WO2024019165A1 - 微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット - Google Patents

微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット Download PDF

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WO2024019165A1
WO2024019165A1 PCT/JP2023/026836 JP2023026836W WO2024019165A1 WO 2024019165 A1 WO2024019165 A1 WO 2024019165A1 JP 2023026836 W JP2023026836 W JP 2023026836W WO 2024019165 A1 WO2024019165 A1 WO 2024019165A1
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surfactant
enzyme
cells
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悠子 一柳
繁哉 鈴木
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キッコーマン株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting microorganisms or cells or microorganism-related substances or cell-related substances.
  • Adenosine triphosphate (hereinafter referred to as ATP) is a nucleotide found in all living organisms, and is used by cells as a substrate to store and release energy. Microorganisms and cells can be detected by measuring ATP.
  • Non-Patent Document 1 a method is known in which ATP and substrate luciferin are reacted in the presence of luciferase and luminescence is measured. This reaction is catalyzed by luciferase and proceeds as follows in the presence of divalent metal ions. [ka] Luciferin + ATP + O 2 ⁇ Oxyluciferin + Adenosine monophosphate (AMP) + Pyrophosphate (PPi) + CO 2 + Light
  • Luciferase is found in bacteria, protozoa, molluscs, insects, etc. Insects that have luciferase include beetles such as fireflies and click beetles. Many luciferase genes have been isolated, and their nucleotide sequences have also been determined.
  • the conventional method for measuring cell-derived ATP includes a step of first sampling, and then a step of extracting the sampled sample.
  • Sampling is a process for collecting microorganisms (and ultimately the ATP contained in the microorganisms).
  • the extraction step is a step for releasing ATP in microorganisms contained in the collected sample to the outside of the cells so that ATP can be measured.
  • a surfactant is usually used to destroy the cell walls of the cells.
  • surfactants are carried over into ATP measurement reagents containing luciferase, they cause inhibition of the luciferin-luciferase reaction, such as inactivation of luciferase.
  • luciferases with surfactant resistance have been developed (for example, Patent Document 1 and Patent Document 2), but there are limitations.
  • a dilution step has been used to dilute the extracted solution containing carryover surfactant.
  • An object of the present invention is to provide a method and kit for detecting microorganisms or cells, microorganism-related substances, or cell-related substances, which at least partially solves the above problems.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies on the ATP measurement method, and have surprisingly discovered that by performing the extraction step as the first step and then contacting it with a surfactant adsorbent as the second step.
  • the inventors have found that it is possible to extract ATP from microorganisms or cells using an extractant and detect ATP in a sample that is brought into contact with a surfactant adsorbent, and have completed the present invention which includes this as an embodiment. .
  • the present invention includes the following embodiments.
  • the following steps (i) removing the microorganisms or cells by contacting the surfactant-containing extractant with the solution which may contain the microorganisms or cells without contacting the surfactant adsorbent with the solution which may contain the microorganisms or cells; a step of extracting an adenine nucleotide component; (ii) a step of contacting a sample containing an adenine nucleotide component derived from microorganisms or cells with a surfactant adsorbent after performing the extraction in step (i); (iii) contacting the specimen that has been in contact with a surfactant adsorbent with a luminescent reagent containing luciferase and luciferin, or suspending the specimen that has been in contact with a surfactant adsorbent in a solution; contacting the solution with a luminescent reagent comprising luciferase and
  • the extractant is a surfactant, cationic surfactant, anionic surfactant, amphoteric surfactant, nonionic surfactant, or benzalkonium chloride or n-tetradecyl-N,N- 3.
  • the method of embodiment 2, comprising one or more of dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • the method is a method for detecting microorganisms or cells
  • the extractant is a microbial extractant or cell extractant that extracts ATP from microorganisms or cells
  • Adenine nucleotide is ATP
  • Step (iii) includes causing ATP to emit light with luciferase, The method according to embodiment 3.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ATP from AMP and an enzyme that generates ATP from ADP.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ADP from AMP, an enzyme that generates ADP from ATP and AMP, and an enzyme that generates ATP from ADP.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ATP from AMP and an enzyme that generates AMP from ADP.
  • the extractant is a surfactant, cationic surfactant, anionic surfactant, amphoteric surfactant, nonionic surfactant, or benzalkonium chloride or n-tetradecyl-N,N- 14.
  • the kit of embodiment 13, comprising one or more of dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • the kit is a kit for detecting microorganisms or cells
  • the extractant is a microbial extractant or cell extractant that extracts ATP from microorganisms or cells
  • Adenine nucleotide is ATP
  • Step (C) includes causing ATP to emit light using luciferase, Kit according to embodiment 12.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ATP from AMP and an enzyme that generates ATP from ADP.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ADP from AMP, an enzyme that generates ADP from ATP and AMP, and an enzyme that generates ATP from ADP.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ATP from AMP and an enzyme that generates AMP from ADP.
  • microorganisms can be detected easily.
  • the relative luminescence amount at each concentration of benzalkonium chloride is shown.
  • the relative luminescence amount at each concentration of n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate is shown.
  • Figure 3 shows changes over time in the amount of luminescence at various concentrations of n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate with and without cotton balls.
  • the effect of inhibiting luminescence inhibition of n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate by each cotton swab is shown.
  • the one on the left is a Lucipak (registered trademark) cotton swab (A), and the one on the right is an industrial cotton swab P1502E (B).
  • the color change with benzalkonium chloride solution brought into contact with each cotton swab is shown. At 0.01% and 0.005%, the color was blue, at 0% it was reddish-purple, and at 0.0001 and 0.00005% it was an intermediate color tone.
  • S-S-P and Lucipak (registered trademark) exhibited a darker color closer to purple than 0.001%.
  • An example of the procedure for detecting microorganisms by ATP measurement is shown. This is an overview of Example 1. The relative luminescence amount in adenine nucleotide measurement of each microorganism is shown. The relative luminescence amount in adenine nucleotide measurement of each microorganism when using an ATP scavenging reagent is shown. The luminescence amount of each microorganism (ATP+AMP measurement, Advantech Toyo filter) is shown. The luminescence amount of each microorganism (ATP+AMP measurement, GVS Filter Technology filter) is shown.
  • the luminescence amount (ATP+AMP measurement, Merck Millipore filter) of each microorganism is shown.
  • the luminescence amount of E.coli (ATP+ADP+AMP measurement, Advantech Toyo filter) is shown.
  • the luminescence amount of E.coli ATP+ADP+AMP measurement, GVS Filter Technology filter
  • the luminescence amount of E.coli (ATP+ADP+AMP measurement, Merck Millipore filter) is shown.
  • the invention provides methods of detecting microorganisms or cells.
  • This method is (i) removing the microorganisms or cells by contacting the surfactant-containing extractant with the solution which may contain the microorganisms or cells without contacting the surfactant adsorbent with the solution which may contain the microorganisms or cells;
  • the first step of extracting the adenine nucleotide component (ii) a second step of collecting a sample containing an adenine nucleotide component derived from microorganisms or cells after the extraction in step (i) using a sampling section containing a surfactant adsorbent; (iii) a third step of contacting the specimen collected by the sampling section with a luminescent reagent, or suspending the specimen collected by the sampling section in a solution and then contacting the solution in which the specimen was suspended with a luminescent reagent; (iv) It may include a fourth step of measuring the amount of light emission.
  • a second step is performed after the first step.
  • Adenine nucleotides can be ATP, ADP, or AMP.
  • adenine nucleotides, ATP, ADP, and AMP are sometimes referred to as microorganism-related substances or cell-related substances.
  • the surfactant adsorbent can include cotton, rayon, cellulose, or polyester. In certain embodiments, the surfactant adsorbent is selected from the group consisting of cotton, rayon, cellulose, polyester, and combinations thereof. In certain embodiments, the surfactant adsorbent is comprised of cotton, rayon, cellulose, or polyester. In certain embodiments, the surfactant adsorbent is a material that is capable of adsorbing surfactants and does not inhibit measurement of adenine nucleotides (eg, ATP, ADP, AMP).
  • adenine nucleotides eg, ATP, ADP, AMP
  • a surfactant When a surfactant is carried over into an ATP measurement reagent containing luciferase, it can inhibit the luciferin-luciferase reaction, such as inactivating luciferase.
  • adsorbing a surfactant means that the surfactant absorbs a surfactant to the extent that it substantially reduces luciferase inactivation or luciferin-luciferase reaction inhibition caused by the surfactant. It refers to the adsorption of agents.
  • a trace amount of adsorption for example, physical adsorption of a trace amount of surfactant on the surface of a normal container
  • a trace amount of adsorption for example, physical adsorption of a trace amount of surfactant on the surface of a normal container
  • a material that adsorbs only a trace amount of surfactant that does not substantially affect luciferase inactivation or luciferin-luciferase reaction inhibition by a surfactant does not fall under the surfactant adsorbent of the present disclosure ( (excluded from the surfactant adsorbents of this disclosure).
  • the sampling section containing the surfactant adsorbent can have any shape.
  • the sampling portion containing the surfactant adsorbent may be shaped like a thin rod, such as a cotton swab or a cotton ball, but the shape is not limited thereto.
  • the surfactant adsorbent can be placed at the end (tip) of the cotton swab.
  • the luminescent reagent may include luciferase and luciferin.
  • the extractant may include one or more of a surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride.
  • the method is a method of detecting microorganisms.
  • the extractant is a microbial extractant that extracts ATP from the microorganism, the adenine nucleotide is ATP, and step (iii) may include causing ATP to emit light with luciferase.
  • the method is a method of detecting cells.
  • the extractant is a microbial extractant that extracts ATP from cells, the adenine nucleotide is ATP, and step (iii) may include causing ATP to emit light with luciferase.
  • microorganisms and cells are sometimes collectively referred to as a specimen from which ATP and the like contained therein are extracted.
  • the specimen from which ATP and the like contained therein are extracted includes cells.
  • the specimen from which the contained ATP and the like are extracted by extraction contains microorganisms.
  • the terms microorganism and cell are not mutually exclusive. There may be specimens (measurement targets) that are both microorganisms and cells (unicellular microorganisms, etc.). When mutually exclusive terms must be used, the specimen from which the contained ATP etc. are removed by extraction includes microorganisms and non-microbial cells.
  • non-microbial cells include cells that are not derived from microorganisms, such as animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • microorganisms such as animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • fungi and fungi are referred to as microorganisms.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from AMP. In certain embodiments, the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP or AMP from ADP.
  • the method may further include a step (o) of filtering the solution to be tested using a filter and collecting microorganisms or cells on the filter before step (i).
  • Filters can be used, for example, to remove impurities or to concentrate microorganisms or cells. Unless otherwise specified, the filter collects microorganisms or cells on the filter and allows impurities to pass through to the filtrate side.
  • the filter has a pore size capable of trapping microorganisms or cells, such as a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m or more, such as 0.2 ⁇ m, 0.45 ⁇ m, 0.5 ⁇ m, 0.8 ⁇ m, 1 ⁇ m, etc. obtain.
  • a membrane filter unit or the like that can be attached to a syringe or the like for filtration can be used.
  • filter materials include, but are not limited to, cellulose mixed ester, cellulose acetate, polyethersulfone (PES), polyvinylidene fluoride (PVDF), hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE), PTFE, nitrocellulose, etc. .
  • the filter can be a filter comprising cellulose acetate.
  • the filter is a cellulose acetate filter.
  • the cellulose mixed ester membrane is known as a mixed cellulose ester membrane containing cellulose acetate and nitrocellulose.
  • cellulose acetate filter when referring to a "cellulose acetate filter”, this is meant to mean a filter made of cellulose acetate. Further, a filter made of a cellulose mixed ester membrane or a filter containing a cellulose mixed ester membrane does not fall under the "cellulose acetate filter” referred to in this specification.
  • the invention provides kits for performing the above methods.
  • the kit includes: (i) an extractant containing a surfactant; (ii) a sampling section containing a surfactant adsorbent; (iii) a luminescent reagent; and (iv) instructions for use.
  • the instructions for use may describe procedures for carrying out the method described above.
  • the kit may further include a luminescence measurement unit.
  • the kit may be used in combination with a luminescence measurement unit.
  • commercially available luminescence measurement devices such as Lumitester (registered trademark) C-110 and Lumitester (registered trademark) Smart can be used, but are not limited thereto.
  • the surfactant adsorbent may include cotton, rayon, cellulose, or polyester.
  • surfactant adsorbents included in the kit include cotton, rayon, cellulose, and polyester.
  • the surfactant adsorbent included in the kit is selected from the group consisting of cotton, rayon, cellulose, polyester, and combinations thereof.
  • the surfactant adsorbent included in the kit consists of cotton, rayon, cellulose, or polyester.
  • Luminescent reagents can also include luciferase and luciferin.
  • the extractant may be a surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride or n-tetradecyl-N,N-dimethyl. -3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • the kit is a kit for detecting microorganisms or cells
  • the extractant is a microbial extractant or cell extractant for extracting ATP from the microorganism or cells
  • the adenine nucleotide is ATP
  • step (iii) ) may include causing ATP to emit light with luciferase.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from AMP.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP or AMP from ADP.
  • the kit may further include a filter.
  • the filter can be a cellulose acetate-containing filter.
  • the filter may also be a cellulose acetate filter.
  • Extractants include surfactants. Additionally, extractants may include cell lysis reagents such as lysozyme (EC 3.2.1.17) and combinations thereof.
  • surfactants that can be used in the extractant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and zwitterionic surfactants, such as benzalkonium chloride. or n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate (Zwittergent(TM) 3-14, CAS 14933-09-6).
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, fatty acid sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers, such as Triton (registered trademark) X-100, Triton (registered trademark) X-45 , Tween(R) 20, Tween(R) 60, Tween(R) 80, Span(R) 60, Span(R) 80, and Thesit(R).
  • Triton (registered trademark) X-100 Triton (registered trademark) X-45
  • Tween(R) 20 Tween(R) 60, Tween(R) 80, Span(R) 60, Span(R) 80, and Thesit(R).
