JPH1189592A - 微生物ａｔｐの測定方法 - Google Patents
微生物ａｔｐの測定方法Info
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- JPH1189592A JPH1189592A JP28284597A JP28284597A JPH1189592A JP H1189592 A JPH1189592 A JP H1189592A JP 28284597 A JP28284597 A JP 28284597A JP 28284597 A JP28284597 A JP 28284597A JP H1189592 A JPH1189592 A JP H1189592A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 食品などの遊離ＡＴＰを多量に含有した測定
試料の遊離ＡＴＰのみをＡＴＰ分解酵素で分解して、試
料の微生物ＡＴＰを生物化学発光法により高精度に測定
することを可能とした微生物ＡＴＰの測定方法にある。 【解決手段】 微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解試
薬を含んだ試料をろ過材でろ過して、試料中に含まれる
微生物をろ過材上に捕捉する。ついでろ過材を無菌の洗
浄液で洗浄して、ろ過材および微生物に付着した試料溶
液に溶解しているＡＴＰ分解試薬を洗い流し、除去す
る。その後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試薬を
適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した
微生物ＡＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリ
ンによる生物化学発光法を用いて測定する。
試料の遊離ＡＴＰのみをＡＴＰ分解酵素で分解して、試
料の微生物ＡＴＰを生物化学発光法により高精度に測定
することを可能とした微生物ＡＴＰの測定方法にある。 【解決手段】 微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解試
薬を含んだ試料をろ過材でろ過して、試料中に含まれる
微生物をろ過材上に捕捉する。ついでろ過材を無菌の洗
浄液で洗浄して、ろ過材および微生物に付着した試料溶
液に溶解しているＡＴＰ分解試薬を洗い流し、除去す
る。その後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試薬を
適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した
微生物ＡＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリ
ンによる生物化学発光法を用いて測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物化学発光法を
利用した微生物ＡＴＰの測定方法に関し、特に試料中に
含まれる遊離ＡＴＰを除去する分解試薬の影響を除い
て、微生物ＡＴＰの濃度を高精度に測定可能とした測定
方法に関するものである。
利用した微生物ＡＴＰの測定方法に関し、特に試料中に
含まれる遊離ＡＴＰを除去する分解試薬の影響を除い
て、微生物ＡＴＰの濃度を高精度に測定可能とした測定
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌、酵母菌、乳酸菌およびその他の
微生細の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、
超純水、環境などの分野において非常に重要である。一
般に、微生物測定は、成長培地中のコロニーの計測、血
球計算盤による顕微鏡下の計測、濁度測定などによって
行なわれている。
微生細の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、
超純水、環境などの分野において非常に重要である。一
般に、微生物測定は、成長培地中のコロニーの計測、血
球計算盤による顕微鏡下の計測、濁度測定などによって
行なわれている。
【０００３】成長培地中のコロニー計測による方法は、
高感度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞種が同定できる等の点で優れている。
しかし、細胞の培養を必要とするので、測定に通常１日
以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さな
い。
高感度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞種が同定できる等の点で優れている。
しかし、細胞の培養を必要とするので、測定に通常１日
以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さな
い。
【０００４】血球計算盤による方法は、顕微鏡を用いる
ために操作が煩雑である、自動化が困難である等の欠点
を有している。
ために操作が煩雑である、自動化が困難である等の欠点
を有している。
【０００５】濁度測定による方法は、迅速で自動化が容
易である点で優れているが、感度が低い、生細胞と死細
胞が区別ができない、発酵乳などベースの濁度が高い試
料には適用できない等の問題点を有している。
易である点で優れているが、感度が低い、生細胞と死細
胞が区別ができない、発酵乳などベースの濁度が高い試
料には適用できない等の問題点を有している。
【０００６】ところで、上記分野における微生物測定に
は、迅速かつ高感度の測定が要求される。たとえば食品
衛生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の
検査は必要不可欠である。従来、この検査はコロニー計
測法によって行なわれているが、検査に１日以上を要す
るために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかね
ばならない。このため流通効率の点で問題があるだけで
なく、牛乳などの製品では保管時間が長くなるにつれて
微生物汚染の可能性が高くなる。又、食品で汚染を問題
にする微生物濃度は総じて低濃度であるので、高感度な
検査が要求される。
は、迅速かつ高感度の測定が要求される。たとえば食品
衛生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の
検査は必要不可欠である。従来、この検査はコロニー計
測法によって行なわれているが、検査に１日以上を要す
るために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかね
ばならない。このため流通効率の点で問題があるだけで
なく、牛乳などの製品では保管時間が長くなるにつれて
微生物汚染の可能性が高くなる。又、食品で汚染を問題
にする微生物濃度は総じて低濃度であるので、高感度な
検査が要求される。
【０００７】上記の要求を満たす微生物濃度測定法とし
て、生きた微生物中に必ず存在するアデノシン３リン酸
（ＡＴＰ）を、蛍発光の基質であるルシェフェリンとそ
の酵素であるルシェフェラーゼを用いて生物化学発光法
により測定する方法が知られている。この方法は微生物
に含まれるＡＴＰ濃度が微生物濃度に比例することを利
用しており、測定時間が短く、高感度であるために非常
に有効な方法である。
て、生きた微生物中に必ず存在するアデノシン３リン酸
（ＡＴＰ）を、蛍発光の基質であるルシェフェリンとそ
の酵素であるルシェフェラーゼを用いて生物化学発光法
により測定する方法が知られている。この方法は微生物
に含まれるＡＴＰ濃度が微生物濃度に比例することを利
用しており、測定時間が短く、高感度であるために非常
に有効な方法である。
【０００８】しかしながら、食品などではほとんどの場
合、微生物に由来しないＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を含んで
おり、生物化学発光法により微生物ＡＴＰだけを測定す
ることは困難である。また、遊離ＡＴＰの濃度は微生物
ＡＴＰと比べると桁違に高い場合が多く、生物化学発光
法による微生物ＡＴＰの測定をさらに困難なものにして
いる。
合、微生物に由来しないＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を含んで
おり、生物化学発光法により微生物ＡＴＰだけを測定す
ることは困難である。また、遊離ＡＴＰの濃度は微生物
ＡＴＰと比べると桁違に高い場合が多く、生物化学発光
法による微生物ＡＴＰの測定をさらに困難なものにして
いる。
【０００９】そこで、これらの問題を解決するために、
ＡＴＰ分解酵素であるアピラーゼなどを測定試料に作用
させ、微生物に由来しない遊離ＡＴＰを予め分解してか
ら、生物化学発光法による測定を行なう方法が開発され
ている。
ＡＴＰ分解酵素であるアピラーゼなどを測定試料に作用
させ、微生物に由来しない遊離ＡＴＰを予め分解してか
ら、生物化学発光法による測定を行なう方法が開発され
ている。
