ES2275312T3 - Medio de cultivo y de identificacion especifica de diferentes especies de candida y metodo de analisis. - Google Patents
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Abstract
Un medio de cultivo para la identificación específica y / o la diferenciación de las levaduras Candida albicans y Candida tropicalis, que comprende un substrato cromógeno o fluorígeno, susceptible de poder hidrolizarse mediante una enzima del grupo de las hexosaminidasas, caracterizado por el hecho de que, el medio, comprende, además, por lo menos un compuesto selectivamente inhibidor de la actividad hexosaminidasa de C. tropicalis.
Description
Medio de cultivo y de identificación específica
de diferentes especies de Candida y métodos de análisis.
La presente invención, se refiere a un medio de
cultivo y de identificación específica de levaduras y a un
procedimiento de análisis microbiológico para identificar
específicamente las levaduras Candida albicans y Candida
tropicalis y/o diferenciar las levaduras C. albicans y
C. tropicalis.
La especie C. albicans, es la más
comúnmente aislada a partir de muestras clínicas, y provoca
infecciones más o menos importantes de la piel, de las uñas y de
las mucosas, en los individuos que presentan defensas inmunitarias
normales, e infecciones muy serias, en los individuos debilitados y,
especialmente, en aquéllos infectados por el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (VIH). Según los estudios, la C.
tropicalis, es la segunda o la tercera especie en frecuencia de
aislamiento, en las extracciones de origen humano. Es por lo tanto
esencial, no únicamente el poder detectar muy rápidamente la
presencia de estas levaduras en las extracciones sino también,
igualmente, el diferenciar aquéllas que pertenecen a la especie
C. albicans, de aquéllas de la especie C.
Tropicalis.
Para realizar este cometido, se han propuesto,
en estos últimos años, numerosas técnicas para identificar
rápidamente las levaduras C. albicans. El número más grande
de entre éstas, se basa en la evidenciación de una actividad
hexosaminidasa, es decir, de enzimas que tienen una actividad
N-acetil-\beta-D-galactosaminidasa
ó
N-acetil-\beta-D-manosaminidasa
(FR - 2 684 110, FR - 2 659 982). No obstante, estos procedimientos,
sufren de una especificidad reducida con respecto a las levaduras
de la especie C. tropicalis.
Los inventores de la presente invención, han
descubierto que, procediendo a inhibir una actividad enzimática de
la especie C. tropicalis, especialmente, la actividad
hexosaminidasa, es posible el paliar los inconvenientes de los
tests de ensayo anteriormente citados, arriba, y con ello, el
aportar un medio de identificación y/o de diferenciación de las
levaduras, especialmente, de C. albicans y de C.
tropicalis, rápido y poco costoso.
Además, la actividad enzimática glucosidasa, ha
sido ya objeto de investigaciones por parte de ciertos documentos,
como el de Casal, M. y Linares, M.J. "Contribution to the study of
the enzymatic profiles of yeast organismes with medical
interest", -Contribución al estudio de los perfiles enzimáticos
de organismos de levaduras con interés médico-,
Mycopathologie 81,155 - 159 (1983). Esta actividad, es positiva, en algunas cepas de C. albicans, C. tropicalis y Candida pseudotropicalis (denominada, hoy en día, Candida Kefyr), pero negativa, para otras candida, como por ejemplo, las C. parapsilois, C. guilliermondii, C. krusei.
Mycopathologie 81,155 - 159 (1983). Esta actividad, es positiva, en algunas cepas de C. albicans, C. tropicalis y Candida pseudotropicalis (denominada, hoy en día, Candida Kefyr), pero negativa, para otras candida, como por ejemplo, las C. parapsilois, C. guilliermondii, C. krusei.
Ha parecido por lo tanto interesante, el
intentar acumular, en un mismo medio, la posibilidad de investigar
dos actividades enzimáticas diferentes, es decir, hexosaminidasa y
glucosidasa. Se ha constatado el hecho de que, en los medios en
concordancia con la presente invención, este cúmulo, permite
diferenciar, de una forma más precisa, a las C. albicans,
con relación a las C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae
y/o C. tropicalis, y con relación a las otras Candida, pero
permite igualmente diferenciar a las C. guilliermondii, C.
kefyr, C. lusitaniae y/o C. tropicalis, con relación a
las otras Candida.
