KR101639031B1 - 캘빈회로 유전자가 도입된 이산화탄소 저감용 재조합 미생물 및 이를 활용한 이산화탄소 저감 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 캘빈회로(Calvin Cycle) 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 이를 활용한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 로도박터스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 캘빈회로의 캘빈-벤슨-배스햄순환(CalvinBensonBassham cycle; cbb)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법 또는 유용 유기물 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 상기 캘빈회로 유전자 도입으로 인해 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.

Description

캘빈회로 유전자가 도입된　이산화탄소 저감용　재조합 미생물 및 이를 활용한　이산화탄소 저감　방법{Recombinant microorganism comprising calvin cycle　for reducing carbon dioxide　and　carbone dioxide reduction　method using the same}

본 발명은 캘빈회로(Calvin Cycle) 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 이를 활용한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 로도박터스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 캘빈회로의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Basshame; cbb) 회로를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법 또는 유용 유기물 생산방법에 관한 것이다.

이산화탄소는 지구 온난화를 일으키는 주요 물질 중 하나로, 산업화에 따른 화석연료의 사용증가로 인해 이산화탄소 발생이 증가하여 지구 온난화를 촉진하고 있다. 이를 방지하기 위해 세계 각국에서는 탄소 배출을 줄이는 것과 동시에 이산화탄소 저감을 위한 노력을 하고 있다. 탄소배출권을 판매하여 탄소의 발생 및 화석연료의 사용을 가능한 한 억제하고 있으며, 이미 발생한 이산화탄소를 감소하기 위한 연구가 진행 중이다.

또한, 이산화탄소를 단지 제거해야 할 오염물질로만 보는 것 이외에, 이를 활용하여 경제적인 부가가치를 창출하고자 하는 노력이 진행되고 있다. 일반적으로 제시되는 재연소법 등의 방식으로 이산화탄소를 대기에서 분리할 경우 사후 처리 비용이 높아 경제적 가치가 떨어졌지만, 분리한 이산화탄소를 기반으로 가치 있는 물질을 확보할 경우 그 응용 가능성과 경제적 가치는 매우 높다고 할 수 있다. 이러한 방법 중 대표적인 예로 생체-결정화(biomineralization)가 있으며, 분리된 이산화탄소를 다른 화학물질과 결합시켜 결정화시키면, 적은 비용으로 이산화탄소를 감소시킬 수 있으며 동시에 처리와 이용이 쉬운 생성물질들을 얻을 수 있다. 특히 자연계에서 일어나는 생체-결정화를 모방하였기 때문에 반응 환경이 까다롭지 않으며, 응용을 통해 원하는 형태로 얻을 수 있다는 장점을 지니고 있다 (Yu, K.M.K., et al ., Chemsuschem , 1(11):893, 2008; Haszeldine, R.S., Science, 325(5948):1647, 2009; Al-Traboulsi, M., et al ., Environmental and Experimental Botany , 80:43, 2012; Chalmers, H., J. Gibbins, and M. Leach, Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 17(6):621, 2012).

최근 유전공학, 대사공학, 합성생물학 기술이 발전함에 따라 외부 유전자를 도입하여 광합성 시스템을 이용하는 연구가 증가하고 있다. 특히 캘빈회로 경로를 통해 이산화탄소가 당 및 화학소재로 형성되므로 루비스코 유전자의 과발현을 통해서 이산화탄소 고정 효율을 증가하는 연구가 수행되고 있다. 대기 또는 수중의 이산화탄소는 식물 또는 미생물 (미세조류, cyanobacteria 등)의 광합성 작용에 의해 유기물질로 고정된다. 즉 광합성 작용은 자연계 물질순환의 핵심기능이며, 이산화탄소 저감을 위한 환경 친화적 방법이다. 광합성 미생물은 지상 식물과 마찬가지로 빛을 필수 에너지원으로 이산화탄소를 기질로 유기물을 합성하는 특성을 가지고 있다. 광합성 미생물에 의해 생산되는 유기물은 다양한 유용물질 (단백질, 비타민, 다당류 물질 등)을 함유하고 있어 사용 균주에 따라서 생물의약, 생리활성물질, 건강 보조식품, 치어 양식용 사료 등 고부가가치 제품을 생산하는 공정에 활용이 가능하다는 장점이 있다. 하지만, 기존 이산화탄소의 생물학적 전환 방법의 경우 미세조류의 이산화탄소 고정화 능력과 광합성 능력을 이용하여 연구가 진행되고 있으나, 배양속도 및 유전자 조작기술의 한계에 따른 다양한 화학제품생산 및 생산수율 증대의 어려움이 있다.

이산화탄소를 고정하는 경로를 유용 화합물 생산 미생물에 도입하여, 유용 물질을 생산하고자 하는 시도로, 아이디어로서는 몇 가지가 보고되어 있다. 예를 들면 국제공개특허 제2009/094485호 또는 국제공개특허 제2010/071697호에는, 아세트산균의 Wood-Ljungdahl 경로와 유사한 경로를 도입한 미생물을 이용하여 이산화탄소로부터 아세틸-CoA를 생산하는 제안이 개시되어 있다. 또한, CO₂를 고정하여 유용 화합물을 생산시키는 예로서, 국제공개특허 제2009/046929호에는, 히드로게나제와 테트라히드로엽산리아제를 도입한 미생물을 이용하여 이산화탄소에서 젖산을 생산하는 시도가 개시되어 있으며, 국제공개특허 제2011/099006호에는, 아세틸-CoA상에의 탄산 고정 반응이나 말로닐-CoA의 환원 반응을 경유하여, CO₂를 고정하는 회로가 개시되어 있다.

한편, 몇몇 광합성 세균들은 CO₂가 유일한 탄소원일 때, 세포의 탄소원을 공급하기 위하여 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; CBB)의 환원성 펜타오스 포스페이트(pentose phosphate) 경로를 작동시킨다. 식물의 엽록체에서, 이 경로의 탄소고정 역할을 담당하는 루비스코(RubisCO)는 큰단위 단백질과 작은단위 단백질이 8개씩으로 이루어진 구조를 가지고 있다. 로도박터(Rhodobacter) 에 속하는 세균들은 form I과 form Ⅱ의 RubisCO는 각각 별도의 염색체(chromosome)에 존재하며 form I의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbbI 오페론(operon)에, form Ⅱ의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbb Ⅱ 오페론에 존재하는 것으로 알려져 있다. cbbI 오페론(operon)과 cbb Ⅱ 오페론에 의해 코딩되는 효소들은 CO₂ 고정 경로뿐만 아니라, 다른 탄수화물 대사과정에도 관여한다.

이에, 본 발명자들은 광합성 박테리아인 로도박터 스페로이드로부터 분리된 캘빈회로 유전자를 캘빈회로를 가지고 있지 않은 미생물에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며, 상기 재조합 미생물에 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 캘빈회로의 cbb 오페론 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환되거나, 캘빈회로의 cbb 오페론 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법 또는 유용 유기물의 생산 방법을 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS)를 포함하는 재조합 벡터 또는 D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래일 수 있으며, 상기 fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 12로 표시되는 prkA - cfxA 유전자 및 서열번호 13으로 표시되는 cbbL - cbbS 유전자를 포함할 수 있다

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 서열번호 14로 표시되는 fbpB -prkB 유전자, 서열번호 15로 표시되는 tklB - gapB 유전자 및 서열번호 16으로 표시되는 cfxB - rbpL 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS); 또는 (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)가 숙주세포에 도입되어 있거나, 상기 (ⅰ) cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 (ⅱ) fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 캘빈회로를 가지고 있지 않은 미생물일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 (ⅰ)서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자 또는 (ⅱ) 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자가 숙주세포에 도입되어 있을 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물은 (ⅰ) cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자 및 (ⅱ) fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자가 동시에 숙주세포에 도입되어 있을 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물은 (ⅰ) cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 (ⅱ) fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 동시에 숙주세포에 도입되어 있을 수 있다.

