JPH11239493A - ルシフェラーゼおよびそれを用いる細胞内ａｔｐの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 界面活性剤に耐性を有するルシフェラー
ゼ、及び細胞を含む試料から界面活性剤の存在下にＡＴ
Ｐを抽出する第１工程、該ＡＴＰ抽出液にルシフェラー
ゼを含む発光試薬を添加して発光させる第２工程、およ
び該発光量を検出する第３工程を含む細胞内ＡＴＰの測
定法において、ルシフェラーゼとして、界面活性剤に耐
性を有するルシフェラーゼを使用することを特徴とする
細胞内ＡＴＰの測定法。 【効果】 本発明により界面活性剤に耐性を有する新規
なルシフェラーゼが提供され、この新規なルシフェラー
ゼを用いて細胞内ＡＴＰを測定することにより界面活性
剤が高濃度に存在する場合でも生物発光反応の触媒活性
が低下することなく細胞内ＡＴＰを測定することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ルシフェラーゼお
よびそれを用いる細胞内ＡＴＰの測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超
純水、環境などの分野では、試料中の細胞の有無や細胞
数の計測等を目的として、細胞内ＡＴＰの測定が日常的
に行なわれている。細胞内ＡＴＰの測定法においては、
細胞を含む試料に、界面活性剤を有効成分とするＡＴＰ
抽出試薬を添加して、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した
後、ルシフェラーゼを含む発光試薬を試料に添加し、生
じる発光の発光量を測定する方法が一般的である。

【０００３】ルシフェラーゼは、ＡＴＰおよびマグネシ
ウムイオンの存在下で、基質であるルシフェリンの発光
反応を触媒する酵素である。細胞内ＡＴＰの測定法にお
けるルシフェラーゼとしては、例えばホタル（ゲンジボ
タル、ヘイケボタル、アメリカホタル、ロシアホタル
等）を由来とするものが用いられている。

【０００４】細胞内ＡＴＰの抽出は、細胞を含む試料
に、ＡＴＰ抽出試薬を添加して撹拌することにより成し
遂げられる。充分な抽出能力を発現させるためには、試
料と抽出試薬を混合したときの混合液に対し、界面活性
剤の濃度が0.05％以上になるように添加することが望ま
しい。しかし、界面活性剤の濃度が0.05％以上である場
合、生物発光によりATP濃度を測定する工程で酵素反応
を著しく阻害するため、測定感度および精度が大きく低
下する。これは、高濃度の界面活性剤によりルシフェラ
ーゼの活性が低下することが原因であると考えられてい
る。例えば、アメリカホタルのルシフェラーゼは、0.1
％の塩化ベンザルコニウムの存在下では、その活性が約
20％にまで低下する（表１参照）。一方、界面活性剤の
濃度が低いと生物発光反応の阻害を小さくできるが、Ａ
ＴＰの抽出効率が不十分となる。

【０００５】界面活性剤による発光反応の阻害を抑制す
る方法として、サイクロデキストリンまたはその誘導体
を使用する方法は公知である（特表平６−５０４２００
号）。また、細胞を含む試料を界面活性剤と接触させて
細胞内ＡＴＰを抽出し、次いでルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ生物発光反応法により該ＡＴＰを測定する方法に
おいて、ＡＴＰ抽出後の試料をサイクロデキストリンと
接触させた後に生物発光反応法を適用することを特徴と
する細胞内ＡＴＰの測定方法も公知である（特開平７−
２０３９９５号公報）。しかしながら、ルシフェラーゼ
に注目して、界面活性剤による生物発光反応の阻害を抑
制しようとした試みはなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、界面
活性剤が高濃度に存在する場合でも活性が低下しない、
界面活性剤に耐性を有する新規なルシフェラーゼを提供
することにある。また、本発明の目的は、界面活性剤を
使用して細胞内ＡＴＰを抽出し、ついで該細胞内ＡＴＰ
をルシフェラーゼを用いる生物発光反応法により測定す
る方法において、界面活性剤による生物発光反応の阻害
を抑制することができ、且つ細胞内ＡＴＰの抽出効率を
低下させることがない方法を提供することにある。な
お、ここでいう「抑制」とは、界面活性剤による生物発
光反応の阻害を有意に低減すること、及び該阻害を完全
に排除することを意味する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は界面
活性剤に耐性を有するルシフェラーゼである。上記界面
活性剤に耐性を有するルシフェラーゼとしては、野生型
ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、490位
のアミノ酸、またはゲンジボタルもしくはヘイケボタル
のルシフェラーゼの490位と同等位置のアミノ酸を、グ
ルタミン酸以外の他のアミノ酸、例えばリジンに置換し
たものが挙げられる。

【０００８】また、上記界面活性剤に耐性を有するルシ
フェラーゼとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）からなる
ポリペプチド （ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド （ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて１若しくは複数の
アミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列
からなり、かつ界面活性剤に耐性を有するルシフェラー
ゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、以下の（ａ）
又は（ｂ）からなるボリペプチド （ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて１若しくは複数の
アミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列
からなり、かつ界面活性剤に耐性を有するルシフェラー
ゼ活性を有するタンパク質、が挙げられる。

【０００９】さらに、本発明は上記界面活性剤に耐性を
有するルシフェラーゼをコードするルシフェラーゼ遺伝
子である。さらに、本発明は上記界面活性剤に耐性を有
するルシフェラーゼをコードするルシフェラーゼ遺伝子
を含む組換ベクターである。さらに、本発明は上記組換
ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は上
記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から界面
活性剤に耐性を有するルシフェラーゼを採取することを
特徴とする該ルシフェラーゼの製造法である。

【００１０】さらに、本発明は細胞を含む試料から界面
活性剤の存在下にＡＴＰを抽出する第１工程、該ＡＴＰ
抽出液にルシフェラーゼを含む発光試薬を添加して発光
させる第２工程、および該発光量を検出する第３工程を
含む細胞内ＡＴＰの測定法において、ルシフェラーゼと
して、界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼを使用
することを特徴とする細胞内ＡＴＰの測定法である。

【００１１】

【発明の実施の態様】以下、本発明について詳述する。 〔界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼについて〕
本発明の界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼにつ
いて説明する。「界面活性剤に耐性を有する」とは、次
のいずれかの性質を有するものをいう。 （１）従来公知のルシフェラーゼと比較した場合に、界
面活性剤存在下での初発の発光量が増大するものをい
う。ここでいう「比較」とは、例えば、公知のルシフェ
ラーゼのアミノ酸配列に変異を導入して本発明のルシフ
ェラーゼを作製する場合であれば、変異導入前のルシフ
ェラーゼの発光量と、変異導入後のルシフェラーゼの発
光量との比較を意味する。