En el bien entendido, se prevé el asociar, en un
mismo medio, a los substratos específicos de las actividades
hexasominidasa y glucosidasa que se investigan, un inhibidor en
concordancia con la presente invención, e incluso un activador de
la actividad hexosaminidasa.
El objeto de la presente invención, es por lo
tanto un medio de cultivo y de identificación específica de las
levaduras, que comprende un substrato cromógeno o fluorígeno,
susceptible de poder hidrolizarse mediante una enzima del grupo de
las hexosaminidasas, caracterizado por el hecho de que, el medio,
comprende, además, por lo menos un compuesto selectivamente
inhibidor de la actividad hexosaminidasa de Candida
tropicalis.
Gracias a la invención, el medio de cultivo,
permite especialmente la identificación específica de las levaduras
de la especie C. albicans y/o C. tropicalis.
Según una forma de realización preferencial de
la invención, el medio de cultivo, comprende, en calidad de
compuesto selectivamente inhibidor, una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, saturada o
insaturada, alifática o cíclica, que comporta eventualmente por lo
menos un heteroátomo,
- o bien ya sea, cada una de las R y/o R' y/o
R'', forman, conjuntamente, una cadena de hidrocarburo cíclica,
saturada o insaturada, que comporta eventualmente por lo menos un
heteroátomo,
y, en segundo lugar, n es un número entero,
superior o igual a 1.
Según la invención, mediante una cadena de
hidrocarburo que "comporta" por lo menos un heteroátomo, se
entiende que, la cadena de hidrocarburo, puede encontrarse
sustituida mediante por lo menos un sustituyente tal como,
especialmente, -NH_{2}, -COOH, -CH, y un átomo de halógeno y/o
puede encontrarse interrumpida mediante por lo menos un heteroátomo
tal como, especialmente, O, S y N.
Según una forma de realización preferencial de
la invención, el medio de cultivo, comprende, en calidad de
compuesto selectivamente inhibidor, una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, saturada o
insaturada, alifática o cíclica, eventualmente interrumpida mediante
por lo menos un heteroátomo,
- o bien ya sea cada una de las R y/o R' y/o
R'', forman, conjuntamente, una cadena de hidrocarburo, cíclica,
saturada o insaturada, que comporta eventualmente por lo menos un
heteroátomo,
y, en segundo lugar, n es un número entero,
superior o igual a 1.
Según otra forma de realización preferencial de
la invención, el medio de cultivo, comprende, en calidad de
compuesto selectivamente inhibidor, una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, alifática,
y, en segundo lugar, n es igual a 1 ó 2.
Según una forma de realización muy preferencial
de la invención, el compuesto selectivamente inhibidor, es una
acetamida.
Según otra forma de realización de la invención,
el medio de cultivo, comprende un activador específico de la enzima
hexosaminidasa de C. albicans.
Según una forma de realización preferida de la
invención, el activador específico de la enzima hexasominidasa, es
la N-acetil-glucosamina.
Según otra forma de realización de la invención,
el medio de cultivo, comprende una mezcla de compuestos
selectivamente inhibidores.
Según una forma de realización preferida de la
invención, la mezcla de compuestos selectivamente inhibidores, se
encuentra constituida por acetamida y formamida.
Según una forma de realización preferida de la
invención, el medio, es líquido o gelificado.
\newpage
Según una forma de realización de la invención,
el medio de cultivo, es gelificado y comprende, por 1 litro:
| - | peptonas o mezcla de peptonas | 0,01 - 40 g |
| - | extracto de levadura | 0,01 - 40 g |
| - | glucosa (fuente de carbono) | 0 - 10 g |
| - | tampón fosfato (pH entre 5 y 8,5) | 2,5 - 100 mM |
| - | 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida | 20 - 600\cdot10^{-6} M |
| - | acetamida | 0,01 - 20 g |
| - | inhibidor de bacterias | 0 - 20 g |
| - | agar | 11 - 20 g |
Según otra forma de realización preferida de la
invención, el medio de cultivo gelificado o líquido descrito
anteriormente, arriba, comprende, además,
N-acetil-glucosamina, a 1,0 g/l.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, el medio de cultivo gelificado o líquido descrito
anteriormente, arriba, comprende, además, formamida, a 0,5 g/l.