두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법은 상기 재조합 미생물을 이산화탄소 존재하에서 배양할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법에서 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 또는 ZnPc(Zinc phthalocyanine)를 재조합 미생물 배양 배지에 처리하면 더욱 효과적으로 이산화탄소를 저감시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 이용한 유용물질 생산방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물을 이용한 유용물질 생산방법은 상기 재조합 미생물을 이산화탄소를 탄소원으로 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 생성된 유용물질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 유용물질은 유용물질은 캘빈회로에 의해 생성되는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프럭토스(fructose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 당, 유기산 또는 ATP로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 상기 캘빈회로 유전자 도입으로 인해 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.

도 1은 cbbI 오페론 유래의 cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터(MBTLY I-3)의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 cbbⅡ 오페론 유래의 fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터(MBTLY Ⅱ-3)의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 나타낸 모식도이다 (MBTL-YS0 : 캘빈회로 유전자가 삽입되지 않은 빈벡터(pET-28b 및 PET-21a)로 형질전환된 재조합 미생물, MBTL-YS1 : cbbI 관련 단백질을 코팅하는 유전자를 포함한 재조합 벡터(MBTLY I-3) 및 cbbⅡ 관련 단백질을 코팅하는 유전자를 포함한 재조합 벡터(MBTLY Ⅱ-3)로 형질전환된 재조합 미생물, MBTL-YS2 : cbbI 관련 단백질을 코팅하는 유전자를 포함한 재조합 벡터(MBTLY I-3) 및 PET-21a로 형질전환된 재조합 미생물, MBTL-YS3 : cbbⅡ 관련 단백질을 코팅하는 유전자를 포함한 재조합 벡터(MBTLY Ⅱ-3) 및 pET-28b로 형질전환된 재조합 미생물).
도 4는 재조합 미생물을 LB 배지에 배양하였을 때, 세포 성장곡선을 나타낸 데이터이다.
도 5는 M9 최소배지에 재조합 균주를 넣고 1mM IPTG를 이용하여 재조합된 단백질을 과발현하였을 때 세포 성장속도를 나타낸 데이터이다.
도 6은 LB 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 배양하였을 때 IPTG를 첨가한 시간을 기준으로 각각의 재조합 균주의 이산화탄소 양을 나타낸 데이터이다.
도 7은 LB 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 24시간 동안 배양하였을 때 생균수 (a)와 생균수당 이산화탄소 양(b)을 나타낸 데이터이다.
도 8은 LB 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 배양하였을 때 IPTG를 첨가한 시간을 기준으로 각각의 재조합 균주의 이산화탄소 양을 나타낸 데이터이다.
도 9는 LB 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 24시간 동안 배양하였을 때 생균수(a)와 생균수당 이산화탄소 양(b)을 나타낸 데이터이다.
도 10은 M9 최소 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 배양하였을 때 IPTG를 첨가한 시간을 기준으로 각각의 재조합 균주의 이산화탄소 양을 나타낸 데이터이다.
도 11은 M9 최소 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 24시간 동안 배양하였을 때 생균수(a)와 생균수당 이산화탄소 양(b)을 나타낸 데이터이다.
도 12은 M9 최소 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG와 10 uM RuBP를 첨가하여 배양하였을 때 IPTG와 RuBP를 첨가한 시간을 기준으로 각각의 재조합 균주의 이산화탄소 양을 나타낸 데이터이다.
도 13은 M9 최소 배지에 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG와 10 uM RuBP를 첨가하여 24시간 동안 배양하였을 때 생균수(a)와 생균수당 이산화탄소 양(b)을 나타낸 데이터이다.
도 14는 M9 최소 배지에서 재조합 균주를 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG와 10 uM RuBP를 첨가하여 재조합된 단백질을 2시간 동안 과발현하였을 때 ATP(a)와 NAD/NADH의 비율(b)을 나타낸 데이터이다(IPTG는 M9 액체 배지에 본 배양을 하였으며, +IPTG는 M9 액체 배지에 본 배양을 한 후 1mM IPTG를 첨가하였으며, +RuBP는 M9 액체 배지에 본 배양을 한 후 1mM IPTG와 10 uM RuBP를 첨가함).
도 15는 M9 최소 배지에 재조합 균주와 50 ug/ml Zinc Phthalocyanine을 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 배양하였을 때 IPTG를 첨가한 시간을 기준으로 각각의 재조합 균주의 이산화탄소 양을 나타낸 데이터이다.
도 16은 M9 최소 배지에 재조합 균주와 50 ug/ml Zinc Phthalocyanine을 넣고 빛이 존재하지 않는 조건에서 1mM IPTG를 첨가하여 24시간 동안 배양하였을 때 생균수(a)와 생균수 당 이산화탄소 양(b)을 나타낸 데이터이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 이산화탄소의 생물학적 전환 방법의 경우 미세조류의 이산화탄소 고정화 능력과 광합성 능력을 이용하여 연구가 진행되고 있으나, 배양속도 및 유전자 조작기술의 한계에 따른 다양한 화학제품생산 및 생산수율 증대의 어려움이 있다.

본 발명은 로도박터스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 캘빈회로의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; cbb) 회로에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 캘빈회로를 포함하지 않은 미생물에 캘빈회로 유전자를 도입시킴으로써 이산화탄소 고정능을 가진 재조합 미생물을 제조할 수 있으며, 상기 재조합 미생물은 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS)를 포함하는 재조합 벡터 또는 (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

상기 cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래일 수 있으며, 상기 fbpB , prkB , tklB , gapB, cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래일 수 있다.

상기 '오페론(operon)'은 염색체상에서 하나의 리프레서와 오퍼레이터에 의해 조절을 받고 있는 전사 단위. 이것에 의해 하나의 대사계 중에서 효소군의 합성이 동시에 조절된다. 리프레서의 오퍼레이터에 대한 결합의 유무로 전사가 억제된다. 이러한 조절기능이 있는 유전자군을 오페론이라고 하며, 현재는 단순히 전사 단위를 오페론이라 하는 경우도 있다.

또한, 상기 '캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; CBB) 회로'는 캘빈회로(Calvin cycle)에 일종으로, 몇몇 광합성 세균들은 CO₂가 유일한 탄소원일 때, 세포의 탄소원을 공급하기 위하여 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; CBB)의 환원성 펜타오스 포스페이트(pentose phosphate) 경로를 작동시킨다. 이 경로의 탄소고정 역할을 담당하는 단백질은 루비스코(RubisCO)로 알려져 있으며, 로도박터(Rhodobacter) 에 속하는 세균들은 form I과 form Ⅱ의 두 종류 루비스코(RubisCO)를 함유하고 있다. form I과 form Ⅱ의 RubisCO는 각각 별도의 염색체(chromosome)에 존재하며 form I의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbbI 오페론(operon)에, form Ⅱ의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbb Ⅱ 오페론에 존재하는 것으로 알려져 있다. cbbI 오페론(operon)과 cbb Ⅱ 오페론에 의해 코딩되는 효소들은 CO₂ 고정 경로뿐만 아니라, 다른 탄수화물 대사과정에도 관여한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 12로 표시되는 prkA-cfxA 유전자 및 서열번호 13으로 표시되는 cbbL-cbbS 유전자를 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 14로 표시되는 fbpB-prkB 유전자, 서열번호 15로 표시되는 tklB-gapB 유전자 및 서열번호 16으로 표시되는 cfxB-rbpL 유전자를 포함할 수 있다.

도 1 및 2는 cbbI 오페론 또는 cbbⅡ 오페론 유전자 유래의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; CBB) 회로 관련 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법을 나타낸 모식도로, 본 발명에서는 cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터(MBTLY I-3) 및 fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터(MBTLY Ⅱ-3)를 제조하기 위해 로도박터스페로이드 KCTC 1434 (Rhodobacter sphaeroides KCTC 1434) 균주 유래의 캘빈회로 유전자를 사용하였다.

본 발명의 일실시예에서, 로도박터 스페로이드의 유전체 데이터로부터 cbbI 오페론에 해당하는 cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자와 cbbⅡ 오페론에 해당하는 fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자의 DNA 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 로도박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA로부터 상기 각각의 유전자를 수득하였으며, 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 12로 표시되는 prkA - cfxA 유전자 및 서열번호 13으로 표시되는 cbbL - cbbS 유전자가 포함된 재조합 벡터(MBTLY I-3) 및 서열번호 14로 표시되는 fbpB-prkB 유전자, 서열번호 15로 표시되는 tklB-gapB 유전자 및 서열번호 16으로 표시되는 cfxB-rbpL 유전자가 포함된 재조합 벡터(MBTLY Ⅱ-3)를 제조하였다.

