie Wasser bzw. verdünnte Salzsäure; s.o.), sowie verschließbare Röhrchen, wie z.B. Eppendorf- Röhrchen mit Plastik-Verschluss (sogenannte Eppendorf Tubes, Typ Safe-Lock, aus Polypropylen) sowie.
Zur Duchführung des AufSchluß-/Derivatisierungsverfahrens wird ferner folgendes benötigt:
• Heizblock 100°C,
• Zentrifuge mit ca. 18000 g RZB (relative Zentrifugalbeschleunigung) ,
• Laborabzug,
• Druckgasflasche mit Stickstoff,
• Schüttler (Gyrator) , z.B. vom Typ Uniprep® der Fa. Unie- quip (Martinsried, Deutschland) ,
• Wasserstrahlpumpe mit Schlauch und wechselbarer Pipettensitze,
• GC/MS-Gerät, vorzugsweise Typ QP2010, der Fa. Shimadzu Eu- rope Ltd. , Duisburg/Deutschland.
Für die Probenvorbereitung bei bakteriellen Nachweisverfahren wird ferner vorzugsweise folgendes benötigt: • 2ml-Röhrchen zur Blutentnahme mit Antigerinnungsmittel (EDTA, Zitrat, Heparin) , falls die biologische Probe eine
Blutprobe ist,
• 0, 5ml-Röhrchen mit Safe-Lock-Deckel aus Polypropylen (z.B. Fa. Eppendorf, Deutschland) ,
• spezieller Ständer, der einen schnellen Wärmeentzug beim Einfrieren der Blutproben gewährleistet,
• Zentrifuge mit ca. 18000 g RZB (relative Zentrifugalbeschleunigung) ,
• Heizblock (37°C) zum Auftauen der Proben,
• Schüttler (Gyrator) , z.B. vom Typ Uniprep® der Fa. Unie- quip (Martinsried, Deutschland) ,
• Wasserstrahlpumpe mit Schlauch und wechselbarer Pipettensitze.
Einzelne der letztgenannten werden daher vorzugsweise ebenfalls in den vorgenannten Kits enthalten sein.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein sensitiver Nachweis grampositiver und gramnegativer Bakterien bereitgestellt, der sehr schnell durchgeführt werden kann, wodurch innerhalb eines gegenüber dem Stand der Technik deutlich verkürzten Zeitraums (bereits nach etwa zwei Stunden) eine Aussage darüber getroffen werden kann, ob die getestete biologische Probe mit Bakterien kontaminiert war oder nicht. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nicht nur darin, dass auch bereits abgestorbene Bakterien dem Nachweis zugeführt werden können, sondern, daß bestimmte diagnostische Problemfälle, wie der Nachweis einer Sepsis, bei denen üblicherweise Probleme bei der Bakterienan- züchtung bestehen, ebenfalls nachgewiesen werden können. Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gelingt der Probenauf- schluss und die Probenderivatisierung innerhalb kürzester Zeit, und ohne dass es teurer Spezialapparaturen bedarf. Vielmehr können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von in Labors üblicherweise ohnehin schon vorhandenen Geräten und Verbrauchsmaterial durchgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass auch Proben von Patienten eingesetzt werden können, die bereits einer Therapie mit Antibiotika unterzogen wurden. Bei der klassischen Anzüchtung von Keimen erfordert dies die Zugabe von Aktivkohle. Dieser zusätzliche Arbeitsschritt, der auch eine wesentliche Fehlerquelle darstellt, kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausfüh- rungsbeispiels beschrieben, wobei das Beispiel als Illustration verstanden wird, ohne die Erfindung darauf beschränken zu wollen. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass auch Modifikationen bzw. Variationen der hier und im Folgenden beschriebenen Verfahren möglich sind, ohne vom Kern der Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL
Probenentnahme:
Blutproben in üblichen Röhrchen zur Plasmagewinnung (z.B. in EDTA-, Zitrat- oder Heparin-Röhrchen) abnehmen.