Otro objeto de la presente invención, es un
procedimiento de análisis microbiológico para identificar
selectivamente las levaduras C. albicans y/o C.
tropicalis y/o diferenciar las levaduras C. albicans y
C. tropicalis, caracterizado por el hecho de que, la muestra
a analizar, se pone directamente en contacto con por lo menos un
medio de identificación descrito anteriormente, arriba.
A dicho efecto, la presente invención, se
refiere igualmente a un medio para la detección y la identificación
específica de lavaduras, el cual se caracteriza por el hecho de que
éste comprende dos substratos, un primer substrato, cromógeno o
fluorígeno, susceptible de poder ser hidrolizado por una enzima del
grupo de las hexosaminidasas, y un segundo substrato, cromógeno o
fluorígeno, susceptible de poder ser hidrolizado por una enzima del
grupo de las glucosidasas.
Según una forma preferida de realización de la
invención, en este medio, cada substrato, se encuentra constituido
por una parte específica de la enzima y por una parte marcador,
caracterizado por el hecho de que, la parte marcador del primer
substrato, se diferencia de la parte marcador del segundo
substrato.
Según otra forma preferida de realización de la
presente invención, el medio, comprende un activador y/o un
inhibidor de hexosaminidasa.
En el caso en donde hay un activador y/o un
inhibidor, este activador, se encuentra constituido por una
hexosamina y/o una hexosaminidina y, este inhibidor, tomas las
características descritas anteriormente, arriba.
Según todavía otra forma preferida de
realización de la invención, el substrato de hexosaminidinasa, se
encuentra constituido por un derivado de indoxil y/o el substrato
de glucosidasa, se encuentra constituido por un derivado de
indoxil.
En todos los casos de representación, el medio,
es líquido o gelificado.
La presente invención, se refiere, también, a un
procedimiento de análisis microbiológico para detectar e
identificar selectivamente ciertas especies de levaduras Candida, el
cual se caracteriza por el hecho de que, la muestra, se pone
directamente en contacto con un medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 ó 18, por el hecho de que se espera que
aparezcan coloraciones en el medio, y por el hecho de se
identifican, por diferencias de coloraciones, las C.
albicans, con relación, por una parte, a las C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C.
tropicalis y, por otra parte, a las otras Candida, así como las
C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C.
tropicalis, con relación a las otras Candida.
Se esperan entre 36 y 60 horas y, de forma
ventajosa, sensiblemente 48 horas, cuando el medio no contiene
activador o inhibidor.
Se esperan entre 18 y 30 horas y, de forma
ventajosa, sensiblemente 24 horas, cuando el medio contiene un
activador o un inhibidor.
Según una primera forma de realización, estos
procedimientos, permiten identificar C. albicans, C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C.
tropicalis, con relación a las otras Candida, cuando el medio
contiene:
- un substrato de hexosaminidasa, y/o
- un substrato de glucosidasa, y/o
- un activador de hexosaminidasa y/o
- inhibidor de hexosaminidasa.
Según una segunda forma de realización, estos
procedimientos, permiten identificar C. albicans con relación
a C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae, C. tropicalis
y/o a las otras Candida, cuando el medio contiene:
- un substrato de hexosaminidasa y un substrato
de glucosidasa, y/o
- un activador de hexosaminidasa, y/o
- inhibidor de hexosaminidasa.
Por "compuesto selectivamente inhibidor de la
actividad de la hexosaminidasa de C. tropicalis", se
entiende todo compuesto capaz de inhibir, de una forma selectiva,
la actividad de la hexosaminidasa de C. tropicalis. Por
ejemplo, los compuestos del tipo amida, de la fórmula descrita
anteriormente, arriba, tienen la propiedad de inhibir
específicamente la actividad hexosaminidasa de las C.
tropicalis, sin afectar a la de las C. albicans.
Por "identificación", se entiende la
detección y/o la cuantificación.
Por "muestra", se entiende especialmente
toda extracción de tipo biológico, una cepa o un conjunto de cepas
de levaduras aisladas, por ejemplo, después de cultivo.
Se expone, a continuación, de una forma general,
la composición del medio de cultivo, expresado en g/l, del medio
final.
El medio comprende una base nutritiva necesaria
para el desarrollo de las levaduras y de los inhibidores específicos
de la hexosaminidasa de C. tropicalis según la
invención.