  • Cationic surfactants include quaternary ammonium salts, pyridinium salts, phosphonium salts, such as alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts, alkylbenzyldimethylammonium salts, alkylpyridinium salts, alkylphosphonium salts, imidazolium salts, alkylimidazo Examples include lium salt, isoquinonium salt, alkylisoquinonium salt, cetyltrimethylammonium or benzyldimethyldodecylammonium bromide, or benzalkonium chloride.
  • quaternary ammonium salts include decyltrimethylammonium chloride or bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or bromide, tetradecyltrimethylammonium chloride or bromide, hexadecyltrimethylammonium chloride or bromide, octadecyltrimethylammonium chloride or bromide, eicosyltrimethyl Mention may be made of ammonium chloride or bromide.
  • Examples of the pyridinium salt include 1-decylpyridinium chloride or bromide, 1-dodecylpyridinium chloride or bromide, 1-tetradecylpyridinium chloride or bromide, 1-hexadecylpyridinium chloride or bromide, N-cetyl-2-methylpyridinium chloride. , N-cetyl-3-methylpyridinium chloride, N-cetyl-4-methylpyridinium chloride, 1-octadecylpyridinium chloride or bromide, 1-eicosylpyridinium chloride or bromide.
  • Phosphonium salts include, for example, tetraethylphosphonium chloride or bromide, tributylmethylphosphonium chloride, bromide or iodide, tetrabutylphosphonium chloride or bromide, tetra-n-octylphosphonium chloride or bromide, tributyldodecylphosphonium chloride or bromide, tributylhexadecylphosphonium Mention may be made of chloride or bromide, methyltriphenylphosphonium chloride, bromide or iodide, tetraphenylphosphonium chloride or bromide.
  • Zwitterionic surfactants include sulfobetaine surfactants, such as sulfobetaine 3-10, alkyldimethylamine oxide, alkylcarboxybetaine, CHAPS, CHAPSO, Big Chap, Brij (registered trademark), Zwittergent (trademark) 3- 14 (3-(N,N-dimethylmyristyl ammonio)propanesulfonic acid) and the like, but are not limited thereto.
  • anionic surfactants include deoxycholate, linear alkylbenzene sulfonate, alkyl sulfate, alpha olefin sulfonate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, ⁇ -sulfo fatty acid ester salt, and alkali of natural fatty acid.
  • metal salts such as sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the surfactant contained in the extraction agent is the surfactant contained in the mixture of the analyte and luminescent reagent collected by the sampling portion when adsorbed by the surfactant adsorbent contained in the sampling portion.
  • the amount of adsorbent is reduced.
  • the reduction in the amount of surfactant adsorbent contained in the mixture of the sample collected by the sampling section and the luminescence reagent means that the amount of the surfactant adsorbent contained in the mixture of the specimen collected by the sampling section and the luminescence reagent is reduced.
  • the extractant can contain any amount of surfactant, as long as the surfactant is not adsorbed by the surfactant adsorbent contained in the sampling portion and the ATP measurement reaction by the luminescent reagent is not reduced as a result.
  • the surfactant contained in the extractant has a concentration in the measurement system of 0.0001% to 5% by weight, 0.001% to 3% by weight, 0.01% to 2% by weight, 0.1% to 1.5% by weight. It may be included in the extractant in an amount such as % by weight.
  • the luminescent reagent may also contain an enzyme stabilizer, such as bovine serum albumin or gelatin, which protects the reporter molecule, such as luciferase, from degradation.
  • the luminescent reagent may also contain substances that adjust pH or improve storage stability. For example, suitable pH buffers (HEPES, Tricine, Tris, phosphate buffer, acetate buffer, etc.), reducing agents (dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol, etc.), sugars (glucose, sucrose, trehalose, etc.) etc.
  • luminescent reagents include luciferase and luciferin.
  • metal ions such as magnesium, manganese, calcium, etc. may also be included.
  • Luciferase converts ATP, O 2 and luciferin into AMP, pyrophosphate, CO 2 and oxyluciferin, resulting in luminescence.
  • the luciferase may be a naturally occurring luciferase or a genetically engineered recombinant luciferase variant. Luciferase variants may be site-directed or random mutagenized. It may also be a fusion protein with a protein having other functions. Luciferase variants can have desired properties, such as those with improved heat resistance or surfactant resistance.
  • the amount of luminescence of luciferase can be measured using an appropriate luminometer, such as a luminometer (manufactured by Berthold, Lumat LB9510, Junior LB9509, Sirius 2 LB9526 or Centro LB963, Kikkoman Biochemifa, Lumitester (registered trademark) C-110, Evaluation can be performed using the relative luminescence amount (RLU) obtained using a Lumitester (registered trademark) Smart, etc.) as an index. Typically, the luminescence produced during the conversion of luciferin to oxyluciferin is measured.
  • a luminometer manufactured by Berthold, Lumat LB9510, Junior LB9509, Sirius 2 LB9526 or Centro LB963, Kikkoman Biochemifa, Lumitester (registered trademark) C-110
  • Evaluation can be performed using the relative luminescence amount (RLU) obtained using a Lumitester (registered trademark) Smart, etc.) as an index.
  • RLU
  • the luciferase is not particularly limited as long as it uses ATP as a substrate, but luciferases derived from bacteria, protozoa, animals, molluscs, and insects can be used.
  • insect-derived luciferases include beetle luciferases, such as those of the genus Photinus, such as the North American firefly (Photinus pyralis), the genus Photuris, such as Photuris lucicrescens, Photuris pennsylvanica, and the genus Luciola, such as Luciola cruciata.
  • luciferase genes have been reported, and their nucleotide sequences and amino acid sequences can be obtained from known databases such as GeneBank.
  • the luciferase gene may be wild type or may have a mutation. Mutations may be site-specifically introduced or may be random mutations. Known mutations include mutations that improve the luminescence amount as described in JP-A No. 2011-188787, mutations that increase the persistence of luminescence as described in JP-A No. 2000-197484, and Japanese Patent No. 2666561. Mutations that change the emission wavelength as described in Publications or Special Publication No. 2003-512071, mutations that increase surfactant resistance as described in JP-A No. 11-239493, and International Publication No. 99/02697 Pamphlets, mutations that increase substrate affinity as described in Japanese Patent Publication No. 10-512750 or Japanese Patent Application Publication No. 2001-518799, Japanese Patent No.
  • Japanese Patent Application Laid-open No. 2000-197487 Japanese Patent Publication No. 1999-9- Examples include, but are not limited to, mutations that increase stability as described in Japanese Patent Publication No. 510610 and Japanese Patent Application Publication No. 2003-518912.
  • the luciferase gene and its recombinant DNA can be prepared by conventional methods.
  • Japanese Patent Publication No. 7-112434 describes the Heike firefly luciferase gene.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-51086 describes the Genji firefly luciferase gene.
  • the luciferase gene can be incorporated into a vector such as a plasmid, bacteriophage, or cosmid, and used to transform or transduce a suitable host.
  • the host can be a microorganism, bacteria such as E. coli, yeast, and the like.
  • a transformed host capable of producing luciferase can be cultured by various known methods.
  • the medium may include one or more nitrogen sources such as tryptone, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, or soybean or wheat bran infusion, plus sodium chloride, monopotassium phosphate, dibasic potassium phosphate, chloride.
  • nitrogen sources such as tryptone, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, or soybean or wheat bran infusion
  • sodium chloride monopotassium phosphate, dibasic potassium phosphate, chloride.
  • examples include those to which one or more inorganic salts such as magnesium, ferric chloride, magnesium sulfate, or manganese sulfate are added, and if necessary, carbohydrate raw materials, vitamins, etc. are added.
  • the initial pH of the medium can be, for example, 7 to 9.
  • Cultivation can be carried out, for example, at 30 to 40°C for 2 to 24 hours by aeration stirring culture, shaking culture, static culture, or the like. After culturing, luciferase is recovered from the culture using a known method.
  • the bacterial cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, trituration treatment, etc. using conventional methods, or luciferase is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme.
  • the obtained extract is filtered, centrifuged, etc., and if necessary, nucleic acids are removed using streptomycin sulfate, etc., and ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto for fractionation to obtain the crude enzyme.
  • the crude enzyme may be further purified by various gel filtration or chromatography techniques.
  • Commercially available luciferases can also be used, for example, luciferase from Kikkoman Biochemifa, catalog number 61314. This luciferase is described in JP-A-11-239493 (Patent No. 3749628), and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • commercially available luciferase from Sigma-Aldrich, Promega, and Life Technologies, available as Molecular Probes (registered trademark) can also be used.
  • Luciferin may be of any type as long as it is recognized as a substrate by the luciferase used, and may be natural or chemically synthesized. Moreover, any known luciferin derivatives can also be used. The basic skeleton of luciferin is imidazopyrazinone, and there are many tautomers. Luciferins include, but are not limited to, firefly luciferin, bacterial luciferin, vargulin, dinoflagellate luciferin, and coelenterazine. Firefly luciferin is a substrate for firefly luciferase (EC 1.13.12.7).
  • Bacterial luciferin is found in bacteria and fish and consists of a long-chain aldehyde and the reduced form of riboflavin phosphate.
  • Vargulin is an imidazolopyrazine derivative found in midshipman fish and ostracods.
  • Dinoflagellate luciferin is a chlorophyll derivative.
  • Coelenterazine is found in radiolarians, ctenophores, cnidarians, squids, trichognaths, radiopods, shrimp, fish, etc.
  • Another example is (E)-2-methyl-4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohex-1-yli)-1-buten-1-olgiferin from Latia neritoides. Examples include acids.
  • the luciferin derivatives may be those described in JP-A No. 2007-91695, Japanese Patent Application Publication No. 2010-523149 (International Publication No. 2008/127677), and the like.
  • the final concentration of luciferase in the measurement system is 0.001 ⁇ g protein/mL or more, 0.01 ⁇ g protein/mL or more, 0.02 ⁇ g protein/mL or more, when absorbance at 280 nm is taken as luciferase concentration (mg protein/mL).
  • 0.05 ⁇ g protein/mL or more 0.10 ⁇ g protein/mL or more, 0.20 ⁇ g protein/mL or more, 0.25 ⁇ g protein/mL or more, 0.5 ⁇ g protein/mL or more, 0.75 ⁇ g protein/mL or more, 1 ⁇ g protein/mL or more, 5 ⁇ g protein /mL or more, 10 ⁇ g protein/mL or more, 20 ⁇ g protein/mL or more, 30 ⁇ g protein/mL or more, 40 ⁇ g protein/mL or more, 50 ⁇ g protein/mL or more, 60 ⁇ g protein/mL or more, 70 ⁇ g protein/mL or more, 80 ⁇ g protein/mL 90 ⁇ g protein/mL or more, 100 ⁇ g protein/mL or more, 110 ⁇ g protein/mL or more, 120 ⁇ g protein/mL or more, 130 ⁇ g protein/mL or more, 140 ⁇ g protein/mL or more, for example, 150 ⁇ g protein/mL or more.
  • the final concentration of luciferase in the measurement system is 200 ⁇ g protein/mL or less, 150 ⁇ g protein/mL or less, 140 ⁇ g protein/mL or less, or 130 ⁇ g protein/mL, where the absorbance at 280 nm is taken as the luciferase concentration (mg protein/mL).
  • mL or less 120 ⁇ g protein/mL or less, 110 ⁇ g protein/mL or less, 100 ⁇ g protein/mL or less, 90 ⁇ g protein/mL or less, 80 ⁇ g protein/mL or less, 70 ⁇ g protein/mL or less, 60 ⁇ g protein/mL or less, 50 ⁇ g protein/mL or less , 40 ⁇ g protein/mL or less, 30 ⁇ g protein/mL or less, 20 ⁇ g protein/mL or less, 10 ⁇ g protein/mL or less, 5 ⁇ g protein/mL or less, 1 ⁇ g protein/mL or less, 0.5 ⁇ g protein/mL or less, 0.3 ⁇ g protein/mL or less It can be done.
  • the final concentration of luciferin or a luciferin derivative in the measurement system is 0.01mM to 20mM, 0.02mM to 20mM, 0.03mM to 20mM, 0.04mM to 20mM, 0.05mM to 20mM, 0.1mM to 20mM, 0.5mM to 10mM, For example, it can be 0.75mM to 5mM.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from AMP. This makes it possible to measure not only ATP but also AMP as adenine nucleotides present in the system.
  • Enzymes that generate ATP from AMP include, but are not limited to, pyruvate-phosphate dikinase (PPDK) and pyruvate water dikinase (PWDK).
  • PPDK pyruvate-phosphate dikinase
  • PWDK pyruvate water dikinase
  • PPDK can be used with phosphoenolpyruvate (PEP) and phosphoric acid.
  • PWDK can be used with PEP and water.
  • multiple enzymes may be combined.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from ADP. This makes it possible to measure not only ATP but also ADP as adenine nucleotides present in the system.
  • Enzymes that generate ATP from ADP include pyruvate kinase (PK), creatine kinase, acetate kinase, polyphosphate kinase, hexokinase, glucokinase, glycerol kinase, fructokinase, phosphofructokinase, riboflavin kinase, and fructose bisphosphatase. Examples include, but are not limited to.
  • the luminescent reagent can further include an enzyme that generates AMP from ADP.
  • an enzyme that generates AMP from ADP For example, AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates AMP from ADP and an enzyme that generates ATP from AMP with luciferase.
  • Enzymes that generate AMP from ADP include, but are not limited to, ADP-dependent hexokinase and apyrase.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ADP from AMP.
  • an enzyme that generates ADP from AMP For example, AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates ADP from AMP and an enzyme that generates ATP from ADP with luciferase.
  • Examples of enzymes that generate ADP from AMP include, but are not limited to, ADP-dependent hexokinase. Note that ADP-dependent hexokinase normally generates AMP from ADP, but it can also catalyze the reverse reaction, and therefore, by appropriately adjusting the substrate concentration, it can be used as an enzyme that generates ADP from AMP.
  • the luminescent reagent can further include an enzyme that generates ADP from ATP and AMP.
  • AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates ADP from ATP and AMP with an enzyme that generates ATP from ADP.
  • Enzymes that generate ADP from ATP and AMP include, but are not limited to, adenylate kinase (AK).
  • Enzymes that generate ATP from AMP and enzymes that generate ATP from ADP are sometimes collectively referred to as enzymes that have ATP-generating ability. Any known enzyme can be used as the enzyme capable of producing ATP, including, but not limited to, a kinase capable of producing ATP.