【００１０】この方法では、測定試料にＡＴＰ分解酵素
を添加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、遊離ＡＴＰを
分解した測定試料にＡＴＰ抽出試薬を添加して、試料中
の微生物細胞からＡＴＰを抽出し、微生物ＡＴＰを抽出
した試料にルシェフェラーゼとルシェフェリンを添加し
て、生物化学発光法により微生物ＡＴＰの濃度を測定す
る。
を添加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、遊離ＡＴＰを
分解した測定試料にＡＴＰ抽出試薬を添加して、試料中
の微生物細胞からＡＴＰを抽出し、微生物ＡＴＰを抽出
した試料にルシェフェラーゼとルシェフェリンを添加し
て、生物化学発光法により微生物ＡＴＰの濃度を測定す
る。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、遊離Ａ
ＴＰを効率よく短時間で分解するためには、測定試料の
ＡＴＰ分解酵素の濃度を十分に高くする必要があり、こ
の分解酵素の濃度が高すぎると、つぎの工程で抽出した
微生物ＡＴＰも同時に分解してしまい、微生物ＡＴＰの
測定濃度がゼロになってしまう問題を生じる。
ＴＰを効率よく短時間で分解するためには、測定試料の
ＡＴＰ分解酵素の濃度を十分に高くする必要があり、こ
の分解酵素の濃度が高すぎると、つぎの工程で抽出した
微生物ＡＴＰも同時に分解してしまい、微生物ＡＴＰの
測定濃度がゼロになってしまう問題を生じる。
【００１２】この問題を解決するために、測定試料のＡ
ＴＰ分解酵素の濃度を低くして、ＡＴＰの分解速度を遅
くする方法があるが、遊離ＡＴＰの分解に要する時間が
長くなり、測定の迅速性が損なわれる問題があった。ま
た、ＡＴＰ分解酵素を作用させて測定試料中の遊離ＡＴ
Ｐを分解した後、試料にＡＴＰ分解酵素の阻害剤を添加
してから、微生物ＡＴＰを抽出する方法も開発されてい
るが、阻害剤を添加する工程が増え効率が悪くなるばか
りでなく、阻害剤の添加で試料が希釈されることによ
り、測定感度が低下する問題もあった。
ＴＰ分解酵素の濃度を低くして、ＡＴＰの分解速度を遅
くする方法があるが、遊離ＡＴＰの分解に要する時間が
長くなり、測定の迅速性が損なわれる問題があった。ま
た、ＡＴＰ分解酵素を作用させて測定試料中の遊離ＡＴ
Ｐを分解した後、試料にＡＴＰ分解酵素の阻害剤を添加
してから、微生物ＡＴＰを抽出する方法も開発されてい
るが、阻害剤を添加する工程が増え効率が悪くなるばか
りでなく、阻害剤の添加で試料が希釈されることによ
り、測定感度が低下する問題もあった。
【００１３】本発明の目的は、食品などの遊離ＡＴＰを
多量に含有した測定試料の遊離ＡＴＰのみをＡＴＰ分解
酵素で分解して、試料の微生物ＡＴＰを生物化学発光法
により高精度に測定することを可能とした微生物ＡＴＰ
の測定方法を提供することである。
多量に含有した測定試料の遊離ＡＴＰのみをＡＴＰ分解
酵素で分解して、試料の微生物ＡＴＰを生物化学発光法
により高精度に測定することを可能とした微生物ＡＴＰ
の測定方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記目的は、本発明にか
かる微生物ＡＴＰの測定方法にて達成される。要約すれ
ば、本発明は、微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、抽出試薬を適用し
て微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した微生物Ａ
ＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリンによる
生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰの測定方
法において、前記ＡＴＰ分解試薬の添加により試料中の
遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解試薬を含んだ試料
をろ過材でろ過して、試料中に含まれる微生物をろ過材
上に捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して、ろ過材
およびろ過材上の微生物に付着したＡＴＰ分解試薬を洗
い流し、然る後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試
薬を適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出すること
を特徴とする微生物ＡＴＰの測定方法である。
かる微生物ＡＴＰの測定方法にて達成される。要約すれ
ば、本発明は、微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、抽出試薬を適用し
て微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した微生物Ａ
ＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリンによる
生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰの測定方
法において、前記ＡＴＰ分解試薬の添加により試料中の
遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解試薬を含んだ試料
をろ過材でろ過して、試料中に含まれる微生物をろ過材
上に捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して、ろ過材
およびろ過材上の微生物に付着したＡＴＰ分解試薬を洗
い流し、然る後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試
薬を適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出すること
を特徴とする微生物ＡＴＰの測定方法である。
【００１５】本発明の他の態様では、前記微生物を含む
試料にＡＴＰ分解試薬を添加せずに試料をろ過材でろ過
して、試料中に含まれる微生物をろ過材上に捕捉し、ろ
過材にＡＴＰ分解試薬を作用させて、ろ過材に吸着した
試料中の遊離ＡＴＰを分解し、ろ過材を無菌の洗浄液で
洗浄して、ろ過材およびろ過材上の微生物に付着したＡ
ＴＰ分解試薬を洗い流し、然る後、ろ過材上に捕捉され
た微生物に抽出試薬を適用して、微生物の細胞からＡＴ
Ｐを抽出する。
試料にＡＴＰ分解試薬を添加せずに試料をろ過材でろ過
して、試料中に含まれる微生物をろ過材上に捕捉し、ろ
過材にＡＴＰ分解試薬を作用させて、ろ過材に吸着した
試料中の遊離ＡＴＰを分解し、ろ過材を無菌の洗浄液で
洗浄して、ろ過材およびろ過材上の微生物に付着したＡ
ＴＰ分解試薬を洗い流し、然る後、ろ過材上に捕捉され
た微生物に抽出試薬を適用して、微生物の細胞からＡＴ
Ｐを抽出する。
【００１６】本発明によれば、前記ろ過材の孔径は０．
２〜０．５μｍとすることができる。前記ろ過材はメン
ブランフィルタまたは中空糸フィルタとすることができ
る。前記無菌の洗浄液は、滅菌した蒸留水、イオン交換
水、ｐＨ緩衝液、糖水溶液またはポリアルコール水溶液
とすることができる。前記ＡＴＰ分解試薬は、アピラー
ゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ケトヘキソキナ
ーゼ、フルクトキナーゼまたはガラクトキナーゼを含む
とすることができる。
２〜０．５μｍとすることができる。前記ろ過材はメン
ブランフィルタまたは中空糸フィルタとすることができ
る。前記無菌の洗浄液は、滅菌した蒸留水、イオン交換
水、ｐＨ緩衝液、糖水溶液またはポリアルコール水溶液
とすることができる。前記ＡＴＰ分解試薬は、アピラー
ゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ケトヘキソキナ
ーゼ、フルクトキナーゼまたはガラクトキナーゼを含む
とすることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。
【００１８】本発明では、食品などの微生物ＡＴＰを生
物化学発光法により測定するに際し、食品などに多量に
含まれる微生物に由来しない遊離ＡＴＰを除去するため
に、測定試料にＡＴＰ分解試薬（酵素）を添加して遊離
ＡＴＰを分解するが、その後、抽出試薬により微生物細
胞からＡＴＰを抽出したときに、抽出した微生物ＡＴＰ
がＡＴＰ分解酵素により分解されるのを防ぐために、
（１）試料にＡＴＰ分解試薬を添加して遊離ＡＴＰを分
解してから、試料をろ過材でろ過して微生物を捕捉する
か、あるいは（２）試料にＡＴＰ分解試薬を添加せず
に、試料をろ過材でろ過して微生物を捕捉してから、ろ
過材にＡＴＰ分解試薬を作用させて遊離ＡＴＰを分解す
る。そして、その後、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して
ＡＴＰ分解酵素を洗い流してから、微生物ＡＴＰを抽出
するようにしたことが大きな特徴である。
物化学発光法により測定するに際し、食品などに多量に
含まれる微生物に由来しない遊離ＡＴＰを除去するため