【００１２】（２）従来公知のルシフェラーゼと比較し
た場合に、界面活性剤存在下での活性の低下が緩やかで
あることをいう。 （３）０．４％の界面活性剤存在下で、８５％以上の残
存活性を有することをいう。 以後、「界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼ」
を、「界面活性剤耐性ルシフェラーゼ」と表記する。

【００１３】「活性」とは、生物発光反応の触媒活性を
意味する。また、本発明でいう「界面活性剤」とは、細
胞内ＡＴＰの測定系に使用されうるものであればいずれ
でもよく、例えば、アニオン系界面活性剤、カチオン系
界面活性剤、ツイッターイオン系界面活性剤、非イオン
系性界面活性剤等が挙げられ、さらに具体的には、塩化
ベンザルコニウムあるいは塩化ベンゼトニウム等の第４
級アンモニウム塩を主成分とする試薬が挙げられる。

【００１４】本発明のルシフェラーゼは、発光性生物の
発光器官等から調製することにより得られる。発光性生
物としては、発光性昆虫、発光性細菌等が挙げられる。
発光性昆虫としては、甲虫目（cleoptera)に属するも
の、例えばホタル科やコメツキムシ科の昆虫、具体的に
は、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル、ロ
シアホタル、ヒカリコメツキムシツチボタル、鉄道虫等
が挙げられる。また、本発明のルシフェラーゼは、上記
の発光生物からルシフェラーゼ遺伝子をクロ−ニング
し、該遺伝子を適当なベクター−宿主系を用いて発現さ
せることにより得られる。

【００１５】さらに、本発明のルシフェラーゼは、従来
公知のルシフェラーゼのアミノ酸配列に付加、欠失、置
換等の変異を導入することにより得られる。アミノ酸配
列に変異を導入する方法としては、公知の遺伝子工学的
手法を使用することができる。その場合、まず、上記の
発光性生物を由来とするルシフェラーゼ遺伝子や既知の
ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列に遺伝子工学的手法に
より付加、欠失、置換等の変異を導入して変異型ルシフ
ェラーゼ遺伝子を構築する。ついで、該変異型遺伝子を
適当なベクター−宿主系に導入して組み換え微生物を作
製する。さらに該組み換え微生物の中から、本発明のル
シフェラーゼを生産するものをスクリーニングし、それ
を培地に培養し、得られる培養物からルシフェラーゼを
採取すればよい。以後、アミノ酸配列に変異を導入する
ことにより得られた界面活性剤耐性ルシフェラーゼを、
「変異型ルシフェラーゼ」と表記することとする。

【００１６】変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、
野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、
ゲンジボタルもしくはヘイケボタルのルシフェラーゼの
490位と同等位置のアミノ酸が、グルタミン酸以外のア
ミノ酸に置換されたルシフェラーゼが挙げられる。グル
タミン酸以外のアミノ酸としては、例えば塩基性アミノ
酸、具体的には、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が
挙げられる。「ゲンジボタルもしくはヘイケボタルのル
シフェラーゼの490位と同等位置のアミノ酸」とは、確
定したルシフェラーゼのアミノ酸配列をゲンジボタルま
たはヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較
した場合に、ゲンジボタルまたはヘイケボタルルシフェ
ラーゼの490位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味す
るものである。

【００１７】なお、ゲンジボタルまたはヘイケボタルの
ルシフェラーゼでは、490位のアミノ酸はグルタミン酸
である。また、アメリカホタルルシフェラーゼにおい
て、「ゲンジボタルまたはヘイケボタルのルシフェラー
ゼの490位と同等位置のアミノ酸」とは、４８７位のグ
ルタミン酸である。さらに具体的には、変異型ルシフェ
ラーゼとは、配列番号１または２で表されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列のうちの１若しくは複数のアミ
ノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含
むポリペプチドである。

【００１８】〔遺伝子工学的手法を用いて変異型ルシフ
ェラーゼを得る方法〕以下に、遺伝子工学的手法を用い
て変異型ルシフェラーゼを得る方法について説明する。
変異型ルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼ遺伝子
の塩基配列に付加、欠失、置換等の変異を導入して変異
型ルシフェラーゼ遺伝子を構築し、該遺伝子を適当なベ
クター−宿主系により発現させることにより得られる。
既知のルシフェラーゼ遺伝子としては、特に限定されな
いが、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、具体的に
は、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼ遺伝子（特開平
２−１７１１８９号公報に記載）、耐熱性ヘイケボタル
ルシフェラーゼ遺伝子（特開平５−２４４９４２号公報
に記載）等が挙げられる。

【００１９】ｉ) ルシフェラーゼ遺伝子に変異を導入す
る方法としては、該遺伝子と変異原となる薬剤、具体的
にはヒドロキシルアミン、亜硝酸、亜硫酸、５−ブロモ
ウラシル等を接触させる方法を挙げることができる。こ
の他、紫外線照射法、カセット変異法、ＰＣＲ法を用い
た部位特異的変異導入法等の方法を広く用いることがで
きる。更には、化学合成したＤＮＡをアニーリングして
所望の部位に変異を有する変異型ルシフェラーゼ遺伝子
を構築することも可能である。

【００２０】ii) 次いで、変異型ルシフェラーゼ遺伝子
を、プロモーター配列、マーカー遺伝子、複製起点等を
有するベクターＤＮＡに挿入して組み換え体プラスミド
を得る。ベクターＤＮＡは、宿主細胞で複製可能なもの
であれば如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤ
ＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。宿主
細胞が大腸菌である場合のベクターＤＮＡとしては、プ
ラスミドpUC119（宝酒造社製）、pBluescript SK+(Stra
tagene社製)、pMAL-C2（NEW England Labs社製）、pGEX
-5X-1（ファルマシア社製）、pXa1（ベーリンガー社
製）、pMA56（G.Ammerer, Meth. Enzymol., 101, 192,1
983）等が使用できる。