Anreicherung und Waschen:
Je 0,5 ml Blut in 0, 5-ml-Eppendorf-Röhrchen (Typ Safe-Lock aus Polypropylen) geben. Röhrchen einfrieren (z.B. bei -80°C) und auftauen.
In der Eppendorf-Zentrifuge (Typ 5417C, mit Festwinkelrotor) 20 min. bei 14.000 U/min. (entspricht 18.200 g RZB (relative Zentrifugalbeschleunigung) zentrifugieren. Dabei sind die Röhrchen gleich auszurichten, damit beim Absaugen des Überstands der dem Pellet gegenüberliegende Punkt gewählt werden kann.
Danach Überstand weitgehend mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe und Schlauch mit 200 μl-Pipettenspitze bis auf einen Rest von ca. 20 μl absaugen.
Zum Waschen 400 μl Wasser (Merck) zugeben, 10 sec. am Gyrator (Schüttler vom Typ Uniprep der Fa. Uniequip, Martinsried) schütteln und wie oben 15 min. zentrifugieren und absaugen.
Dieser Waschprozess wird anschließend mit 300 μl Methanol in gleicher Weise wiederholt. Aufschluss, Reinigung und Derivatisierung:
Zu den 0,5-ml-Röhrchen mit den gewaschenen zellulären Resten der Blutprobe werden je 100 μl der Methanol-Salzsäure-Mischung mit 0,13 g HCl-Gas/ml gegeben. Nach ca. 10 sec. Schütteln am Gyrator und evtl. Aufrühren des Pellets mit einer 10-μl-Pipettenspitze werden die Proben 15 min. bei 100°C im Heizblock erwärmt. Durch eine aufliegende ALU-Platte von mehr als 30 mm Dicke, die zuvor bei -18°C im Kühlfach gelagert wurde, werden dabei die Deckel gekühlt. Danach werden nach vorsichtiger Öffnung der Deckel (Schutzbrille!) die Tropfen am Deckel der 0,5 ml-Reaktionsgefäße mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe abgesaugt und die Methanol/Salzsäure-Reste in der Probe im Heizblock bei 100°C kurz mit Stickstoff abgeblasen.
Zur Verringerung von fettlöslichen StörSubstanzen werden 300 μl n-Hexan zugegeben und die Röhrchen ca. 10 sec. am Gyrator geschüttelt. Nach Absaugen des n-Hexans werden die Proben im Heizblock bei 100°C im Stickstoffström getrocknet. Danach werden 10 μl innerer Standard Heptadecansäuremethylester (16 ng/μl) zugegeben und die Proben analog zu vorher getrocknet.
Die anschließende Derivatisierung erfolgt durch Zugabe von je 30 μl Acylierungsmittel (Essigsäureanhydrid und Pyridin) , kurzem Schütteln am Gyrator, evtl. Aufrühren des Pellets mit einer 10- μl-Pipettenspitze und 15 min. Erwärmung auf 100°C im Heizblock (unter Kühlung der Deckel mit einer zweiten, gekühlten Alu- Platte) .
Nach Öffnen der Deckel wird der Tropfen am Deckel analog abgesaugt und die Probe im Heizblock (100°C) unter Stickstoff- Einleitung zur Trockne eingeengt. Nach Zugabe von 100 μl Chloroform wird kurz (ca. 10 sec.) am Gyrator geschüttelt und, falls erforderlich, das Pellet mit einer 10-μl-Pipettenspitze aufgerührt. Zum Waschen werden 200 μl 0,05 m HCl zugegeben, 10 sec. am Gyrator geschüttelt und 1 min bei 14.000 U/min. zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstands wird dieser Waschprozess mit 200 μl Wasser (Merck) wiederholt. Die Chloroform-Phasen werden in GC-Röhrchen mit Spitzbodeneinsatz überführt, und die Röhrchen werden verschlossen.