  • Kinases with ATP generating ability include, for example, pyruvate kinase, pyruvate-phosphate dikinase, creatine kinase, acetate kinase, polyphosphate kinase, hexokinase, glucokinase, glycerol kinase, fructokinase, phosphofructokinase, and riboflavin kinase. , fructose bisphosphatase, and combinations thereof.
  • Pyruvate kinase (EC 2.7.1.40) converts phosphoenolpyruvate to pyruvate in glycolysis, during which ADP is converted to ATP. This reaction is an exergonic reaction with negative Gibbs energy and is irreversible under natural conditions. PEP + ADP ⁇ Pyruvate + ATP The reverse reaction is catalyzed by pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in gluconeogenesis, producing PEP and ADP from ATP and pyruvate. When cell extraction is performed, various enzymes are mixed in the system, and the above reaction can proceed in both directions.
  • ADP can be converted to ATP if phosphoenolpyruvate is present in high concentrations. Furthermore, if not only phosphoenolpyruvate but also pyruvate kinase is present in the system, it is thought that more ADP will be converted to ATP.
  • Creatine kinase (EC 2.7.3.2) mediates the conversion reaction between creatine and ATP and creatine phosphate and ADP. Creatine + ATP ⁇ ⁇ Creatine phosphate + ADP Creatine kinase (CK) is also called creatine phosphokinase (CPK) or phosphocreatine kinase. These terms can be used interchangeably herein. Normally, in animal muscles, creatine phosphate and ADP are generated from creatine and ATP. However, this reaction is reversible, and if high concentrations of creatine phosphate and ADP are present in the system, the reaction can proceed in the opposite direction, producing creatine and ATP.
  • cytoplasmic creatine kinase is composed of two subunits, B or M. Therefore, three types of isozymes, CK-MM, CK-BB, and CK-MB, can exist depending on the combination of subunits. Although isozyme patterns vary from tissue to tissue, any combination can be used in the present invention.
  • Pyruvate-phosphate dikinase (EC 2.7.9.1) mediates the reaction between ATP, pyruvate, and orthophosphate and adenosine monophosphate (AMP), phosphoenolpyruvate (PEP), and pyrophosphate (PPi). catalyze.
  • PPDK Pyruvate-phosphate dikinase
  • ATP pyruvate, phosphate phosphotransferase, pyruvate orthophosphate dikinase, and pyruvate phosphate ligase. These terms can be used interchangeably herein.
  • PPDK normally converts pyruvate to PEP, which consumes one molecule of ATP and converts it to AMP.
  • the reaction can be divided into the following three reversible reactions. 1.
  • the enzyme PPDK binds to ATP, converting it to AMP and producing diphosphorylated PPDK. 2.
  • Diphosphorylated PPDK binds to inorganic phosphate, producing diphosphate and monophosphorylated PPDK.
  • Monophosphorylated PPDK binds to pyruvate, generating PEP and regenerating PPDK. At this time, if the PEP concentration present in the system is high, the reaction proceeds in the opposite direction as shown below.
  • PEP binds to PPDK, producing monophosphorylated PPDK and pyruvate.
  • Diphosphorylated PPDK and inorganic phosphate are generated from diphosphate and monophosphorylated PPDK.
  • PPDK and ATP are generated from diphosphorylated PPDK and AMP.
  • Acetate kinase (EC 2.7.2.1) catalyzes the conversion between ATP and acetate and ADP and acetylated phosphate in the presence of cations.
  • ATP + acetic acid ⁇ ⁇ ADP + acetylated phosphate acetate kinase (AK) is also called ATP:acetate phosphotransferase or acetyl kinase.
  • ATP + acetic acid ⁇ ⁇ ADP + acetylated phosphate acetate kinase (AK) is also called ATP:acetate phosphotransferase or acetyl kinase. These terms can be used interchangeably herein.
  • ADP and acetylated phosphate are generated from ATP and acetic acid, and ultimately it promotes the reaction that produces acetyl-CoA. If acetylated phosphate and ADP generated from acetyl-CoA are present in
  • Polyphosphate kinase (EC 2.7.4.1) catalyzes the reaction that converts polyphosphate (PolyP n ) and ADP into polyphosphate (PolyP n-1 ) and ATP.
  • Polyphosphate kinase (PPK) is also called ATP:polyphosphate phosphotransferase. These terms can be used interchangeably herein.
  • PPK is involved in oxidative phosphorylation in vivo. If polyphosphate (n) and ADP are present in the system, this can be converted to polyphosphate (n-1) and ATP.
  • Riboflavin kinase (EC 2.7.1.26), also described as FMNK, catalyzes the reaction that converts riboflavin and ATP to riboflavin phosphate (FMN) and ADP.
  • FMNK riboflavin phosphate
  • ATP + riboflavin ⁇ ⁇ ADP + FMN Riboflavin kinase belongs to ATP:riboflavin 5'-phosphotransferase (also called flavokinase).
  • Phosphofructokinase 1 (EC 2.7.1.11), also described as PFK1, converts fructose-6-phosphate (Fru6P) and ATP to fructose-1,6-bisphosphate (Fru1,6-BP) and ADP. catalyze the reaction of Fru6P+ATP ⁇ Fru1,6-BP+ADP Phosphofructokinase 1 belongs to phosphofructokinase. In this specification, phosphofructokinase 1 may be referred to as Fru-1,6BPK.
  • Fructose bisphosphatase (EC 3.1.3.11), also described as FBPase, is responsible for the reaction that converts fructose-1,6-bisphosphate (Fru1,6-BP) and ADP into fructose-6-phosphate (Fru6P) and ATP. catalyze. Fru1,6-BP+ADP ⁇ Fru6P+ATP Fructose bisphosphatase is also sometimes described as FBP or FBP1.
  • any known enzyme can be used, such as those derived from microorganisms, bacteria, eukaryotes, protists, plants, animals, etc.
  • commercially available enzymes can be used. be able to.
  • the amount of the enzyme capable of producing ATP can be appropriately set depending on the desired concentration and reaction system.
  • the enzyme capable of producing ATP is added so that the activity unit in the measurement system is 0.001U or more, 0.01U or more, 0.1U or more, 1U or more, 2U or more, 3U or more, 4U or more, or 5U or more. be able to.
  • the enzyme capable of producing ATP can be added so that the activity unit in the measurement system is 1000 U or less, 100 U or less, 50 U or less, 10 U or less, 9 U or less, 8 U or less, 7 U or less, or 6 U or less. .
  • the sample to be measured is a solution that may contain cells, a medium that may contain cells or microorganisms, such as tap water, river water, treated river water, drinking water, drinking water, manufacturing water, bath water, hot spring water, and fountain water.
  • microorganisms include prokaryotes, bacteria, yeast, protists, and fungi.
  • cells include microbial cells, animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • microorganisms or cells By measuring adenine nucleotides such as ATP, ADP, and AMP in a sample, the presence or absence of microorganisms or cells can be determined qualitatively or quantitatively. This can be used for contamination of beverages and food products with microorganisms or cells, contamination of water with microorganisms or cells, quantification of propagated microorganisms, quantification of proliferated cells, sanitary monitoring, etc.
  • adenine nucleotides such as ATP, ADP, and AMP
  • Lucipak (registered trademark) II (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60375) is used for ATP measurement
  • Lucipak (registered trademark) Pen (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60331) is used for ATP+AMP measurement.
  • ATP+ Lucipak (registered trademark) A3 Surface (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60361) can be used for ADP+AMP measurement.
  • extraction reagents 0.01% benzalkonium chloride solution and 0.01% n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate solution may be used as extraction reagents.
  • Adenine nucleotides may be measured by a similar method with reference to the instructions for use of these commercially available kits.
  • Lumitester (registered trademark) C-110 (manufactured by Kikkoman Biochemifa) is used for ATP measurement
  • Lumitester (registered trademark) Smart (manufactured by Kikkoman Biochemifa) is used for ATP + AMP measurement and ATP + ADP + AMP measurement.
  • the amount of luminescence can be measured by adding 0.2 mL of a sample solution containing benzalkonium chloride at each concentration to 0.1 mL of the ATP measurement reagent, and then adding 0.01 mL of a 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M ATP solution.
  • the amount of luminescence can be measured using Lumitester (registered trademark) C-110 (manufactured by Kikkoman Biochemifa).
  • Luminescence can be described as a relative luminescence unit (RLU) based on a certain standard.
  • the method of the present disclosure may include the step of eliminating ATP, ADP, and/or AMP outside the microbial cell.
  • the kit of the present disclosure may include a reagent that eliminates ATP, ADP, and/or AMP outside the bacterial body. ATP, ADP, and/or AMP can be eliminated using known reagents or commercially available reagents.
  • a method for ATP decomposition when only ATP is measured, a method using apyrase is known (for example, see JP-A-11-89592).
  • apyrase is an enzyme that decomposes ATP into ADP and then AMP, it does not catalyze any further dephosphorylation reaction, and in ATP+AMP measurement and ATP+ADP+AMP, which includes an enzyme that generates ATP from AMP. does not function as a clearing reagent.
  • Known reagents include, but are not limited to, adenosine phosphate deaminase.
  • Non-Patent Document 1 uses a method using adenosine phosphate deaminase to erase adenine nucleotides, but it requires standing for 30 minutes to degrade ATP. Examples of commercially available reagents include, but are not limited to, Lucifer ATP elimination reagent (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60254).
  • the method of the present disclosure is characterized in that after extracting ATP, a sample containing an extractant and the like is brought into contact with an extractant adsorbent (surfactant adsorbent) such as a cotton swab.
  • an extractant adsorbent surfactant adsorbent
  • the kit of the present disclosure When measuring microorganisms in water, it is also known to use cotton swabs or sampling devices, but the conventional method is to first collect water with a cotton swab or sampling device, then soak it in an extractant, and then extract the microorganisms.
  • a common method is to extract ATP from water and add the extracted liquid to a luminescent reagent.
  • a cotton swab Since a cotton swab is used for the purpose of sampling water, it is used before the ATP extraction process, and the ATP extraction is performed after sampling. conduct. To the best of the inventors' knowledge, no method for measuring microorganisms has been reported in which extraction, for example ATP extraction, is performed first and then contact is made with a sampling device such as a cotton swab. Furthermore, no method for measuring microorganisms in which extraction is first performed and then contact with a surfactant adsorbent has been reported.
  • the extracted sample solution contains a considerable amount of surfactant, which may be carried over and cause adverse effects such as inhibition of luminescence of the luminescent reagent and deactivation of the luminescent enzyme. effect.
  • the present inventors were able to selectively adsorb the surfactant, with almost no decrease in the recovery rate of adenine nucleotides like ATP. It has been found that the amount of surfactant carried over into the mixed solution with the luminescent reagent can be reduced.
  • the extracted ATP could be measured using a luminescent reagent.
  • the finding that the cotton swab could selectively adsorb only the surfactant without affecting the ATP recovery rate was very surprising.
  • adsorption phenomenon can be seen in all kinds of substances; for example, ordinary container surfaces and ordinary filters can also physically adsorb small amounts of surfactants.
  • surfactants only a very small amount of surfactant is adsorbed on the surface of a normal container or by a normal filter, and it is difficult to suppress luciferase inactivation or inhibition of the luciferin-luciferase reaction by surfactants. impossible or difficult.
  • Such a small amount of adsorption does not correspond to "adsorbing a surfactant" as referred to in this specification.
  • step (i) of extracting the adenine nucleotide component in the microorganism or cell by contacting an extractant comprising a surfactant with a solution that may contain the microorganism or cell testing The solution may be filtered using a filter (also referred to as step (o)).
  • a filter for example, a cellulose acetate filter
  • the kit for detecting microorganisms or cells of the present disclosure is for detecting microorganisms or cells in a solution.
  • a filter refers to a filter for filtering liquid.
  • a member for filtering gas is referred to as an air filter in this specification.
  • a kit for detecting microorganisms or cells of the present disclosure does not have an air filter.
  • kits for detecting microorganisms or cells of the present disclosure exclude those having air filters.
  • kits of the invention may include an RNA degrading enzyme.
  • the methods of the invention may also use RNA degrading enzymes. Note that the RNA degrading enzyme used here means an RNA degrading enzyme that is not derived from the sample.
  • RNA degrading enzyme refers to an enzyme that catalyzes a reaction that produces 5'-mononucleotides (AMP, GMP, CMP, and UMP) from RNA, and includes, for example, the following: (1) Endonuclease S 1 (EC3.1.30.1), (2) Venom exonuclease (EC3.1.15.1), (3) Phosphodiesterase One (Phospho diesterase 1) (EC3.1.4.1). Note that the above-mentioned endonuclease S-1 includes Nuclease P 1 , Mung beans nuclease, and Neurospora crassa nuclease.
  • the kit of the invention does not contain RNAse, or does not contain a substantial amount of RNAse.
  • the methods of the invention do not use RNAse, or do not use a substantial amount of RNAse.
  • an RNA degrading enzyme derived from the sample may be included in the reaction system.
  • "a substantial amount of RNA degrading enzyme” refers to the effect of the kit or method of the present invention (for example, the effect of providing an accurate contamination detection method that is less susceptible to ATP degrading activity). It means an amount of RNA degrading enzyme that has no effect.
  • RNA degrading enzyme examples include, for example, the final concentration in the reaction system: 0.3 U/ml or less, 0.15 U/ml or less, 0.1 U/ml or less, 0.05 U/ml or less, 0.01 U/ml Examples include a kit containing RNA decomposing enzyme in an amount of 0.001 U/ml or less, or a method using such an amount of RNA degrading enzyme.
  • the enzyme unit of RNA degrading enzyme refers to the enzyme unit of RNA degrading enzyme, focusing on the RNA degrading ability of the enzyme. Defined as the amount of enzyme converted into nucleotides.
  • the enzymatic unit of Nuclease P 1 is defined as the amount of enzyme that converts 1.0 ⁇ mol of substrate into acid-soluble nucleotides per minute at 37°C and pH 5.3 (the enzymatic activity of Nuclease P 1 is For details of the definition, please refer to the Merck catalog (http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/nuclease_p1.pdf).