【００２１】iii)次いで、上記の組み換え体プラスミド
を用いて適当な宿主細胞を形質転換又は形質導入し、変
異型ルシフェラーゼの生産能を有する組み換え微生物を
スクリーニングする。宿主細胞としては、真核細胞及び
原核細胞のいずれをも使用できる。真核細胞としては動
物、植物、昆虫、酵母等の細胞が、原核細胞としては大
腸菌、枯草菌、放線菌等が挙げられる。動物細胞として
は、CHO 、COS、HeLa細胞及びミエローマ細胞系統の細
胞が、原核細胞としては、エッシェリシア属に属する微
生物、例えば大腸菌JM101(ATCC 33876)、JM109（宝酒造
社製）、 XL1-Blue（Stratagene社製）、HB101(ATCC336
94)等が使用できる。

【００２２】本発明においては、形質転換は、例えば、
D.M.Morrisonの方法（Meth. Enzymol.,68,326-331,197
9）等により、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法（Met
h. Enzymol.,68,299-309,1979）等により行うことがで
きる。組み換え微生物より組み換え体ＤＮＡを精製する
方法としては、例えば、P.Guerryの方法（J.Bacteriolo
gy,116,1064-1066,1973）、D.B.Clewellの方法（J.Bact
eriology,110,667-676,1972）等を用いることができ
る。又、組み換え体ＤＮＡに挿入された遺伝子の塩基配
列の決定は、例えば、Maxam-Gilbert 法（Proc.Natl. A
cad. Sci. USA,74,560-564,1977 ）、Dideoxy法（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,74,5463-5467,1977）等により
行うことができる。

【００２３】iv) 上記の方法により得られた組み換え微
生物を培地中で培養することにより、本発明の変異型ル
シフェラーゼを生産することができる。宿主細胞が大腸
菌である場合、組み換え大腸菌を固体培養法で培養して
もよいが、液体培養法により培養するのが好ましい。培
地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆も
しくは小麦ふすま浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化
ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄、あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。なお、培地の初発 pH は、
pH 7〜9に調製するのが適当である。また培養は30〜42
℃、好ましくは37℃前後で3〜24時間、好ましくは5〜8
時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等によ
り実施するのが好ましい。

【００２４】組み換え大腸菌の培養終了後、培養物より
変異型ルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取
手段を用いることができる。すなわち、培養物を遠心分
離して菌体を得た後、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌
処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊
し、融合タンパク質を菌体外に排出させる。次いで、ろ
過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することによ
り、変異型ルシフェラーゼを含有する粗酵素液を得るこ
とができる。

【００２５】本発明では、上記の粗酵素液をそのままタ
ンパク質標品としてもよいが、通常のタンパク質精製法
を用いて、更に純度を高めてもよい。具体的には、硫安
塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わ
せて用いることができる。本発明の界面活性剤耐性ルシ
フェラーゼを使用することにより、細胞内ＡＴＰの抽出
工程において、界面活性剤を高濃度に添加することが可
能となる。

【００２６】〔本発明の細胞内ＡＴＰの測定法〕以下
に、本発明の細胞内ＡＴＰの測定法について説明する。 i) まず、細胞を含む試料に、界面活性剤を有効成分と
するＡＴＰ抽出試薬を添加して、細胞内ＡＴＰを細胞外
に抽出する。細胞とは、動物、植物、微生物（例えば、
酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイ
ルス、原生動物等）等を由来とする細胞を意味する。

【００２７】試料とは、上記の細胞を含むものであれば
特に限定されないが、例えば、飲食物、医薬、化粧品、
海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血
液、喀痰、膿汁、上記細胞の培養物等が挙げられる。ま
た、上記の試料を、適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理
的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。検体
液が固形分を含む場合には、該検体液を適当な溶媒に懸
濁するか、ミキサーなどでホモジナイズすれば溶液状の
ものと同様に扱うことができる。

【００２８】また、上記溶液状の試料を、親水性または
疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕捉した後に該濾過膜
を試料としてもよい。細胞を捕捉した濾過膜を試料とす
る場合、親水性濾過膜としては、例えば親水性ポリテト
ラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンフルオライ
ド、親水性ポリアミド、アセチルセルローズ、ニトロセ
ルローズ等を材料とするフィルム状又はシート状のもの
が使用できる。また、疎水性濾過膜としては、例えばＰ
ＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポ
リトラフルオロエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）等を
材料とするものが使用できる。

【００２９】界面活性剤としては、例えば、アニオン系
界面活性剤、カチオン系界面活性剤、ツイッターイオン
系界面活性剤、非イオン系界面活性剤等が挙げられる。
アニオン系界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロ
イルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリ
ウムがあげられる。カチオン系界面活性剤としては、例
えば塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウ
ム（BZC）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリ
メチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジル
アンモニウムがあげられる。また、ツイッターイオン系
界面活性剤としては、例えばTwittergentDetergent 3-0
8, 3-10, 3-12, 3-14, 3-16、Tegoがあげられる。さら
に非イオン系界面活性剤、例えば、 Tween 20, 60, 8
0、Span 60, 80、 Triton X-45, x-100,ポリオキシエチ
レンエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルが
あげられる。 界面活性剤の濃度は、充分なATP抽出能
力を発現させる濃度であればいずれでもよいが、試料と
ＡＴＰ抽出試薬を混合した時の混合液に対し、界面活性
剤の濃度が好ましくは0.05％以上になるように添加す
る。試料とＡＴＰ抽出試薬との反応条件は、室温あるい
は加温しつつ接触させればよい。

【００３０】ii)ＡＴＰ抽出後の試料に界面活性剤耐性
ルシフェラーゼを含む生物発光試薬を添加して発光を生
じさせ、生じた発光を検出する。界面活性剤耐性ルシフ
ェラーゼがホタル由来のものである場合、生物発光試薬
とは、例えば以下の（イ）〜（ハ）の成分を含む試薬で
ある。 （イ）界面活性剤耐性ルシフェラーゼ （ロ）ルシフェリン （ハ）マグネシウムイオンまたは他の金属イオン なお、発光試薬には上記の成分のほか、ｐＨ調製や保存
性向上に関与する物質を添加してもよい。そのような物
質としては、例えば、EDTA 2Na、ジチオスレイトール、
硫酸アンモニウム、シュークロース、2-メルカプトエタ
ノール、HEPES、Tricine、Tris、等が挙げられる。