Los elementos constituyentes de la base
nutritiva, comprenden:
- peptonas de 0,01 a 40 g/l, tales como la
peptona de carne, el producto comercializado por la sociedad
bioMérieux, con la marca bioSoyasa o análogo, o también, una mezcla
de peptonas; de una forma preferente, la peptona o la mezcla de
peptonas, se encuentra presente, en el medio, a una tasa de 6 g/l
\pm 0,5 g/l;
- un extracto de levadura de 0,01 a 40 g/l, de
una forma preferente, aproximadamente 1,5 g/l, que aporte vitaminas
de crecimiento de levaduras;
- una fuente de carbono, tal como la glucosa, el
glicerol, un acetato, un pivurato, un lactato, la arginina, un
aminobutirato, o una mezcla de estos compuestos, en la proporción de
0 a 10 g/l; la fuente de carbono es, de una forma preferente, la
glucosa, en una cantidad de 1 g/l;
- un tampón añadido al medio reactivo, con el
fin de obtener un pH favorable, para el desarrollo de C. albicans,
comprendido dentro de unos márgenes situados entre 5 y 8,5;
eligiéndose, el tampón, entre los tampones fosfatos, Tris, Hépès
(ácido
N-2-hidroxietil-piperazina-N'-2-etasulfónico)
y citrato, en la proporción de 2,5 a 100 mM; de una forma
preferente, el tampón, es un tampón fosfato de 10 mM, para ajustar
el pH del medio a un valor cercano a 7;
- Agar, de 11 a 20 g/l, de una forma preferible,
15 g/l.
El substrato cromógeno o fluorígeno, puede ser
todo substrato cromógeno o fluorígeno, hidrolizable por una
hexosaminidasa, tal como una galactosaminidasa, glucosaminidasa o
manosaminidasa, para liberar un producto coloreado o fluorescente.
De una forma preferente, el substrato, se elige de entre aquéllos
que presentan una fuerte coloración o fluorescencia con pocas
moléculas, y que no inducen ninguna modificación del metabolismo de
los microorganismos, excepto en cuanto a lo referente a la actividad
enzimática investigada. Estos substratos, se eligen, de una forma
preferente, para los substratos cromógenos, entre aquéllos que
comprenden un grupo cromógeno, tal como el indolilo, sustituido o
no y, especialmente, entre la
5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida
o la
5-bromo-6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida
de 20 a 600 mM, de una forma ventajosa, la
5-bromo-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
a 200 mM, y para los substratos fluorígenos, entre la
4-metilumbeliferil-N-acetil-b-D-galactosaminida,
la
4-metilumbeliferil-N-acetil-b-D-glucosaminida.
El inhibidor específico de la hexosaminidasa de
las levaduras de la especie C. tropicalis, se elige, de una
forma preferente, de entre el grupo de los compuestos del tipo amida
(I) o sus mezclas. Éste se elige, principalmente, entre las amidas
tales como la formamida, la ecetamida, la propionamida, la
glicinamida, la succinamida y otras. La cantidad del compuesto del
tipo amida, se encuentra comprendida entre 0,1 y 20 g/l. De una
forma preferible, el inhibidor elegido, es la acetamida a 1
g/l.
Con el fin de obtener, para las levaduras de la
especie C. albicans, una actividad intensa y precoz, de una
forma preferible, puede añadirse, al medio de cultivo, un activador
de hexosaminidasa, tal como el que se describe en el documento FR -
A - 2 684 110. Del mismo modo, al medio, se le puede añadir un
inhibidor o una mezcla de inhibidores de las bacterias, que permita
inhibir el crecimiento de las bacterias a Gram positivo, y de
aquéllas a Gram negativo, sin afectar al de las levaduras y, si
posible, de los hongos. De una forma preferible, los inhibidores de
las bacterias, se eligen de entre el grupo de los antibióticos,
tales como la gentamicina, el cloranfenicol, la penicilina, la
estreptomicina, la cicloheximida, la neomicina, la tetraciclina, la
oxitetraciclina o una mezcla de antibióticos, y/o entre la telurita,
un molibdato y análogos, o sus mezclas. De una forma ventajosa, se
elige el cloranfenicol, (0,5 g/l), o una mezcla de gentamicina (0,1
g/l) y de cloranfenicol (0,5 g/l). Es igualmente posible el inhibir
el crecimiento de las bacterias, procediendo a hacer disminuir el
pH del medio, hasta un pH ácido.