Die Messung erfolgt mit Hilfe eines GC/MS-Gerätes (GC-17A/QP- 5050A der Fa. Shimadzu) mit einer gering polaren Kapillar- Trennsäule von 15 m Länge und 0,25 mm Innendurchmesser im SIM- Modus bei den Massenzahlen m/z = 88.10 und 213.15 für das Mura- minsäurederivat und m/z = 143.10 und 241.05 für den inneren Standard.
Die Abbildungen 1 bis 4 zeigen Beispielchromatogramme. Die GC/MS-Chromatogramme wurden erhalten mit Split/Splitlos-Injektor bei 2 min Hochdruck-Injektion (50 kPa) und 2 min. Sampling-Time (splitlos) , Injektionsvolumen: 4 μl von ca. 25 μl Probe, d.h. ca. 16 % der Probe.

Claims

Patentansprüche;
1. Verfahren zum Aufschluss und zur Derivatisierung biologischer Proben für einen Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen, bei dem man eine biologische Probe in ein mit einem Deckel verschließbares Röhrchen gibt, man einen Probenaufschluss in Gegenwart eines flüssigen AufSchlussmittels durchführt, indem man die Probe unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels auf eine Temperatur von etwa 30-50°C über dem Siedepunkt des Auf- schlussmittels erwärmt und man anschließend das Kondensat vom Deckel des. Röhrchens entfernt, man die Probe wäscht und sie mit einem zur Derivatisierung von Muraminsäure geeigneten Mittel versetzt und zur Derivatisierung geeignete Bedingungen einstellt, wobei man die Probe zur Beschleunigung der Derivatisierung wiederum unter gleichzeitiger Kühlung des Deckels auf eine über dem Siedepunkt des Derivatisierungsmittels liegende Temperatur erwärmt und man anschließend das Kondensat vom Dek- kel des Röhrchens absaugt und im Stickstoffstrom zur Trockne einengt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das AufSchlussmittel alkoholische Säure ist.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Derivatisierung des gebildeten Mura insäuremonoalkylesters ein Acylierungsmittel ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid/Pyridin, Trif- luoressigsäureanhydrid/Pyridin, Trichloressigsäure- anhydrid/Pyridin, Trimethylsilylchlorid/Pyridin oder Bis(trimethylsilyl) trifluoracetamid (BSTFA) ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Blutprobe ist und man die Probe im Röhrchen vor dem Aufschluß zunächst zur Zerstörung von roten Blutkörperchen und weiteren Zellen einfriert, zur Beschleunigung in eine gekühlte Flüssigkeit eintaucht, anschließend wieder auftaut und zentrifu- giert .
6. Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontaminationen oder Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 durchführt und man im Zentrifugat ein Muraminsäurederivat bildet und nachweist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Muraminsäurederivat mittels GC/MS nachweist.
8. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 5.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es alkoholische Säure enthält.
10. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die alkoholische Säure methanoϊische Salzsäure ist.
11. Kit nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner verschließbare Röhrchen, eine Metallplatte, Wasser, verdünnte Salzsäure, Chloroform und/oder ein unpolares lipophiles Lösungsmittel enthält.
12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallplatte eine Aluminiumplatte mit einer Dicke von mindestens 30 mm ist.
13. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 6 und 7.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es die Bestandteile eines Kits nach den Ansprüchen 8 bis 12 und ferner ein Acylierungsmittel enthält.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die alkoholische Säure methanolische Salzsäure und das Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid/Pyridin, Trifluor- essigsäureanhydrid/Pyridin, Trichloressigsäure- anhydrid/Pyridin, Trimethylsilylchlorid/Pyridin oder Bis(trimethylsilyl) trifluoracetamid (BSTFA) ist.
16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner Röhrchen zur Blutentnahme mit Antigerin- nungsmittel enthält.
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