【００３１】iii) 生物発光試薬の添加により生じた光
の発光量は、ルミノメーター、例えばキッコーマン社製
ルミテスターK-100、アロカ社製ルミネッセンスリーダ
ーＢＬＲ−２０１（改良型）、ベルトールド社製Lumat
LB9501等により測定することができる。また、細胞を捕
捉した濾過膜を試料とする場合、生物発光画像解析シス
テム装置、例えばＡＲＧＵＳー５０／ＣＬ〔テーパーフ
ァイバー付：浜松ホトニクス（株）社製〕を用いて濾過
膜上の輝点を撮像することにより、細胞数を測定するこ
とが可能である。

【００３２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。ただし、本発明はこれらの実施例にそのその技
術的範囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕 各種ホタル由来の天然型ルシフェラーゼ
の界面活性剤耐性 （各種ホタル由来の野生型ルシフェラーゼの調製法）以
下の方法に準じて、ゲンジおよびヘイケボタル由来のル
シフェラーゼを調製した。すなわち、25mMトリス（ヒド
ロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液に、1mMエチレンジ
アミン４酢酸２ナトリウム及び2mMフェニルメチルスル
フォニルフルオリドを添加し、更に硫酸アンモニウムを
10％飽和となる如く添加して得た混液（pH7.8）に、各
種ホタルの尾部を添加してヒスコトロン〔（株）日音医
理科器械製作所製〕を用いて破壊した。得られた溶液を
12,000r.p.m.で20分間遠心分離し、上清を以下の精製工
程の出発原料とした。精製は、硫酸アンモニウム塩析、
ウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ34（ＬＫＢ社製）カラ
ム、ヒドロキシ−アパタイトＨＰＬＣ（東洋曹達工業社
製、ＴＳＫgel ＨＡ−1000）カラムの工程により行い、
最終的に電気泳動的に単一な標品を得た。なお、アメリ
カホタル由来のルシフェラーゼは市販品（Sigma社製、L
-9506）を使用した。

【００３３】（ルシフェラーゼの活性測定法）ルシフェ
ラーゼ標品を酵素希釈液（1 mM EDTA, 1 mM 2-メルカプ
トエタノール, 1% BSA, 50 mM HEPES, (pH 7.5)）にて
適宜希釈し、その100μｌに100μｌの基質溶液（1.4 mM
ルシフェリン, 40 mM ATP, 300 mM MgSO4.7H2O, 50 mM
HEPES,(pH 7.5)）を添加した。発光量の測定は、BLR-20
1 Luminescence reader（アロカ社製）を用いて以下の
設定条件で測定を行った。 測定レンジ：x100 表示数値：x1000 測定温度：30℃ 測定時間：20秒間 この条件での測定値が1 Kcountの時の活性値を1 MLU（メ
カ゛ライトユニット）/mlとした。

【００３４】（界面活性剤耐性の測定法）各種ホタル由
来ルシフェラーゼ標品を0.5 MLU/mlの濃度になるよう酵
素希釈液（1 mM EDTA, 1 mM 2-メルカプトエタノール,
5%グリセロール, 50 mM HEPES (pH 7.5)）を用いて調
整し、酵素標品とした。100μｌの基質溶液（4 mM ATP,
0.4 mMルシフェリン, 10 mM 硫酸マグネシウム, 50 mM
HEPES (pH 7.5)）に50μｌの0.4%塩化ベンザルコニウ
ム（25 mM Tricine (pH 7.75)）を添加し、さらに50μ
ｌの酵素標品を添加して、5秒撹拌した後にBerthold Lu
mat LB-9501にて１秒ごとに１分間の発光量を経時的に
測定した。その結果を図２に示す。図中縦軸には、0.4%
塩化ベンザルコニウムの代わりに25 mM Tricine (pH 7.
75)を使用したときの初発発光量を100%とした際の発光
量の相対比をプロットしている。

【００３５】この結果において、アメリカホタルルシフ
ェラーゼは初発の発光量が低く、また発光量が急激に減
衰しているのがわかる。これはアメリカホタルルシフェ
ラーゼの界面活性剤耐性が低いためであり、感度の低下
および測定値の精度の低下を招く。これに対し、ゲンジ
ボタルルシフェラーゼはアメリカホタルルシフェラーゼ
と比べ初発の発光量が高かった。すなわち、ゲンジボタ
ルルシフェラーゼはアメリカホタルルシフェラーゼより
界面活性剤耐性が優れていることが示された。さらにヘ
イケボタルルシフェラーゼはゲンジボタルルシフェラー
ゼより初発の発光量が高く、発光の減衰も緩やかであっ
たことから、優れた耐性を示すことが明らかになった。
この結果より、ルシフェラーゼの界面活性剤に対する耐
性度は、起源とするホタルの種類により異なっているこ
とが示唆された。

【００３６】〔実施例２〕 変異型ルシフェラーゼHLK
およびHIKの作製 以下の方法により、ヘイケボタルを由来とする２種類の
変異型ルシフェラーゼ（「HLK」及び「HIK」と命名）を
調製した。 （変異型ルシフェラーゼHLKをコードする遺伝子の作
製）PCRを用いた部位特異的変異法により、変異型ルシ
フェラーゼ遺伝子を作成した。PCR反応の鋳型として特
開平5-244942号公報記載のプラスミドpHLf7-217Leu（プ
ラスミドpUC119に、217番目のAlaに相当する遺伝子部分
がLeuをコードする遺伝子に置換された耐熱性ヘイケボ
タルルシフェラーゼの遺伝子が挿入された組み換え体プ
ラスミド）を使用した。なお、該プラスミドが導入され
た大腸菌JM101株は、大腸菌（E. coli）JM101(pHLf7-21
7Leu)と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-3840として寄託されている。

【００３７】PCR反応のプライマーとして配列番号１、
２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、またDN
A polymeraseとしてのKOD dash polymerase（TOYOBO社
製）を使用した。KOD dash polymerase に付属の実施例
に準じてGeneAmp PCR System9600（Perkin Elmer社製）
を用い、94℃で30秒、50℃で2秒、74℃で3分のサイクル
を30サイクル繰り返し、PCR反応を行った。生じたPCR産
物を常法に従ってLigationを行い、環状の組み換え体プ
ラスミドpHLfLKを得た。

【００３８】pHLfLKに含まれる変異型ルシフェラーゼ遺
伝子のシークエンシングを行った。ダイプライマータッ
クシークエンシングキット（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いて反応を行い、ABI 373A DNAシークエン
サー（アプライドバイオシステムズ社製）で泳動解析を
行った。このようにして得られた変異型ルシフェラーゼ
遺伝子の全塩基配列を配列番号３に、また、該遺伝子が
コードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に
示す。変異型ルシフェラーゼ遺伝子では、野性型ヘイケ
ボタルルシフェラーゼの217番目のアラニンに相当する
遺伝子部分がロイシンに、また490番目のグルタミン酸
に相当する遺伝子部分がリジンをコードする遺伝子に置
換されていた。