상기 MBTLY I-3 재조합 벡터는 도 1에 나타난 바와 같이, cbbF, prkA-cfxA, cbbL-cbbS 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있으며, MBTLY Ⅱ-3 재조합 벡터는 도 2에 나타난 바와 같이, fbpB - prkB , tklB - gapB , cfxB - rbpL 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있다.

다음으로 본 발명은, (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS); 또는 (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)가 숙주세포에 도입되어 있거나, 상기 (ⅰ) cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 (ⅱ) fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 재조합 미생물은 (ⅰ) cbbF , prkA, cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자 및 (ⅱ) fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자가 동시에 숙주세포에 도입되어 있거나, (ⅰ) cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 (ⅱ) fbpB , prkB, tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 동시에 숙주세포에 도입되어 있을 수 있다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110,E. coli X1776, E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 바람직하게는 캘빈회로롤 포함하지 않은 미생물, 더 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)을 사용할 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al.,EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에서 캘빈회로 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca⁺을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전-서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용한다.

도 3은 상기 재조합 벡터인 MBTLY I-3 및/또는 MBTLY Ⅱ-3로 형질전환된 재조합 미생물을 나타낸 모식도로, 본 발명의 일실시예에서는 MBTLY I-3 및 MBTLY Ⅱ-3을 동시에 E. coli BL21(DE3)에 전기천공법으로 형질전환시켜 재조합 미생물(MBTL-YS1)을 제조하였으며, 두 벡터의 동시발현 시스템으로 캘빈회로 효율을 더욱 증가시키고자하였다. 대조군으로는 유전자가 삽입되지 않은 pET-21a 벡터와 pET-28b 벡터를 함께 형질전환한 재조합 미생물(MBTL-YS0)를 사용하였으며, 보다 효과적인 비교를 위해 MBTLY I-3 와 pET-21a 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS2), MBTLY Ⅱ-3 와 pET-28b 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS3)를 제조하였다.

다음으로 본 발명은, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법은 상기 재조합 미생물을 이산화탄소 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에서 제조한 재조합 미생물인 MBTL-YS0, MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주 각각에 대한 성장 정도 및 이산화탄소 고정능력을 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 상기 각각의 재조합 미생물을 LB 배지에서 배양하며 세포 성장곡선을 확인한 결과, 각각의 균주의 성장 정도는 크게 다르지 않음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법에서 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 및 ZnPc(Zinc phthalocyanine)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 재조합 미생물 배양 배지에 처리하면, 더욱 강력하고 효과적으로 이산화탄소를 저감시킬 수 있다.

도 5에 나타난 바와 같이, IPTG를 처리하면 재조합 균주 내 재조합 단백질을 과발현되어 세포의 성장속도가 증가됨을 확인하였다. 즉, 균주의 균체성장속도는 MBTL-YS0, MBTL-YS3, MBTL-YS2, MBTL-YS1 순으로 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 여러가지 조건에서 재조합 미생물을 배양한 후, 이산화탄소 저감 효과를 측정하였다. 빛이 존재하지 않는 조건에서도 재조합 미생물은 이산화탄소 저감 효과를 가지며, 빛이 존재하는 조건에서도 재조합 미생물은 이산화탄소 저감 효과를 가지는 것으로 확인되었다(도 6 내지 11 참조).

본 발명의 일실시예에서는 RuBP를 처리하였을 때, 생균수 당 이산화탄소 농도가 재조합 미생물에서 낮게 나타나는 것으로 확인하였다(도 12 및 13 참조). RuBP가 추가로 첨가되었을 때, ATP의 농도가 감소하여 재조합 미생물의 캘빈회로가 작동하였고, 이로 인해 이산화탄소가 더욱 효과적으로 저감되었다(도 14 참조).

본 발명의 일실시예에서는 ZnPc를 처리하였을 때, 빛을 흡수하여 에너지를 전달해주어 캘빈회로가 더욱 잘 작동할 수 있게 되고, 이에 이산화탄소 농도가 더욱 효과적으로 저감되었다(도 15 및 16 참조).

특히, cbbI 관련 단백질을 코팅하는 유전자 및 cbbⅡ 관련 단백질을 코팅하는 유전자가 동시에 도입된 MBTL-YS1 균주는 이산화탄소의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 캘빈회로를 가지고 있지 않는 미생물에 캘빈회로 유전자를 도입함으로써, 탄소고정능이 생성된 재조합 미생물이 제조된 것을 의미한다.

또한, 상기 탄소고정능을 가진 재조합 미생물을 이산화탄소 존재하에서 배양하면, 이산화탄소를 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 이산화탄소 저감을 위한 방법에 활용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 '이산화탄소(CO₂) 고정'이란, 당대사에 있어서 발생하는 CO₂나 외부로부터 공급된 CO₂를 유기 화합물로 변환하는 것을 가리킨다. CO₂는 HCO₃ ^-이여도 된다.

다음으로 본 발명은, 상기 재조합 미생물을 이용한 유용물질 제조방법을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 이용한 유용물질 생산방법은 상기 재조합 미생물을 이산화탄소를 탄소원으로 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 생성된 유용물질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 유용물질은 캘빈회로에 의해 생성되는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프럭토스(fructose) 등의 당과 유기산 또는 에너지 전달 물질인 ATP 등 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 탄소고정능을 가지고 있으므로, 광합성 효율을 증가시킬 수 있으며, 광합성 과정을 통해 생성되는 각종 유용한 유기물을 생산할 수 있다.

본 발명에서는 ATP 측정을 통해 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물의 광합성 효율이 증가한 것을 확인하였으며, 생성된 유기물의 양을 확인하였다.

즉, 본 발명에서는 상기 두 개의 플라스미드를 동시에 발현시키는 2 플라스미드 시스템을 통해 cbbI 오페론 유래 cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자 및 cbbⅡ 오페론 유래 fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자가 동시에 작동하게 하는 재조합 미생물을 얻었으며, 이를 통해 보다 향상된 이산화탄소의 저감 효과와 증가된 유기물질의 생산을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 상기 캘빈회로 유전자 도입으로 인해 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

로도박터 스페로이드 내 캘빈회로에 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

본 발명에서는 캘빈회로를 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위해 통성혐기성 광합성 균주인 로도박터스페로이드 KCTC 1434 (Rhodobacter sphaeroides KCTC 1434) 균주를 사용하였으며, 단백질 발현벡터로 알려진 pET-21a(Novagen, 미국) 및 pET-28b(Novagen, 미국) 벡터를 사용하여 클로닝 하였다.

먼저, 로도박터 스페로이드 유래의 캘빈회로인 캘빈-벤슨-배스햄(CalvinBensonBassham; cbb) 회로를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 로도박터 스페로이드의 유전체 데이터로부터 CBB 사이클의 cbbI 오페론을 구성하고 있는 유전자인 D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF; 서열번호 1), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA; 서열번호 2), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA; 서열번호 3), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL; 서열번호 4) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS; 서열번호 5)와 cbbⅡ 오페론을 구성하고 있는 유전자인 D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB; 서열번호 6), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자(prkB; 서열번호 7), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB; 서열번호 8), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB; 서열번호 9), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxB; 서열번호 10) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit; 서열번호 11)을 코딩하는 유전자(rbpL)의 DNA 서열을 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보하여 각각의 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하였으며, 증폭된 유전자를 벡터에 삽입할 수 있도록 제한효소 사이트가 포함되도록 제작하였다 (바이오니아, 한국).