に、測定試料にＡＴＰ分解試薬（酵素）を添加して遊離
ＡＴＰを分解するが、その後、抽出試薬により微生物細
胞からＡＴＰを抽出したときに、抽出した微生物ＡＴＰ
がＡＴＰ分解酵素により分解されるのを防ぐために、
（１）試料にＡＴＰ分解試薬を添加して遊離ＡＴＰを分
解してから、試料をろ過材でろ過して微生物を捕捉する
か、あるいは（２）試料にＡＴＰ分解試薬を添加せず
に、試料をろ過材でろ過して微生物を捕捉してから、ろ
過材にＡＴＰ分解試薬を作用させて遊離ＡＴＰを分解す
る。そして、その後、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して
ＡＴＰ分解酵素を洗い流してから、微生物ＡＴＰを抽出
するようにしたことが大きな特徴である。
【００１９】本発明において、ＡＴＰ分解試薬として
は、ＡＴＰをＡＤＰまたＡＭＰに分解する酵素として知
られている多数のＡＴＰ分解酵素を使用することができ
る。たとえばアピラーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナ
ーゼ、ケトヘキソキナーゼ、フルクトキナーゼ、または
ガラクトキナーゼ等を好適に使用することができる。こ
れらの酵素は、水溶性のＡＴＰ分解酵素であり、水溶液
の試料に添加して使用するのに便利である。
は、ＡＴＰをＡＤＰまたＡＭＰに分解する酵素として知
られている多数のＡＴＰ分解酵素を使用することができ
る。たとえばアピラーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナ
ーゼ、ケトヘキソキナーゼ、フルクトキナーゼ、または
ガラクトキナーゼ等を好適に使用することができる。こ
れらの酵素は、水溶性のＡＴＰ分解酵素であり、水溶液
の試料に添加して使用するのに便利である。
【００２０】ＡＴＰ分解酵素は、酵素活性が高いほど遊
離ＡＴＰを分解する性能も高くなるが、遊離ＡＴＰの分
解時間、コスト等を勘案して、具体的に使用量を決定す
ればよい。一例を挙げれば、１００ｎｍｏｌ／ｌまでの
遊離ＡＴＰを１分以内に分解するには、酵素活性１〜１
０Ｕ／ｍｌとなる量で使用する。
離ＡＴＰを分解する性能も高くなるが、遊離ＡＴＰの分
解時間、コスト等を勘案して、具体的に使用量を決定す
ればよい。一例を挙げれば、１００ｎｍｏｌ／ｌまでの
遊離ＡＴＰを１分以内に分解するには、酵素活性１〜１
０Ｕ／ｍｌとなる量で使用する。
【００２１】ろ過材としては、メンブランフィルタや中
空糸フィルタ等が使用できる。これらは、孔径が揃って
おり、また機械的強度も強いので、微生物の捕捉に吸引
ろ過を利用するのに好適である。
空糸フィルタ等が使用できる。これらは、孔径が揃って
おり、また機械的強度も強いので、微生物の捕捉に吸引
ろ過を利用するのに好適である。
【００２２】ろ過材の孔径は、食品などに付着した細菌
や真菌等の微生物を捕捉することから、０．２〜０．５
μｍ程度であることが好ましい。ろ過材の孔径が０．２
μｍ未満では小さすぎて、吸引ろ過を行なってもろ過効
率が悪く、またろ過材の価格が高価になる。逆に孔径が
０．５μｍを超えると大きすぎて、細菌などの種類によ
っては捕捉できない場合が生じる。
や真菌等の微生物を捕捉することから、０．２〜０．５
μｍ程度であることが好ましい。ろ過材の孔径が０．２
μｍ未満では小さすぎて、吸引ろ過を行なってもろ過効
率が悪く、またろ過材の価格が高価になる。逆に孔径が
０．５μｍを超えると大きすぎて、細菌などの種類によ
っては捕捉できない場合が生じる。
【００２３】微生物を捕捉後のろ過材の洗浄は、ろ過材
に付着した試料溶液に溶解しているＡＴＰ分解酵素を洗
い流すために行なうので、洗浄液は水溶液であればよ
く、洗浄力は必要ない。洗浄液として、たとえば蒸留
水、イオン交換水、ｐＨ緩衝液あるいは糖水溶液、ポリ
アルコール水溶液など各種の水溶液が使用できる。この
洗浄液は、ろ過材の微生物汚染を防ぐために無菌である
ことが必要である。従って、洗浄水として蒸留水、イオ
ン交換水を使用する場合は、オートクレーブで１２１
℃、１０〜６０分の煮沸などの滅菌操作を施す。ｐＨ緩
衝液、糖水溶液あるいはポリアルコール水溶液の場合
も、粉状薬剤を希釈して調製するときは同様とする。市
販品をそのまま使用する場合も滅菌することが好まし
い。
に付着した試料溶液に溶解しているＡＴＰ分解酵素を洗
い流すために行なうので、洗浄液は水溶液であればよ
く、洗浄力は必要ない。洗浄液として、たとえば蒸留
水、イオン交換水、ｐＨ緩衝液あるいは糖水溶液、ポリ
アルコール水溶液など各種の水溶液が使用できる。この
洗浄液は、ろ過材の微生物汚染を防ぐために無菌である
ことが必要である。従って、洗浄水として蒸留水、イオ
ン交換水を使用する場合は、オートクレーブで１２１
℃、１０〜６０分の煮沸などの滅菌操作を施す。ｐＨ緩
衝液、糖水溶液あるいはポリアルコール水溶液の場合
も、粉状薬剤を希釈して調製するときは同様とする。市
販品をそのまま使用する場合も滅菌することが好まし
い。
【００２４】洗浄液の使用量は、ろ過した試料量と同量
か、２倍量程度あれば十分であるが、適宜増減すること
ができる。
か、２倍量程度あれば十分であるが、適宜増減すること
ができる。
【００２５】微生物細胞からＡＴＰを抽出する抽出試薬
としては、各種のものが使用できるが、アルキルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベンゼトニウ
ム、セチルトリメチルアンモニウムクロライド等の陽イ
オン性界面活性剤が特に好適に使用できる。
としては、各種のものが使用できるが、アルキルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベンゼトニウ
ム、セチルトリメチルアンモニウムクロライド等の陽イ
オン性界面活性剤が特に好適に使用できる。
【００２６】本発明の方法によれば、ＡＴＰ分解酵素で
遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解酵素を含む試料を
ろ過材でろ過して微生物を捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄
液でＡＴＰ分解酵素を洗い流して除去してから、微生物
ＡＴＰを抽出するので、抽出した微生物ＡＴＰのＡＴＰ
分解酵素による分解がなく、このため、生物化学発光法
により微生物ＡＴＰの濃度を高精度に測定することがで
きる。そのＡＴＰ分解酵素を除去する操作も簡単であ
る。
遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解酵素を含む試料を
ろ過材でろ過して微生物を捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄
液でＡＴＰ分解酵素を洗い流して除去してから、微生物
ＡＴＰを抽出するので、抽出した微生物ＡＴＰのＡＴＰ
分解酵素による分解がなく、このため、生物化学発光法
により微生物ＡＴＰの濃度を高精度に測定することがで
きる。そのＡＴＰ分解酵素を除去する操作も簡単であ
る。
【００２７】また、試料をろ過して微生物をろ過材に捕
捉するので、試料に含まれる微生物を濃縮することがで
き、従って微生物ＡＴＰの測定感度を増加させることが
可能となる。さらに、発光試薬のルシェフェラーゼとル
シェフェリンによる発光反応を阻害する塩分などの妨害
物質も、ろ過により除去できる利点がある。
捉するので、試料に含まれる微生物を濃縮することがで
き、従って微生物ＡＴＰの測定感度を増加させることが
可能となる。さらに、発光試薬のルシェフェラーゼとル
シェフェリンによる発光反応を阻害する塩分などの妨害
物質も、ろ過により除去できる利点がある。
【００２８】さらにまた、ＡＴＰ分解酵素による分解を
遊離ＡＴＰのみとしたので、ＡＴＰ分解酵素の濃度を十
分に高くしても問題がなく、効率よく遊離ＡＴＰを分解
できる。
遊離ＡＴＰのみとしたので、ＡＴＰ分解酵素の濃度を十
分に高くしても問題がなく、効率よく遊離ＡＴＰを分解
できる。
【００２９】本発明の具体例について説明する。
【００３０】実施例１および比較例１、２ ＡＴＰ分解試薬としてアピラーゼ（米国シグマ社 Ａ６
１３２）を、ろ過材として直径２５ｍｍ、孔径０．４５
μｍのメンブランフィルタ（アドバンテック東洋 Ｃ４
５０２５Ａ。材質：アセチルセルロース）を用いた。測
定試料は大腸菌培養液である。
１３２）を、ろ過材として直径２５ｍｍ、孔径０．４５
μｍのメンブランフィルタ（アドバンテック東洋 Ｃ４
５０２５Ａ。材質：アセチルセルロース）を用いた。測
定試料は大腸菌培養液である。
【００３１】実施例１の測定操作は、以下の通りであ
る。大腸菌数（濃度）が１×１０4 個／ｍｌ、１×１０
5 個／ｍｌ、１×１０6 個／ｍｌの大腸菌培養液を用意
し、それぞれに遊離ＡＴＰとして１００ｎｍｏｌ／ｌ
（１００ｎＭ）の濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加して、３種類の測定試料を調製した。各試料を１ｍｌ
採取してそれぞれ滅菌した試験管に入れ、各試験管に酵
素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を１００μｌ添加