【００３９】pHLfLKを導入した大腸菌JM109株を、大腸
菌（E. coli）JM109(pHLfLK)と命名した（図１参照）。
大腸菌（E. coli）JM109(pHLfLK)は、工業技術院生命工
学工業技術研究所にFERM BP-６１４７として寄託され
ている。配列番号４に示すポリペプチドを、変異型ルシ
フェラーゼＨＬＫと命名した。

【００４０】（変異型ルシフェラーゼHIKをコードする
遺伝子の作製）特開平5-244942号公報記載のプラスミド
pHLf7-217Ile（プラスミドpUC119に、217番目のAlaに相
当する遺伝子部分がIleをコードする遺伝子に置換され
た耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼの遺伝子が挿入さ
れた組み換え体プラスミド）を用いて変異型ルシフェラ
ーゼ遺伝子を作成した。該プラスミドによる形質転換株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-384
1として寄託されている。

【００４１】pHLfLKをEcoRVおよびNarIで切断し得られ
た約560bpの断片をアガロースゲル電気泳動により取得
し、同じ制限酵素で処理したpHLf7-217Ileに挿入した。
このようにして得られた組み換え体プラスミドをpHLfIK
と命名し、該プラスミドを導入した大腸菌JM109株を大
腸菌（E. coli）JM109(pHLfIK)と命名した。大腸菌（E.
coli）JM109(pHLfIK)は、工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERMBP-６１４６として寄託されている。

【００４２】pHLfIKに含まれる変異型ルシフェラーゼ遺
伝子の全塩基配列を配列番号5に、また、該遺伝子がコ
ードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号6に示
す。変異型ルシフェラーゼ遺伝子では、野性型ヘイケボ
タルルシフェラーゼの217番目のアラニンに相当する遺
伝子部分がイソロイシンに、また490番目のグルタミン
酸に相当する遺伝子部分がリジンをコードする遺伝子に
置換されていた（図１参照）。配列番号６に示すポリペ
プチドを、変異型ルシフェラーゼＨＩＫと命名した。

【００４３】〔実施例３〕 変異型ルシフェラーゼHLK
およびHIKの調製 大腸菌（E. coli）JM109(pHLfLK)及び大腸菌（E. col
i）JM109(pHLfIK)を、それぞれアンピシリンを含むＬＢ
培地〔バクトトリプトン１％（W/V）、酵母エキス 0.5
％（W/V）、NaCl 0.5％（W/V）、アンピシリン（50μg/
ml）、1.4％（W/V）寒天〕に接種し、３７℃で１８時間
培養を行なった。得られた培養液を、8000r.p.m.で１０
分間の遠心分離し、沈殿した菌体を0.1 M リン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.8）、0.1 M 硫酸アンモニウム、1 mM ED
TA〕に懸濁した後、超音波破砕した。次いで、12000 r.
p.m.で１０分間遠心分離を行ない、粗酵素液を得た。得
られた粗酵素液を前述した精製法により、電気泳動的に
単一にまで精製した。

【００４４】〔実施例４〕 変異型ルシフェラーゼHLK
およびHIKの界面活性剤耐性 （発光の経時変化）変異型ルシフェラーゼと公知のルシ
フェラーゼとの界面活性剤耐性を比較するため、前述し
た界面活性剤耐性の測定法に準じて発光量の経時変化を
測定した。界面活性剤として、0.4 ％塩化ベンザルコニ
ウム(25mM Tricine(pH 7.75)) を使用した結果を図３
に、0.８％塩化ベンゼトニウム(25mM Tricine(pH 7.7
5)) を使用した結果を図４に示す。

【００４５】図中「ヘイケＩ変異体」は、野性型ヘイケ
ボタルルシフェラーゼの217番目のAlaがIle に置換され
た耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（特開平5-244942
号公報) であり、「ヘイケＬ変異体」は、野性型ヘイケ
ボタルルシフェラーゼの２１７番目のＡｌａがLeu に置
換された耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（特開平5-
244942号) である。また、「ＨＩＫ」はヘイケＩ変異体
の４９０番目のGlu をLysに置換した変異体であり、実
施例３で調製した変異型ルシフェラーゼＨＩＫである。
「ＨＬＫ」はヘイケＬ変異体の４９０番目のGlu をLys
に置換した変異体であり、実施例３で調製した変異型ル
シフェラーゼＨＩＫである。

【００４６】図３に示した塩化ベンザルコニウムの結果
において、ＨＩＫとヘイケＩ変異体とを比較するとＨＩ
Ｋのほうが発光の減衰が穏やかであることがわかる。ま
た、ＨＬＫとヘイケＬ変異体とを比較すると、ＨＬＫの
ほうが初発発光量が20％程度向上しており、また発光の
減衰が穏やかであることがわかる。このことより４９０
番目のアミノ酸の置換により界面活性剤耐性が向上して
いることが示された。

【００４７】図４に示した塩化ベンゼトニウムの結果に
おいて、ＨＩＫとヘイケＩ変異体とを比較すると、ＨＩ
Ｋのほうが発光の減衰が穏やかであることがわかる。ま
た、ＨＬＫとヘイケＬ変異体とを比較すると、ＨＬＫの
ほうが発光の減衰が穏やかであることがわかる。このこ
とより４９０番目のアミノ酸の置換により界面活性剤耐
性が向上していることが示された。

【００４８】（発光率の比較）発光の経時変化を測定す
る際に使用した酵素溶液、基質溶液および塩化ベンザル
コニウムを用い、実際の発光測定条件下での測定値への
影響を調べた。Berthold Lumat LB-9501を用い、待ち時
間５秒、測定時間３秒の測定条件で求めた発光量を表１
に示す。なお、0.4%塩化ベンザルコニウムの代わりに25
mM Tricine (pH 7.75)を使用したときの発光量をコン
トロールとし、0.4%塩化ベンザルコニウム存在時の発光
量をコントロール値で割った値を発光率（残存活性）と
して算出した。

【００４９】

【表１】

【００５０】アメリカボタルルシフェラーゼは発光率が
21.6%と最も低く、感度が大幅に低下することが示唆さ
れた。これに対しゲンジボタルルシフェラーゼおよびヘ
イケボタルルシフェラーゼの発光率はそれぞれ41.0%お
よび76.3%であり、アメリカボタルルシフェラーゼと比
較し感度低下の影響が少ないことがわかる。