상기 cbbI 오페론 및 cbbⅡ 오페론을 구성하고 있는 각각의 유전자는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

프라이머 서열

유전자			프라이머 서열	비고	서열번호
cbb I	cbbF	forward	5'- TAA TCT AGA GTG AAG CCC TTT CCC ACC -3'	XbaI	서열번호 17
		reverse	5'- TAA CAT ATG TCA GCT CCG GAA CAG GCC -3'	NdeI	서열번호 18
	prkA-cfxA	forward	5'- GGG CAT ATG AGC AAG AAG CAT CCC ATC -3'	NdeI	서열번호 19
		reverse	5'- TAA GCT AGC TCA GGC GGC TTT GGC GGT -3'	NheI	서열번호 20
	cbbL-cbbS	forward	5'- TTT GCT AGC ATG GAT ACC AAC ACC ACC -3'	NheI	서열번호 21
		reverse	5'- AAT AAG CTT TCA GCG GAC GAT GCT GTG -3'	Hind	서열번호 22
cbb	fbpB-prkB	forward	5'- TAA TCT AGA ATG GCC ATC GAG CTG GAG GAC -3'	XbaI	서열번호 23
		reverse	5'- TAA CAT ATG TCT CCG TCT GTC TGT CGC -3'	NdeI	서열번호 24
	tklB-gapB	forward	5'- TTA CAT ATG AAG GAC ATT GGA GCC GCG -3'	NdeI	서열번호 25
		reverse	5'- ATT GCT AGC TCA GAG AAG CCG GCC CAT -3'	NheI	서열번호 26
	cfxB - rbpL	forward	5'- AAG GCT AGC ATG GCA CTC ATC ACG CTT -3'	NheI	서열번호 27
		reverse	5'- AAT AAG CTT TCA GGC CGC GCG ATG CAG -3'	Hind	서열번호 28

*표 1의 밑줄친 부분은 제한효소에 의해 절단되는 위치를 표기한 것임.

cbbI 오페론을 구성하고 있는 cbbF , prkA , cfxA , cbbL 및 cbbS 유전자를 증폭시키기 위해, 로도박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR증폭 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 결과, cbbF 는 1 kb, prkA - cfxA은 1.95 kb, cbbL - cbbS는 1.85 kb의 크기를 가지는 cbbI(form I) DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭 산물의 서열을 확인한 결과, cbbF 유전자는 서열번호 1로, prkA - cfxA 유전자는 서열번호 12, cbbL - cbbS 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 것을 확인하였다.

또한, cbbⅡ 오페론을 구성하고 있는 fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB 및 rbpL 유전자를 증폭시키기 위해, 로도박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR증폭 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 결과, fbpB - prkB 는 1.87 kb, tklB - gapB은 2.97 kb, cfxB - rbpL는 2.44 kb의 크기를 가지는 cbbⅡ(form Ⅱ) DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭 산물의 서열을 확인한 결과, fbpB - prkB 유전자는 서열번호 14, tklB - gapB 유전자는 서열번호 15, cfxB - rbpL 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 것을 확인하였다.

재조합 벡터 및 재조합 미생물 제조

2-1 : 재조합 벡터 제조

본 발명에서는 실시예 1에서 증폭한 캘빈-벤슨-배스햄(CalvinBensonBassham; cbb) 회로 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하기 위해 대장균-단백질 발현벡터인 pET-28b(Novagen, 미국)를 기본 벡터로 사용하여 캘빈회로 form I(cbb I) 발현용 벡터인 MBTLY I-3을 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다; 실시예 1에서 증폭한 cbbF DNA절편을 XbaI과 NdeI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pET-28b 벡터에 도입하였으며, 이를 MBTLY I-1로 명명하였다. 여기에 prkA-cfxA 유전자를 NdeI과 NheI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY I-2로 명명하였다. 또한 여기에 cbbL-cbbS 유전자를 NheI과 HindⅢ로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY I-3으로 명명하였다 (도 1).

또한, 대장균-단백질 발현벡터인 pET-21a (Novagen, 미국)를 기본 벡터로 사용하여 캘빈-벤슨-배스햄 form Ⅱ(cbbⅡ) 발현용 벡터인 MBTLY Ⅱ-3을 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다; 실시예 1에서 증폭한 fbpB-prkB DNA 절편을 XbaI과 NdeI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pET-21a벡터에 도입하였으며, 이를 MBTLY Ⅱ-1로 명명하였다. 여기에 tklB-gapB 유전자를 NdeI과 NheI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY Ⅱ-2로 명명하였다. 또한 여기에 cfxB-rbpL유전자를 NheI과 HindⅢ로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY Ⅱ-3으로 명명하였다 (도 2).

2-2 : 재조합 미생물 제조

본 발명에서는, 두 벡터의 동시발현 시스템으로 캘빈회로 효율을 더욱 증가시키기 위해, 실시예 2-1에서 제조한 재조합 벡터인 MBTLY I-3 및 MBTLY Ⅱ-3을 동시에 대장균인 Escherichia coli BL21 (DE3)에 전기천공법 (Electroporation)으로 형질전환하여 재조합 미생물을 제조하였다.

상기에서 제조된 재조합 미생물은 카나마이신과 암피실린이 각각 함유된 LB 고체평판배지에서 배양하여 콜로니를 수득한 다음, 새로운 배지에 옮겨 단일 콜로니를 수득하였으며, 이 균주를 MBTL-YS1이라 명명하였다. 상기 균주에 캘빈-벤슨-배스햄 회로 유전자가 제대로 도입되었는지 확인하기 위해, DNA 시퀀싱(Sequancing)을 수행하였으며, MBTLY I-3에 삽입된 cbbF, cfxA, prkA, cbbL, cbbS의 DNA 염기서열 및 MBTLY Ⅱ-3에 삽입된 fbpB , prkB , tklB , gapB , cfxB , rbpL 의 DNA 염기서열이 포함되어 있는 것을 확인하였다

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군으로는 유전자가 삽입되지 않은 pET-21a 벡터와 pET-28b 벡터를 함께 형질전환한 재조합 미생물(MBTL-YS0)를 사용하였으며, 보다 효과적인 비교를 위해 MBTLY I-3 와 pET-21a 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS2), MBTLY Ⅱ-3 와 pET-28b 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS3) 및 MBTLY I-3 벡터와 MBTLY Ⅱ-3 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS1)을 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.

재조합 미생물의 성장

3-1 : 재조합 미생물 성장 곡선 확인

본 발명에서는 실시예 2-2에서 제조한 재조합 미생물인 MBTL-YS0, MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주의 성장 정도를 비교하기 위해, 각각의 균주를 LB 배지를 사용하여 바이알(WH.224037, Wheaton, 미국)에서 배양하면서 세포 성장 곡선을 분석하였다.

먼저, 실시예 2-2의 재조합 미생물을 암피실린(A9518-25G; Sigma-aldrich, 미국) 및 카나마이신(11815-032; Gibco, 미국)이 각각 50 ㎍/㎖씩 함유되어 함유된 5 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하여 수득한 배양액 600 ㎕를 암피실린 및 카나마이신이 각각 50 ㎍/㎖으로 함유된 60 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하고 30℃에서 150rpm으로 배양하였다. 균주의 균체성장 측정은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 각각의 균주의 성장 정도는 크게 다르지 않음을 확인하였다.

3-2 : IPTG 을 첨가하였을 때의 미생물 성장 곡선 확인

실시예 2-2에서 제조한 재조합 미생물인 MBTL-YS0, MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주의 성장 정도를 비교하기 위해, 각각의 균주를 pH7 M9 최소배지 사용하여 바이알(WH.224037, Wheaton, 미국)에서 배양하면서 세포 성장 곡선을 분석하였다.

각각의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후 이 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml이 함유된 M9 (per L; 12.8g Na₂HPO₄·7H2O, 3g KH₂PO₄, 0.5g NaCl, 1g NH₄Cl, 2mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 4g glucose) 최소배지 (pH7) 60 ml를 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.4 ~ 0.5 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 균주의 균체성장 측정은 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 균주의 균체성장속도 측정은 균체성장 측정한 결과를 이용하여 시간에 따른 성장 변화량을 계산하였다. 그 결과는 도 5 에 나타내었다.

상기 도 5 에 나타낸 바와 같이 균주의 균체성장속도는 MBTL-YS0, MBTL-YS3, MBTL-YS2, MBTL-YS1 순으로 증가하는 것을 확인하였다.