  • Example 1 Benzalkonium chloride or n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate (manufactured by Merck Millipore) as a surfactant was added to sterile ultrapure water at concentrations of 0, 0.01, and 0.1%. was prepared and subjected to the following tests.
  • benzalkonium chloride benzalkonium chloride solution Osban disinfectant solution 10% (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was used. After adding 0.1 mL of each concentration of surfactant to a cotton ball, the mixture was centrifuged at 5000 rpm for 1 minute to collect the surfactant solution from the cotton ball.
  • Figure 1 shows the relative luminescence amount of benzalkonium chloride at each concentration when the luminescence amount of sterile ultrapure water containing no surfactant is taken as 100%.
  • Figure 2 shows the relative luminescence amount of 3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • both the cationic surfactant benzalkonium chloride and the zwitterionic surfactant n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate Accordingly, the amount of luminescence decreased significantly, but it was shown that this decrease was suppressed when the solution was brought into contact with the cotton ball. This is thought to be because the surfactant is adsorbed to the cotton ball, thereby suppressing the inhibition of luminescence of luciferase by the surfactant.
  • FIG. 3 shows the change over time in the amount of luminescence in n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • the luminescence level is only slightly attenuated due to consumption of ATP, but 0.01% n-tetradecyl-N
  • the amount of luminescence is greatly attenuated when it is not brought into contact with cotton balls.
  • Adenine nucleotides in microorganisms collected on a filter are extracted with an extraction reagent containing a surfactant, and then, rather than reacting directly with a luminescent reagent, the adenine nucleotides in the microorganisms collected on the filter are brought into contact with a surfactant adsorbent such as a cotton ball. It has been shown that it is possible to measure adenine nucleotides in microorganisms with high sensitivity by suppressing the introduction of the activator into the luminescence reagent and by performing luminescence measurements while suppressing the effects of inhibition and deactivation.
  • Example 2 The surfactant benzalkonium chloride or n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate (Zwittergent(TM) 3-14, manufactured by Merck Millipore) was sterilized to a concentration of 0.01%. It was prepared with ultrapure water and subjected to the following tests. As benzalkonium chloride, benzalkonium chloride solution Osban disinfectant solution 10% (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was used.
  • cotton swabs material: cotton
  • Lucipak registered trademark
  • A3 Surface manufactured by Kikkoman Biochemifa Co., Ltd., product number: 60361
  • industrial cotton swabs P1502E manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.
  • Uses industrial cotton swab SSP manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.
  • Mentip registered trademark
  • polyester swab sterilized
  • 1PW1505P manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.
  • Figure 4 shows the luminescence inhibition suppressing effect of benzalkonium chloride using each cotton swab, when the luminescence amount of sterile ultrapure water containing no surfactant is taken as 100%.
  • FIG. 5 shows the luminescence inhibition suppressing effect when ammonio-1-propanesulfonate is used.
  • Example 3 In order to check whether benzalkonium chloride, the main component of the extractant, is adsorbed, a cationic surfactant measurement reagent called "Pack Test Cationic Surfactant (manufactured by Kyoritsu Rikagaku Kenkyusho Co., Ltd.)" was used to test with a cotton swab. The amount of cationic surfactant in the solution after contact was measured.
  • Pack Test Cationic Surfactant manufactured by Kyoritsu Rikagaku Kenkyusho Co., Ltd.
  • Lucipak (registered trademark) A3 Surface cotton swab and industrial cotton swab S-S-P were used as cotton swabs. After each cotton swab was made to absorb 0.1 mL of 0.01% benzalkonium chloride solution, it was centrifuged at 5000 rpm for 1 minute to collect the surfactant solution from the cotton swab. This surfactant solution was diluted twice with sterile ultrapure water, 1 mL of the diluted solution was taken out and added to a pack test tube, and the reagent in the tube was dissolved by pipetting.
  • FIG. 6 shows the solution that was brought into contact with each of the cotton swabs mentioned above and a comparative solution containing benzalkonium chloride at various concentrations.
  • the five solutions from the left shown in Figure 6 are benzalkonium chloride solutions with different concentrations for comparison; 0.01% and 0.005% show blue, 0% shows reddish-purple color, and 0.0001 and 0.00005% show an intermediate color. It became a color tone.
  • Lucipak registered trademark
  • A3 Surface cotton swab and industrial cotton swab S-S-P the color tone corresponds to the benzalkonium chloride concentration between 0.005% and 0.001%. It was confirmed that the concentration of the surfactant, which was 0.01% before contact with the cotton swab, was significantly reduced by contacting with the cotton swab.
  • Example 4 tests were conducted on various microorganisms. Specifically, Cronobacter sakazakii IAM12660, Klebsiella pneumoniae NBRC14940, Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Pseudomonas fluorescence NISL420, Sphingomonas parapaucimobilis, Bacillus subtilis AT CC9372, Bacillus cereus NBRC3836, and 2.5 mL of trypto soy broth medium (Sakae (manufactured by Kenkagaku Co., Ltd.) and cultured overnight at 30°C and shaking at 160 rpm.
  • trypto soy broth medium Sakae (manufactured by Kenkagaku Co., Ltd.
  • Lucifer ATP elimination reagent manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60254
  • a culture diluted solution 10 mL
  • the mixture was left to stand for 30 minutes and filtered in the same manner.
  • adenine nucleotides By sucking 0.24mL of extraction reagent (0.01% benzalkonium chloride) measured into a container in advance through the filter that has collected microorganisms and discharging it into the container, adenine nucleotides (ATP) are extracted from the microorganisms collected on the filter. , AMP, ADP) were extracted. Regarding adenine nucleotides in the collected extract, ATP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) II (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60375), and ATP+AMP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) Pen (Kikkoman Biochemifa, Inc., product number: 60375).
  • ATP+ADP+AMP was measured using Lucipak (registered trademark) A3 Surface (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60361). Add 0.1 mL to the cotton swab of each test reagent, use Lumitester (registered trademark) C-110 (manufactured by Kikkoman Biochemifa) for ATP measurement, Lumitester (registered trademark) for ATP+AMP measurement, and Lumitester (registered trademark) for ATP+ADP+AMP measurement. )Smart (manufactured by Kikkoman Biochemifa) to measure the amount of luminescence.
  • ATP+ADP (ATP+ADP+AMP amount) + (ATP+AMP amount) + ATP amount
  • FIG. 7 shows an overview of this embodiment.
  • the luminescence amount (corrected value) when using the ATP+ADP+AMP measurement reagent is set as 100%, and the relative luminescence amount of each microorganism is shown in Figure 8, and the relative luminescence amount when using the ATP elimination reagent is shown in Figure 9. .
  • the ratio of the amount of ATP contained in the microorganisms in the water was very low, and the ratio of the amount of ATP+AMP was also a low value. This result was an unexpected and surprising value from the result in Non-Patent Document 1 that in a sugar-free solution, 79.8 to 89.0% was ATP+AMP.
  • Klebsiella pneumoniae NBRC14940 Saccharomyces cerevisiae NISL3399, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Micrococcus luteus IFO3333, Bacillus cereus NBRC3836, Cronobacter sakazakii IAM12660, Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC6538 into 2.5 mL of trypto soy broth medium (manufactured by Eiken Kagaku Co., Ltd.). , cultured overnight at 30°C and 160 rpm with shaking.
  • Each microbial culture solution was diluted with sterile ultrapure water to prepare microbial dilutions in 10-fold increments.
  • 10 mL of each microbial culture solution was diluted 100 times with sterile ultrapure water, and the entire amount was filtered using a 10 mL syringe (manufactured by Terumo Corporation) equipped with various syringe filters to collect microorganisms.
  • a 10 mL syringe manufactured by Terumo Corporation
  • various filters manufactured by Advantech Toyo, GVS Filter Technology, and Merck Millipore were used. All pores used had a diameter of 0.45 ⁇ m.
  • adenine nucleotides ATP, AMP
  • the adenine nucleotide extract was sampled using a cotton swab of Lucipak (registered trademark) Pen (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60331), and the luminescence amount was measured using Lumitester (registered trademark) Smart (manufactured by Kikkoman Biochemifa, Inc.). It was measured.
  • FIG. 10 shows the luminescence amount of ATP+AMP measurement of each microorganism using the Advantech Toyo filter
  • Figure 11 shows the luminescence amount with the GVS filter
  • Figure 12 shows the luminescence amount with the Merck Millipore filter.
  • Figure 13 shows the luminescence amount of E.coli ATP+ADP+AMP measurement using Advantech Toyo's filter
  • Figure 14 shows the luminescence amount using GVS's filter
  • the luminescence amount with Membrane Solutions' filter The amount of light emitted by the Merck Millipore filter is shown in FIG. 15 and FIG. 16.