【００５１】一方、変異型ルシフェラーゼHIKおよびHLK
の発光率はそれぞれ89.3%および101.7%であり、野性型
のヘイケボタルルシフェラーゼおよび耐熱性ヘイケボタ
ルルシフェラーゼの発光率を大きく上回った。中でもHL
Kの発光率はほぼ100%であり、界面活性剤の有無にかか
わらず同じ発光量を得ることが出来る。すなわち界面活
性剤を用いても感度低下を全く受けず、精度の高い測定
が可能であることが示された。

【００５２】（IC50の比較）塩化ベンザルコニウムと各
種ルシフェラーゼを10分間接触させ、活性の50%を失活
させる塩化ベンザルコニウム濃度（IC50）を求めた。前
述した濃度に調整したルシフェラーゼ溶液と0.01〜0.1%
までの塩化ベンザルコニウムを等量で混和し、10分間室
温で放置した。その後、100 μｌの基質溶液を添加し
て、Berthold Lumat LB-9501にて直ちに発光量を測定し
た。得られたIC50を表２にまとめた。

【００５３】

【表２】

【００５４】野性型ルシフェラーゼ３種のうちアメリカ
ホタルルシフェラーゼは最も低いIC50を示し、界面活性
剤に対する耐性が最も劣っていることが示された。ヘイ
ケボタルルシフェラーゼは野性型の中で最も高いIC50を
示した。HLKおよびHIKは、野性型ヘイケボタルルシフェ
ラーゼおよび耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼのIC50
を更に上回り、490番目のアミノ酸の置換により耐性が
向上したことが示された。中でもHLKの IC50はHIKを上
回り、最も界面活性剤耐性が優れていることが示唆され
た。

【００５５】〔実施例５〕 （細胞内ATPの測定法) 次に、本発明の界面活性剤耐性ルシフェラーゼを用いた
細胞内ATPの測定法について説明する。なお、従来法と
して、トリクロロ酢酸（TCA)により細胞内ATPを抽出
し、抽出されたATP量をルシフェリン−ルシフェラーゼ
発光反応により測定する方法（TCA抽出法) を採用し
た。TCA 抽出法はATP の抽出効率が非常に優れており、
また、TCA を含む試料を１００倍に希釈した後に発光を
測定するので、TCA による発光反応の阻害も生じない。
しかし、この希釈操作のため、TCA 抽出法は、操作が煩
雑となり、また、測定感度の低下が起こるという問題が
ある。

【００５６】１．実験材料 （１）使用した界面活性剤 界面活性剤として、塩化ベンザルコニウム（BAC、日本
薬局法のオスバン液)を使用した。上記界面活性剤を 0.
25 ％濃度で25mM Tricine(pH 7.75) に溶解したもの
を、ATP抽出用試薬とした。 （２）使用した微生物 Escherichia coli(ATCC 25922)、Staphylococcus aureu
s (ATCC 25923)、Pseudomonas aeruginosa (ATCC 2785
3) およびEnterococcus faecalis (ATCC 29212)の4 菌
種を使用した。

【００５７】（３）試料の調製 従来法では、上記微生物を普通ブイヨン培地（栄研化学
（株）製）で一晩３５℃で培養して得られた培養液の原
液を試料とした。一方、本発明の方法では、該培養液の
原液を滅菌水で100 倍希釈して得られた希釈液を試料と
した。 （４）使用したルシフェラーゼ 本発明の界面活性剤耐性ルシフェラーゼとして、ＨＩＫ
及びＨＬＫを使用した。また、対照として公知のルシフ
ェラーゼ種（アメリカボタルルシフェラーゼ、ゲンジボ
タルルシフェラーゼ、ヘイケボタルルシフェラーゼ、ヘ
イケＩ変異体、ヘイケＬ変異体）を使用した。

【００５８】（５）発光試薬 各種ルシフェラーゼを、0.15 mM ルシフェリン、6 mM E
DTA, 15 mM酢酸マグネシウム、0.2 mMジチオスレイトー
ル、0.5 ％ BSA、25 mM HEPES(pH 7.75)の溶液に添加
し、発光試薬として用いた。添加するルシフェラーゼ量
は、発光試薬100μl に等量の2x10^-8MのATP 標準液を添
加した時の発光量が、発光試薬として「ルシフェラーゼ
LU 」( キッコーマン社製) に付属の発光試薬を用いた
時と同じになるように調整した。

【００５９】２．細胞内ＡＴＰの測定法について （１）本発明の方法 試料100μlにATP抽出用試薬100μlを添加した。20秒間
室温で放置した後、発光試薬100μlを添加し、直ちに発
光量をBerthold社製Lumat LB-9501 を用いて測定した。 （２）従来法 試料100μlに等量の10％のトリクロロ酢酸溶液を加えて
１分間放置した。その抽出液に 9.8 ml の25mM Tricine
(pH 7.75 )を添加してよく攪拌した。この試料100μlに
100μl の25mM Tricine(pH 7.75 )および「ルシフェー
ル LU 」( キッコーマン社製) に付属の発光試薬100μl
を添加し、直ちに発光量をBerthold社製Lumat LB-9501
を用いて測定した。 ３．結果 結果を表３及び表４に示す。また、従来法（TCA抽出法)
で得られた発光量を100％とした際に、各種ルシフェラ
ーゼを用いた発光試薬で得られた発光量の相対比も表中
に示した。

【００６０】

【表３】

【００６１】

【表４】

【００６２】アメリカボタルルシフェラーゼを用いた発
光試薬は全く発光せず、またゲンジボタルルシフェラー
ゼの場合も微弱な発光しか示さなかった。これは、ルシ
フェラーゼ自体が界面活性剤により失活してしまったた
めである。従って、これらのルシフェラーゼには、ATP
抽出用試薬として本検討で用いたような高濃度の界面活
性剤は使用出来ないことが示された。

【００６３】一方、ヘイケボタルルシフェラーゼの場
合、アメリカボタルルシフェラーゼやゲンジボタルルシ
フェラーゼと異なり、TCA抽出法の６〜７割程度の発光
が認められた。ヘイケボタルルシフェラーゼは、アメリ
カボタルルシフェラーゼやゲンジボタルルシフェラーゼ
より高い界面活性剤耐性を有することが示された。耐熱
性ヘイケボタルルシフェラーゼであるヘイケＩ変異体お
よびヘイケＬ変異体の場合、得られた発光量はTCA抽出
法の４割前後であり、野性型のヘイケボタルルシフェラ
ーゼの場合を大きく下回った。