LB 배지 상에서는 균주의 성장 속도가 유의미한 차이를 나타내지 않았지만, IPTG를 첨가하여, 재조합된 단백질을 과발현시킬 경우, 재조합된 균주에서 성장속도가 월등히 향상됨을 확인할 수 있었다.

이산화탄소 농도 측정

본 발명에서 제조한 재조합 미생물에 도입된 캘빈-벤슨-배스햄 회로 유전자에 의해 캘빈회로를 포함하지 않은 미생물에서 이산화탄소 고정능이 형성됐는지 확인하기 위해 실시예 2-2에서 제조한 각 재조합 미생물을 배양하여 여러가지 조건에서 배양한 후, 이산화탄소 농도를 측정하였다.

4-1 : - light , pH7 LB 배지, + IPTG 조건에서의 이산화탄소 농도 측정

실시예 2-2의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml이 함유된 LB 배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.6 ~ 0.7 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 이산화탄소 농도는 바이알 헤드공간의 가스를 시린지로 1 ml 채취한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. 생균수를 확인하기 위하여 24시간 동안 바이알에서 배양한 배양액을 희석한 후, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml가 함유된 LB 고체 배지에 희석한 배양액 100 ul를 뿌린 후 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 6 및 7 에 나타난 바와 같이, 빛이 존재하지 않는 조건에서 캘빈회로 유전자가 도입되지 않은 MBTL-YS0 균주는 이산화탄소를 방출하는 것을 확인한 반면, 캘빈회로 유전자가 도입된 MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주는 이산화탄소의 양이 MBTL-YS0 균주에 비해 감소하는 것을 확인하였다.

특히, cbbI 관련 단백질을 코팅하는 유전자 및 cbbⅡ 관련 단백질을 코팅하는 유전자가 동시에 도입된 MBTL-YS1 균주는 이산화탄소의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 캘빈회로를 가지고 있지 않는 미생물에 캘빈회로 유전자를 도입함으로써, 탄소고정능이 생성된 재조합 미생물이 제조된 것을 의미한다.

4-2 : + light , pH7 LB 배지, + IPTG 조건에서의 이산화탄소 농도 측정

실시예 2-2의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml,이 함유된 LB 배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 존재하는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.6~0.7 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 이산화탄소 농도는 바이알 헤드공간의 가스를 시린지로 1 ml 채취한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. 생균수를 확인하기 위하여 24시간 동안 바이알에서 배양한 배양액을 희석한 후, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml가 함유된 LB 고체 배지에 희석한 배양액 100 ul를 뿌린 후 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 8 및 9 에 나타낸 바와 같이, 빛이 존재는 조건에서 캘빈회로 유전자가 도입되지 않은 MBTL-YS0 균주는 이산화탄소를 방출하는 것을 확인한 반면, 캘빈회로 유전자가 도입된 MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주는 이산화탄소의 양이 MBTL-YS0 균주에 비해 감소하는 것을 확인하였다.

4-3 : -light, pH7 M9배지, +IPTG 조건에서의 이산화탄소 농도 측정

실시예 2-2의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후 이 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml이 함유된 M9 최소배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.4~0.5 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 이산화탄소 농도는 바이알 헤드공간의 가스를 시린지로 1 ml 채취한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. 생균수를 확인하기 위하여 24시간 동안 바이알에서 배양한 배양액을 희석한 후, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml가 함유된 LB 고체 배지에 희석한 배양액 100 ul를 뿌린 후 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 10 및 11 에 나타낸 바와 같이, 빛이 존재하는 조건에서는 비록 세포 당 생산량은 단백질 과발현에 따른 균체성장의 차이로 인하여 단백질이 과 발현되지 않은 조건에서 이산화탄소 농도가 더 적었다. 하지만, 각 조건을 독립적으로 비교하였을 때 대장균에서는 이산화탄소를 방출해 내지만, 캘빈회로가 포함한 미생물에서는 이산화탄소 방출이 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다.

4-4 : -light, pH7 M9배지, +IPTG, +RuBP 조건에서의 이산화탄소 농도 측정

실시예 2-2의 재조합 미생물 4종을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후 이 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml이 함유된 M9 최소배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.4~0.5 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)와 10 uM RuBP (ribulose 1,5-bisphosphate)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 이산화탄소 농도는 바이알 헤드공간의 가스를 시린지로 1 ml 채취한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. 생균수를 확인하기 위하여 24시간 동안 바이알에서 배양한 배양액을 희석한 후, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml가 함유된 LB 고체 배지에 희석한 배양액 100 ul를 뿌린 후 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 12 및 13 에 나타낸 바와 같이, 전체적인 생산량에는 RuBP의 유무에 관계없이 비슷한 양의 이산화탄소를 생산하였지만, 생균수 당 이산화탄소 농도는 캘빈회로 유전자가 도입된 MBTL-YS1, MBTL-YS2 및 MBTL-YS3 균주에서 이산화탄소의 양이 MBTL-YS0 균주에 비해 감소하는 것을 확인하였다.

에너지 저장물질 및 전달물질의 농도 측정

본 발명에서 제조한 재조합 미생물에 도입된 캘빈-벤슨-배스햄 회로 유전자에 의해 캘빈회로를 포함하지 않은 미생물에서 에너지 전달 물질 및 에너지 저장 물질능이 형성됐는지 확인하기 위해 실시예 2-2에서 제조한 각 재조합 미생물에서 ATP, NAD+ 및 NADH의 농도를 측정하였다.

각각의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후 이 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml이 함유된 M9 최소배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.4~0.5 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)와 10 uM RuBP (ribulose 1,5-bisphosphate)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. ATP의 농도와 NAD/NADH의 측정은 상기 실시예 2에서 제조한 재조합 미생물 4종을 IPTG를 이용하여 재조합 된 캘빈회로를 과 발현 시킨 후 2시간이 지났을 때 미생물의 농도를 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 일정하게 하였다. ATP의 농도 측정을 위하여 BacTiter-Glo kit를 사용하여 추출된 intracellular ATP를 luminometer 기기를 이용하여 luciferase에 의해 발생하는 빛의 양을 측정하였다. NAD/NADH 측정을 위하여 HCl, NaOH, SDS, Trisma를 사용하여 세포 내부에 존재하는 NAD와 NADH를 추출하였으며, NAD/NADH kit를 이용하여 luciferase와 반응시켜 빛을 발생하게 하였으며 발생된 빛은 luminometer 기기를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 14 에 나타내었다. 상기 도 14 에 나타낸 바와 같이 단백질이 과 발현 될수록, 그리고 캘빈회로의 중간물질인 RuBP (ribulose 1,5-bisphosphate)가 첨가되었을 때 ATP의 농도가 감소하였기에 재조합된 캘빈회로가 작동하였으며, 이산화탄소를 감소시키는데 사용되는 것을 확인할 수 있었다. NAD/NADH ratio가 증가하는 것으로 보아 재조합 된 캘빈회로에 의해 NAD가 생성되었으며 이에 따른 NADH는 감소되었음을 이용하여 재조합 된 미생물에서 캘빈회로가 정상적으로 작동하는 것을 확인하였다.

ZnPc 처리 후 이산화탄소 농도 측정

상기 실시예 2-2에서 제조한 재조합 미생물 4종을 pH7 M9 최소배지를 사용하였으며 바이알에서 배양하여 일반적인 대장균은 빛을 흡수하여 에너지를 생산하지 못하기 때문에, 이를 대체할 수 있는 물질인 Zinc Phthalocyanine (ZnPc)을 결합하여 이산화탄소 농도를 확인하였다. 상기 실시예 3에서는 각각의 재조합 미생물을 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 5 ml 에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 배양 한 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후 이 배양액 600 ul, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml, ZnPc 50 ug/ml가 함유된 M9 최소배지 (pH7) 60 ml 을 100 ml 바이알에 넣고 밀봉하여 37℃, 160rpm, 빛이 없는 조건으로 본 배양하였다. 본 배양 후 4시간 동안 배양하여 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.4~0.5 일 때 1.5 ml 튜브의 뚜껑에 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)를 넣고 실린지를 이용하여 첨가하였다. 이산화탄소 농도는 바이알 헤드공간의 가스를 시린지로 1 ml 채취한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. 생균수를 확인하기 위하여 24시간 동안 바이알에서 배양한 배양액을 희석한 후, 암피실린 50 ug/ml, 카나마이신 50 ug/ml가 함유된 LB 고체 배지에 희석한 배양액 100 ul를 뿌린 후 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 상기 도 15, 16 에 나타낸 바와 같이 빛을 흡수하여 에너지를 전달해 주는 ZnPc를 첨가하였을 때 컨트롤에 비해 캘빈회로가 재조합된 균주에서의 이산화탄소 농도가 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 상기 캘빈회로 유전자 도입으로 인해 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다. 또한, IPTG, RuBP 및 ZnPc를 첨가하여 효과를 극대화시킬 수 있다.

