DE68906075T2

DE68906075T2 - Verfahren zur adhaesion von proben an ein testsubstrat.

Info

Publication number: DE68906075T2
Application number: DE8989108313T
Authority: DE
Inventors: Huey Ling Lina Jou Jou; Huey Langyang; John Todd
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1988-05-10
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2009-05-10
Also published as: EP0343424A1; DE68906075D1; US5024933A; CA1339249C; EP0343424B1; JPH0213399A

Description

Diese Erfindung betrifft die Adhäsion von Gewebe- Zell- oder anderen Polynucleotide enthaltenden Proben an analytische Elemente oder Vorrichtungen zur Erprobung von Nucleinsäure-Hybridisierungstests. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von natürlich vorkommenden adhäsiven Substanzen bei der Untersuchung solcher Proben mittels Festphasenhybridisierungstest für klinische diagnostische oder Forschungszwecke.
In der Histologie, Zytologie und verwandten Gebieten werden seit langem gefärbte oder ungefärbte Gewebeproben für eine Vielzahl von Anwendungen auf dem Bildungs-, Experimental- und Kliniksektor verwendet. Sowohl in Paraffin eingebettete als auch gefrorene Gewebe- oder Zellproben aus dem Blut oder der zervikalen Spülung werden für die mikroskopische Untersuchung auf Glasobjektträger aufgebracht.
Ein wichtiger Aspekt dieser Verfahren ist die Zuverlässigkeit des Haftens von Nucleinsäuren, Zellen und Gewebeabschnitten auf dem Objektträger oder einer anderen Oberfläche, auf der die Untersuchung ausgeführt wird. Ein wiederkehrendes Problem, besonders bei in-situ-Hybridisierungstests, war die fehlende Haftung der Zellen oder Gewebeproben auf dem Objektträger.
Eine Behandlung zum Beispiel mit HCl, H&sub2;O&sub2;, Verdauung mit Proteinase, Prähybridisierung und Hybridisierung bei erhöhten Temperaturen oder mit Formamid kann dazu führen, daß sich die Zellen oder das Gewebe vom Objektträger lösen. Die Zellverdauung mittels Proteinase K als Teil der Herstellung von Proben für die in-situ-Hybridisierungstests hat das Problem verstärkt, selbst wenn extrem verdünnte Präparationen der Proteinase verwendet werden. Siehe, zum Beispiel, Morley, et al., In Situ Localization of Amylase mRNA and Protein. An Investigation of Amylase Gene Activity in Normal Human Parotid Cells. J. Histochem. and Cytochem., 35:9-14 (1987) und Brigati, et al., Detection of Viral Genomes in Cultured Cells and Paraffin-Embedded Tissue Sections Using Biotin-Labeled Hybridization Probes, Virology, 126:32-50 (1983).
Einige der wirksamsten Haftmittel der Natur werden von sessilen intertidalen marinen Invertebraten, wie Miesmuscheln, hergestellt und die Anstrengungen, das Adhäsionsvermögen von Mytilus edulis dürch die Fäden mit einer Scheibe an der Spitze und dem Namen "Byssus" mit der chemischen Zusammensetzung zu korrelieren, sind durch die extreme Unlöslichkeit der Scheibenproteine behindert worden. Diese adhäsive Scheibe ist wegen ihrer Einlagerung von aromatischem oder "polyphenolischem Proteine" von Histologen als "Phenoldrüse" bezeichnet worden.
Waite, et al. The Bioadhesive of Mytilus Byssus: A Protein Containing L-Dopa, Biochem. Biophys. Res. Comm.,96: 1554-1561 (1960) berichten hier, daß die adhäsive Scheibe und das polyphenolische Protein von Mytilus beträchtliche Mengen an L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) enthalten. Von umfassenden Isolationsverfahren wird berichtet. Eine aromatische Verbindung "A" wurde in den Hydrolysaten gefunden und auf der Basis mehrerer analytischer Kriterien als identisch mit dem Standard-L-Dopa bezeichnet. Obwohl die Autoren anerkennen, daß die Funktion von DOPA im Scheibenprotein nicht bekannt ist, erhebt sich die Frage, ob DOPA dem Scheibenprotein einzigartige adhäsive Eigenschaften verleiht und/oder zur Wechseiwirkung von Kollagen und polyphenolischem Protein beiträgt.
Waite, et al., Polyphenolic Substance of Mytilus edulis: Novel Adhesive Containing L-DOPA and Hydroxyproline, Science 212:1038-1040 (1981) berichten, daß die adhäsiven Scheiben von Mytilus edulis reich an der Aminosäure 3,4-Dihydroxyphenylalanin (Dopa) sind. Ein säurelösliches Protein wurde aus der Phenoldrüse, die in dem Byssus-sezernierenden Fuß des Tieres gelegen ist, extrahiert und gereinigt. Man fand, daß dieses Protein stark basisch ist und große Mengen Lysin, Dopa und 3- und 4-Hydroxyprol in enthält. Die Autoren schließen daraus, daß dieses Protein zu der Adhäsion des Byssus beiträgt.