【００６４】ところで、本発明の界面活性剤耐性ルシフ
ェラーゼ、すなわちＨＩＫ及びＨＬＫの場合、得られた
発光量は野性型ヘイケボタルルシフェラーゼ及び耐熱性
ルシフェラーゼを上回るものであった。また、この場合
の発光量は、TCA抽出法の６〜８割であった。ＨＩＫ及
びＨＬＫは、ヘイケＩ変異体およびヘイケＬ変異体の49
0位のGlu をLys に置換したものである。490位のアミノ
酸への変異の導入により、界面活性剤に対する耐性が向
上したものと考えられる。従って、ＨＩＫ及びＨＬＫ
は、本検討で用いたような高濃度のATP 抽出用試薬に対
しても感度低下は少ないので、これらを用いることによ
り、精度の高い測定が可能であることが示された。

【００６５】

【発明の効果】本発明により界面活性剤に耐性を有する
新規なルシフェラーゼが提供される。さらに、この新規
なルシフェラーゼを用いて細胞内ＡＴＰを測定すること
により界面活性剤が高濃度に存在する場合でもルシフェ
ラーゼ活性が低下することなく細胞内ＡＴＰを測定する
ことができる。

【００６６】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：合成ＤＮＡ 配列番号２：合成ＤＮＡ

【００６７】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> LUCIFERASE AND A METHOD FOR DETECTING INTRAC
ELLULAR ATPUSING THE SAME <130> P98-0634 <140> <141> <150> JP97/361022 <151> 1997-12-26 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 tgttgtactt aagaaaggaa aat 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 acagctcccg gaagctcacc agc 23 <210> 3 <211> 1644 <212> DNA <213> Luciola lateralis <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <400> 3 atg gaa aac atg gag aac gat gaa aat att gtg tat ggt cct gaa cca 48 Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 1 5 10 15 ttt tac cct att gaa gag gga tct gct gga gca caa ttg cgc aag tat 96 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 atg gat cga tat gca aaa ctt gga gca att gct ttt act aac gca ctt 144 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 acc ggt gtc gat tat acg tac gcc gaa tac tta gaa aaa tca tgc tgt 192 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 cta gga gag gct tta aag aat tat ggt ttg gtt gtt gat gga aga att 240 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 gcg tta tgc agt gaa aac tgt gaa gaa ttc ttt att cct gta tta gcc 288 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 ggt tta ttt ata ggt gtc ggt gtg gct cca act aat gag att tac act 336 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 cta cgt gaa ttg gtt cac agt tta ggc atc tct aag cca aca att gta 384 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 ttt agt tct aaa aaa gga tta gat aaa gtt ata act gta caa aaa acg 432 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 gta act gct att aaa acc att gtt ata ttg gac agc aaa gtg gat tat 480 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 aga ggt tat caa tcc atg gac aac ttt att aaa aaa aac act cca caa 528 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 ggt ttc aaa gga tca agt ttt aaa act gta gaa gtt aac cgc aaa gaa 576 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 caa gtt gct ctt ata atg aac tct tcg ggt tca acc ggt ttg cca aaa 624 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 ggt gtg caa ctt act cat gaa aat ttg gtc act aga ttt tct cac gct 672 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 aga gat cca att tat gga aac caa gtt tca cca ggc acg gct att tta 720 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 act gta gta cca ttc cat cat ggt ttt ggt atg ttt act act tta ggc 768 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 tat cta act tgt ggt ttt cgt att gtc atg tta acg aaa ttt gac gaa 816 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 gag act ttt tta aaa aca ctg caa gat tac aaa tgt tca agc gtt att 864 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 ctt gta ccg act ttg ttt gca att ctt aat aga agt gaa tta ctc gat 912 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 aaa tat gat tta tca aat tta gtt gaa att gca tct ggc gga gca cct 960 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 tta tct aaa gaa att ggt gaa gct gtt gct aga cgt ttt aat tta ccg 1008 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 ggt gtt cgt caa ggc tat ggt tta aca gaa aca acc tct gca att att 1056 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 atc aca ccg gaa ggc gat gat aaa cca ggt gct tct ggc aaa gtt gtg 1104 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 cca tta ttt aaa gca aaa gtt atc gat ctt gat act aaa aaa act ttg 1152 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 ggc ccg aac aga cgt gga gaa gtt tgt gta aag ggt cct atg ctt atg 1200 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 aaa ggt tat gta gat aat cca gaa gca aca aga gaa atc ata gat gaa 1248 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 gaa ggt tgg ttg cac aca gga gat att ggg tat tac gat gaa gaa aaa 1296 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 cat ttc ttt atc gtg gat cgt ttg aag tct tta atc aaa tac aaa gga 1344 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 tat caa gta cca cct gct gaa tta gaa tct gtt ctt ttg caa cat cca 1392 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 aat att ttt gat gcc ggc gtt gct ggc gtt cca gat cct ata gct ggt 1440 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 gag ctt ccg gga gct gtt gtt gta ctt aag aaa gga aaa tct atg act 1488 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Lys Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 gaa aaa gaa gta atg gat tac gtt gct agt caa gtt tca aat gca aaa 1536 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 cgt ttg cgt ggt ggt gtc cgt ttt gtg gac gaa gta cct aaa ggt ctc 1584 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 act ggt aaa att gac ggt aaa gca att aga gaa ata ctg aag aaa cca 1632 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 gtt gct aag atg 1644 Val Ala Lys Met 545 <210> 4 <211> 548 <212> PRT <213> Luciola lateralis <400> 4 Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Lys Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 Val Ala Lys Met 545 <210> 5 <211> 1644 <212> DNA <213> Luciola lateralis <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <400> 5 atg gaa aac atg gag aac gat gaa aat att gtg tat ggt cct gaa cca 48 Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 1 5 10 15 ttt tac cct att gaa gag gga tct gct gga gca caa ttg cgc aag tat 96 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 atg gat cga tat gca aaa ctt gga gca att gct ttt act aac gca ctt 144 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 acc ggt gtc gat tat acg tac gcc gaa tac tta gaa aaa tca tgc tgt 192 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 cta gga gag gct tta aag aat tat ggt ttg gtt gtt gat gga aga att 240 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 gcg tta tgc agt gaa aac tgt gaa gaa ttc ttt att cct gta tta gcc 288 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 ggt tta ttt ata ggt gtc ggt gtg gct cca act aat gag att tac act 336 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 cta cgt gaa ttg gtt cac agt tta ggc atc tct aag cca aca att gta 384 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 ttt agt tct aaa aaa gga tta gat aaa gtt ata act gta caa aaa acg 432 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 gta act gct att aaa acc att gtt ata ttg gac agc aaa gtg gat tat 480 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 aga ggt tat caa tcc atg gac aac ttt att aaa aaa aac act cca caa 528 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 ggt ttc aaa gga tca agt ttt aaa act gta gaa gtt aac cgc aaa gaa 576 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 caa gtt gct ctt ata atg aac tct tcg ggt tca acc ggt ttg cca aaa 624 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 ggt gtg caa ctt act cat gaa aat atc gtc act aga ttt tct cac gct 672 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Ile Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 aga gat cca att tat gga aac caa gtt tca cca ggc acg gct att tta 720 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 act gta gta cca ttc cat cat ggt ttt ggt atg ttt act act tta ggc 768 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 tat cta act tgt ggt ttt cgt att gtc atg tta acg aaa ttt gac gaa 816 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 gag act ttt tta aaa aca ctg caa gat tac aaa tgt tca agc gtt att 864 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 ctt gta ccg act ttg ttt gca att ctt aat aga agt gaa tta ctc gat 912 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 aaa tat gat tta tca aat tta gtt gaa att gca tct ggc gga gca cct 960 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 tta tct aaa gaa att ggt gaa gct gtt gct aga cgt ttt aat tta ccg 1008 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 ggt gtt cgt caa ggc tat ggt tta aca gaa aca acc tct gca att att 1056 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 atc aca ccg gaa ggc gat gat aaa cca ggt gct tct ggc aaa gtt gtg 1104 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 cca tta ttt aaa gca aaa gtt atc gat ctt gat act aaa aaa act ttg 1152 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 ggc ccg aac aga cgt gga gaa gtt tgt gta aag ggt cct atg ctt atg 1200 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 aaa ggt tat gta gat aat cca gaa gca aca aga gaa atc ata gat gaa 1248 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 gaa ggt tgg ttg cac aca gga gat att ggg tat tac gat gaa gaa aaa 1296 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 cat ttc ttt atc gtg gat cgt ttg aag tct tta atc aaa tac aaa gga 1344 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 tat caa gta cca cct gct gaa tta gaa tct gtt ctt ttg caa cat cca 1392 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 aat att ttt gat gcc ggc gtt gct ggc gtt cca gat cct ata gct ggt 1440 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 gag ctt ccg gga gct gtt gtt gta ctt aag aaa gga aaa tct atg act 1488 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Lys Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 gaa aaa gaa gta atg gat tac gtt gct agt caa gtt tca aat gca aaa 1536 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 cgt ttg cgt ggt ggt gtc cgt ttt gtg gac gaa gta cct aaa ggt ctc 1584 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 act ggt aaa att gac ggt aaa gca att aga gaa ata ctg aag aaa cca 1632 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 gtt gct aag atg 1644 Val Ala Lys Met 545 <210> 6 <211> 548 <212> PRT <213> Luciola lateralis <400> 6 Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Ile Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Lys Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 Val Ala Lys Met 545