  • CA cellulose acetate
  • PES polyethersulfone
  • CA can extract the most adenine nucleotides (ATP, ADP, AMP) from the microorganisms captured on the membrane.
  • MCE cellulose mixed ester
  • CA cellulose acetate
  • microorganisms or cells can be detected by measuring adenine nucleotides.

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Abstract

簡便な微生物又は細胞を検出する方法及びキットを提供することを課題とする。　まず、界面活性剤を含む抽出剤により、微生物又は細胞を抽出し、その後、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部により検体を採取し、発光試薬により発光量を測定する工程を含む、微生物又は細胞の検出方法及びそのためのキットが提供される。

Description

微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット
　本発明は、微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキットに関する。
　アデノシン三リン酸（以下、ATPという）は、あらゆる生体内に見られるヌクレオチドであり、エネルギーを貯蔵したり、放出したりする基質として細胞に利用される。ATPを測定することで微生物や細胞を検出することができる。
　代表的なATP測定法としては、ルシフェラーゼの存在下でATPと基質ルシフェリンを反応させ、発光を測定する方法が知られている（非特許文献１）。この反応はルシフェラーゼにより触媒され、２価金属イオンの存在下で以下のように進行する。
[化]
ルシフェリン＋ATP＋O2→オキシルシフェリン＋アデノシン一リン酸（AMP）＋ピロリン酸（PPi）＋CO2＋光
　ルシフェラーゼは細菌、原生動物、軟体動物、昆虫などに見出される。ルシフェラーゼを有する昆虫としては甲虫、例えばホタルやコメツキムシが挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子は多数単離されており、その塩基配列も決定されている。
　従来の細胞由来ATP測定方法は、まずサンプリングを行う工程、及び、その後、サンプリングされた試料について抽出を行う工程を含む。サンプリングは、微生物（ひいては当該微生物に含まれるATP）を採取するための工程である。抽出工程は、当該採取されたサンプルに含まれる微生物内のATPを細胞外に放出させATPを測定することができるようにするための工程である。
　抽出工程では、通常、細胞の細胞壁を破壊するための界面活性剤が使用される。ところが、界面活性剤は、ルシフェラーゼを含むATP測定試薬に持ち越されると、ルシフェラーゼを失活させる等、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応を阻害する原因となる。この問題に対処するために界面活性剤耐性を有するルシフェラーゼの開発も行われているが（例えば特許文献１、特許文献２）、限界があった。また、この問題に対処するために、持ち越された界面活性剤を含む抽出された溶液を希釈する、希釈工程が用いられることがあった。
特表２００４－５２８０２４ 特開平１１－２３９４９３
Anal Biochem, 312 (2003) pp. 48-56
　本発明は、上記の問題を少なくとも部分的に解決する、微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキットを提供することを課題とする。
　上記の問題に鑑み、本発明者らは、ATP測定方法について鋭意検討した結果、第1工程として抽出工程を先に行い、次いで、第２工程として界面活性剤吸着剤と接触させることにより、驚くべきことに、抽出剤により微生物若しくは細胞からATPを抽出し、界面活性剤吸着剤と接触させた試料についてATPを検出し得ることを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成させた。
　すなわち本発明は以下の実施形態を含む。
[１]　以下の工程、
(i) 界面活性剤吸着剤と微生物又は細胞を含み得る溶液とを接触させることなく、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(ii)工程(i)の抽出を行った後の、微生物又は細胞由来のアデニンヌクレオチド成分を含む検体を、界面活性剤吸着剤と接触させる工程、
(iii)界面活性剤吸着剤と接触させた検体を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる、又は、界面活性剤吸着剤と接触させた検体を溶液に懸濁し次いで検体を懸濁した該溶液を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)発光量を測定する工程、
を含む、微生物又は細胞を検出する方法。
[２]　界面活性剤吸着剤が、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含む、実施形態１に記載の方法。
[３]　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの１以上を含む、実施形態２に記載の方法。
[４]　方法が微生物又は細胞を検出する方法であり、
　抽出剤が微生物又は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり、
　アデニンヌクレオチドがATPであり、
　工程(iii)が、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含む、
実施形態３に記載の方法。
[５]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素を含む、実施形態４に記載の方法。
[６]　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態４に記載の方法。
[７]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、及びADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態４に記載の方法。
[８]　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又はATP及びAMPからADPを生成する酵素、並びに、ADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態４に記載の方法。
[９]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、並びに、ADPからAMPを生成する酵素を含む、実施形態４に記載の方法。
[１０]　工程(i)の前に、検査する溶液を、フィルターを用いてろ過し、微生物又は細胞を含み得る溶液とする工程(o)をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
[１１]　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、実施形態１０に記載の方法。
[１２]　(i)界面活性剤を含む抽出剤、
　(ii)界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部、
　(iii) ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬、及び
　(iv)使用説明書
を含む、微生物又は細胞を検出するキットであって、
前記使用説明書は、
(A) 界面活性剤吸着剤と微生物又は細胞を含み得る溶液とを接触させることなく、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(B)工程(A)の抽出を行った後の、微生物又は細胞由来のアデニンヌクレオチド成分を含む検体を、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部により採取する工程、
(C)サンプリング部により採取した検体を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる工程、及び
(D)発光量を測定する工程、
により微生物又は細胞を検出することを記載したものである、前記キット。
[１３]　界面活性剤吸着剤が、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含む、実施形態１２に記載のキット。
[１４]　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの１以上を含む、実施形態１３に記載のキット。
[１５]　キットが、微生物又は細胞を検出するキットであり、
　抽出剤が微生物又は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり、
　アデニンヌクレオチドがATPであり、
　工程(C)が、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含む、
実施形態１２に記載のキット。
[１６]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素を含む、実施形態１５に記載のキット。
[１７]　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態１５に記載のキット。
[１８]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、及びADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態１５に記載のキット。
[１９]　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又はATP及びAMPからADPを生成する酵素、並びに、ADPからATPを生成する酵素を含む、実施形態１５に記載のキット。
[２０]　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、並びに、ADPからAMPを生成する酵素を含む、実施形態１５に記載のキット。
[２１]　フィルターをさらに含む、実施形態１２に記載のキット。
[２２]　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、実施形態２１に記載のキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-116858号の開示内容を包含する。
　本発明の効果として、微生物を簡便に検出することができる。
各濃度の塩化ベンザルコニウムにおける相対発光量を示す。 各濃度のn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにおける相対発光量を示す。 綿球ありの場合と、綿球なしの場合における、各濃度のn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにおける発光量の経時変化を示す。n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含まない（0%）溶液では発光量はATPの消費によりわずかに減衰するのみであるが、0.01% n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含む溶液では綿球と接触させない場合、発光量が大きく減衰した。これに対して、0.01% n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート存在下でも、綿球と接触させた場合、減衰が顕著に抑制された。なお、黒塗りの丸は、白抜の丸と重なる形で同じ位置にプロットされている。 各綿棒による塩化ベンザルコニウムの発光阻害抑制効果を示す。左から順に、ルシパック(登録商標)綿棒(A)、工業用綿棒P1502E(B)、工業用綿棒S-S-P(C)、及びメンティップ(登録商標)1PW1505P(D)を使用した。 各綿棒によるn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの発光阻害抑制効果を示す。左がルシパック(登録商標)綿棒(A)であり、右が工業用綿棒P1502E(B)である。 各綿棒に接触させた塩化ベンザルコニウム溶液での色調変化を示す。0.01％、0.005％では青色、0％では赤紫色を示し、0.0001、0.00005％ではその中間的な色調となった。また、S-S-P及びルシパック(登録商標)は0.001%よりも紫寄りの濃い色を示した。 ATP測定による微生物検出の手順の例を示す。実施例1の概要である。 各微生物のアデニンヌクレオチド測定における相対発光量を示す。 ATP消去試薬を用いた場合の各微生物のアデニンヌクレオチド測定における相対発光量を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、アドバンテック東洋社のフィルター）を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、GVS Filter Technology社のフィルター）を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、メルクミリポア社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、アドバンテック東洋社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、GVS Filter Technology社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、Membrane Solutions社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、メルクミリポア社のフィルター）を示す。
　ある実施形態において、本発明は微生物又は細胞を検出する方法を提供する。この方法は、
(i) 界面活性剤吸着剤と微生物又は細胞を含み得る溶液とを接触させることなく、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する第１工程、
(ii)工程(i)の抽出を行った後の、微生物又は細胞由来のアデニンヌクレオチド成分を含む検体を、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部により採取する第２工程、
(iii)サンプリング部により採取した検体を発光試薬と接触させる、又は、サンプリング部により採取した検体を溶液に懸濁し次いで検体を懸濁した該溶液を発光試薬と接触させる、第３工程、及び
(iv)発光量を測定する第４工程を含み得る。第１工程の後に第２工程を行う。アデニンヌクレオチドは、ATP、ADP、又はAMPであり得る。本明細書において、アデニンヌクレオチド、ATP、ADP、及びAMPのことを微生物関連物質、又は、細胞関連物質ということがある。
　ある実施形態において、界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含むものであり得る。ある実施形態において、界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、ポリエステル、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。ある実施形態において、界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルからなる。ある実施形態において、界面活性剤吸着剤は、界面活性剤を吸着することができ、かつ、アデニンヌクレオチド（例えばATP、ADP、AMP）の測定を阻害しない材料である。界面活性剤は、ルシフェラーゼを含むATP測定試薬に持ち越されると、ルシフェラーゼを失活させる等、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応を阻害し得る。本明細書において、（界面活性剤吸着剤が）「界面活性剤を吸着する」とは、界面活性剤によるルシフェラーゼ失活や、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応阻害を、実質的に低減する程度に、界面活性剤を吸着することをいう。したがって、界面活性剤によるルシフェラーゼ失活や、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応阻害に実質的に影響しない程度の微量の吸着（例えば通常の容器表面における微量の界面活性剤の物理吸着）は、本明細書にいう「界面活性剤を吸着する」に該当しないものとする。逆に言えば、界面活性剤によるルシフェラーゼ失活や、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応阻害に実質的に影響しない程度の微量の界面活性剤しか吸着しない材料は、本開示の界面活性剤吸着剤に該当しない（本開示の界面活性剤吸着剤から除かれる）。界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部は任意の形状とすることができる。ある実施形態において、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部は、細い棒状の形状、例えば綿棒のような形状又は綿球とし得るが、形状はこれに限らない。界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部を綿棒形状とする場合、界面活性剤吸着剤を、綿棒の端部（先端部）に配置することができる。
　ある実施形態において、発光試薬はルシフェラーゼ及びルシフェリンを含み得る。
　ある実施形態において、抽出剤は界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含み得る。
　ある実施形態において、方法は微生物を検出する方法である。この場合、抽出剤は微生物からATPを抽出する微生物用抽出剤であり、アデニンヌクレオチドはATPであり、工程(iii)は、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含み得る。別の実施形態において、方法は細胞を検出する方法である。この場合、抽出剤は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤であり、アデニンヌクレオチドはATPであり、工程(iii)は、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含み得る。
　微生物及び細胞を、本明細書において便宜上、まとめて、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体ということがある。ある実施形態において、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は細胞を含む。別の実施形態において、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は微生物を含む。微生物と細胞という用語は相互に排他的ではない。微生物でもあり細胞でもある検体（測定対象）は存在しうる（単細胞微生物等）。相互に排他的な用語を使用しなければならない場合には、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は、微生物、及び、非微生物細胞を含む。非微生物細胞としては、細胞であるが微生物由来ではない細胞、例えば動物細胞、動物由来細胞、植物細胞、植物由来細胞、昆虫細胞、昆虫由来細胞等が挙げられる。本明細書では便宜上、真菌及び菌類は微生物とする。
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、AMPからATPを生成する酵素を含み得る。ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからATP又はAMPを生成する酵素を含み得る。
　ある実施形態において、方法は、工程(i)の前に、検査する溶液を、フィルターを用いてろ過し、微生物又は細胞をフィルター上に捕集する工程(o)をさらに含み得る。フィルターは、例えば不純物を除去するために、又は、微生物又は細胞を濃縮するために使用され得る。フィルターは、特に断らない限り、フィルター上に微生物又は細胞を捕集し、不純物を濾液側に透過させるものである。ある実施形態において、フィルターとしては、微生物又は細胞を捕集できる孔径のものを使用し、例えば0.2μm以上、例えば0.2μm、0.45μm、0.5μm、0.8μm、1μmなどの孔径のフィルターを使用し得る。例えばシリンジ等に取り付けてろ過することができるメンブレンフィルターユニット等を使用することができる。フィルターの材質としては、セルロース混合エステル、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ、ニトロセルロース等が挙げられるがこれに限らない。ある実施形態において、フィルターは、酢酸セルロースを含むフィルターであり得る。ある実施形態において、フィルターは、酢酸セルロースフィルターである。なお、セルロース混合エステル膜は、酢酸セルロースとニトロセルロースとを含む混合されたセルロースエステル膜として知られている。しかしながら、本明細書において「酢酸セルロースフィルター」というとき、これは酢酸セルロースからなるフィルターを意味するものとする。また、セルロース混合エステル膜からなるフィルターや、セルロース混合エステル膜を含むフィルターは、本明細書にいう「酢酸セルロースフィルター」に該当しないものとする。