Waite, Evidence for a Repeating 3,4-Dihydroxyphenylalanine- and Hydroxyproline-containing Decapeptide in the Adhesive Protein of the Mussel, Mytilus edulis L., J. Biol. Chem., 258:2911-2915 (1983). Hier wurde berichtet, daß die Behandlung des adhäsiven Proteins mit Kollagenase aus Chlostridien das Molekulargewicht um weniger als 10% senkt. Es wurde berichtet, daß das Kollagenase-resistente Fragment den größten Teil oder das gesamte Hyp und Dopa enthält. Es wurde berichtet, daß die Trypsinbehandlung des polyphenolischen Protein zu umfassender Degradation führt. Das hauptsächliche tryptische Peptid (80%) enthält 10 Aminosäuren einschließlich Hyp und Dopa und erwies sich bei der Sequenzanalyse als H&sub2;N-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-COOH.
Es wird berichtet, daß, wenn der Organismus auf Glas aufgebracht wird, die Anheftungsplaques eine durchschnittliche adhäsive Zugfestigkeit von 10&sup6; Newton-Meter² aufweisen. Es wird angegeben, daß die Substanz im Plaque, die eine Adhäsion zwischen den kollagenen Fäden der Scheibe und dem Substrat vermittelt, das polyphenolische Protein ist. Die Autoren erwähnen, daß das polyphenolische Protein die Aufmerksamkeit als Haftmittel erweckt hat, da seine Adhäsions- und Polymerisationsfähigkeit und Langlebigkeit im Gegensatz zu den meisten synthetischen Haftmitteln nicht durch die Anwesenheit von Wasser nachteilig beeinflußt wird. Obwohl man berichtet, daß der Grund für diese Wasserresistenz unbekannt ist, nimmt man an, daß es wahrscheinlich mit der ungewöhnlichen Zusammensetzung des polyphenolischen Protein in Zusammenhang steht.
Das US-Patent US-A-4 496 397 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von polyphenolischen Proteinen, die reich an Catechol sind, wie jene aus Mytilus edulis und deren Stabilisierung in einem Bereich von pH 7,0 bis 9,0. Das beschriebene Verfahren umfaßt die zusätzlichen Schritte nach der Essigsäureextraktion des catecholhaltigen Proteins, der Entfernung der löslichen, niedermolekularen Materialien nach der Essigsäureextraktion des catecholhaltigen Proteins aus dem Extrakt und der Umsetzung der Extraktionsfraktion mit einem wasserlöslichen Borat.
Das US-Patent US-A-4585585 offenbart Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Decapeptiden mit der Formel ala-lys-pro/hyp-ser/thr- tyr/dopa-pro/ hyp-pro/hyp-ser/thr-tyr/dopa-lys und großen polyphenolischen Molekülen, die repetitive Einheiten des Decapeptids umfassen, deren bindende Gruppen Aminosäuren, Oligopeptide oder bifunktionelle Spacer sind. Die Verdauung der polyphenolischen Proteine in Trypsin in Gegenwart eines neutralen oder leicht basischen Puffers führt zu den vorstehend genannten Decapeptiden. In der Beschreibung ist angegeben, daß die Decapeptide als Bausteine beim Aufbau von größeren polyphenolischen Molekülen verwendet werden können, die die adhäsiven Fähigkeiten des nativen bioadhäsiven Proteins besitzen.
Wenn die bioadhäsiven Proteine mit Kollagenase aus Clostridien behandelt werden, wird das Molekulargewicht auf einen Wert zwischen etwa 110.000 und 130.000 gesenkt. Die resultierenden Kollagenase-resistenten Fragmente enthalten den größten Teil von HYP und DOPA des ursprünglichen bioadhäsiven Proteins. Kollagenase-resistente Fragmente werden schnell durch Trypsin in Decapeptide, die repetitive Einheit im nativen Protein, abgebaut. In einer anderen Ausführungsform kann die Trypsinverdauung an isolierten bioadhäsiven Proteinen ausgeführt werden, ohne zuerst die bioadhäsiven Proteine mit Kollagenase aus Clostridien zu behandeln.
Das US-Patent US-A-4 687740 ging aus einer Teilanmeldung des vorstehend erwähnten US-A-4585 585-Patents hervor und betrifft das Verfahren, das Decapeptid herzustellen.
Ein Produkt, das als Cell-Tak Zell- und Gewebe-Adhäsivum bezeichnet wird, ist von BioPolymers , Inc., Farmington, CT, erhältlich und wird als eine hochgereinigte Zubereitungsform des adhäsiven Proteins der marinen Miesmuschel angegeben. Die Anwendung, für die es angeboten wird, ist für Zell- und Gewebekulturwachstum unter Bedingungen, die mit der Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen verträglich sind und sie fördern.
Seit dem Nachweis der adhäsiven Eigenschaft in der säurelöslichen Fraktion, wie in den früheren Berichten, die vorstehend dargestellt sind, beschrieben, zeigen die folgenden und jüngeren Entwicklungen, wie in den erwähnten Patenten offenbart, daß das Ziel nun die vollständige Reinigung ist, was zu synthetischen Decapeptiden und dem synthetischen Aufbau von großen polyphenolischen Proteinen daraus führt. Weiterhin zielt die Anwendung dieser gereinigten und synthetischen Proteine auf physiologisch günstige Bedingungen, wie jene, bei denen nicht nur die Zelle oder die Gewebekultur wachsen sollen, sondern auch das Protein selbst nicht möglicherweise destruktiven harten Bedingungen ausgesetzt ist.