【図面の簡単な説明】

【図１】変異型ルシフェラーゼHIKの遺伝子の作製図。

【図２】天然型ルシフェラーゼの発光量の経時変化を示
す図。

【図３】変異型ルシフェラーゼの塩化ベンザルコニウム
に対する耐性比較を示す図。

【図４】変異型ルシフェラーゼの塩化ベンゼトニウムに
対する耐性比較を示す図。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 界面活性剤に耐性を有するルシフェラー
   ゼ。
2. 【請求項２】 ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に
   おいて、ゲンジボタルもしくはヘイケボタルのルシフェ
   ラーゼの490位と同等位置のアミノ酸が、グルタミン酸
   以外の他のアミノ酸に置換されたものである、請求項１
   記載のルシフェラーゼ。
3. 【請求項３】 グルタミン酸以外の他のアミノ酸がリジ
   ンである、請求項２に記載のルシフェラーゼ。
4. 【請求項４】 以下の（ａ）又は（ｂ）からなる請求項
   １記載のルシフェラーゼ。 （ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド （ｂ）（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１
   若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換され
   たアミノ酸配列からなり、かつ界面活性剤に耐性を有す
   るルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
5. 【請求項５】 以下の（ａ）又は（ｂ）からなる請求項
   １記載のルシフェラーゼ。 （ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド （ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて１若しくは複数の
   アミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列
   からなり、かつ界面活性剤に耐性を有するルシフェラー
   ゼ活性を有するポリペプチド
6. 【請求項６】 請求項１乃至５のいずれかの項記載のル
   シフェラーゼをコードする、ルシフェラーゼ遺伝子。
7. 【請求項７】 請求項６記載のルシフェラーゼ遺伝子を
   含む組換ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載の組換ベクターを含む形質
   転換体。
9. 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体を培地に培養
   し、得られる培養物からルシフェラーゼを採取すること
   を特徴とするルシフェラーゼの製造法。
10. 【請求項１０】 細胞を含む試料から界面活性剤の存在
    下にＡＴＰを抽出する第１工程、該ＡＴＰ抽出液にルシ
    フェラーゼを含む発光試薬を添加して発光させる第２工
    程、および該発光量を検出する第３工程を含む細胞内Ａ
    ＴＰの測定法において、ルシフェラーゼとして、界面活
    性剤に耐性を有するルシフェラーゼを使用することを特
    徴とする細胞内ＡＴＰの測定法。
11. 【請求項１１】 界面活性剤に耐性を有するルシフェラ
    ーゼが請求項１乃至５のいずれかの項記載のルシフェラ
    ーゼであることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞
    内ＡＴＰの測定法。
12. 【請求項１２】 発光試薬の添加による発光が、0.01％
    以上の界面活性剤の存在下で行なわれる請求項１０また
    は１１に記載の細胞内ＡＴＰの測定法。
13. 【請求項１３】 界面活性剤がカチオン系界面活性剤、
    アニオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤、ツイッ
    ターイオン系界面活性剤のいずれかである請求項１０、
    １１または１２に記載の細胞内ＡＴＰの測定法。