JP3864033B2 - Atpの検査方法 - Google Patents
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【発明が属する技術分野】
本発明は、動植物の代謝・生合成系において生成されるATPの量を、連鎖的に増加させ、増加したATPを生物発光によって検出することにより、従来検出できなかった極微量のATPの検出を可能になすものであり、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【0002】
【従来の技術】
ATPは生きた生物の指標である。従って、微生物由来のATPを生物発光に供することによって、光を指標にした微生物の衛生検査が行われている。(例えば、特公平6-34757,登録第1911659号)しかし、微量の微生物の場合にはATPに由来する生物発光が十分に行われない。
【0003】
そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。
【0004】
しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、生物発光の安定の技術であって、ATP量を増加させる技術ではなく、ATPが消費されるに従い、経時的に発光が減衰する欠点を有する。
【0005】
また、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックAMPの定量法が開示されている。
【化1】
【0006】
この方法は、サイクリックAMPをサイクリック3’,5’−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼで加水分解して反応系にAMPを生成せしめる(反応1)と、マグネシウムイオン、微量のATPの存在下に、該AMPをアデニレートキナーゼと反応させてADPに変換せしめる(反応2)と、マグネシウムイオン、ホスホエノールピルビン酸の存在下で、該ADPをピルビン酸キナーゼと反応させて、ATP及びピルビン酸に変換せしめる(反応3)と、ルシフェリン、マグネシウムイオン(又は他の金属イオン)及び溶存酸素の存在下で、ATPをルシフェラーゼと反応させ発光を生成せしめる(反応4)と、(反応4)で生成した発光量を測定することによりサイクリックAMPを定量する方法(METHODSIN ENZYMOLOGY 38,62-65;1974)を特徴としている。
【0007】
しかしながら、この方法は、サイクリックAMPから変換されたAMPを、ADPに変換し、さらに該ADPをホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼの反応によりATPとしてATPのリサイクルが行われるが、ATP量が増加しているわけではない。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、極微量のATPでも検出可能になすことを目的とするもので、従来法とは全く異なる観点でATP量を連鎖的に増加させる新規な方法を提案するとともに、該方法で増加されたATPを生物発光により検出することによって、従来検出できなかった極微量のATPの検出を可能とする新規な方法を提供することを目的とするものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明は、微量のATP(アデノシン三リン酸)の検出可能なATPの検出方法であって、微量のATPの存在下に、AMP(アデノシン一リン酸)、ADK(アデニレートキナーゼ)、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が10〜100個直鎖状に重合したポリリン酸( poly P n ; n =10〜100)又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が10〜1000個直鎖状に重合したポリリン酸( poly P n ; n =10〜1000)、及びPPK(ポリリン酸キナーゼ)を混合し、前記AMPを、前記ADKの存在下で前記ATPと反応させて2分子のADP(アデノシンニリン酸)に変換せしめる第1の反応と、該2分子のADPを、前記PPKの存在下で前記ポリリン酸化合物と反応させて2分子のATPとリン酸基数の減少したポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応と、を一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回実行させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増加させ、該増加したATPを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光を生成させ、該生成した発光量を測定することによりATPを検出する、という技術的手段を講じた。
【0010】
反応系の1回目の反応において、ADK(アデニレートキナーゼ)によって微量のATPとAMPが直ちに反応し、2分子のADPに変換される(第1の反応)。次いで、該2分子のADPはPPK(ポリリン酸キナーゼ)によってポリリン酸(リン酸基数;n)と反応し、2分子のATPとリン酸基数nが2つ減少したポリリン酸(リン酸基数;n-2)に変換される(第2の反応)。そして、反応系の2回目の反応に移るが、このとき、反応系1回目で生じた前記2分子のATPが2分子のAMPと反応し、4分子のADPに変換される(第1の反応)。次いで、該4分子のADPはPPKの存在下で前記ポリリン酸(リン酸基数;n-2)と反応し、4分子のATPとポリリン酸(リン酸基数;n-6)に変換される(第2の反応)。以下、反応系の3回目、反応系の4回目、反応系の5回目…と複数回繰り返されることによりATPが増加する。この反応は、反応系の1回目に存在する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。
【0011】
また、前記ポリリン酸化合物として化学合成により生成されたポリリン酸化合物を用いる場合には、10〜100個のリン酸基(PO3基)が直鎖状に重合したものを用いるとよい。ポリリン酸化合物(PolyPn)とはn個のリン酸基が直鎖状につながったものである。ポリリン酸化合物の1分子中にはリン酸基が少なくとも10〜100個つながっているので、請求項1の第2の反応におけるADPからATPへの変換が容易に行われ、ATPを増加させる際のリン酸基の補給が少量となり経済的になる。また、多数のリン酸基の存在により反応系の反応時間が継続する。