Im Gegensatz zu allem, das durch die vorstehend beschriebenen Anstrengungen oder aus einem allgemeinen Wissen über die äußeren Bedingungen, die die Proteine für ihre strukturelle Integrität, und vor allem ihre Aktivität erfördern, vorgeschlagen wurde, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß ein Isolat des natürlich vorkommenden Muscheladhäsionsproteins hoch wirksam ist beim Erhalt der Adhärenz von Gewebe, Zellen und anderen Polynucleotide enthaltenden Proben an Oberflächen, auf denen sie fixiert sind, selbst bei den harten und strengen Bedingungen der Vorbehandlungsschritte, die notwendig für die Nucleinsäure-Hybridisierungstests sind. Diese umfassen das sehr hohen Temperaturen, stark saurer Umgebung und stark toxischen Reagentien, wie Formamid, Ausgesetzsein.
Entsprechend liefert die vorliegende Erfindung eine Verbesserung, die die Adhäsion von Proben auf eine Oberfläche für einen Nucleinsäurehybridisierungstest zum Nachweis eines Zielpolynucleotids betrifft. In einer Hinsicht liefert die Erfindung ein Verfahren zum Anheften einer Gewebe-, Zell- oder anderes Ziel-Polynucleotid enthaltenden Probe an ein Substrat unter Bedingungen anzuheften, die verträglich mit einem Nucleinsäurehybridisierungstest sind. Dieses Verfahren umfaßt (a) Aufbringen eines Adhäsionsmittels, das ein Isolat eines natürlich vorkommenden Muscheladhäsionsproteins umfaßt, auf mindestens einen Teil einer Oberfläche, auf der der Nucleinsäure-Hybridisierungstest durchgeführt werden soll; (b) das Anheften oder das Fixieren der Probe auf mindestens einen Teil der Oberfläche, auf die das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist; und (c) die Behandlung der angehefteten Probe zur Erstellung von Bedingungen, die mit der Durchführung einer Nucleinsäure-Hybridisierung verträglich sind. Der Behandlungsschritt kann Zellen in der Probe umfassen, so daß deren Nucleinsäuregehalt für die Hybridisierung zugänglich wird, die Verdauung der Probe mit Proteinase und die Aussetzung der Probe gegenüber Chemikalien und Reagentien, einschließlich Formamid und starken Säuren.
In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung einen Nucleinsäure-Hybridisierungstest, der auf einem Substrat ausgeführt wird, an das entweder eine Zielpolynucleotidprobe oder mindestens ein Reagens für den Test angeheftet wird. Dieses Verfahren umfaßt (a) das Aufbringen eines Adhäsionsmittels, das ein Isolat eines natürlich vorkommenden Muschel- Adhäsionsproteins umfaßt, auf mindestens einen Teil der Oberfläche, auf dem ein Nucleinsäure-Hybridisierungstest an einer Probe durchgeführt wird; (b) das Anheften eines Zielgewebes, einer Zelle oder einer Polynucleotidprobe oder eines Mittels, das an der Oberfläche haftet und ein Oligo- oder Polynucleotid umfaßt, das spezifisch mit einem ersten Teil des Ziels hybridisierbar sind, auf mindestens einen Teil der Oberfläche, auf der das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist. (c)das Inkontaktbringen des Polynucleotids von (b) unter Hybridisierungstestbedingungen mit (i) einem Reagenzmittel umfassend ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid, das spezifisch mit mindestens einem Teil des Ziels hybridisierbar ist, wenn die Probe an der Oberfläche haftet, oder (ii) dem Ziel und einem Reagenzmittel, umfassend ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid, das spezifisch mit einem zweiten Teil des Ziels hybridisierbar ist, wenn das Oligo- oder Polynucleotid, das mit dem ersten Teil des Ziels hybridisierbar ist, an der Oberfläche haftet; und (d) Nachweis der Reaktion darauf.
Das Zielpolynucleotid ist gewöhnlich eine doppelsträngige DNA oder RNA menschlichen, tierischen, mikrobiellen, pflanzlichen oder viralen Ursprungs. Das Adhäsionsmittel kann prinzipiell als adhäsive Komponente davon ein säurelösliches Isolat des natürlich vorkommenden Muschel- Adhäsionsproteins aus einer Miesmuschel der Gattung Mytilus umfassen. Die Oberfläche ist mindestens eine Oberfläche einer formstabilen analytischen Vorrichtung, wie ein mikroskopischer Objektträger.