　フィルター上に捕集された微生物又は細胞に抽出剤を適用するには、例えばフィルターろ過に用いたシリンジにフィルターを接続したまま、抽出剤をシリンジで吸い上げ、抽出を行い、次いで、吸い上げた溶液をシリンジから出すことができる。例えば図７を参照のこと。
　ある実施形態において、本発明は、上記の方法を行うためにキットを提供する。ある実施形態において、キットは、
　(i)界面活性剤を含む抽出剤、
　(ii)界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部、
　(iii)発光試薬、及び
　(iv)使用説明書
を含み得る。前記使用説明書は、上記の方法を行う手順を記載したものであり得る。特定の実施形態において、キットはさらに発光量測定部を含み得る。別の実施形態では、キットを、発光量測定部と組み合わせて使用し得る。発光量測定部としては、ルミテスター(登録商標)C-110、ルミテスター(登録商標)Smartなど市販の発光測定装置を使用し得るがこれに限らない。
　キットに関し、界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含み得る。ある実施形態において、キットに含まれる界面活性剤吸着剤としては、綿、レーヨン、セルロース、及びポリエステルが挙げられる。ある実施形態において、キットに含まれる界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、ポリエステル及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。ある実施形態において、キットに含まれる界面活性剤吸着剤は、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルからなる。また、発光試薬はルシフェラーゼ及びルシフェリンを含み得る。また、抽出剤は界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの１以上を含み得る。
　ある実施形態において、キットは微生物又は細胞を検出するキットであり、抽出剤が微生物又は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり、アデニンヌクレオチドがATPであり、工程(iii)が、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含み得る。キットに関し、発光試薬はさらに、AMPからATPを生成する酵素を含み得る。また、キットに関し、発光試薬はさらに、ADPからATP又はAMPを生成する酵素を含み得る。また、キットはフィルターをさらに含み得る。フィルターは酢酸セルロースを含むフィルターであり得る。また、フィルターは酢酸セルロースフィルターであり得る。
抽出剤
　抽出剤は界面活性剤を含む。さらに、抽出剤は、リゾチーム（EC 3.2.1.17）などの細胞溶解試薬及びこれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態において、抽出剤に用いることのできる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両イオン性界面活性剤、例えば塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(Zwittergent(商標)3-14、CAS 14933-09-6)が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、例えばTriton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-45、Tween(登録商標)20、Tween(登録商標)60、Tween(登録商標)80、Span(登録商標)60、Span(登録商標)80、Thesit(商標)が挙げられるがこれに限らない。カチオン性界面活性剤としては第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、アルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、アルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、セチルトリメチルアンモニウム又はベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド、又は塩化ベンザルコニウムなどが挙げられる。第四級アンモニウム塩としては、例えば、デシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。ピリジニウム塩としては、例えば、１－デシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－ドデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－テトラデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－ヘキサデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、Ｎ－セチル－２－メチルピリジニウムクロリド、Ｎ－セチル－３－メチルピリジニウムクロリド、Ｎ－セチル－４－メチルピリジニウムクロリド、１－オクタデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－エイコシルピリジニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、ブロミド又はヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド又はブロミド、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド又はブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、ブロミド又はヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。両性イオン性界面活性剤としてはスルホベタイン系界面活性剤、例えばスルホベタイン3-10、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、CHAPS、CHAPSO、Big Chap、Brij(登録商標)、Zwittergent(商標) 3-14（3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホン酸）等が挙げられるがこれに限らない。アニオン性界面活性剤としては、デオキシコール酸塩、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられ、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）が挙げられる。
　ある実施形態において、抽出剤に含まれる界面活性剤は、サンプリング部に含まれる界面活性剤吸着剤により吸着された場合、サンプリング部により採取された検体と発光試薬の混合物中に含まれる界面活性剤吸着剤の量が低減される。ここで、サンプリング部により採取された検体と発光試薬の混合物中に含まれる界面活性剤吸着剤の量が低減されるとは、発光試薬に含まれるATP測定用酵素、例えばルシフェラーゼなどのレポーター分子等に悪影響を及ぼさない、実質的に悪影響を及ぼさない又はそれらの活性を有意に低減させない、又はルシフェラーゼなどのレポーター分子等に対する影響を軽減する程度にサンプリング部により採取された検体と発光試薬の混合物中に含まれる界面活性剤吸着剤の量が低減されることをいう。ここで実質的に悪影響を及ぼさない又はそれらの活性を有意に低減させない、又は影響を軽減するとは、影響がないか又はあったとしても全体としてのATP測定ができることをいう。すなわち抽出剤は、サンプリング部に含まれる界面活性剤吸着剤により界面活性剤が吸着され、結果的に発光試薬によるATP測定反応が低減されなければ、任意の量の界面活性剤を含み得る。例えば抽出剤に含まれる界面活性剤は、当該界面活性剤の測定系における濃度が0.0001重量％～5重量％、0.001重量％～3重量％、0.01重量％～2重量％、0.1重量％～1.5重量％等となる量にて抽出剤に含まれ得る。
　発光試薬はまた、ルシフェラーゼ等のレポーター分子を分解から保護するウシ血清アルブミン又はゼラチンのような酵素安定化剤を含み得る。発光試薬はまた、pH調整や保存性を向上させる物質を添加してもよい。例えば適当なpH緩衝剤（HEPES、Tricine、Tris、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、還元剤（ジチオトレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール等）、糖（グルコース、スクロース、トレハロース等）等が挙げられる。
発光試薬
　ある実施形態において、発光試薬は、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンも含まれ得る。ルシフェラーゼによりATP、O2及びルシフェリンはAMP、ピロリン酸、CO2及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。ルシフェラーゼは、天然ルシフェラーゼでもよく、遺伝子工学的に操作された組換えルシフェラーゼ変異体であってもよい。ルシフェラーゼ変異体は、部位特異的突然変異導入又はランダム突然変異導入されたものであってもよい。他の機能を有するタンパク質との融合タンパク質でもよい。ルシフェラーゼ変異体は、耐熱性が向上したもの、界面活性剤耐性が向上したもの等、所望の性質を有するものであり得る。
　ルシフェラーゼの発光量は、適当な発光測定装置、例えば、ルミノメーター（ベルトールド社製、Lumat LB9510、Junior LB9509、Sirius 2 LB9526或いはCentro LB963、キッコーマンバイオケミファ社製、ルミテスター(登録商標)C-110、ルミテスター(登録商標)Smart等）を用いて得られる相対発光量（RLU）を指標に評価することができる。通常、ルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換の際に生じる発光を測定する。
　ルシフェラーゼは、ATPを基質とするものであれば、特に限定されないが細菌、原生動物、動物、軟体動物、昆虫由来のものを用いることができる。昆虫由来としては甲虫ルシフェラーゼが挙げられ、例えばフォーチヌス（Photinus）属、例えば北米ボタル(Photinus pyralis)、フォーツリス（Photuris）属、例えばPhoturis lucicrescens、Photuris pennsylvanica、ルシオラ（Luciola）属、例えばゲンジボタル（Luciola cruciata）、ヘイケボタル(Luciola lateralis)、ヒメボタル(Luciola parvula)、マドボタル(Pyrocoelia属)、オバボタル(Lucidina biplagiata)のホタルやピロフォールス（Pyrophorus）属のコメツキムシ由来のものが挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子は多数報告されており、GeneBankなどの公知のデータベースよりその塩基配列及びアミノ酸配列を取得することができる。
　ルシフェラーゼ遺伝子は、野生型のものでもよく、変異を有するものでもよい。変異は、部位特異的に導入されたものでもよく、ランダム変異でもよい。公知の変異としては、特開２０１１－１８８７８７号公報に記載されるような発光量を向上させる変異、特開２０００－１９７４８４号公報に記載されるような発光持続性を高める変異、特許第２６６６５６１号公報又は特表２００３－５１２０７１号公報に記載されるような発光波長を変化させる変異、特開平１１－２３９４９３号公報に記載されるような界面活性剤耐性を高める変異、国際公開第９９／０２６９７号パンフレット、特表平１０－５１２７５０号公報又は特表２００１－５１８７９９号公報に記載されるような基質親和性を高める変異、特許第３０４８４６６号公報、特開２０００－１９７４８７号公報、特表平９－５１０６１０号公報及び特表２００３－５１８９１２号公報に記載されるような、安定性を高める変異等が挙げられるがこれに限らない。
　ルシフェラーゼ遺伝子及びその組換え体DNAは慣用法により調製できる。例えば、特公平７－１１２４３４号公報はヘイケボタルルシフェラーゼ遺伝子を記載している。また特開平１－５１０８６号公報はゲンジボタルルシフェラーゼ遺伝子を記載している。
　ルシフェラーゼ遺伝子は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド等のベクターに組み入れ、これで適当な宿主を形質転換する又は形質導入することができる。宿主は微生物、大腸菌等の細菌、酵母等であり得る。形質転換されルシフェラーゼ産生能を有する宿主は各種公知の方法で培養することができる。
　培地としては、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、或いはダイズ若しくは小麦ふすまの浸出液等の１以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸マグネシウム、若しくは硫酸マンガン等の無機塩類を１種以上添加し、必要により糖質原料、ビタミン等を添加したものが挙げられる。
　培地の初期pHは例えば７～９とすることができる。培養は例えば30～40℃で2～24時間、通気撹拌培養、振とう培養、静置培養等により行うことができる。培養後、公知の手法により培養物からルシフェラーゼを回収する。
　具体的には、慣用法により菌体を超音波破砕処理、磨砕処理等に供するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いてルシフェラーゼを抽出する。得られた抽出液を濾過、遠心分離等し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩等により核酸を除去し、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトン等を加えて分画し、粗酵素を得ることができる。
　粗酵素はさらに各種のゲルろ過やクロマトグラフィー手法により精製してもよい。市販されているルシフェラーゼを用いることもでき、例えばキッコーマンバイオケミファ社、カタログ番号61314のルシフェラーゼを使用し得る。このルシフェラーゼは特開平１１－２３９４９３号公報（特許第３７４９６２８号）に記載されているものであり、そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また市販されているシグマ・アルドリッチ社、プロメガ社、ライフテクノロジー社のモレキュラープローブ(登録商標)のルシフェラーゼを用いることもできる。
　ルシフェリンは、用いるルシフェラーゼにより基質として認識されるものであればどのようなものでもよく、天然のもの又は化学合成されたものでもよい。また任意の公知のルシフェリン誘導体を用いることもできる。ルシフェリンの基本骨格はイミダゾピラジノンであり、多くの互変異性体がある。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、ヴァルグリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、セレンテラジンが挙げられるがこれに限らない。ホタルルシフェリンはホタルルシフェラーゼ(EC 1.13.12.7)の基質である。バクテリアルシフェリンは細菌や魚類に見出され、長鎖アルデヒドと還元型のリン酸リボフラビンからなる。ヴァルグリン(vargulin)はガマアンコウ(midshipman fish)や貝虫(ostracods)に見出されるイミダゾロピラジン誘導体である。渦鞭毛藻類ルシフェリンはクロロフィル誘導体である。セレンテラジンは放散虫、有櫛動物、刺胞動物、イカ、毛顎動物、橈脚類、エビ、魚等に見出される。他にはラティア・ネリトイデス（Latia neritoides）のラティアルシフェリンである(E)-2-メチル-4-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキシ-1-イリ)-1-ブテン-1-オールギ酸が挙げられる。ルシフェリン誘導体は特開２００７－９１６９５、特表２０１０－５２３１４９（国際公開２００８／１２７６７７号）等に記載されているものであり得る。
　ある実施形態においてルシフェラーゼの測定系における終濃度は、280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度（mg protein/mL）としたときに0.001μg protein/mL以上、0.01μg protein/mL以上、0.02μg protein/mL以上、0.05μg protein/mL以上、0.10μg protein/mL以上、0.20μg protein/mL以上、0.25μg protein/mL以上、0.5μg protein/mL以上、0.75μg protein/mL以上、1μg protein/mL以上、5μg protein/mL以上、10μg protein/mL以上、20μg protein/mL以上、30μg protein/mL以上、40μg protein/mL以上、50μg protein/mL以上、60μg protein/mL以上、70μg protein/mL以上、80μg protein/mL以上、90μg protein/mL以上、100μg protein/mL以上、110μg protein/mL以上、120μg protein/mL以上、130μg protein/mL以上、140μg protein/mL以上、例えば150μg protein/mL以上とすることができる。ある実施形態においてルシフェラーゼの測定系における終濃度は、280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度（mg protein/mL）としたときに200μg protein/mL以下、150μg protein/mL以下、140μg protein/mL以下、130μg protein/mL以下、120μg protein/mL以下、110μg protein/mL以下、100μg protein/mL以下、90μg protein/mL以下、80μg protein/mL以下、70μg protein/mL以下、60μg protein/mL以下、50μg protein/mL以下、40μg protein/mL以下、30μg protein/mL以下、20μg protein/mL以下、10μg protein/mL以下、5μg protein/mL以下、1μg protein/mL以下、0.5μg protein/mL以下、0.3μg protein/mL以下とすることができる。ある実施形態においてルシフェリン又はルシフェリン誘導体の測定系における終濃度は0.01mM～20mM、0.02mM～20mM、0.03mM～20mM、0.04mM～20mM、0.05mM～20mM、0.1mM～20mM、0.5mM～10mM、例えば0.75mM～5mMとすることができる。
AMPからATPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、AMPからATPを生成する酵素を含み得る。これにより、系に存在するアデニンヌクレオチドとして、ATPのみならず、AMPをも測定することができる。AMPからATPを生成する酵素としては、ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ（PPDK）、及びピルビン酸ウォータージキナーゼ（PWDK）等が挙げられるがこれに限らない。例えばPPDKはホスホエノールピルビン酸（PEP）およびリン酸と共に使用し得る。例えばPWDKはPEP及び水と共に使用し得る。別の実施形態では、複数の酵素を組み合わせてもよい。
ADPからATPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからATPを生成する酵素を含み得る。これにより、系に存在するアデニンヌクレオチドとして、ATPのみならず、ADPをも測定することができる。ADPからATPを生成する酵素としては、ピルビン酸キナーゼ(PK)、クレアチンキナーゼ、酢酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、フルクトースビスホスファターゼが挙げられるがこれに限らない。
ADPからAMPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからAMPを生成する酵素を含み得る。例えばADPからAMPを生成する酵素と、AMPからATPを生成する酵素をルシフェラーゼと組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。ADPからAMPを生成する酵素としては、ADP依存ヘキソキナーゼやアピラーゼなどが挙げられるがこれに限らない。
AMPからADPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、AMPからADPを生成する酵素を含み得る。例えばAMPからADPを生成する酵素と、ADPからATPを生成する酵素をルシフェラーゼと組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。AMPからADPを生成する酵素としては、例えばADP依存ヘキソキナーゼ等が挙げられるがこれに限らない。なお、ADP依存ヘキソキナーゼは通常、ADPからAMPを生成するが、逆反応も触媒することができ、したがって、基質濃度を適当に調節することにより、AMPからADPを生成する酵素として利用し得る。