Tal y como se demuestra mediante los ejemplos
que se facilitan posteriormente, a continuación, la reacción de
hidrólisis enzimática, permanece específica, después de 24 horas de
incubación.
Ejemplo
1
Se procedió a realizar tests de ensayo, para
ensayar el efecto de la acetamida sobre la actividad hexosaminidasa
de las levaduras.
Se prepararon dos medios, según las técnicas
habituales. El primer medio, el cual se designará, de ahora en
adelante, como Medio I, contiene todos los elementos de base
nutritiva, así como un substrato cromógeno de una hexosaminidasa y
una mezcla inhibidora de bacterias.
La composición del Medio I, par un litro de
medio final, es la siguiente:
| - | bioSoyasa (bioMerieux) | 6,0 g |
| - | extracto de levadura (bioMerieux) | 1,5 g |
| - | glucosa (Merck) | 1,0 g |
| - | tampón fosfato (Merck) | 10,0 mM |
| - | Mn2+ (Merck) | 1,0 mM |
| - | 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida (Biosynth) | 1,0 g |
| - | gentamicina | 0,1 g |
| - | cloranfenicol | 0,05 g |
| - | agar (bioMerieux) | 15,0 g |
El pH del medio, se ajusta a un valor de
aproximadamente 7.
El segundo medio, denominado Medio II,
corresponde al medio según la invención, y contiene todos los
elementos que se han descrito anteriormente, arriba, para el medio
I, más un inhibidor específico de la hexosaminidasa de las C.
tropicalis, es decir, un compuesto acetamida (Sigma), a 1,0
g.
Sobre estos dos medios, se cultivaron
directamente 12 cepas de levaduras, en placas de Petri. Las cepas
procedentes de la colección del solicitante, pertenecen a las
especies siguientes: C. albicans (3 cepas), C.
glabrata (2 cepas), C. krusei (1 cepa), C.
parapsilosis (1 cepa), C. tropicalis (3 cepas),
Saccharomyces cerevisiae (1 cepa), Trichosporon spp.
(1 cepa). Las placas, se incubaron a una temperatura de 37°C,
durante un transcurso de tiempo de 48 horas. Las colonias formadas,
se examinaron visualmente, respectivamente, después de,
respectivamente, 24 y 48 horas de incubación, según las
interpretaciones siguientes:
- las colonias azules, corresponden a cepas que
producen la
N-acetil-\beta-D-glucosaminidasa,
que pertenece, a priori, a la especie C.
albicans;
- las colonias blancas, corresponden a las cepas
que no producen la enzima precitada, o en donde, esta enzima, se
inhibe mediante el compuesto de tipo amida, por lo cual, éstas
pertenecen a otras especies de levaduras que deberán identificarse,
entonces, mediante técnicas habituales.
Los resultados, se presentan en la tabla I que
se facilita a continuación:
| * : número de cepas, "-" = 0. |
Tal y como resalta de la tabla I anterior, el
aporte del compuesto de tipo amida, permite una detección específica
de las cepas de C. albicans. En efecto, sólo las cepas de
C. albicans, así como una cepa de Trichosporon, después de
48 horas de incubación únicamente, producen colonias coloreadas
sobre el medio según la invención. Las colonias de C.
tropicalis que son azules, después de un tiempo de 48 horas
sobre el Medio I, proporcionan colonias incoloras sobre el Medio
II, excepto una muy débilmente coloreada, después de 48 horas de
incubación.
Ejemplo
2
Se procedió a reproducir la experiencia del
ejemplo 1, pero utilizando medios líquidos, en lugar de medios
gelificados.
Los medios III y IV, corresponden por lo tanto a
los medios I y II del ejemplo, pero se encuentran desprovistos de
agar. Además, la concentración de la
5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-b-D-glucosamida,
es de 150 mg/l de medio final, para una utilización en medio
líquido. Los medios, se repartieron en ampollas de vidrio, a razón
de 3 ml por ampolla. Las cepas estudiadas, son las mismas que en el
ejemplo 1. Se procedió a efectuar una suspensión contrastada a 2
MacFarland, con la ayuda de un nefelómetro, para cada una de las
cepas, directamente, en las ampollas que contenían el medio. Las
ampollas de esta forma inoculadas, se incubaron durante un
transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de 37°C. Éstas
se examinaron, después de respectivamente 24 y 48 horas, según las
interpretaciones del ejemplo 1.