In anderer Hinsicht liefert die Erfindung eine Verbesserung, die die Adhäsion von Zell- und Gewebeproben auf analytische Elemente oder Objektträger in einem Nucleinsäure- Hybridisierungstest-Kit betrifft. Der Kit umfaßt mindestens ein analytisches Element, das auf mindestens einer Oberfläche ein Adhäsionsmittel hat, das ein säurelösliches Isolat eines natürlich vorkommenden Muscheladhäsionsproteins umfaßt, und mindestens einen Reagenzbehälter, der ein Reagenzmittel enthält, das ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid umfaßt, das spezifisch mit dem Zielpolynucleotid hybridisierbar ist und das, wenn es damit hybridisiert, direkt oder indirekt eine nachweisbare Reaktion erzeugt. Das Adhäsionsmittel kann hergestellt werden, indem man phenolische Drüsen aus Mytilus edulis erhält, ein erstes Homogenat aus ihnen in einer neutralen oder alkalischen Lösung herstellt, ein Gewebepellet daraus abtrennt und gewinnt, das Pellet mit einer milden Säurelösung, wie Essigsäure, mischt, und ein zweites Homogenat daraus herstellt, den Überstand aus dem zweiten Homogenat daraus abtrennt und gewinnt, und das Adhäsionsmittel aus dem Überstand konzentriert.
Verschiedene Merkmale und alternative Aspekte des Verfahrens, wobei das Adhäsionsmittel, das ein im wesentlichen ungereinigtes Isolat eines natürlich vorkommenden Muscheladhäsivums umfaßt, hergestellt wird, sind folgende:
Phenolische Drüsen werden aus Mytilus edulis erhalten, indem man Verfahren verwendet, die in der Literatur beschrieben worden sind. Ein erstes Homogenat der phenolischen Drüsen wird in Wasser oder einer neutralen oder milden alkalischen Lösung hergestellt. Tris oder andere neutrale Puffer sind geeignet. Die Trennung der gebildeten und löslichen Fraktionen des ersten Homogenats zur Erzeugung eines Gewebepellets kann zum Beispiel durch Zentrifugation erfolgen.
Das Pellet, das gewonnen wird, wird zur Herstellung eines zweiten Homogenats mit einer Lösung einer milden Säure, wie Essigsäure, gemischt. Diese Lösung kann gegebenenfalls Phenylmethylsulfonylfluorid umfassen, das als Proteaseinhibitor dient. Die Trennung des zweiten Homogenats und die Gewinnung des Überstands kann zum Beispiel durch Zentrifugation erfolgen.
Die Konzentrierung des Adhisionsmittels aus dem Überstand kann durch verschiedene Verfahren erfolgen, einschließlich der Dialyse mit Sephadex , Sepharose oder Polyethylenglykol, durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Gefriertrocknung.
Die Oberfläche auf der das Adhäsivum ausgestrichen wird, ist typischerweise ein Objektträger aus Glas oder ähnliches Material. Der Hybridisierungstest kann auf jeder geeigneten Oberfläche ausgeführt werden, auf das das adhäsive Protein aufgebracht worden ist. Das Adhäsionsmittel liegt bevorzugt in einem Volumen von ungefähr 0,5 ul bis etwa 5,0 ul vor, das ausreicht, um 15 x 15 Millimeter Oberfläche mit der Lösung in einer Konzentration zu bedecken, die an vorbestimmte optimale Bedingungen angepaßt ist.
Nachdem das Gewebe angeheftet ist, wird die Probe dann der Hybridisierung mit dem Reagenz unterzogen. Das Zielpolynucleotid kann an die analytische Oberfläche durch das Adhäsionsmittel angeheftet werden, entweder in Form von nackter Nukleinsäure oder einer Gewebeprobe, dessen Nucleinsäuregehalt durch Zellzerstörung einsträngig und zugänglich gemacht wurde. Mehr als eine markierte Sonde kann verwendet werden, um Ziel-Oligo- oder -Polynucleotide von Interesse zu identifizieren. Geeignete Marker umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Avidin, Streptavidin, Biotin, Iminobiotin, eine elektronendichte Komponente, eine magnetische Komponente, ein Enzym, eine Hormonkomponente, eine radioaktive Komponente, eine metallhaltige Komponente, eine fluoreszierende Komponente und eine Antigen- oder Antikörperkomponente oder Kombinationen davon. Das Reagenzmittel kann Oligo- oder Polynucleotide umfassen, die beide markiert oder nicht markiert sind. In einer anderen Ausführungsform kann an die analytische Oberfläche durch das Adhäsivum ein Mittel angeheftet sein, das ein Oligo- oder Polynucleotid einschließt, das spezifisch mit einem ersten Teil des Zielpolynucieotids hybridisierbar ist. In diesem Fall wird ein zusätzliches Reagenz geliefert, das ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid umfaßt, das spezifisch mit einem zweiten Teil des Ziels hybridisierbar ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, aber begrenzen sie nicht.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung und Herstellung des erfindungsgemäßen Muschel-Adhäsionsproteins (M-Protein) aus Mytilus edulis.