ATP及びAMPからADPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含み得る。ATP及びAMPからADPを生成する酵素を、ADPからATPを生成する酵素と組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。ATP及びAMPからADPを生成する酵素としては、アデニル酸キナーゼ（AK）が挙げられるがこれに限らない。
　AMPからATPを生成する酵素及びADPからATPを生成する酵素を、まとめて、ATP生成能を有する酵素ということがある。ATP生成能を有する酵素としては、任意の公知のものを用いることができ、例えばATP生成能を有するキナーゼが挙げられるがこれに限らない。ATP生成能を有するキナーゼとしては、例えばピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ、クレアチンキナーゼ、酢酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、フルクトースビスホスファターゼ及びその組み合わせが挙げられるがこれに限らない。
　ピルビン酸キナーゼ（EC 2.7.1.40）は、解糖系においてホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変換し、その際、ADPがATPに変換される。この反応はギブスエネルギーが負の発エルゴン反応であり、天然の条件下では不可逆的である。
PEP＋ADP→ピルビン酸＋ATP
逆方向の反応は、糖新生において、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが触媒し、ATP及びピルビン酸からPEP及びADPを生じる。細胞抽出を行うと、系には種々の酵素が混在し、上記反応は両方向に進行し得る。その際、ホスホエノールピルビン酸が高濃度に存在するとADPがATPに変換され得る。また、ホスホエノールピルビン酸のみならずピルビン酸キナーゼが系に存在すれば、よりADPがATPに変換されると考えられる。
　クレアチンキナーゼ(EC 2.7.3.2)は、クレアチン及びATPと、クレアチンリン酸及びADPとの間の変換反応を媒介する。
クレアチン＋ATP←→クレアチンリン酸＋ADP
クレアチンキナーゼ（CK）は別名をクレアチンホスホキナーゼ（CPK）又はホスホクレアチンキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。通常、動物の筋肉などではクレアチン及びATPからクレアチンリン酸及びADPを生じる。しかしながらこの反応は可逆反応であり、系にクレアチンリン酸及びADPが高濃度で存在すると、反応は逆方向に進行し、クレアチン及びATPが生じ得る。生体内では細胞質性クレアチンキナーゼは２つのサブユニットB又はMから構成される。したがってサブユニットの組み合わせにより３種のアイソザイム、CK-MM、CK-BB及びCK-MBが存在し得る。アイソザイムパターンは組織によって異なるが、本発明ではどのような組み合わせも使用可能である。
　ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ(EC 2.7.9.1)はATP、ピルビン酸、及びオルトリン酸と、アデノシン一リン酸(AMP)、ホスホエノールピルビン酸（PEP）及びピロリン酸（PPi）との間の反応を触媒する。
ATP＋ピルビン酸＋リン酸←→AMP＋PEP＋PPi
ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ（PPDK）は別名をATP：ピルビン酸，リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ、ピルビン酸リン酸リガーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPDKは通常、ピルビン酸をPEPに変換し、そのプロセスでATPが１分子消費されAMPに変換される。反応は次の３つの可逆反応に分けられる。
１．酵素PPDKがATPに結合し、AMPに変換と二リン酸化PPDKを生じる。
２．二リン酸化PPDKが無機リン酸に結合し、二リン酸と一リン酸化PPDKを生じる。  
３．一リン酸化PPDKがピルビン酸に結合し、PEPを生じるとともにPPDKを再び生じる。　このとき、系に存在するPEP濃度が高いと反応は以下のように逆方向に進行する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　便宜上、反応段階は上と同じ番号で説明する。
３．PEPがPPDKに結合し、一リン酸化PPDK及びピルビン酸を生じる。
２．二リン酸と一リン酸化PPDKから二リン酸化PPDKと無機リン酸が生じる。
１．二リン酸化PPDKとAMPからPPDKとATPが生じる。
　酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)は陽イオンの存在下で、ATP及び酢酸と、ADP及びアセチル化リン酸との間の変換を触媒する。
ATP＋酢酸←→ADP＋アセチル化リン酸
酢酸キナーゼ（AK）は別名をATP:酢酸ホスホトランスフェラーゼ、アセチルキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。生体内ではATP及び酢酸から、ADP及びアセチル化リン酸を生じ、最終的にはアセチルCoAを生成する反応を促進する。系にアセチルCoAから生じたアセチル化リン酸及びADPが存在する場合、これを酢酸及びATPに変換し得る。
　ポリリン酸キナーゼ(EC 2.7.4.1)は、ポリリン酸（PolyPn）及びADPを、ポリリン酸（PolyPn-1）及びATPに変換する反応を触媒する。
ADP＋PolyPn←→ATP＋PolyPn-1
ポリリン酸キナーゼ（PPK）は別名をATP:ポリリン酸ホスホトランスフェラーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPKは生体内では酸化的リン酸化に関与する。系にポリリン酸（n）及びADPが存在する場合、これをポリリン酸（n-1）及びATPに変換し得る。
　リボフラビンキナーゼ(EC 2.7.1.26)は、FMNKとも記載され、リボフラビン及びATPを、リン酸リボフラビン（FMN）及びADPに変換する反応を触媒する。
ATP＋リボフラビン←→ADP＋FMN
　リボフラビンキナーゼはATP:リボフラビン5'-ホスホトランスフェラーゼ（フラボキナーゼともいう）に属する。
　ホスホフルクトキナーゼ1(EC 2.7.1.11)は、PFK1とも記載され、フルクトース-6-リン酸（Fru6P）及びATPを、フルクトース-1,6-ビスリン酸（Fru1,6-BP）及びADPに変換する反応を触媒する。
Fru6P＋ATP←→Fru1,6-BP＋ADP
　ホスホフルクトキナーゼ1はホスホフルクトキナーゼに属する。本明細書ではホスホフルクトキナーゼ1をFru-1,6BPKと記載することがある。
　フルクトースビスホスファターゼ(EC 3.1.3.11)は、FBPaseとも記載され、フルクトース-1,6-ビスリン酸（Fru1,6-BP）及びADPをフルクトース-6-リン酸（Fru6P）及びATPに変換する反応を触媒する。
Fru1,6-BP＋ADP←→Fru6P＋ATP
　フルクトースビスホスファターゼはFBP、FBP1とも記載されることがある。
　上記の酵素を本開示の方法に使用し得る。
　ATP生成能を有する酵素は微生物由来、細菌由来、真核生物由来、原生生物由来、植物由来、動物由来のもの等、任意の公知のものを用いることができ、例えば市販されているものを用いることができる。ATP生成能を有する酵素の添加量は、目的の濃度や反応系に応じて適宜設定することができる。
　ATP生成能を有する酵素としては種々のものが知られ、種々の基質を認識するが、本発明は特にそのATP生成能に着目する。したがって本明細書ではATP生成能を有する酵素の活性単位（U）を37℃でpH 7.8にて、1分当たり1.0μモルの基質をATPに変換する酵素量と定義する（1U=1μmol ATP/min, pH7.8, 37℃）。ある実施形態においてATP生成能を有する酵素は、測定系における活性単位が0.001U以上、0.01U以上、0.1U以上、1U以上、2U以上、3U以上、4U以上、又は5U以上となるよう添加することができる。ある実施形態においてATP生成能を有する酵素は、測定系における活性単位が1000U以下、100U以下、50U以下、10U以下、9U以下、8U以下、7U以下、又は6U以下となるよう添加することができる。
　測定する試料は、細胞を含み得る溶液、細胞や微生物を含む可能性のある媒体、例えば水道水、河川水、河川水処理水、飲料、飲料水、製造用水、風呂水、温泉水、噴水の水、定置洗浄(CIP洗浄)のリンス水、製造排水、遊戯施設の池の水、プールの水、水槽注入用水、クーリングタワーの冷却水、血液の人工透析液、工業用処理水、液状の医薬品、サプリメント、生理食塩水等を含み得る。微生物としては、原核生物、細菌、酵母、原生生物、真菌等が挙げられる。細胞としては、微生物細胞のほか、動物細胞、動物由来細胞、植物細胞、植物由来細胞、昆虫細胞、昆虫由来細胞が挙げられる。
　試料中のATP、ADP、AMPなどのアデニンヌクレオチドを測定することで微生物又は細胞の存在又は不在を定性的に或いは定量的に決定することができる。これは飲料や食品製品への混入微生物又は混入細胞、水中の微生物又は細胞の混入、繁殖した微生物の定量、増殖した細胞の定量、衛生上の監視等に利用できる。
　ATP測定にはルシパック(登録商標)II（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60375）、ATP+AMP測定には、ルシパック(登録商標)Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）ATP+ADP+AMP測定にはルシパック(登録商標)A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を使用し得る。抽出試薬は、0.01% 塩化ベンザルコニウム溶液、0.01% n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート溶液を使用し得る。これらの市販キットの使用説明書を参照して類似の方法によりアデニンヌクレオチドを測定してもよい。
　ATP測定にはルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）を、ATP＋AMP測定、及びATP+ADP+AMP測定にはルミテスター(登録商標)Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）を使用することができる。例えばATP測定試薬0.1mLに、各濃度の塩化ベンザルコニウムを含む試料溶液0.2mLを添加し、さらに1×10-7MのATP溶液を0.01mL添加し、発光量を測定することができる。発光量の測定は、ルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）を用いて行うことができる。
　発光は、ある基準を定めて、それに対する相対発光単位（RLU）と記載することができる。
　ある実施形態において、本開示の方法は、菌体外のATP、ADP、及び／又はAMPを消去する工程を含み得る。また、本開示のキットは、菌体外のATP、ADP、及び／又はAMPを消去する試薬を含み得る。ATP、ADP、及び／又はAMPは公知の試薬や、市販の試薬により消去し得る。ATP分解を行う方法として、ATPのみを測定する場合、アピラーゼを用いる方法が知られている（例えば特開平１１-８９５９２を参照）。ただし、アピラーゼはATPをADPさらにAMPへと分解する酵素であるが、それ以上の脱リン酸反応は触媒せず、AMPからATPを生成する酵素を含むATP+AMP測定やATP+ADP+AMPにおいては消去試薬としては機能しない。公知の試薬としては、アデノシンリン酸デアミナーゼが挙げられるがこれに限らない。非特許文献１ではアデニンヌクレオチドの消去として、アデノシンリン酸デアミナーゼによる方法を行っているが、ATP分解のため、30分間静置する必要がある。市販の試薬としては、例えばルシフェールATP消去試薬（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60254）が挙げられるがこれに限らない。
　本開示の方法は、ATPを抽出した後に、抽出剤などを含むサンプルを、綿棒などの抽出剤吸着剤（界面活性剤吸着剤）と接触させることを特徴とする。本開示のキットも同様である。水中の微生物を測定する際に、綿棒やサンプリング器具などを使用する方法も知られているが、従来の方法は、水を綿棒やサンプリング器具でまず採取し、次いでそれらを抽出剤に浸し、微生物からATPを抽出し、その抽出した液を発光試薬に添加する方法が一般的であり、水をサンプリングする目的で綿棒が使用されるため、ATP抽出工程の前に使用し、サンプリング後にATP抽出を行う。本発明者らの知る限り、抽出、例えばATP抽出を先に行い、その後、綿棒などのサンプリング器具と接触させる微生物測定方法はこれまでに報告されていない。また、抽出を先に行い、その後、界面活性剤吸着剤と接触させる微生物測定方法はこれまでに報告されていない。サンプリングした試薬を発光試薬に添加することを考えた場合、技術常識によれば、ATP抽出後に綿棒などと接触させる工程を追加することは、ATPが綿棒から十分回収できず、発光量を低減することが懸念される。そのため、抽出後の溶液については、綿棒などに接触させる工程を行わず、これをそのまま発光測定に供することが、一般的であった。一方で、界面活性剤を含む抽出剤で抽出を行うと、抽出された試料溶液は相当量の界面活性剤を含み、これが持ち越されて、発光試薬の発光阻害や発光酵素の失活など、悪影響を及ぼす。ところが、本発明者らがATP抽出を行った後に、綿棒に接触させる工程を追加することにより、ATPのようなアデニンヌクレオチドの回収率の低下はほとんどなく、界面活性剤を選択的に吸着させることができ、発光試薬との混合溶液に持ち越される界面活性剤の量を低減することができることを見出した。すなわち、抽出溶液について、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部を用いてサンプリングを行っても、抽出されたATPを、発光試薬により測定することができた。綿棒が、ATPの回収率には影響を与えないにもかかわらず、界面活性剤だけを選択的に吸着させることができることという結果は、非常に驚きであった。
　吸着現象はあらゆる物質に見られ、例えば通常の容器表面や通常のフィルターも微量の界面活性剤を物理吸着し得る。しかしながら、通常の容器表面や通常のフィルターにより吸着される界面活性剤はごく微量であり、界面活性剤によるルシフェラーゼ失活や、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応阻害を、このような微量の吸着により抑制することは不可能又は困難である。このような微量の吸着は、本明細書にいう「界面活性剤を吸着する」に該当しない。例えば、ある実施形態において、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程(i)の前に、検査する溶液を、フィルターを用いてろ過してよい(工程(o)ともいう)。このとき、フィルター（例えば酢酸セルロースフィルター）も微量の界面活性剤を吸着し得るが、上記のとおり、これは本明細書にいう「界面活性剤を吸着する」に該当しないものとする。
　ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットは、溶液中の微生物又は細胞を検出するためのものである。本明細書において、特に断らない限り、フィルターとは、液体をろ過するためのフィルターをいう。これとは別に、気体をろ過するための部材は本明細書では、エアーフィルターというものとする。ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットは、エアーフィルターを有しない。ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットから、エアーフィルターを有するものは除かれる。
　［RNA分解酵素］
　ある実施形態において、本発明のキットはRNA分解酵素を含んでもよい。またある実施形態において、本発明の方法は、RNA分解酵素を使用してもよい。なお、ここでいうRNA分解酵素は、サンプルに由来しないRNA分解酵素を意味する。
　本明細書において、RNA分解酵素とは、RNAから5'-モノヌクレオチド（AMP、GMP、CMP、及びUMP）を生成する反応を触媒する酵素を意味し、例えば以下に記載のものが挙げられる：（1）エンドヌクレアーゼ・エス・ワン（Endonuclease S1）（EC3.1.30.1）、（2）ベノム・エキソヌクレアーゼ（Venom exonuclease）（EC3.1.15.1）、（3）ホスホ・ジエステラーゼ・ワン（Phospho diesterase 1）（EC3.1.4.1）。なお、上記エンドヌクレアーゼ・エス・ワンには、ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（Nuclease P1）、マング・ビーン・ヌクレアーゼ（Mung beans nuclease）、ニューロスポラ・クラッサ・ヌクレアーゼ（Neurospora crassa nuclease）が含まれる。
　別の実施形態において、本発明のキットはRNA分解酵素を含まないか、又は実質的な量のRNA分解酵素を含まない。またある実施形態において、本発明の方法は、RNA分解酵素を使用しないか、又は実質的な量のRNA分解酵素を使用しない。この実施形態において、サンプルに由来するRNA分解酵素が反応系に含まれてもよい。本明細書において、「実質的な量のRNA分解酵素」とは、本発明のキット又は方法の効果（例えばATP分解活性の影響を受けにくい、正確な汚染の検出方法を提供するという効果）に影響を与えない量のRNA分解酵素を意味する。実質的なRNA分解酵素の量を含まない例として、例えば反応系での終濃度として0.3U/ml以下、0.15U/ml以下、0.1U/ml以下、0.05U/ml以下、0.01U/ml以下、又は0.001U/ml以下のRNA分解酵素を含むキット、又はこのような量のRNA分解酵素を用いる方法が挙げられる。本明細書において、RNA分解酵素の酵素単位は、酵素のRNA分解能に着目し、RNA分解能を有する酵素の活性単位（U）を37℃にて、1分当たり1.0μモルの基質を酸可溶性のヌクレオチドに変換する酵素量と定義する。例えば、Nuclease P1の酵素単位は、37℃にて、pH5.3で、1分当たり1.0μモルの基質を酸可溶性のヌクレオチドに変換する酵素量と定義される（Nuclease P1の酵素活性の定義の詳細については、Merck社のカタログ（http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/nuclease_p1.pdf）を参照されたい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）
　界面活性剤である塩化ベンザルコニウムまたはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（メルクミリポア社製）を0、0.01、0.1％となるように滅菌超純水にて調製し、以下の試験に供した。塩化ベンザルコニウムとして、ベンザルコニウム塩化物液オスバン消毒液10％（日本製薬社製）を用いた。各濃度の界面活性剤を綿球に0.1mL添加した後、5000rpmで1分間遠心分離して、綿球部から界面活性剤溶液を回収した。この操作を5回行い、回収された界面活性剤溶液を1つにまとめた。界面活性剤吸着剤としての綿球として、コットンボール・オオサキ綿球・サイズNo.7（オオサキメディカル社製）（材質：コットン）を用いた。
　ルミチューブ(登録商標)（キッコーマンバイオケミファ社製）に表１の組成で調製した発光試薬0.1mLを分注し、綿球から回収した各濃度の界面活性剤溶液を0.2mL添加し、1×10-7MのATP溶液をすばやく0.01mL添加し、直ちに発光量をルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）にて測定した。比較として、綿球と接触させない各濃度界面活性剤溶液についても同様に試験した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらにn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートについては、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含まない溶液及び0.01% n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにおける発光量の経時変化を綿球との接触の有無で測定した。
　界面活性剤を含まない滅菌超純水の発光量を100％としたときの、各濃度の塩化ベンザルコニウムにおける相対発光量を図１に、各濃度のn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにおける相対発光量を図２に示す。
　界面活性剤が存在すると、陽イオン性界面活性剤である塩化ベンザルコニウム、両イオン性界面活性剤であるn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートともに、濃度に応じて発光量が顕著に低下するが、綿球と接触させた溶液ではその低下が抑制されることが示された。これは、綿球部に界面活性剤が吸着されることにより、界面活性剤のルシフェラーゼへの発光阻害を抑えられるためであると考えられる。