Los resultados, se presentan en la tabla II que
se facilita a continuación:
| * : número de cepas, "-" = 0. |
Tal y como resalta de la tabla II anterior, el
aporte del compuesto de tipo amidado, permite una detección
específica de las cepas de C. albicans. En efecto, sólo las
cepas de C. albicans, proporcionan tubos coloreados en azul,
en el medio según la invención. Las colonias de C.
tropicalis, que proporcionan tubos coloreados en el Medio III,
proporcionan tubos incoloros en el medio IV. Después de un tiempo de
48 horas de incubación, la coloración de los tubos que comportan
cepas de C. tropicalis, se inhibe igualmente o por lo menos
se reduce de una forma muy fuerte.
\newpage
Ejemplo
3
Se procedió a realizar tests de ensayo, con
objeto de ensayar el efecto de la acetamida sobre la actividad
hexosaminidasa de las levaduras, en presencia de un activador
específico de esta enzima.
Se repitió la experiencia del ejemplo 1, pero
añadiendo N-acetil-glucosamina al
medio. Los medios V y VI, corresponden, por lo tanto, a los medios
I y II del ejemplo 1, a los cuales se les ha añadido
N-acetil-glucosamina, a 1,0 g/l de
medio final. Las cepas estudiadas, son las mismas que en el ejemplo
1. Éstas se cultivaron directamente en placas de Petri. Las placas,
se incubaron durante un transcurso de tiempo de 48 horas, a una
temperatura de 37°C. Las colonias formadas, se examinaron
visualmente, después de respectivamente 24 y 48 horas de incubación,
según las interpretaciones del ejemplo 1.
Los resultados, se presentan en la tabla I que
se facilita a continuación:
| * : número de cepas, "-" = 0. |
\newpage
Tal y como resalta de la tabla III anterior, el
aporte del compuesto de tipo amida, permite una detección
específica de las cepas de C. albicans. En efecto, sólo las
cepas de C. albicans, así como una cepa de Trichosporon,
después de 48 horas de incubación únicamente, producen colonias
coloreadas sobre el medio según la invención. Las colonias de C.
tropicalis que son azules, sobre el Medio V, proporcionan
colonias incoloras sobre el Medio VI. El conjunto de estos dos
medios, permite por lo tanto, igualmente, una identificación
específica de las levaduras de la especie C. tropicalis,
puesto que, después de 24 horas de incubación, éstas son las únicas
que son positivas sobre el medio V, y negativas sobre el medio
VI.
Ejemplo
4
Se procedió a realizar tests de ensayo, con
objeto de ensayar el efecto de una mezcla de compuestos amidados,
sobre la actividad hexosaminidasa de las levaduras, en presencia de
un activador específico de esta enzima.
Se repitió la experiencia del ejemplo 3, pero
añadiendo formamida al medio VI, a 0,5 g/l de medio final (medio
VIII), siendo, el medio VII, idéntico al medio V del ejemplo 3. Las
cepas estudiadas, son las mismas que en el ejemplo 3. Éstas se
cultivaron directamente en placas de Petri. Las placas, se incubaron
durante un transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de
37°C. Las colonias formadas, se examinaron visualmente, después de
respectivamente 24 y 48 horas de incubación, según las
interpretaciones del ejemplo 1.
Los resultados, se presentan en la tabla IV que
se facilita a continuación:
| * : número de cepas, "-" = 0. |
Tal y como resalta de la tabla IV anterior, el
aporte del compuesto de tipo amida, permite una detección todavía
más específica de las cepas de C. albicans. En efecto, sólo
las cepas de C. albicans, producen colonias coloreadas sobre
el medio según la invención. Las colonias de C. tropicalis
que son azules, sobre el Medio VII, proporcionan colonias incoloras
sobre el Medio VIII y la cepa de Trichosporon, fuertemente
coloreada, después de 48 horas de incubación sobre el medio VII, no
lo es más que de una forma muy débil, sobre el medio VIII.
Ejemplo
5
Se procedió a realizar tests de ensayo, con
objeto de ensayar el interés de combinar un substrato de
hexosaminidasa y un substrato de
\beta-glucosidasa en un medio para el aislamiento
e identificación de levaduras.