Reagenz-Herstellung

M-Protein, Lösung A. Die Herstellung von 1 Liter M-Protein-Lösung A findet wie folgt statt. In ein 2 Liter-Becherglas mit magnetischen Rührstab wird folgendes eingegeben:
58,45 g NaCl
6,06 g Tris- Base
7,90 g EDTA
1,25 g Ethylmaleimid
0,065 g KCN
Dann wird Phenylmethylsulfonylfluorid (0,174 g) in Isopropylalkohol (1 ml) gelöst und zu der Lösung, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, hinzugefügt. Gegebenenfalls erfolgt die Einstellung auf einen pH-Wert von 7,5 mit HCl und die Einstellung des Volumens auf 1 Liter.
M-Protein, Lösung B (0,9 M Essigsäure). Entionisiertes Wasser (500 ml) wird in ein geeignetes Gefäß zusammen mit einem magnetischen Rührstab gegeben. Unter Rühren des Rührstabs wird Eisessig (54 ml) langsam hinzugefügt. Das Volumen wird auf 1 Liter mit entionisiertem Wasser aufgefüllt und die Lösung wird in einem dicht verschlossenen Behälter aufbewahrt.

Aufarbeitung der Muscheln:

Zwanzig Pfund Muscheln werden am selben Tag, an dem sie verarbeitet werden, erhalten und auf feuchtem Eis gehalten . In schneller Arbeit wird die phenolische Drüse herausgeschnitten und sofort auf ein Stück Trokkeneis gelegt. Die gefrorenen phenolischen Drüsen werden in einem sterilen 50 ml-Polypropylenteströhrchen gesammelt, das auf Trockeneis gehalten wird.