し、１分間の放置により遊離ＡＴＰを分解した。ついで
各試験管内の溶液１ｍｌをメンブランフィルタを取付け
たろ過器で吸引ろ過し、溶液が過された後も吸引を続け
たまま、各回１０ｍｌの滅菌蒸留水を用いてフィルタを
２回洗浄した。
る。大腸菌数（濃度）が１×１０4 個／ｍｌ、１×１０
5 個／ｍｌ、１×１０6 個／ｍｌの大腸菌培養液を用意
し、それぞれに遊離ＡＴＰとして１００ｎｍｏｌ／ｌ
（１００ｎＭ）の濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加して、３種類の測定試料を調製した。各試料を１ｍｌ
採取してそれぞれ滅菌した試験管に入れ、各試験管に酵
素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を１００μｌ添加
し、１分間の放置により遊離ＡＴＰを分解した。ついで
各試験管内の溶液１ｍｌをメンブランフィルタを取付け
たろ過器で吸引ろ過し、溶液が過された後も吸引を続け
たまま、各回１０ｍｌの滅菌蒸留水を用いてフィルタを
２回洗浄した。
【００３２】洗浄後、メンブランフィルタをろ過器から
外して、内径２６ｍｍの滅菌したシャーレに入れ、微生
物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を２００μ
ｌをフィルタ上に塗布し、そのまま２０秒間待って大腸
菌からＡＴＰを抽出した。抽出後、抽出液を１００μｌ
吸引して、測定用のディスポチューブ（内径１２ｍｍ×
長さ５５ｍｍ、東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に入れ、ル
シェフェラーゼとルシェフェリンを含んだ発光試薬（東
亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ
測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、Ａ
ＴＰ濃度を測定した。
外して、内径２６ｍｍの滅菌したシャーレに入れ、微生
物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を２００μ
ｌをフィルタ上に塗布し、そのまま２０秒間待って大腸
菌からＡＴＰを抽出した。抽出後、抽出液を１００μｌ
吸引して、測定用のディスポチューブ（内径１２ｍｍ×
長さ５５ｍｍ、東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に入れ、ル
シェフェラーゼとルシェフェリンを含んだ発光試薬（東
亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ
測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、Ａ
ＴＰ濃度を測定した。
【００３３】比較のために、アピラーゼによる遊離ＡＴ
Ｐの分解およびメンブランフィルタによるろ過、洗浄を
行なわない場合（比較例１）と、アピラーゼによる遊離
ＡＴＰの分解は行なったが、メンブランフィルタによる
ろ過、洗浄を行なわない場合（比較例２）についても試
験した。
Ｐの分解およびメンブランフィルタによるろ過、洗浄を
行なわない場合（比較例１）と、アピラーゼによる遊離
ＡＴＰの分解は行なったが、メンブランフィルタによる
ろ過、洗浄を行なわない場合（比較例２）についても試
験した。
【００３４】比較例１の測定操作は、つぎの通りであ
る。１×１０4 個／ｍｌ、１×１０5個／ｍｌ、１×１
０6 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料各１００μｌを吸引して、測定
用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に
入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）
を１００μｌ添加して、２０秒間待って大腸菌からＡＴ
Ｐを抽出した。抽出後、ディスポチューブに発光試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、Ａ
ＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
る。１×１０4 個／ｍｌ、１×１０5個／ｍｌ、１×１
０6 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料各１００μｌを吸引して、測定
用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に
入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）
を１００μｌ添加して、２０秒間待って大腸菌からＡＴ
Ｐを抽出した。抽出後、ディスポチューブに発光試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、Ａ
ＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００３５】比較例２の測定操作は、つぎの通りであ
る。１×１０4 個／ｍｌ、１×１０5個／ｍｌ、１×１
０6 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料を各１ｍｌ、それぞれ滅菌した
試験管に入れ、各試験管に酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラ
ーゼ溶液を１００μｌ添加し、１分間待って遊離ＡＴＰ
を分解した。ついで各試験管内の溶液１００μｌをそれ
ぞれ滅菌した小型試験管内に入れ、微生物用抽出試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を１００μｌ添加して、
２０秒間待って大腸菌からＡＴＰを抽出した。
る。１×１０4 個／ｍｌ、１×１０5個／ｍｌ、１×１
０6 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料を各１ｍｌ、それぞれ滅菌した
試験管に入れ、各試験管に酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラ
ーゼ溶液を１００μｌ添加し、１分間待って遊離ＡＴＰ
を分解した。ついで各試験管内の溶液１００μｌをそれ
ぞれ滅菌した小型試験管内に入れ、微生物用抽出試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を１００μｌ添加して、
２０秒間待って大腸菌からＡＴＰを抽出した。
【００３６】抽出後、抽出液を１００μｌを吸引して、
測定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ
１）に入れ、ルシェフェラーゼとルシェフェリンを含ん
だ発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ
添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）に
セットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
測定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ
１）に入れ、ルシェフェラーゼとルシェフェリンを含ん
だ発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ
添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）に
セットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００３７】測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度
との関係を図１に示す。
との関係を図１に示す。
【００３８】図１に示すように、本実施例１では、試料
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の大腸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の大腸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
【００３９】これに対し、アピラーゼによる遊離ＡＴＰ
の分解およびメンブランフィルタによるろ過、洗浄を行
なわない比較例１では、遊離ＡＴＰとして試料に添加し
た１００ｎＭ ＡＴＰの分解がないために、試料のＡＴ
Ｐ濃度測定値は試料の大腸菌数に関係なくほぼ一定値と
なり、正比例関係が得られなかった。
の分解およびメンブランフィルタによるろ過、洗浄を行
なわない比較例１では、遊離ＡＴＰとして試料に添加し
た１００ｎＭ ＡＴＰの分解がないために、試料のＡＴ
Ｐ濃度測定値は試料の大腸菌数に関係なくほぼ一定値と
なり、正比例関係が得られなかった。
【００４０】アピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は行な