Al medio I del ejemplo 1, se le añadió un
substrato de \beta-glucosidasa, el
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
a 0,07 g/l (medio IX). A este medio, se le añadió o bien ya sea un
activador de hexosaminidasa
(N-acetil-glucosamida), a 1 g/l
(medio X), o bien ya sea un inhibidor de hexosaminidasa de las C.
tropicalis (Acetamida), a 1 g/l (medio XI), o bien ya sea una
combinación del activador y el inhibidor anteriormente citados, a
las mismas concentraciones (medio
XII).
XII).
Sobre estos cuatro medios, se cultivaron
directamente dieciocho cepas de levaduras, en placas de Petri. Las
cepas procedentes de la colección del solicitante, pertenecen a las
especies siguientes: C. albicans (3 cepas), C.
glabrata (2 cepas), C. gulliermondii (2 cepas), C.
kefyr (2 cepas), C. krusei (1 cepa), C. lusitaniae
(2 cepas), C. parapsilosis (1 cepa), C. tropicalis (3
cepas), Saccharomyces cerevisiae (1 cepa), Trichosporon
spp. (1 cepa). Las placas, se incubaron a una temperatura de
37°C, durante un transcurso de tiempo de 48 horas. Las colonias
formadas, se examinaron visualmente, respectivamente, después de,
respectivamente, 24 y 48 horas de incubación, según las
interpretaciones siguientes:
- las colonias azules, corresponden a cepas que
producen la
N-acetil-\beta-D-glucosaminidasa,
que pertenece, a priori, a la especie C.
albicans;
- Las colonias rosas, corresponden a las cepas
que producen la
N-acetil-\beta-glucosidasa,
que pertenecen, a priori, a las especies C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y C.
tropicalis;
- las colonias violeta, corresponden a las cepas
que producen las dos actividades enzimáticas;
- Las colonias blancas, corresponden a las cepas
que no producen ninguna de las enzimas precitadas, o en donde,
estas enzimas, se inhiben, por lo cual, éstas pertenecen a otras
especies de levaduras que deberán identificarse, entonces, mediante
técnicas habituales.
Los resultados, se presentan en la tabla V que
se facilita a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| * : número de cepas - color de las colonias, "-" = 0. |
Tal y como resalta de la tabla V anterior, el
aporte de una combinación de un substrato de hexosaminidasa y de un
substrato de \beta-glucosidasa, permite una
detección de un número más importante de especies de levadura. En
efecto, es posible el distinguir, sobre el medio en concordancia con
la presente invención, las cepas de C. albicans, por una
parte, y las cepas de C. guilliermondii, C. kefyr, C.
lusitaniae y C. tropicalis por otra parte, de las otras
especies de levaduras. Los medios X, XI y XII, ilustran el interés
de asociar esta combinación de substrato a un activador de
hexosaminidasa, a un inhibidor específico de la hexosaminidasa de
las cepas de C. tropicalis o a la mezcla de los dos. Sobre el
medio X, la detección de las cepas de C. albicans, es más
rápida que sobre el medio IX, sobre el medio XI, la diferencia entre
las cepas de C. albicans y las de C. tropicalis, es
más neta y, el medio XII, combina las ventajas de los medios X y
XI.
Claims (22)
1. Un medio de cultivo para la identificación
específica y/o la diferenciación de las levaduras Candida
albicans y Candida tropicalis, que comprende un substrato
cromógeno o fluorígeno, susceptible de poder hidrolizarse mediante
una enzima del grupo de las hexosaminidasas, caracterizado
por el hecho de que, el medio, comprende, además, por lo menos un
compuesto selectivamente inhibidor de la actividad hexosaminidasa de
C. tropicalis.
2. Medio de cultivo, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, el compuesto
selectivamente inhibidor, es una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, saturada o
insaturada, alifática o cíclica, que comporta eventualmente por lo
menos un heteroátomo,
- o bien ya sea, cada una de las R y/o R' y/o
R'', forman, conjuntamente, una cadena de hidrocarburo cíclica,
saturada o insaturada, que comporta eventualmente por lo menos un
heteroátomo,
y, en segundo lugar, n es un número entero,
superior o igual a 1.
3. Medio, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, el compuesto
selectivamente inhibidor, es una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, saturada o
insaturada, alifática o cíclica, eventualmente interrumpida mediante
por lo menos un heteroátomo,
- o bien ya sea cada una de las R y/o R' y/o
R'', forman, conjuntamente, una cadena de hidrocarburo, cíclica,
saturada o insaturada, que comporta eventualmente por lo menos un
heteroátomo,
y, en segundo lugar, n es un número entero,
superior o igual a 1.