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant microoganism Comprising Calvin Cycle and Method Using the same <130> 1042133 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1002 <212> DNA <213> D-fructose-1,6-bisphosphatase(cbbF) <400> 1 tcagctccgg aacaggccgc gattgccgaa gagggccgac gtctcctgct cgggcaggtc 60 gtgatacgcg gtgatgcggg ccaccttctc ggcggacccg aagacgaagg gcgtgcgggc 120 atgaagccgc gagggcgtct gtccgaggat cggattctcg ccgtcggtgg ccccgccgcc 180 cgcctgggtg atgacgaagg cgatgggcgc gcattcgtag agatagcgca ggcgaccctg 240 ctcgtagccc ttgcggctgt cgcgcggata gaggaacacg ccgccccgcg cgaggatgcg 300 gtgggtctcg gccaccagcg aggccagcca gcgcatgttg aagttgcgtc cccgcggccc 360 ctcggtaccc gccacgcaat cgtcgatata ggcgcggatc ggcttcggcc agtggcggta 420 gttcgaggcg ttgatcgcga attcggtcga gctgggcggc accttcacgg cacggtcgac 480 cagcacgaag ctgcggctgc cgggatcgag cacatatttc tgcgtcccct tcccgaagct 540 caccatcatg cagacttgcg ggccgtagat gacatagccc gccgcgatga gctcggagcc 600 caggcgcagg 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ctcgtgccca tggcgatggc cagcgcgtcg acgcgggtcg cctgcacgaa 540 ctccaccgcc tgatccgggt cggtcagcat ctggctgtgg tcgagctttc cttccgcacc 600 cgagccgtcc tcggcctccg cctcgccctt ctcgaggctg cccagcaccc ccagctcgcc 660 ctcgaccgag gctccgaccc agtgggccgc gtcggtcacg cggcgggtga tgtccacgtt 720 gtaatcgtag gaggccaccg tcttcatgtc ggcctgaagc gatccgtcca tcatcaccga 780 ggtgaagccg tgccggatcg ccgagaggca ggtggcctcg ttgttgccgt ggtcctgatg 840 caggcagatc gggatctgcg gatacatttc ggccagcgcc tcgacgatgt ggcgcagcat 900 gatgtcgccg gcatagctgc gcgccccgcg gctggcctgc aggatcaccg gcgcgtcgca 960 ggcgcgggcg gcggcgagga tggcgagccc ctgctccatg ttgttgatgt tgaaggcggg 1020 cacgccatag ccgcgctctg cggcatggtc gagcaattgt ctgagcgtga tcagggccat 1080 gggtctcctc ccgggtcgtc atgtcagtcg gatgggtgcg ggatatcggc cggccgggcg 1140 ggtgccggcc gggacggtcg agccgagggt ccgaggcggc tctgcgcccg ccccgggtcc 1200 ggatcaggcc accttgctct ctcggacgag gcggtcgatc agcggtgtca ggatcagctg 1260 catcgcgagg tccagcttgt tgccgggcac cacgatggaa ttggcgcggc tcatccacga 1320 gccgtggatc atcgaggtga 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gcggaggctg ggctcgacct cggggcggtt gacgatgaag ctcatcgtga ccgtctcgaa 120 gccgcgggtg gaatcgaagg cattgatgcg gatgtagcgg ccgggccagg ccttgcggca 180 ctcgtccagc tcgatcatca cgcccttggg gtcgcgcagg tcgaacatcg gcatgcccca 240 catttcccag taggtgttcc ggggatgcgg gtcgtcggta tgttcgaggc tcacggccca 300 gccgcggccg aggcaatagt ccacctgcgc cgagatctgc gcgtcggtca ggtcgggcag 360 gaacgagaag cagccttggg tgatgcgcat gtccggtctc cttacatcgc gaccgaggcg 420 gtcggcacga agtccgacgt gtcggtggag gtgtagttga aggtgatgtt gccccaggta 480 tcgagggcgg cctccagcgg cttgcaccat ttggccgcgg cgcggaggat ctccgggccc 540 tccacatcga tgttgcggcc ctcgttgcgc gccagcacca tcgcttccag cgccacgcgg 600 ttcgcggtcg ccccggcctg gatccccatc gggtggccga tggtgccgcc gccgaactgc 660 agcaccacat cgtcgccgaa gaggctcaga agctggtgca tctgcccggc atggatcccg 720 cccgaggcca ccggcatgac cttcctcagg tccgcccagt cctgctcgaa gaagatcccg 780 cgcggcaggt cgaccgtgtt gaagggctcg cggcagacat tgtaatagcc ctgcaccgtc 840 agcgggtcgc cctcgagctt gcccacggcc gtgccgcaat gcagatggtc cacccccgcc 900 agccgcagcc acttggcgat cacgcggaag ctgatgccgt ggttcttctg ccgcgtgtag 960 gtgccgtggc ccgcgcggtg catgtgcagg atcatgtcgt tctgccggca ccattccgag 1020 atcgactgga tcgccgtata gccgatgatg agatcgacca tcacgatgac cgagccaagc 1080 gacttggcga attccgcccg ccggtacatc tcctccatcg tgccggcggt gatgttgagg 1140 tagtggccct tcacctcgcc ggtctgggcc gaggcgaggt tcaccgcctc catcacatag 1200 aggaaccggt cgcgccagtg catgaagggc tgcgagttga tgttctcgtc gtccttcatg 1260 aagtcgaggc cgcccttcag cccctcatag accacgcggc cgtagttctt gcccgacagg 1320 ccgagcttgg gcttcgtggt ggcgccgaga aggggcttgc cgaacttgtc cagccgctcg 1380 cgctcgccca cgatgccggt gggcgggccc ttgtaggtct tcacataggc cacggggaag 1440 cgcatgtcct cgagccgggc ggccttcagc ggcttgaagc tgaagacgtt gccgatgatc 1500 gaggcggtga ggttggcgat cgagccttcc tcgaacagga tcaggtcata ggccacatag 1560 cagaaatact gccccggcgt gcccggcacc ggctccaccc ggtaggcctt ggcgcggtag 1620 ctgtcgcagg cggtcagccg gtcggtccag accacggtcc aggtcgcagt cgagctttcg 1680 ccggccacgg cggcggccgc ctcgaccgga tccaccccct cctgcggtgt gatgcggaac 1740 agcgccagca cgtcggtgtc cttggggacg taatcgccgt cccagtaacc catctgggca 1800 tatttcagga cgccggcctt gtagcgttcc ttgcccttga tctcggtggt cttggtatcc 1860 at 1862 <210> 14 <211> 1878 <212> DNA <213> fbpB-prkB <400> 14 atggccatcg agctggagga cctggggctg agccccgatg tggcggacgt gatgcagcgt 60 ctggcgcgcg tgggggcagg catcgcccgc atcatctcgc gcaacgggct cgagcgcgat 120 ctgggcgcgg gcgtcggcac caatgccgga ggagacgggc agaaggcgct cgacgtgatc 180 gcggacgacg cgttccgcgc ggcgctcgaa ggctctgcgg tggcttatta cgcctccgag 240 gagcaggacg aagtggtgac gctgggcgag ggaagcctcg cgctcgccat cgacccgctg 300 gacggctcgt ccaacatcga tgtgaacgtg tcgatcggga cgatcttctc gatcttcccg 360 gcggcggctg gccccgaggc cagcttcctg cgcccgggca ccgagcagat tgccggcggc 420 tacatcatct acgggccgca atgcgcgctg gtctgcagct tcgggcaggg cgtgcagcac 480 tgggtgctcg acctcgatgc gggcatcttc cggcggatgc ccgacatccg cccgctgccg 540 gccgagacgt ccgagtttgc gatcaacgcc tcgaactacc gccactggcc gcagccgatc 600 cgcgccttcg tcgacgatct ggtcgccggg gccgaggggc cgcgcggcaa gaacttcaac 660 atgcgctgga tcgcctcgct ggtggccgag acgcaccgca tcctgatgcg gggcggggtg 720 tttctctatc ccggcgacga gcgcaagggc tacgagcggg gccggctgcg ccatgtctac 780 gaatgcgcgc ccatcgcctt cctgatcgcg aatgtcgggg ggggcgccac cgacggctgc 840 gccgacatcc tgaccgcgct gcccgaccgg ctgcacgccc gcaccccctt cgtcttcggc 900 tgcgcgagca aggtcgcccg cgtcgccgcc tatcacgatc tggcctgcga agagacgtcc 960 gctctcttcg gcagccgggg cctgttccgg agttaaagag tgtcgaagaa atatcccatc 1020 atttccgtgg tcggctcgtc cggcgcgggc acctcgacgg tcaagaacac gttcgagcag 1080 atcttccgcc gcgagggggt caagtccgtc tcgatcgagg gcgacgcctt ccaccgcttc 1140 aaccgggccg acatgaaggc cgaactcgag cggcgctatg cggcgggcga tgcgaccttc 1200 tcgcatttct cctacgaggc gaacgaactg aaggagctgg agcgcgtctt ccgcgaatat 1260 ggcgagacgg ggcgcggccg cacccgcacc tatgtccatg acgatgccga agccgcccgg 1320 acgggcgtgg cccccggcaa tttcacccaa tgggcgccgt tcgaggacaa cagcgacctg 1380 cttttctacg aggggctgca cggctgcgtg gtcaatgacg aggtgaacct cgtccgccat 1440 gccgatctga agctcggcgt ggtgccggtc atcaaccttg aatggatcca gaagatccac 1500 cgcgaccggg cgcagcgcgg ctatacgacc gaagccgtca ccgacgtgat cctgcgccgg 1560 atgtatgcct acgtccactg tatcgtcccg caattctccg agacggacat caacttccag 1620 cgcgtgccgg tggtggacac ctcgaacccg ttcatcgcgc gctggatccc cacgccggac 1680 gagagcctga tcgtgatccg gttcaagaac ccgcgcggga tcgacttccc ctatctcacc 1740 tcgatgatcg cgggctcgtg gatgagccgg gcgaattcca tcgtggtgcc gggcaacaag 1800 caggatctgg cgatgcagct gatcctgacg ccgctcatcg agcggatggt gcgcgaggcg 1860 cgccgcgcgc gggcctga 1878 <210> 15 <211> 2986 <212> DNA <213> tklB-gapB <400> 15 atgaaggaca ttggagccgc gcaggagacg cggatggcga acgccatccg ggccctcgcg 60 atggatgcgg tggagaaggc caagtcgggc catcccggga tgccgatggg gatggcggac 120 gtggcgaccg tcctcttcaa ccgctttctc acggtcgatc cttcggcgcc caaatggccc 180 gaccgcgacc ggttcgtgct gtcggcgggg catggctcga tgctgctcta tgccatccat 240 catctgctgg gctatgccga tatggacatg gatcagatcc ggtccttccg ccagctcggc 300 gcgcggacgg cgggccaccc ggaatacggc catgccgagg ggatcgaggt cacgaccggg 360 ccgctcggtc aggggatcgc gaccgcggtg ggcatggcgc tggccgagcg catgaagaac 420 gcgcgctatg gcgatgatct ggtggaccat ttcacctatg tcatcgcggg tgacggctgc 480 ctgatggagg gcatctcgca cgaggccatc gacatggcgg gtcatctggg cctcggccgg 540 ctgatcgtgc tgtgggacga caaccgcatc accatcgacg gcgacacggg