ったが、メンブランフィルタによるろ過、洗浄を行なわ
ない比較例２では、試料のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数
は正比例の関係が得られず、ＡＴＰ濃度は実施例１に比
べて１桁以上低い値になった。これは、アピラーゼによ
る遊離ＡＴＰの分解後、メンブランフィルタのろ過、洗
浄によるアピラーゼの除去を行なわないために、微生物
用抽出試薬で大腸菌からＡＴＰを抽出すると、抽出した
大腸菌ＡＴＰがアピラーゼにより分解されるからであ
る。
ったが、メンブランフィルタによるろ過、洗浄を行なわ
ない比較例２では、試料のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数
は正比例の関係が得られず、ＡＴＰ濃度は実施例１に比
べて１桁以上低い値になった。これは、アピラーゼによ
る遊離ＡＴＰの分解後、メンブランフィルタのろ過、洗
浄によるアピラーゼの除去を行なわないために、微生物
用抽出試薬で大腸菌からＡＴＰを抽出すると、抽出した
大腸菌ＡＴＰがアピラーゼにより分解されるからであ
る。
【００４１】以上の結果から、微生物に由来しない遊離
ＡＴＰをアピラーゼにより効率よく分解するとともに、
メンブランフィルタでアピラーゼを洗い流して活性をな
くすことにより、微生物から抽出したＡＴＰを分解する
ことなく測定できることが分かる。
ＡＴＰをアピラーゼにより効率よく分解するとともに、
メンブランフィルタでアピラーゼを洗い流して活性をな
くすことにより、微生物から抽出したＡＴＰを分解する
ことなく測定できることが分かる。
【００４２】実施例１の操作で使用するアピラーゼは、
酵素活性が高いほど遊離ＡＴＰを分解する性能も高くな
るが、遊離ＡＴＰを１分以内に分解することを考える
と、１〜１０Ｕ／ｍｌの活性を有するアピラーゼを使用
するのが、コストを安くすることからも好ましい。また
メンブランフィルターでろ過する試料量を多くすれば、
捕捉される微生物数が多くなり、微生物の検出感度を増
加することも可能である。
酵素活性が高いほど遊離ＡＴＰを分解する性能も高くな
るが、遊離ＡＴＰを１分以内に分解することを考える
と、１〜１０Ｕ／ｍｌの活性を有するアピラーゼを使用
するのが、コストを安くすることからも好ましい。また
メンブランフィルターでろ過する試料量を多くすれば、
捕捉される微生物数が多くなり、微生物の検出感度を増
加することも可能である。
【００４３】実施例２および比較例３、４ ＡＴＰ分解試薬としてアピラーゼ（米国シグマ社 Ａ６
１３２）を、ろ過材として直径１３ｍｍ、孔径０．４５
μｍのディスポーザブルメンブランフィルタユニット
（アドバンテック東洋 １３ＣＰ０４５ＡＳ。材質：ア
セチルセルロース）を用いた。測定試料は乳酸菌添加の
豚肉懸濁液である。
１３２）を、ろ過材として直径１３ｍｍ、孔径０．４５
μｍのディスポーザブルメンブランフィルタユニット
（アドバンテック東洋 １３ＣＰ０４５ＡＳ。材質：ア
セチルセルロース）を用いた。測定試料は乳酸菌添加の
豚肉懸濁液である。
【００４４】実施例２の測定操作は、以下の通りであ
る。豚肉を電子レンジで２分間加熱して滅菌し、無菌の
豚肉を調製する。この無菌の豚肉を２５ｇ秤量し、滅菌
したホモジナイズ用のストマフィルタ（グンゼ産業）に
入れ、滅菌水２５ｍｌを添加して１分間ホモジナイズす
る。ホモジナイズ後の豚肉懸濁液に乳酸菌を、菌数（濃
度）が３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3 個／ｍｌ、３×
１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍｌ、３×１０6 個／
ｍｌとなるように添加して、測定試料として乳酸菌を添
加した豚肉懸濁液を６種類調製した。各試料を１ｍｌ採
取してそれぞれ滅菌した試験管に入れ、各試験管に酵素
活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を１００μｌ添加し、
２０分間の放置により遊離ＡＴＰを分解した。ついで各
試験管内の溶液をディスポーザブルシリンジで１ｍｌ吸
引し、このシリンジの先端にディスポーザブルメンブラ
ンフィルタを取付けて、溶液を押出しろ過した。ろ過
後、滅菌水をシリンジに約１ｍｌ入れて押出し、メンブ
ランフィルタを洗浄した。洗浄操作は２回繰り返す。
る。豚肉を電子レンジで２分間加熱して滅菌し、無菌の
豚肉を調製する。この無菌の豚肉を２５ｇ秤量し、滅菌
したホモジナイズ用のストマフィルタ（グンゼ産業）に
入れ、滅菌水２５ｍｌを添加して１分間ホモジナイズす
る。ホモジナイズ後の豚肉懸濁液に乳酸菌を、菌数（濃
度）が３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3 個／ｍｌ、３×
１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍｌ、３×１０6 個／
ｍｌとなるように添加して、測定試料として乳酸菌を添
加した豚肉懸濁液を６種類調製した。各試料を１ｍｌ採
取してそれぞれ滅菌した試験管に入れ、各試験管に酵素
活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を１００μｌ添加し、
２０分間の放置により遊離ＡＴＰを分解した。ついで各
試験管内の溶液をディスポーザブルシリンジで１ｍｌ吸
引し、このシリンジの先端にディスポーザブルメンブラ
ンフィルタを取付けて、溶液を押出しろ過した。ろ過
後、滅菌水をシリンジに約１ｍｌ入れて押出し、メンブ
ランフィルタを洗浄した。洗浄操作は２回繰り返す。
【００４５】洗浄後、微生物用抽出試薬（東亜電波工業
ＡＦ−２Ｋ１）をシリンジに３００μｌ入れ、微生物用
抽出試薬がディスポーザブルメンブランフィルタユニッ
トの先端に来るまでピストンを押し、そのまま３０秒間
待ってメンブランフィルタ上の乳酸菌からＡＴＰを抽出
した。抽出後、抽出液の全量を測定用のディスポチュー
ブ（内径１２ｍｍ×長さ５５ｍｍ、東亜電波工業ＡＦ−
３Ｓ１）に押出し、ルシェフェラーゼとルシェフェリン
を含んだ発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１０
０μｌ添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７
０）にセットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
ＡＦ−２Ｋ１）をシリンジに３００μｌ入れ、微生物用
抽出試薬がディスポーザブルメンブランフィルタユニッ
トの先端に来るまでピストンを押し、そのまま３０秒間
待ってメンブランフィルタ上の乳酸菌からＡＴＰを抽出
した。抽出後、抽出液の全量を測定用のディスポチュー
ブ（内径１２ｍｍ×長さ５５ｍｍ、東亜電波工業ＡＦ−
３Ｓ１）に押出し、ルシェフェラーゼとルシェフェリン
を含んだ発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１０
０μｌ添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７
０）にセットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００４６】比較のために、アピラーゼによる遊離ＡＴ
Ｐの分解およびディスポーザブルメンブランフィルタユ
ニットによるろ過、洗浄を行なわない場合（比較例３）
と、アピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は行なったが、
ディスポーザブルメンブランフィルタユニットによるろ
過、洗浄を行なわない場合（比較例４）についても試験
した。
Ｐの分解およびディスポーザブルメンブランフィルタユ
ニットによるろ過、洗浄を行なわない場合（比較例３）
と、アピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は行なったが、
ディスポーザブルメンブランフィルタユニットによるろ
過、洗浄を行なわない場合（比較例４）についても試験
した。
【００４７】比較例３の測定操作は、つぎの通りであ
る。豚肉懸濁液に乳酸菌を３×１０2個／ｍｌ、３×１
０3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍ
ｌ、３×１０6 個／ｍｌとなるように添加した６種類の
測定試料各１００μｌを吸引して、測定用のディスポチ
ューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に入れ、微生物用
抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を１００μｌ添
加して、３０秒間待って乳酸菌からＡＴＰを抽出した。
抽出後、ディスポチューブに発光試薬（東亜電波工業Ａ
Ｆ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ測定装置（東
亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、ＡＴＰ濃度を測
定した。