Isolierung des M-Proteins

Gefrorene phenolische Drüsen der Miesmuschel werden in einem Mixer mit einer Eberbach-Spitze mit einem minimalen Volumen gekühlter M-Protein-Lösung A (150-200 ml) gemischt. Die resultierende Konsistenz sollte dem eines Milchshakes gleichkommen. Unter Kühlhaltung wird das Gemisch in einen gekühlten Gewebehomogenisator, wie einem Dounce-Homogenisator, gefüllt, und auf Eis zermahlen, bis das Gemisch frei von Klumpen ist. Das Gemisch wird dann in gekühlte 25 ml-Ultrazentrifugenröhrchen gefüllt und 1 Stunde bei 40.000 Upm in einer vorgekühlten (0-8ºC) Ultrazentrifuge zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen. Die Pellets werden in einen Mixer gebracht und eine minimale Menge gekühlter M-Protein-Lösung B (50-150 ml) wird hinzugefügt. Es wird 1 Minute gemischt , in gekühlte Ultrazentrifugenröhrchen gefüllt und 1 Stunde bei 40.000 Upm zentrifugiert. Die Überstände werden gesammelt und die Pellets verworfen. Der gesammelte Überstand wird in Dialysebeutel (75 ml/Beutel) eingefüllt. Die Beutel werden zur Konzentrierung des Proteins mit Sephadex G 150 bestreut und bei 0-8ºC über Nacht aufbewahrt, währenddessen das Volumen um mindestens 90% abnehmen sollte. Schnitte von Gewebeproben werden verwendet und wie unten beschrieben getestet.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer analytischen Vorrichtung, die das Adhäsionsmittel der Erfindung und andere Materialien für den nicht-radioaktiven Nucleinsäure-Hybridisierungstest von Gewebe enthält.
Ein Standard-Halterungsset für das Anfärben von mikroskopischen Objektträgern wie das von American Scientific Products, Edison, N. J. Catalog No. S7626-12 erhältliche oder ein Äquivalent, und ein kompatibler Halterungsapparat zum Färben von Objektträgern wie der von American Scientific Products, Edison, N. J. Katalog No. S7636 erhältliche oder ein Äquivalent werden zusammen mit anderer Standard-Labor-Ausrüstung wie folgt verwendet.
Die Glasobjektträger, die alle zwei Vertiefungen haben, werden auf der Vorder- und Rückseite gründlich gereinigt und in den Halteapparat zum Anfärben von Objektträgern gesetzt. Behälter aus dem Objektträgerfärbeset werden mit destilliertem Wasser (ungefähr 220 ml) gefüllt und eine äquivalente Zahl von Behältern werden mit 95% Ethanol gefüllt. Die gereinigten Objektträger werden in destilliertem Wasser (ungefähr 3 Minuten) inkubiert, auf einem Stapel von Papiertüchern getrocknet und dann in Ethanol (ungefähr 3 Minuten) eingebracht. Das Wasser wird nach zwei Durchgängen und das Ethanol nach drei Durchgängen gewechselt. Die Objektträger werden luftgetrocknet und, falls notwendig, in staubfreien Behältern aufbewahrt, bis sie benutzt werden sollen.
Ein Gefäß mit M-Protein, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird bei 10.000 Upm fünf Minuten zentrifugiert. Die gewünschte Zahl von Objektträgern, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wird auf eine saubere Arbeitsfläche mit den Vertiefungen nach oben gelegt. Eine geeignete Menge des M-Protein-Präparats wird in die Vertiefung jedes Öblektträgers gebracht.
Indem man ein Deckglas pro Objektträger verwendet, wird das M-Protein über die Oberfläche der beiden Vertiefungen verteilt, so daß die Oberfläche jeder Vertiefung vollständig bedeckt wird. Die Objektträger werden dann luftgetrocknet.
Das M-Protein-Präparat wird dann auf den Objektträgern wie folgt fixiert. Die Objektträger werden in den Halteapparat für das Anfärben der Objektträger gesetzt und 5 Minuten lang in 95%igem Ethanol inkubiert. Das Ethanolbad wird nach allen drei Anwendungen gewechselt. Die Objektträger werden luftgetrocknet und danach zweimal mit destilliertem Wasser gespült und wieder luftgetrocknet. Die Objektträger, die hiernach als adhäsive vorbehandelte Probenobjektträger (APT-Objektträger) bezeichnet werden, werden dann bei 2-8ºC in einem wasserfreien Behälter, wie einzelnen versiegelten Folienbeuteln aufbewahrt, bis sie zur Verwendung gebraucht werden.