【0012】
さらに、前記ポリリン酸化合物としてバクテリア由来のポリリン酸化合物を用いる場合には、少なくとも10〜1000個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。ポリリン酸化合物の1分子中にリン酸基が少なくとも10〜1000個つながっているので、ADPからATPへの変換がさらに容易に行われ、リン酸基の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸基により反応系の反応時間が長時間継続する。
【0013】
そして、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【0014】
ATPを連鎖的に増幅させる方法により極微量のATPを増幅させ、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてAMP及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のATPに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のATPが検出できるようになる。原理的には、最初の反応系に存在する一分子のATPをも検出できるものである。
【0015】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。以下に本発明の理論的な反応式を示す。
【化2】
【0016】
反応の触媒となるアデニレートキナーゼ(ADK)は、アデノシン一リン酸(AMP)とアデノシン三リン酸(ATP)とを反応させたとき、2分子のアデノシン二リン酸(ADP)を生じさせる酵素である。また、ポリリン酸キナーゼ(PPK)は、ADPとポリリン酸(PolyP)とを反応させ、ATPとポリリン酸(PolyPn-2)とに変換する酵素である。
【0017】
本発明では、ADKの存在下で、微量のATPをAMPと反応させて2分子のADPに変換せしめる第1の反応(1式)と、PPKの存在下で、該2分子のADPをポリリン酸化合物(リン酸基数;n)と反応させて2分子のATPとリン酸基数nが2個減少したポリリン酸化合物(リン酸数;n−2)に変換せしめる第2の反応(2式)とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して行うことにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させるのである。
【0018】
これにより、反応系の1回目の反応において、ADKの触媒作用によってATPとAMPとが直ちに反応し、2分子のADPに変換される(式1)。次いで、該2分子のADPは、PPKの触媒作用によってポリリン酸(リン酸基数;n)と反応し、2分子のATPとリン酸基数nが 2 個減少したポリリン酸(リン酸基数;n−2)に変換される(式2)。そして、反応系の2回目の反応に移るが、このとき、反応系1回目で生じた前記2分子のATPがADKの存在下で2分子のAMPと反応し、4分子のADPに変換される(式3)。次いで、該4分子のADPはPPKの存在下でポリリン酸(リン酸基数;n−2)と反応し、4分子のATPとポリリン酸(リン酸基数;n−6)に変換される(式4)。以下、反応系の3回目、反応系の4回目、反応系の5回目…と複数回繰り返されることによりATPが増加する。この反応は、反応系の1回目に存在する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。
【0019】
ポリリン酸(PolyPn)とはn個のリン酸基がつながったもので、例えば、化学合成されたポリリン酸は100個ほどのリン酸基がつながったものである。また、バクテリアから取り出したものは1000個近いリン酸基がつながったものである。
【0020】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物(PolyPn)は、以下の構造式によって表される。ここで、(PolyPn)は10≦n≦1000の範囲が好ましい。
【化3】
【0021】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン酸基が重合しているので反応性が向上する。
【0022】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ATPから生合成する。
【化4】
【0023】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とATPと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸合成酵素を生合成し得るものであればよい。
【0024】
本発明者らは、ATPの連鎖的増幅反応について、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼの代わりにクレアチンキナーゼ及びクレアチンリン酸を使用しても反応が起こることを確認した。すなわち、2分子のADPを2分子のATPに変換することのできるリン酸化合物と酵素であれば、原理的にはATPを連鎖的に増幅反応を起こさせると考えられる。しかし、ポリリン酸はポリリン酸キナーゼと組み合わせることにより、一分子で多数のATPを合成する能力があるので、連続して起こるATPの増幅反応に有利である。
【0025】
【実施例1】
ATPを無添加で反応させた条件と、ATPを添加して反応させた条件とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。
【0026】
I.ATP無添加で反応させた場合
(イ)ポリリン酸キナーゼ10μl
(ロ)アデノシン1リン酸(AMP)7.5μl
(ハ)3mMポリリン酸22.5μl
(ニ)ポリリン酸キナーゼ(PPK)15μl
(ホ)アデニレートキナーゼ(ADK)3μl
(ヘ)蒸留水17μl
合計 75μl
上記(イ)〜(へ)の試料を混合し、測定時間ごとにサンプリング(5μl)を行い、ベーリンガーマンハイム社製のATP測定キットにより、ATP容量を測定した。
【0027】
II.ATP添加で反応させた場合
(イ)ポリリン酸キナーゼ緩衝液10μl
(ロ)アデノシン1リン酸(AMP)7.5μl
(ハ)3mM ポリリン酸22.5μl
(ニ)ポリリン酸キナーゼ(PPK)15μl
(ホ)アデニレートキナーゼ(ADK)3μl