る。豚肉懸濁液に乳酸菌を３×１０2個／ｍｌ、３×１
０3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍ
ｌ、３×１０6 個／ｍｌとなるように添加した６種類の
測定試料各１００μｌを吸引して、測定用のディスポチ
ューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に入れ、微生物用
抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を１００μｌ添
加して、３０秒間待って乳酸菌からＡＴＰを抽出した。
抽出後、ディスポチューブに発光試薬（東亜電波工業Ａ
Ｆ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ測定装置（東
亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、ＡＴＰ濃度を測
定した。
【００４８】比較例４の測定操作は、つぎの通りであ
る。豚肉懸濁液に乳酸菌を３×１０2個／ｍｌ、３×１
０3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍ
ｌ、３×１０6 個／ｍｌとなるように添加した６種類の
測定試料各１ｍｌを採取して、それぞれ滅菌した試験管
に入れ、各試験管に酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶
液を１００μｌ添加し、２０分間の放置により遊離ＡＴ
Ｐを分解した。ついで各試験管内の溶液を１００μｌ吸
引して、測定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ
−３Ｓ１）に入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業Ａ
Ｆ−２Ｋ１）を１００μｌ添加して、３０秒間待って乳
酸菌からＡＴＰを抽出した。抽出後、ディスポチューブ
に発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ
添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）に
セットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
る。豚肉懸濁液に乳酸菌を３×１０2個／ｍｌ、３×１
０3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌ、３×１０5 個／ｍ
ｌ、３×１０6 個／ｍｌとなるように添加した６種類の
測定試料各１ｍｌを採取して、それぞれ滅菌した試験管
に入れ、各試験管に酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶
液を１００μｌ添加し、２０分間の放置により遊離ＡＴ
Ｐを分解した。ついで各試験管内の溶液を１００μｌ吸
引して、測定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ
−３Ｓ１）に入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業Ａ
Ｆ−２Ｋ１）を１００μｌ添加して、３０秒間待って乳
酸菌からＡＴＰを抽出した。抽出後、ディスポチューブ
に発光試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ
添加し、ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）に
セットして、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００４９】測定試料の乳酸菌数と測定したＡＴＰ濃度
との関係を図２に示す。
との関係を図２に示す。
【００５０】図２に示すように、本実施例２では、試料
のＡＴＰ濃度測定値と乳酸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の乳酸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
のＡＴＰ濃度測定値と乳酸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の乳酸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
【００５１】これに対し、アピラーゼによる遊離ＡＴＰ
の分解およびディスポーザブルメンブランフィルタユニ
ットによるろ過、洗浄を行なわない比較例３では、試料
に含まれる遊離ＡＴＰの分解がないために、試料のＡＴ
Ｐ濃度測定値は試料の乳酸菌数に関係なくほぼ一定値と
なり、正比例関係が得られなかった。
の分解およびディスポーザブルメンブランフィルタユニ
ットによるろ過、洗浄を行なわない比較例３では、試料
に含まれる遊離ＡＴＰの分解がないために、試料のＡＴ
Ｐ濃度測定値は試料の乳酸菌数に関係なくほぼ一定値と
なり、正比例関係が得られなかった。
【００５２】アピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は行な
ったが、ディスポーザブルメンブランフィルタユニット
によるろ過、洗浄を行なわない比較例４では、微生物用
抽出試薬で乳酸菌から抽出したＡＴＰがアピラーゼによ
り分解されるため、試料のＡＴＰ濃度測定値と乳酸菌数
は正比例の関係が得られず、ＡＴＰ濃度は実施例１に比
べて１桁以上低い値になった。
ったが、ディスポーザブルメンブランフィルタユニット
によるろ過、洗浄を行なわない比較例４では、微生物用
抽出試薬で乳酸菌から抽出したＡＴＰがアピラーゼによ
り分解されるため、試料のＡＴＰ濃度測定値と乳酸菌数
は正比例の関係が得られず、ＡＴＰ濃度は実施例１に比
べて１桁以上低い値になった。
【００５３】実施例３および比較例５、６ 本実施例３では、試料のろ過を行った後に、ＡＴＰ分解
試薬による分解を行う方法について説明する。
試薬による分解を行う方法について説明する。
【００５４】ＡＴＰ分解試薬としてアピラーゼ（米国シ
グマ社 Ａ６１３２）を、ろ過材として直径１３ｍｍ、
孔径０．４５μｍのディスポーザブルメンブランフィル
タユニット（アドバンテック東洋 １３ＣＰ０４５Ａ
Ｓ。材質：アセチルセルロース）を用いた。測定試料は
大腸菌培養液である。
グマ社 Ａ６１３２）を、ろ過材として直径１３ｍｍ、
孔径０．４５μｍのディスポーザブルメンブランフィル
タユニット（アドバンテック東洋 １３ＣＰ０４５Ａ
Ｓ。材質：アセチルセルロース）を用いた。測定試料は
大腸菌培養液である。
【００５５】実施例３の測定操作は、以下の通りであ
る。大腸菌数（濃度）が３×１０2 個／ｍｌ、３×１０
3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌの大腸菌培養液を用意
し、それぞれに遊離ＡＴＰとして１００ｎｍｏｌ／ｌ
（１００ｎＭ）の濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加して、３種類の測定試料を調製した。各試料を１ｍｌ
をディスポーザブルシリンジで吸引し、ディスポーザブ
ルメンブランフィルタユニットをディスポーザブルシリ
ンジの先端に取り付けて、試料を押し出しろ過した。ろ
過後、このシリンジに酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ
溶液を５００μｌ入れて押し出し、フィルタに吸着した
遊離ＡＴＰを１分間待つことにより分解した。分解後、
滅菌蒸留水をディスポーザブルシリンジに約１ｍｌ入れ
て押し出し、ディスポーザブルメンブランフィルタユニ
ットのフィルタを洗浄した。この洗浄操作は２回繰り返
した。
る。大腸菌数（濃度）が３×１０2 個／ｍｌ、３×１０
3 個／ｍｌ、３×１０4 個／ｍｌの大腸菌培養液を用意
し、それぞれに遊離ＡＴＰとして１００ｎｍｏｌ／ｌ
（１００ｎＭ）の濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加して、３種類の測定試料を調製した。各試料を１ｍｌ
をディスポーザブルシリンジで吸引し、ディスポーザブ
ルメンブランフィルタユニットをディスポーザブルシリ
ンジの先端に取り付けて、試料を押し出しろ過した。ろ
過後、このシリンジに酵素活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ
溶液を５００μｌ入れて押し出し、フィルタに吸着した
遊離ＡＴＰを１分間待つことにより分解した。分解後、
滅菌蒸留水をディスポーザブルシリンジに約１ｍｌ入れ
て押し出し、ディスポーザブルメンブランフィルタユニ
ットのフィルタを洗浄した。この洗浄操作は２回繰り返
した。
【００５６】洗浄後、微生物用抽出試薬（東亜電波工業
ＡＦ−２Ｋ１）を３００μｌをディスポーザブルシリン
ジに入れ、微生物用抽出試薬がディスポーザブルメンブ
ランフィルタユニットの先端に出てくるまでピストンを
押し、３０秒間ＡＴＰの抽出を行う。抽出後、抽出液を
全量、ディスポチューブ（内径１２ｍｍ×長さ５５ｍ