catctcgacc 600 tcgaccgacc agaaggcgcg gttcgccgcc tcgggctggc atgtgctggc ctgcgacggt 660 catgcgcccg aggagatcgc cgccgccatc gaggccgcac ggcgcgaccc ccggccctcg 720 atgatcgcct gccgcacggt gatcggctac ggcgcgccga acaagcaggg cggccacgat 780 gtccatggcg cgccgctggg cgcggccgag atcgcggcgg cgcgcgagcg gctcggctgg 840 gaccatccgc ccttcgagat ccccgcggat ctctacgagg cctggggccg gatcgccgcc 900 cgcggcgccg acgcccgcgc ggcctgggaa acacgccttc aggcgagccc cctccgcgcc 960 gccttcgaga cggcggaggc ggccgacacc tcggcgctgc cgccggccat cgcggcctac 1020 aaggcgcggc tctcggccga ggcgcccaag gtcgcgaccc gcaaggcctc ggaaatggcg 1080 ctgggtgtgg tcaacgaggc gctgcccttc gcggtcggcg gctcggccga cctgacgggc 1140 tcgaacctga cccgctcgaa gggcatggtc tcggtcgcgc cgggcgcctt cgcgggcagc 1200 tatatccatt acggcatccg cgagcacggc atggccgccg cgatgaacgg gatcgcgctg 1260 catggcggcc tgcgccccta cggcggcacc ttcatggcct tcgccgacta ttgccggccc 1320 tcgatccggc tctcggcgct gatgggcgtg ccggtgacct atgtcatgac gcacgattcc 1380 atcgggctcg gcgaggatgg gcccacgcac cagccggtcg agcatctggc gagcctgcgg 1440 gcgatcccga accttgcggt gatccggcct gcggatgcgg tcgagaccgc cgaggcctgg 1500 gagatcgcca tgacggcgac atccacgccc acgcttctgg tgctgtcgcg ccagaacctg 1560 cccacggtgc ggaccgaaca tcgggacgag aacctgaccg cgcgcggcgc ctatctcctg 1620 cgggatccgg gcgagcgaca ggtgacgctg atcgcgaccg gctcggagct ggagctggcg 1680 ctggccgcgg cggatcttct ggccgcggaa ggcatcgccg ccgccgtggt ctcggcgccc 1740 tgcttcgagc tcttcgccgc gcagccggcg gactaccggg cgacggttct gggacgggcc 1800 ccgcgtgtgg gatgcgaggc ggcgctgcgg caggggtggg atctcttcct cggaccgcag 1860 gacgggttcg tgggcatgac gggcttcggc gcttcggcgc ccgcgcccgc actctatcaa 1920 catttcaaca tcaccgctga agccattgtc aaatcggcaa aagaacggat ctgagggaag 1980 aaggatgaca atcagggttg ccatcaacgg cttcggccgt atcggccgca acgtgctgcg 2040 ggccatcgtg gagtcggggc gcaccgatat cgaggtggtc gcgatcaacg atctgggtca 2100 ggtcgagacc aacgcgcatc ttctgcgctt cgacagcgtg cacggccgct tcccggccaa 2160 ggtcaccagc ggagacgact ggatcgatgt gggccgcggc ccgatcaagg tgacggcgat 2220 ccgcaatccg gcggagctgc cctgggcggg tgtcgacatg gcgatggaat gcacgggcat 2280 cttcaccacc aaggagaagg ccgcggccca tctgcagaac ggggcgaagc gggtgctcgt 2340 ctcggcgccc tgcgacgggg ccgaccggac catcgtctat ggggtgaacc atgcgacgct 2400 caccgcggac gacctcgtgg tctcgaatgc ctcctgcacc accaactgcc tctcgccggt 2460 ggccaaggtg cttcacgatg cgatcggcat cgccaagggc ttcatgacca cgatccacag 2520 ctatacgggc gaccagccca cgctcgacac gatgcacaag gatctctacc gcgcccgcgc 2580 cgcggcgctg agcatgatcc ccacctcgac gggagcggcg aaggcggtgg gcctcgtgct 2640 gcccgagctc aagggccggc tcgacggcgt gtcgatccgg gtgcccacgc ccaatgtctc 2700 ggtggtggat ctggtgttcg aggccgcccg cgacacgacg gtggaggagg tgaatgcggc 2760 catcgaggcc gccgcctgcg gaccgttgaa gggcgtgctg ggcttcacga ccgagcccaa 2820 cgtctcgtcc gacttcaacc acgacccgca ttcgtcggtg ttccacatgg accagaccaa 2880 ggtgatggag ggccgcatgg tccgcatcct cagctggtac gacaacgaat ggggcttctc 2940 gaaccggatg gccgacaccg ccgtggcgat gggccggctt ctctga 2986 <210> 16 <211> 2471 <212> DNA <213> cfxB-rbpL <400> 16 atggcactca tcacgcttcg ccagcttctc gatcacgcgg ccgaacaggg ctacggcgtt 60 cccgccttca acatcaacaa catggagcag ggtctcgcga tcatggaggc ggcgcgggcc 120 tgcgatgcgc ccgtcatcat ccaggccagc cgcggcgcgc gcagctacgc caacgacatc 180 atgctggcca agatgatcga ggcgctggcc gcgatctatc ccgagatccc gctctgcatg 240 catcaggacc acggcaacaa cgaggccacc tgcatgaccg cgatccggca cggcttcacc 300 tcggtgatga tggacggctc actgaaggcc gatgccaaga cgcctgccga ttatgactac 360 aatgtcgata tcaccgcccg cgtgagccac atggcgcatt gggtgggcgc ctcggtcgag 420 ggtgagctgg gcgttctggg cagcctcgag accggcgaga gcgaggccga ggacgggcat 480 ggcgcggaag gcaagctcga tcacagccag ctgctgaccg accccgatca ggcggtggat 540 ttcgtgaaga agacccaggt cgatgcgctg gccatcgcct gcggcacctc gcacggcgcc 600 tacaagttca gccgcaagcc cgacggcgag atcctcgcca tgtcggtgat cgaggcgatc 660 cacaagaagc tgcccgacac ccatctcgtg atgcacggat cctcgtcggt gccgcaggag 720 ctgcaggaca tcatcaacgc gttcggcggc gccatgccgc agaccttcgg cgtgccggtc 780 gaggagatcg tgcgcggcat caagatgggc gtgcgcaagg tcaatatcga caccgactgc 840 cgcatggcga tgaccgggca gttccgccgc atcgcgcagc agacgccttc cgaattcgac 900 ccgcgcaagt tcctcaagcc cgcgatggat gcgatgcgcg acctctgcaa gcagcggctc 960 gaagccttcg gcaccgcagg ccaggccggg aagatcagga tcatcccgat ggacgatatg 1020 gccaaacgct atgccagcgg cgcgcttgcg cccaagaccg cctgaaaagc ctcgtgtgaa 1080 aggatacgat catggaccag tccaaccgct acgcccggct tgatctgcag gaagccgatc 1140 tgatcgccgg cggccgtcac gttctctgcg cctatgtcat gaagcccaag gcgggctacg 1200 gctatctgga gacggcggcg catttcgcgg ccgaaagctc caccggcacc aacgtcgagg 1260 tctcgaccac cgacgatttc acccgcggcg tcgatgcgct cgtctatgag atcgacccgg 1320 agaaggagat catgaagatc gcctatccgg tcgagctctt cgaccgcaac atcatcgacg 1380 ggcgggcgat gctctgctcg ttcctgacgc tgacgatcgg caacaaccag ggcatgggcg 1440 acgtcgaata tgccaagatg cacgatttct atgtgccgcc ctgctatctg cgcctgttcg 1500 acggcccctc gatgaacatc gccgacatgt ggcgcgtgct ggggcgcgat gtgcgcaacg 1560 gcggcatggt ggtgggcacg atcatcaagc cgaagctcgg gctgcggccg aaacccttcg 1620 cggatgcctg ccacgagttc tggctgggcg gcgacttcat caagaacgac gagccgcagg 1680 gcaaccagac cttcgcgccg ctgaaggaga ccatccgcct cgtggccgat gcgatgaagc 1740 gcgcgcagga cgagaccggc gaggccaagc tcttctcggc caacatcacc gcggacgacc 1800 attacgagat ggtggcgcgc ggggaataca tcctcgagac cttcggcgag aatgccgacc 1860 atgtggcctt cctcgtcgac ggctatgtga cgggccccgc ggccatcacc accgcgcggc 1920 gccagttccc gcgccagttc ctgcattatc accgggcggg gcacggcgcc gtcacctcgc 1980 cgcagtcgat gcggggctat acggccttcg tgctctcgaa gatggcgcgc ctgcaggggg 2040 cctcgggcat ccacaccggc accatgggct atggcaagat ggagggcgag gcggccgaca 2100 agatcatggc ctacatgctg accgacgagg cggccgaggg gcccttctac cgtcaggact 2160 ggctggggct gaaggccacg acgcccatca tctcgggcgg catgaacgcg ctgcggctgc 2220 cgggcttctt cgacaatctc ggccattcca acgtgatcca gacctcgggc ggcggcgcct 2280 tcggccatct cgacggcggc acggcggggg cgaagtcgct gcgccagtcg cacgaagcct 2340 ggatggcggg ggtggatctc gtgacctatg cccgcgagca tcgcgagctc gcccgtgcct 2400 tcgagagctt cccggcggat gccgacaagt tctatccggg ctggcgcgac cggctgcatc 2460 gcgcggcctg a 2471 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbbF forward primer <400> 17 taatctagag tgaagccctt tcccacc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbbF reverse primer <400> 18 taacatatgt cagctccgga acaggcc 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prkA-cfxA forward primer <400> 19 gggcatatga gcaagaagca tcccatc 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prkA-cfxA reverse primer <400> 20 taagctagct caggcggctt tggcggt 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbbL-cbbS forward primer <400> 21 tttgctagca tggataccaa caccacc 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbbL-cbbS reverse primer <400> 22 aataagcttt cagcggacga tgctgtg 27 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbpB-prkB forward primer <400> 23 taatctagaa tggccatcga gctggaggac 30 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbpB-prkB reverse primer <400> 24 taacatatgt ctccgtctgt ctgtcgc 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tklB-gapB forward primer <400> 25 ttacatatga aggacattgg agccgcg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tklB-gapB reverse primer <400> 26 attgctagct cagagaagcc ggcccat 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfxB-rbpL forward primer <400> 27 aaggctagca tggcactcat cacgctt 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfxB-rbpL reverse primer <400> 28 aataagcttt caggccgcgc gatgcag 27