Die Objektträger können entweder für gefrorene oder Paraffin-eingebettete Proben, die mit Formal in fixiert worden sind, verwendet werden.
A. Für Paraffin-eingebettete, Formalin-fixierte Proben, werden eine bis drei Schnitte (4-6 um dick) jeder Biopsieprobe auf beide Vertiefungen der ATP-Objektträger aufgebracht. Die Objektträger mit dem Gewebe werden dann für eine Stunde bei 60ºC gebacken, um die Objektträger zu fixieren. Zu diesem Zeitpunkt ist das Gewebe jetzt dauerhaft an den Objektträger fixiert und bleibt bei Raumtemperatur mindestens ein Jahr stabil. Die restlichen Schritte, die beschrieben sind, sind Vorbereitung für einen Hybridisierungstest.
Alle Objektträger, einschließlich der Kontrollobjektträger, müssen vor Gebrauch entparaffiniert werden, indem man sie in den folgenden Lösungen für die angegebenen Zeiten inkubiert: Bad Reagenz Dauer Xylol Ethanol Entionisiertes Wasser
Nach der letzten Inkubation werden die Objektträger durch fünfminütiges Erwärmen bei 60ºC vollständig getrocknet.
Um möglichst ein maximales Signal zu erhalten, sollten Formalin-fixierte Gewebeschnitte mit Proteinase K behandelt werden. Deshalb wird frisch verdünnte 1x Proteinase K-Lösung (0,5 mi bei 250 ug Proteinase 20 K/ml) in jede Vertiefung auf jedem Objektträger gegeben und diese Objektträger dann 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Proteinase K-Lösung wird vorsichtig von den Objektträgern geklopft, die dann für eine Minute bei Raumtemperatur in jedem der drei Behälter mit Waschpuffer inkubiert werden. Um jede Peroxidase-Aktivität in dem Gewebeschnitt zu inaktivieren, werden alle Objektträger mit Quench-Reagenz (0,5 ml pro Vertiefung) bedeckt und 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Objektträger werden dann mit Waschpuffer gespült.
B. Für gefrorene Formalin-fixierte Schnitte werden ein bis drei Schnitte (6-8 um dick) jeder Biopsieprobe in beide Vertiefungen der APT-Objektträger eingebracht. Die Objektträger mit dem Gewebe werden dann für eine Stunde bei 60ºC gebacken, um den Gewebschnitt an die Objektträger zu binden. Die Objektträger werden durchzehnminütige Inkubation in Aceton fixiert und dann luftgetrocknet. Zu diesem Zeitpunkt ist das Gewebe jetzt dauerhaft an den Objektträger fixiert und bleibt bei Raumtemperatur für mindestens ein Jahr stabil. Die verbleibenden Schritte, die beschrieben sind, sind Vorbereitung für den Hybridisierungstest.
Für die gefrorenen, Formalin-fixierten Schnitte wird frisch hergestellte 10x Proteinase K-Lösung in 20 Volumen Waschpuffer verdünnt und die resultierende Lösung wird in jede Vertiefung auf jedem Objektträger gegeben. Diese Objektträger werden dann bei 37ºC 15 Minuten inkubiert. Wie vorstehend beschrieben, wird die Proteinase K-Lösung vorsichtig von den Objektträgern geklopft, die dann eine Minute bei Raumtemperatur in jedem der drei Behälter mit Waschpuffer inkubiert werden.
Sowohl für die Paraffin-eingebetteten Formalin-fixierten als auch für die gefrorenen Formalin-fixierten Schnitte werden alle Objektträger mit Quench- Reagenz (0,5 ml pro Vertiefung) bedeckt und 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Peroxidase-Aktivität im Gewebeschnitt zu inaktivieren. Die Objektträger werden dann mit Waschpuffer gespült und dann dehydratisiert, indem man sie in den folgenden Lösungen für die angegebenen Zeiten inkubiert: Bad Reagenz Dauer Entionisiertes Wasser Ethanol
Nach dem letzten Bad wurden die Objektträger durch fünfminütiges Erwärmen auf 60ºC vollständig getrocknet. Die Objektträger sind nun fertig für die Hybridisierung und für Färbeverfahren, die durchgeführt werden können, indem man zum Beispiel ein PathoGene-DNA-Sondentestkit zur Identifizierung des menschlichen Papilloma- Virus (HPV) verwendet.