ｍ、東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に押し出し、ルシェフ
ェラーゼとルシェフェリンを含んだ発光試薬（東亜電波
工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ測定装
置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、ＡＴＰ濃
度を測定した。
ＡＦ−２Ｋ１）を３００μｌをディスポーザブルシリン
ジに入れ、微生物用抽出試薬がディスポーザブルメンブ
ランフィルタユニットの先端に出てくるまでピストンを
押し、３０秒間ＡＴＰの抽出を行う。抽出後、抽出液を
全量、ディスポチューブ（内径１２ｍｍ×長さ５５ｍ
ｍ、東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に押し出し、ルシェフ
ェラーゼとルシェフェリンを含んだ発光試薬（東亜電波
工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、ＡＴＰ測定装
置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットして、ＡＴＰ濃
度を測定した。
【００５７】比較のために、ディスポーザブルメンブラ
ンフィルタユニットによるろ過およびアピラーゼによる
遊離ＡＴＰの分解、その洗浄を行なわない場合（比較例
５）と、ディスポーザブルメンブランフィルタユニット
によるろ過およびアピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は
行ったが、洗浄を行なわない場合（比較例６）について
も試験した。
ンフィルタユニットによるろ過およびアピラーゼによる
遊離ＡＴＰの分解、その洗浄を行なわない場合（比較例
５）と、ディスポーザブルメンブランフィルタユニット
によるろ過およびアピラーゼによる遊離ＡＴＰの分解は
行ったが、洗浄を行なわない場合（比較例６）について
も試験した。
【００５８】比較例５の測定操作は、つぎの通りであ
る。３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3個／ｍｌ、３×１
０4 個／ｍｌの大腸菌培養液のそれぞれに、遊離ＡＴＰ
として１００ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標
準試薬を添加した３種類の測定試料各１００μｌを、測
定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）
に入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ
１）を１００μｌ添加して、２０秒間待って大腸菌から
ＡＴＰを抽出した。抽出後、ディスポチューブに発光試
薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、
ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
る。３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3個／ｍｌ、３×１
０4 個／ｍｌの大腸菌培養液のそれぞれに、遊離ＡＴＰ
として１００ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標
準試薬を添加した３種類の測定試料各１００μｌを、測
定用のディスポチューブ（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）
に入れ、微生物用抽出試薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ
１）を１００μｌ添加して、２０秒間待って大腸菌から
ＡＴＰを抽出した。抽出後、ディスポチューブに発光試
薬（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、
ＡＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００５９】比較例６の測定操作は、つぎの通りであ
る。３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3個／ｍｌ、３×１
０4 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料を各１ｍｌ、ディスポーザブル
シリンジで吸引し、ディスポーザブルメンブランフィル
タユニットをシリンジの先端に取り付けて試料を押し出
しろ過した。ろ過後、ディスポーザブルシリンジに酵素
活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を５００μｌ入れて押
し出し、フィルタに吸着した遊離ＡＴＰを１分間待って
分解した。分解後、洗浄を行わずに微生物用抽出試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を３００μｌ、ディスポ
ーザブルシリンダに入れ、微生物抽出試薬がディスポー
ザブルメンブランフィルタユニットの先端に出てくるま
でピストンを押し、３０秒間のＡＴＰ抽出を行った。
る。３×１０2 個／ｍｌ、３×１０3個／ｍｌ、３×１
０4 個／ｍｌの大腸菌培養液に、遊離ＡＴＰとして１０
０ｎｍｏｌ／ｌの濃度となるようにＡＴＰ標準試薬を添
加した３種類の測定試料を各１ｍｌ、ディスポーザブル
シリンジで吸引し、ディスポーザブルメンブランフィル
タユニットをシリンジの先端に取り付けて試料を押し出
しろ過した。ろ過後、ディスポーザブルシリンジに酵素
活性１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ溶液を５００μｌ入れて押
し出し、フィルタに吸着した遊離ＡＴＰを１分間待って
分解した。分解後、洗浄を行わずに微生物用抽出試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｋ１）を３００μｌ、ディスポ
ーザブルシリンダに入れ、微生物抽出試薬がディスポー
ザブルメンブランフィルタユニットの先端に出てくるま
でピストンを押し、３０秒間のＡＴＰ抽出を行った。
【００６０】抽出後、抽出液全量をディスポチューブ
（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に押し出し、発行試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、Ａ
ＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
（東亜電波工業ＡＦ−３Ｓ１）に押し出し、発行試薬
（東亜電波工業ＡＦ−２Ｌ１）を１００μｌ添加し、Ａ
ＴＰ測定装置（東亜電波工業ＡＦ−７０）にセットし
て、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００６１】測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度
との関係を図３に示す。
との関係を図３に示す。
【００６２】図３に示すように、本実施例３では、試料
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の大腸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数の関係は、ほぼ傾き１の
良好な正比例が関係が得られ、試料の大腸菌ＡＴＰ濃度
が正確に測定できている。
【００６３】これに対し、ディスポーザブルメンブラン
フィルタユニットによるろ過およびアピラーゼによる遊
離ＡＴＰの分解、洗浄を行わない比較例５では、資料に
含まれる遊離ＡＴＰの分解がないため、試料のＡＴＰ濃
度測定値は試料の大腸菌数に関係なくほぼ一定値とな
り、正比例関係が得られなかった。
フィルタユニットによるろ過およびアピラーゼによる遊
離ＡＴＰの分解、洗浄を行わない比較例５では、資料に
含まれる遊離ＡＴＰの分解がないため、試料のＡＴＰ濃
度測定値は試料の大腸菌数に関係なくほぼ一定値とな
り、正比例関係が得られなかった。
【００６４】ディスポーザブルメンブランフィルタユニ
ットによるろ過およびアピラーゼによる遊離ＡＴＰの分
解は行なったが、洗浄を行なわない比較例６では、試料
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数は正比例の関係が得られ
ず、ＡＴＰ濃度は実施例３に比べて１桁以上低い値にな
った。
ットによるろ過およびアピラーゼによる遊離ＡＴＰの分
解は行なったが、洗浄を行なわない比較例６では、試料
のＡＴＰ濃度測定値と大腸菌数は正比例の関係が得られ
ず、ＡＴＰ濃度は実施例３に比べて１桁以上低い値にな
った。
【００６５】以上の結果から、試料をメンブランフィル
タでろ過して微生物を捕捉し、そのフィルタにＡＴＰ分
解試薬を作用させて、微生物に由来しない遊離ＡＴＰを
アピラーゼにより効率よく分解するとともに、メンブラ
ンフィルタでアピラーゼを洗い流して活性をなくすこと