　さらにn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにおける発光量の経時変化について、図３に示した。n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含まない（0%）溶液では発光量はATPの消費によりわずかに減衰するのみであるが、0.01% n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含む溶液では綿球と接触させない場合、発光量が大きく減衰している。それ対して、綿球と接触させた場合、減衰が顕著に抑制され、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを含まない場合とほぼ同等にまで抑えられている。これは綿球との接触がない場合、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの影響により発光試薬のルシフェラーゼが失活しながら発光しているのに対して、綿球と接触させた溶液では、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートが綿球に吸着され、ルシフェラーゼの失活が抑えられているためと考えられる。
　これらの結果から、界面活性剤を含む溶液をコットンなどの界面活性剤吸着剤と接触させることにより、界面活性剤を吸着し、発光試薬への持ち込みが抑制されて、ルシフェラーゼの発光阻害を抑制し、さらには酵素の失活も抑制する効果があることがわかった。
　フィルターに捕集した微生物中のアデニンヌクレオチドを、界面活性剤を含む抽出試薬で抽出した後、直接発光試薬と反応させるのではなく、綿球などの界面活性剤吸着剤と接触させることにより、界面活性剤の発光試薬への持ち込みを抑え、阻害や失活の影響を抑制した状態で発光測定し、高感度に微生物中のアデニンヌクレオチドを測定することが可能になることが示された。この結果は、綿棒が、ATP発光量には影響を与えないにもかかわらず、界面活性剤のみを選択的に吸着し、界面活性剤による発光量の低減を抑制することができたことを実証しており、これは非常に驚きであった。また、先に綿棒で微生物を拭き取りによりサンプリングし、次いで界面活性剤により抽出し発光量を測定する場合、界面活性剤を作用させる段階ではすでに綿棒は使用済みであり、したがって、このような結果は得られない。
（実施例２）
　界面活性剤である塩化ベンザルコニウムまたはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(Zwittergent(商標)3-14、メルクミリポア社製）を0.01％となるように滅菌超純水にて調製し、以下の試験に供した。塩化ベンザルコニウムとして、ベンザルコニウム塩化物液オスバン消毒液10％（日本製薬社製）を用いた。各濃度の界面活性剤を以下に示す各種綿棒の綿球部に0.1mL添加した後、5000rpmで1分間遠心分離して、綿球部から界面活性剤溶液を回収した。この操作を5本分行い、得られた界面活性剤を1本にまとめた。界面活性剤吸着剤には、綿棒として、ルシパック(登録商標)A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）付属の綿棒（材質：コットン）、工業用綿棒 P1502E（日本綿棒社製）（材質：コットン）、工業用綿棒S-S-P（日本綿棒社製）（材質：コットンとレーヨン混紡）、メンティップ(登録商標)ポリエステル綿棒（滅菌済）1PW1505P（日本綿棒社製）（材質：ポリエステル）を用いた。
　比較として、各種界面活性剤を含まない滅菌超純水も同様に各種綿棒と接触させ、試験した。
　ルミチューブ(登録商標)（キッコーマンバイオケミファ社製）に表1の組成で調製した発光試薬0.1mLを分注し、綿棒から回収した各濃度の界面活性剤溶液を0.2mL添加し、すばやく1×10-7 MのATP溶液を0.01mL添加し、発光量をルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）にて測定した。比較として、綿棒と接触させない各濃度界面活性剤溶液についても同様に試験した。
　界面活性剤を含まない滅菌超純水の発光量を100％としたときの、各綿棒による塩化ベンザルコニウムの発光阻害抑制効果を図４に、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートを用いた場合の発光阻害抑制効果を図５に示す。
　界面活性剤が存在すると、発光量は濃度に応じて顕著に低下するが、綿棒と接触させた場合にはその低下が抑制されることが示された。これは、綿球部に界面活性剤が吸着されることにより、界面活性剤のルシフェラーゼへの影響（発光阻害、失活）を抑えられるためであると考えられる。また、本効果は、綿球部の材質や界面活性剤の種類によらないことも確認された。すなわち、他の材質の綿棒や綿球部を使用したり、他の種類の界面活性剤を抽出に用いたりした場合にも、綿棒又は綿球部が界面活性剤を吸着し、発光量への影響を抑制することができる蓋然性が高い。
（実施例３）
　抽出剤の主成分である塩化ベンザルコニウムの吸着の有無を確認するため、陽イオン界面活性剤測定試薬「パックテスト陽イオン界面活性剤（共立理化学研究所社製）」を用いて、綿棒と接触させた後の溶液について、陽イオン界面活性剤量を測定した。
　綿棒としてルシパック(登録商標)A3 Surface用綿棒、工業用綿棒S-S-Pを使用した。各綿棒に0.1mLの0.01%塩化ベンザルコニウム溶液を吸収させた後、5000rpmで1分間遠心分離して、綿球部から界面活性剤溶液を回収した。この界面活性剤溶液を滅菌超純水にて2倍希釈し、希釈液から1ｍLを分取してパックテストのチューブに添加し、ピペッティングによりチューブ内の試薬を溶解した。
　比較として、各濃度の塩化ベンザルコニウムを含む溶液について、同様に2倍希釈して測定した。
　上記の各綿棒に接触させた溶液及び比較とした各濃度の塩化ベンザルコニウムを含む溶液を図６に示す。図６に示す左から5つの溶液は、比較とした各濃度の塩化ベンザルコニウム溶液であり、0.01％、0.005％では青色、0％では赤紫色を示し、0.0001、0.00005％ではその中間的な色調となった。一方、ルシパック(登録商標)A3 Surface用綿棒、工業用綿棒S-S-Pをそれぞれ使用した例では、塩化ベンザルコニウム濃度として0.005％と0.001％の間に相当する色調を示しており、すなわち、綿棒に接触させる前には0.01％であった界面活性剤の濃度が、綿棒と接触させたことにより大幅に低下していることが確認できた。
　このことから、塩化ベンザルコニウムなどの界面活性剤と綿棒などを接触させることにより、塩化ベンザルコニウムが綿棒に吸着し、濃度が低下していると考えられる。これは、実施例２の発光阻害抑制の結果と一致した。
（実施例４）
　次に種々の微生物について試験を行った。具体的には、Cronobacter sakazakii IAM12660、Klebsiella pneumoniae NBRC14940、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853、Pseudomonas fluorescence NISL420、Sphingomonas parapaucimobilis、Bacillus subtilis ATCC9372、Bacillus cereus NBRC3836、を2.5mLのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に植菌し、30℃、160rpmにて一晩振とう培養した。各微生物培養液を滅菌超純水にて100倍希釈した培養希釈液10mLをシリンジフィルターDISMIC（登録商標）- 25CS045AS（アドバンテック東洋社製）を装着した10mLシリンジ（テルモ社製）にて全量ろ過した。
　培養希釈液10mLに0.5mLのルシフェールATP消去試薬（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60254）を添加して30分間放置したものについても、同様にろ過した。
　あらかじめ容器に測り取った0.24mLの抽出試薬（0.01%塩化ベンザルコニウム）を、微生物を捕集したフィルターで吸引し、容器に排出することにより、フィルター上に捕集した微生物からアデニンヌクレオチド（ATP、AMP、ADP）を抽出した。回収した抽出液中のアデニンヌクレオチドについて、ATP測定はルシパック(登録商標)II（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60375）を用いて、ATP+AMP測定はルシパック(登録商標)Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）を用いて、ATP+ADP+AMP測定はルシパック(登録商標)A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を用いて測定した。各検査試薬の綿球部に0.1mL添加し、ATP測定はルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）、ATP+AMP測定、ATP+ADP+AMP測定はルミテスター(登録商標)Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）にて発光量を測定した。発光量は各種検査キットのロット間差を補正するため、ロットごとに既知濃度のATP溶液を添加して発光量を測定した。ATP溶液（1×10-7M）を0.01mL添加した時の発光量を測定した値をATP添加時発光量とし、検体での発光量をATP添加時発光量で除し、各アデニンヌクレオチド検査試薬の平均的な発光量、3000RLUを乗ずることにより補正値を求めた（補正値＝検体での発光量÷ATP添加時発光量×3000）。また、ATP+ADP量は、ATP+ADP+ADP量からATP+AMP量を引いた値を、ATP量に加えることによって算出した。
[数１]
（ATP+ADP量）＝（ATP+ADP+AMP量）－（ATP+AMP量）＋ATP量
　図７に本実施例の概要を示す。ATP+ADP+AMP測定試薬を用いた場合の発光量（補正値）を100％とし、各微生物の相対発光量を図８に、ATP消去試薬を用いた場合の相対発光量を図９に示す。本実施例におけるすべての微生物において、水中微生物に含まれるATP量の割合は非常に低く、ATP+AMP量の割合についても低い値であった。この結果は、非特許文献１において、糖を含まない溶液中では、79.8～89.0％がATP+AMPであるという結果からは、予想外の驚くべき値であった。本実施例では、非特許文献１と異なり溶液での測定ではなく、フィルターに捕集された微生物中での測定であることの違いによるものであると推測されるが、ATP測定よりATP+AMP測定、ATP+ADP測定をすることにより、さらにはATP+ADP+AMP測定をすることにより、高い発光量が得られ、高感度に測定することが可能となることが示された。液体中に含まれる危害菌などの微生物をフィルターに捕集した方法で検出する場合、ATP測定するだけではなく、ATP+AMP測定、ATP+ADP測定、さらにはATP+ADP+AMP測定することにより、高感度に微生物を検出できることが示唆された。
（実施例５）
　Klebsiella pneumoniae NBRC14940、Saccharomyces cerevisiae NISL3399、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853、Micrococcus luteus IFO3333、Bacillus cereus NBRC3836、Cronobacter sakazakii IAM12660、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538を2.5mLのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に植菌し、30℃、160rpmにて一晩振とう培養した。各微生物培養液を滅菌超純水にて希釈し、10倍ごとの微生物希釈液を作製した。各微生物培養液を滅菌超純水にて100倍希釈した培養希釈液10ｍLを、各種シリンジフィルターを装着した10mLシリンジ（テルモ社製）にて全量ろ過し、微生物を捕集した。フィルターは表2のうち、アドバンテック東洋、GVS Filter Technology、メルクミリポア社製の各種フィルターを使用した。孔径はすべて0.45μmのものを使用した。0.24mLの抽出試薬（0.01%塩化ベンザルコニウム）を容器に測り取り、微生物を捕集したフィルターで吸引し、容器内に排出することにより、フィルター上に捕集した微生物からアデニンヌクレオチド（ATP、AMP）を抽出した。アデニンヌクレオチド抽出液をルシパック(登録商標)Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）の綿棒を用いてサンプリングし、ルミテスター(登録商標)Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）にて発光量を測定した。また、適宜希釈した微生物懸濁液0.1mLをR2A培地（ニッスイ製薬社製）に塗布し、30℃で一晩培養した後、形成したコロニーを計測し、生菌数とした。
　同様にE.coliについて、ルシパック(登録商標)A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を用いて、各種ATP+ADP+AMP量を測定した。フィルターは表2のアドバンテック東洋、GVS Filter Technology、Membrane Solutions、メルクミリポア社製の各種フィルターを用いた。
　メーカーによってフィルターユニットのハウジング構造などが異なり、抽出効率に影響することが考えられるため、同じメーカー内でフィルターの材質の違いによる各微生物の発光量を比較した。アドバンテック東洋社のフィルターでの各微生物のATP+AMP測定の発光量を図１０に、同じくGVS社のフィルターでの発光量を図１１、メルクミリポア社のフィルターでの発光量を図１２に示した。同様に、アドバンテック東洋社のフィルターでのE.coliのATP+ADP+AMP測定の発光量を図１３に、同じくGVS社のフィルターでの発光量を図１４に、Membrane Solutions社のフィルターでの発光量を図１５に、メルクミリポア社のフィルターでの発光量を図１６に示した。
　アドバンテック東洋、GVS、Membrane Solutions社における酢酸セルロース（CA）とポリエーテルサルフォン（PES）の比較では、CAの発光量が高く、CAのほうが微生物からアデニンヌクレオチドを多く抽出できていることがわかる。メルクミリポア社フィルターでの比較では、ATP+AMP測定では各微生物においてPESの発光量が最も高く、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）、セルロース混合エステル（MCE）よりも微生物からアデニンヌクレオチドを多く抽出できており、ATP+ADP+AMP測定ではPESはPVDFとほぼ同等、MCEよりも発光量が高いことがわかる。これらの結果を総合すると、CAが最も膜上に捕集された微生物から、アデニンヌクレオチド（ATP、ADP、AMP）を多く抽出することができると言える。セルロース混合エステル（MCE）も成分としては酢酸セルロース（CA）を含んでいることから技術常識上、両者に性能差は無いか又はほとんどないと予測されたが、実験を行ってみると実際にはセルロース混合エステル（MCE）フィルターよりも、酢酸セルロース（CA）フィルターの発光量が高いことが確認された。この結果は非常に驚きであった。検体として細胞を用いた場合も、同様の結果が得られるものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明によれば、アデニンヌクレオチドを測定することで、微生物又は細胞を検出し得る。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (22)

  1. 　以下の工程、
    (i) 界面活性剤吸着剤と微生物又は細胞を含み得る溶液とを接触させることなく、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (ii)工程(i)の抽出を行った後の、微生物又は細胞由来のアデニンヌクレオチド成分を含む検体を、界面活性剤吸着剤と接触させる工程、
    (iii)界面活性剤吸着剤と接触させた検体を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる、又は、界面活性剤吸着剤と接触させた検体を溶液に懸濁し次いで検体を懸濁した該溶液を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (iv)発光量を測定する工程、
    を含む、微生物又は細胞を検出する方法。
  2. 　界面活性剤吸着剤が、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの１以上を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　方法が微生物又は細胞を検出する方法であり、
    　抽出剤が微生物又は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり、
    　アデニンヌクレオチドがATPであり、
    　工程(iii)が、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含む、
    請求項３に記載の方法。
  5. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  7. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、及びADPからATPを生成する酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  8. 　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又はATP及びAMPからADPを生成する酵素、並びに、ADPからATPを生成する酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  9. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、並びに、ADPからAMPを生成する酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  10. 　工程(i)の前に、検査する溶液を、フィルターを用いてろ過し、微生物又は細胞を含み得る溶液とする工程(o)をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　(i)界面活性剤を含む抽出剤、
    　(ii)界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部、
    　(iii) ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬、及び
    　(iv)使用説明書
    を含む、微生物又は細胞を検出するキットであって、
    前記使用説明書は、
    (A) 界面活性剤吸着剤と微生物又は細胞を含み得る溶液とを接触させることなく、界面活性剤を含む抽出剤を、微生物又は細胞を含み得る溶液と接触させることにより前記微生物又は細胞中のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (B)工程(A)の抽出を行った後の、微生物又は細胞由来のアデニンヌクレオチド成分を含む検体を、界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部により採取する工程、
    (C)サンプリング部により採取した検体を、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (D)発光量を測定する工程、
    により微生物又は細胞を検出することを記載したものである、前記キット。
  13. 　界面活性剤吸着剤が、綿、レーヨン、セルロース、又はポリエステルを含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウム若しくはn-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの１以上を含む、請求項１３に記載のキット。
  15. 　キットが、微生物又は細胞を検出するキットであり、
    　抽出剤が微生物又は細胞からATPを抽出する微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり、
    　アデニンヌクレオチドがATPであり、
    　工程(C)が、ATPをルシフェラーゼにより発光させることを含む、
    請求項１２に記載のキット。
  16. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素を含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素を含む、請求項１５に記載のキット。
  18. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、及びADPからATPを生成する酵素を含む、請求項１５に記載のキット。
  19. 　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又はATP及びAMPからADPを生成する酵素、並びに、ADPからATPを生成する酵素を含む、請求項１５に記載のキット。
  20. 　発光試薬がさらに、AMPからATPを生成する酵素、並びに、ADPからAMPを生成する酵素を含む、請求項１５に記載のキット。
  21. 　フィルターをさらに含む、請求項１２に記載のキット。
  22. 　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、請求項２１に記載のキット。
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