(ヘ)1.65μMATP5 μl
(ト)蒸留水12μl
合計 75μl
I.と同様に上記(イ)〜(ト)の試料を混合し、測定時間ごとにサンプリング(5μl)を行い、ベーリンガーマンハイム社製のATP測定キットにより、ATP容量を測定した。
【0028】
上記I.の結果及びII.の結果を図1に示す。この結果から、ATPを添加して反応させた場合(反応II.)、反応後30分からATP量が急激に上昇し、180分経過後にはピークに達する。これに対し、ATP無添加で反応させた場合(反応I.)、ATP量が増加することはなく、低水準のまま推移する。従って、本発明では、微量ATPの存在が引き金となって、ATPの連鎖的増加が起こったことが分かる。従って、わずかな量のATPでもATP量を増加させて感度よく検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。また、安価でかつ簡単なルミノメータによりATPを検出することができる。
【0029】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、微量のATPをADKの存在下でAMPと反応させて2分子のADPに変換せしめる第1の反応と、PPKの存在下で、該2分子のADPをポリリン酸化合物(リン酸基数;n)と反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物(リン酸基数;n−2)に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返し実行させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させるので、反応系の1回目に存在する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的にATPの増加が起こる。そして、ATPの連鎖的増加は、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。この後、増加したATPを生物発光で検出すると、反応系の1回目に添加する微量のATPに比べて、膨大な光量の増強が起こる。
【0030】
ポリリン酸とADPとを反応させてATPを合成する際、連鎖的にATPを増加させることが可能となる。これにより、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができる。
【0031】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜100個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の1分子中にリン酸基( - PO3 - )が少なくとも10〜100個含まれているので、ADPからATPへの連続的な変換が容易に行われる。
【0032】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、ADPからATPへの変換がさらに容易に行われ、リン酸基の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸基により反応系の反応時間が長時間継続する。
【0033】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【0034】
ATPを連鎖的に増幅させる方法により極微量のATPを増幅させ、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてAMP及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のATPに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のATPが検出できるようになり、例えば、ATPの増幅を伴わない方法と比較して1000倍以上の明るさで検出できることになり、生物発光の測定の感度と精度が格別に向上する。
【0035】
また、本発明ではATPの増幅が起こるため、従来の方法では検出できなかった極微量のATPを検出できる。そのために、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。このように、微量有害微生物の検出による衛生管理に応用する他、ATPを生ずる、あるいは、ATPを消費するような一般的な生化学反応の検査にも応用できる。また、ATPを検出することによって、ルミノール反応にかわる科学捜査などへの応用も考えられる。また、ATPの合成生産などにも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 ATPの連鎖的増幅反応においてATPを無添加で反応させた場合とATPを添加して反応させた場合とを比較した図である。
Claims (1)
- 微量のATP(アデノシン三リン酸)の検出可能なATPの検出方法であって、
微量のATPの存在下に、AMP(アデノシン一リン酸)、ADK(アデニレートキナーゼ)、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が10〜100個直鎖状に重合したポリリン酸( poly P n ; n =10〜100)又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が10〜1000個直鎖状に重合したポリリン酸( poly P n ; n =10〜1000)、及びPPK(ポリリン酸キナーゼ)を混合し、前記AMPを、前記ADKの存在下で前記ATPと反応させて2分子のADP(アデノシンニリン酸)に変換せしめる第1の反応と、
該2分子のADPを、前記PPKの存在下で前記ポリリン酸化合物と反応させて2分子のATPとリン酸基数の減少したポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応と、を一対の反応系となし、
該一対の反応系を複数回実行させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増加させ、
該増加したATPを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光を生成させ、
該生成した発光量を測定することによりATPを検出することを特徴とするATPの検出方法。
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