により、微生物から抽出したＡＴＰを分解することなく
測定できることが分かる。
タでろ過して微生物を捕捉し、そのフィルタにＡＴＰ分
解試薬を作用させて、微生物に由来しない遊離ＡＴＰを
アピラーゼにより効率よく分解するとともに、メンブラ
ンフィルタでアピラーゼを洗い流して活性をなくすこと
により、微生物から抽出したＡＴＰを分解することなく
測定できることが分かる。
【００６６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
微生物ＡＴＰ測定試料中に含まれる遊離ＡＴＰをＡＴＰ
分解酵素で分解した後、試料をろ過材でろ過して微生物
を捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄するか、あるい
は、ＡＴＰ分解試薬を添加せずに試料をろ過材でろ過し
て微生物を捕捉し、ろ過材にＡＴＰ分解試薬を作用させ
て試料中に含まれる遊離ＡＴＰを分解した後、ろ過材を
無菌の洗浄液で洗浄することにより、ろ過材に付着した
ＡＴＰ分解酵素を洗い流して除去してから、微生物ＡＴ
Ｐを抽出するので、食品などの遊離ＡＴＰを多量に含有
した試料であっても、微生物ＡＴＰを化学発光法により
高精度に測定することができる。そのＡＴＰ分解酵素を
除去する操作も簡単である。従って、食品衛生、バイオ
などの微生物検査に好適に使用することができる。
微生物ＡＴＰ測定試料中に含まれる遊離ＡＴＰをＡＴＰ
分解酵素で分解した後、試料をろ過材でろ過して微生物
を捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄するか、あるい
は、ＡＴＰ分解試薬を添加せずに試料をろ過材でろ過し
て微生物を捕捉し、ろ過材にＡＴＰ分解試薬を作用させ
て試料中に含まれる遊離ＡＴＰを分解した後、ろ過材を
無菌の洗浄液で洗浄することにより、ろ過材に付着した
ＡＴＰ分解酵素を洗い流して除去してから、微生物ＡＴ
Ｐを抽出するので、食品などの遊離ＡＴＰを多量に含有
した試料であっても、微生物ＡＴＰを化学発光法により
高精度に測定することができる。そのＡＴＰ分解酵素を
除去する操作も簡単である。従って、食品衛生、バイオ
などの微生物検査に好適に使用することができる。
【図１】本発明の実施例１および比較例１、２における
測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
【図２】本発明の実施例２および比較例３、４における
測定試料の乳酸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
測定試料の乳酸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
【図３】本発明の実施例３および比較例５、６における
測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
測定試料の大腸菌数と測定したＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、抽出試薬を適用し
て微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した微生物Ａ
ＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリンによる
生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰの測定方
法において、前記ＡＴＰ分解試薬の添加により試料中の
遊離ＡＴＰを分解した後、ＡＴＰ分解試薬を含んだ試料
をろ過材でろ過して、試料中に含まれる微生物をろ過材
上に捕捉し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して、ろ過材
およびろ過材上の微生物に付着したＡＴＰ分解試薬を洗
い流し、然る後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試
薬を適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出すること
を特徴とする微生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項２】 微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を添
加して試料中の遊離ＡＴＰを分解し、抽出試薬を適用し
て微生物の細胞からＡＴＰを抽出し、抽出した微生物Ａ
ＴＰの濃度をルシェフェラーゼとルシェフェリンによる
生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰの測定方
法において、前記微生物を含む試料にＡＴＰ分解試薬を
添加せずに試料をろ過材でろ過して、試料中に含まれる
微生物をろ過材上に捕捉し、ろ過材にＡＴＰ分解試薬を
作用させて、ろ過材に吸着した試料中の遊離ＡＴＰを分
解し、ろ過材を無菌の洗浄液で洗浄して、ろ過材および
ろ過材上の微生物に付着したＡＴＰ分解試薬を洗い流
し、然る後、ろ過材上に捕捉された微生物に抽出試薬を
適用して、微生物の細胞からＡＴＰを抽出することを特
徴とする微生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項３】 前記ろ過材の孔径は０．２〜０．５μｍ
である請求項１または２の測定方法。 - 【請求項４】 前記ろ過材はメンブランフィルタまたは
中空糸フィルタである請求項１または２の測定方法。 - 【請求項５】 前記無菌の洗浄液は、滅菌した蒸留水、
イオン交換水、ｐＨ緩衝液、糖水溶液またはポリアルコ
ール水溶液である請求項１または２の測定方法。 - 【請求項６】 前記ＡＴＰ分解試薬は、アピラーゼ、ヘ
キソキナーゼ、グルコキナーゼ、ケトヘキソキナーゼ、
フルクトキナーゼまたはガラクトキナーゼを含む請求項
１または２の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28284597A JPH1189592A (ja) | 1997-07-25 | 1997-09-30 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21599997 | 1997-07-25 | ||
| JP9-215999 | 1997-07-25 | ||
| JP28284597A JPH1189592A (ja) | 1997-07-25 | 1997-09-30 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189592A true JPH1189592A (ja) | 1999-04-06 |
Family
ID=26521168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28284597A Pending JPH1189592A (ja) | 1997-07-25 | 1997-09-30 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1189592A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100462714C (zh) * | 2005-05-23 | 2009-02-18 | 西安交通大学 | 一种多样本微生物污染快速筛拣的方法 |
| WO2024019166A1 (ja) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | キッコーマン株式会社 | 溶液中の微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット |
-
1997
- 1997-09-30 JP JP28284597A patent/JPH1189592A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100462714C (zh) * | 2005-05-23 | 2009-02-18 | 西安交通大学 | 一种多样本微生物污染快速筛拣的方法 |
| WO2024019166A1 (ja) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | キッコーマン株式会社 | 溶液中の微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040910 |
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Effective date: 20070724 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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| A02 | Decision of refusal |
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