Claims (11)

1. (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 서열번호 3으로 표시되는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 서열번호 4로 표시되는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 서열번호 5로 표시되는 유전자(cbbS); 및
   (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 서열번호 6으로 표시되는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 서열번호 7로 표시되는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 서열번호 9로 표시되는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 서열번호 10으로 표시되는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 서열번호 11로 표시되는 유전자(rbpL);
   를 포함하고, 상기 (ⅰ) cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래인 것을 특징으로 하며,
   상기 (ⅱ) fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
2. 삭제
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4. (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 유전자(prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 서열번호 3으로 표시되는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 서열번호 4로 표시되는 유전자(cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 서열번호 5로 표시되는 유전자(cbbS); 및
   (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 서열번호 6으로 표시되는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 서열번호 7로 표시되는 유전자(prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 서열번호 9로 표시되는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 서열번호 10으로 표시되는 유전자(cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 서열번호 11로 표시되는 유전자(rbpL);
   가 숙주세포에 도입되어 있거나, 청구항 제1항의 재조합 벡터가 캘빈회로를 가지고 있지 않은 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
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8. 제4항의 재조합 미생물을 이용한 이산화탄소 저감 방법.
   
9. 제8항에 있어서, IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 및 ZnPc(Zinc phthalocyanine)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 재조합 미생물 배양 배지에 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 이산화탄소 저감 방법.
   
10. 제4항의 재조합 미생물을 이용한 캘빈회로에 의해 생성되는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프럭토스(fructose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 당, 유기산 및 ATP로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 유용물질 생산방법.
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