4. Medio, según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado por el hecho de que, el compuesto
selectivamente inhibidor, es una amida de la fórmula (I):
(I)R - (CO -
NR'R'')_{n}
en la
cual,
en primer lugar, o bien ya sea R, R' y R'', se
encuentren constituidas, de una forma independiente las unas con
respecto a las otras, por:
- un átomo de hidrógeno,
- una cadena de hidrocarburo, alifática,
y, en segundo lugar, n es igual a 1 ó 2.
\newpage
5. Medio, según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado por el hecho de que, el compuesto
selectivamente inhibidor, es una acetamida.
6. Medio, según las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado por el hecho de que, éste, comprende un
activador específico de la enzima hexosaminidasa de C.
albicans.
7. Medio, según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que, el activador específico de
la enzima hexasominidasa, es la
N-acetil-glucosamina.
8. Medio, según las reivindicaciones
precedentes, caracterizado por el hecho de que, éste,
comprende una mezcla de compuestos selectivamente inhibidores.
9. Medio, según la reivindicación 8,
caracterizado por el hecho de que, la mezcla de compuestos
selectivamente inhibidores, se encuentra constituida por acetamida
y formamida.
10. Medio, según las reivindicaciones 1 y 9,
caracterizado por el hecho de que, el medio, es gelificado y
comprende, por 1 litro:
11. Medio, según las reivindicaciones 9 y 10, el
cual comprende, además,
N-acetil-glucosamina, a 10 g/l.
12. Medio, según las reivindicaciones 10 y 11,
el cual comprende, además, formamida, a 0,5 g/l.
13. Medio para la identificación específica y/o
diferenciación de las levaduras Candida albicans y Candida
tropicalis, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende un
substrato, cromógeno o fluorígeno, susceptible de poderse hidrolizar
mediante una enzima del grupo de las glucosidasas.
14. Medio según reivindicación 13, en el cual,
cada substrato, se encuentra constituido por una parte específica
de la enzima y por una parte marcadora, caracterizado por el
hecho de que, la parte marcadora del primer substrato, es diferente
de la parte marcadora del segundo substrato.
15. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por el hecho de que,
éste, comprende un activador de hexosaminidasa.
16. Medio, según la reivindicación 15,
caracterizado por el hecho de que, el activador, se encuentra
constituido por una hexosamina y/o una hexosaminidina.
17. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por el hecho de que,
el substrato de hexosaminidinasa, se encuentra constituido por un
derivado indoxil y/o que, el substrato de glucosidasa, se encuentra
constituido por un derivado de indoxil.
18. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por el hecho de que,
el medio, es líquido o gelificado.
19. Procedimiento de análisis microbiológico
para identificar selectivamente las levaduras C. albicans y/o
C. tropicalis y/o diferenciar las levaduras C.
albicans y C. tropicalis, caracterizado por el
hecho de que, la muestra a analizar, se pone directamente en
contacto con por lo menos un medio de identificación según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
20. Procedimiento de análisis microbiológico
para detectar e identificar selectivamente ciertas especies de
levaduras Candida, caracterizado por el hecho de que, la
muestra, se pone directamente en contacto con un medio según una
cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 18, por el hecho de que se
espera que aparezcan coloraciones en el medio, y por el hecho de se
identifican, por diferencias de coloraciones, las C.
albicans, con relación, por una parte, a las C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C. tropicalis
y, por otra parte, a las otras Candida, así como las C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C.
tropicalis, con relación a las otras Candida.
21. Procedimiento, según la reivindicación 20,
caracterizado por el hecho de que se identifican las C.
albicans, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae y/o C.
tropicalis, con relación a las otras Candida, cuando el medio
contiene:
- un substrato de hexosaminidasa, y/o
- un substrato de glucosidasa, y/o
- un activador de hexosaminidasa y/o
- inhibidor de hexosaminidasa.
22. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 21, caracterizado por el hecho de que
identifican las C. albicans con relación a C.
guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae, C. tropicalis
y/o a las otras Candida, cuando el medio contiene:
- un substrato de hexosaminidasa y un substrato
de glucosidasa, y /o
- un activador de hexosaminidasa, y/o
- inhibidor de hexosaminidasa.
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