Claims

1. Verfahren zur Adhäsion einer Gewebe-, Zell- oder ein anderes Zielpolynucleotid enthaltenden Probe an ein Substrat unter Nucleinsäure-Hybridisierungstest-kompatiblen Bedingungen, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Aufbringen eines Adhäsionsmittels, das ein Isolat eines natürlich vorkommenden Muschel-Adhäsionsproteins umfaßt, auf mindestens einen Teil einer Oberfläche, auf der der Nucleinsäure-Hybridisierungstest durchgeführt werden soll;

(b) Anheften oder Fixieren der Probe auf mindestens einem Teil der Oberfläche, auf die das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist; und

(c) Behandlung der angehefteten Probe zur Erzielung von Bedingungen, die mit der Durchführung einer Nucleinsäure-Hybridisierung darauf kompatibel sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielpolynucleotid menschlichen tierischen, mikrobiellen, pflanzlichen oder viralen Ursprungs ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Isolat ein säurelösliches Protein umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Zell- oder Gewebeprobe ist, und die Behandlung das Aufbrechen der Zellen davon umfaßt, um deren Nucleinsäureinhalt für die Hybridisierung bereitzustellen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Zell- oder Gewebeprobe ist, und die Behandlung die Verdauung der Probe mit einer Proteinase umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Behandlung der Probe das Zusammenbringen der Probe mit Formamid oder einer starken Säure umfaßt.

7. Nucleinsäure-Hybridisierungstest für ein Zielpolynucleotid, umfassend die folgenden Schritte:

(b) Anheften der Probe oder eines Mittels, das an der Oberfläche haftet und ein Oligo- oder Polynucleotid umfaßt, das spezifisch mit einem ersten Teil des Ziels hybridisierbar ist, auf mindestens einem Teil der Oberfläche, auf dem das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist;

(c) Inkontaktbringen der Probe oder des Mittels von (b) unter Hybridisierungstestbedingungen mit (i) einem Reagenzmittel, umfassend ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid, das spezifisch mit mindestens einem Teil des Ziels hybridisierbar ist, wenn die Probe an der Oberfläche haftet, oder (ii) einer Probe und einem Reagenzmittel, umfassend ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid, das spezifisch mit einem zweiten Teil des Ziels hybridisierbar ist, wenn das Mittel, einschließlich des mit dem ersten Teil des Ziels hybridisierbaren Oligo- oder Polynucleotid, an der Oberfläche haftet;

und

(d) Nachweis einer Reaktion darauf.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Zielpolynucleotid in einer menschlichen, tierischen, mikrobiellen oder pflanzlichen Zell- oder Gewebeprobe vorliegt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Zielpolynucleotid menschlichen, tierischen, mikrobiellen, pflanzlichen oder viralen Ursprungs ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Oberfläche mindestens eine Oberfläche einer formstabilen analytischen Vorrichtung ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein Oligo- oder Polynucleotid, das spezifisch mit einem ersten Teil des Zielpolynucleotids hybridisierbar ist, an mindestens einem Teil der Oberfläche haftet, auf die das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das nachweisbar markierte Oligo- oder Polynucleotid ausgewählt ist aus Oligo- oder Polynucleotiden, die mit Avidin, Streptavidin, Biotin, Iminobiotin, einer elektronendichten Komponente, einer magnetischen Komponente, einem Enzym, einer Hormonkomponente, einer radioaktiven Komponente, einer metallhaltigen Komponente einer fluoreszierenden Komponente, einer Antigen- oder Antikörperkomponente oder Kombinationen davon markiert sind.

13. Nucleinsäure-Hybridisierungstest-Kit zum Nachweis eines Zielpolynucleotids, wobei der Kit umfaßt:

(a) mindestens ein analytisches Element, bei dem auf mindestens einer Oberfläche ein Adhäsionsmittel vorhanden ist, welches ein Isolat eines natürlich vorkommenden Muscheladhäsionsproteins umfaßt; und

(b) mindestens ein Reagenzbehälter, der ein Reagenzmittel enthält, das ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid umfaßt, das spezifisch mit dem Zielpolynucleotid hybridisierbar ist und das, wenn es direkt oder indirekt damit hybridisiert ist, eine nachweisbare Reaktion erzeugt.

14. Kit nach Anspruch 13, wobei ein spezifisch mit einem ersten Teil des Zielpolynucleotids hybridisierbares Oligo- oder Polynucleotid an mindestens einem Teil der Oberfläche haftet, auf die das Adhäsionsmittel aufgebracht worden ist.

15. Kit nach Anspruch 13, weiterhin ein Reagenzmittel umfassend, das ein nachweisbar markiertes Oligo- oder Polynucleotid enthält, das spezifisch mit einem zweiten Teil des Ziels hybridisierbar ist.