KR20190104181A - 신규의 무기 폴리인산염-기반의 에너지 회생을 가지는 무세포 발현계 - Google Patents

신규의 무기 폴리인산염-기반의 에너지 회생을 가지는 무세포 발현계 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규의 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 시험관 내 무세포 발현 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 세포 에너지원인 ATP가, 무기 폴리포스페이트로부터 이중 효소 시스템을 사용하여 생성되는 무세포 발현 시스템을 포함한다. 상기 구현예에서, 상기 이중 효소 시스템은 열안정성 아데노실 키네이스, 및/또는 폴리포스페이트 키네이스 효소를 포함할 수 있다.

Description

신규의 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생을 가지는 무세포 발현 시스템
본 출원은 2016년 12월 30일자 미국 가출원 특허 제62/440,975호의 이익 및 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 명세서, 도면 및 서열 목록은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
본 발명은 무세포 발현 시스템(cell-free expression system)에 관한 것으로, 반응 혼합물은 시험관 내 전사/번역 메커니즘에 필수적인 모든 무세포 반응 성분, 및 에너지를 제공하며 단백질 합성에 필수적인 아미노산, 뉴클레오타이드, 대사 성분을 포함한다. 본 발명은 또한 단백질과 같은 대상 발현 산물의 수율을 증가시킬 수 있는 신규의 무기 폴리포스페이트(polyphosphate) 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 시험관 내(in vitro) 무세포 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시험관 내 무세포 유전자 발현을 위한 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단 용도 및/또는 분석법으로 도입될 수 있는 신규의 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템에 관한 것이다.
무세포 발현 시스템 (또한 시험관 내 전사/번역, 무세포 단백질 발현, 무세포 번역, 또는 무세포 단백질 합성으로 공지되어 있음)는 연구자가 기능성 단백질 또는 기타 표적 분자를 시험관 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 분자 생물학 기법을 대표한다. 시험관 내 단백질 발현은 유전자 전달감염, 세포 배양 또는 광범위한 단백질 정제를 필요로 하지 않기 때문에, 박테리아 또는 조직 배양 세포에 기반한 생체 내 기법과 비교하여 상당히 빠르다. 이러한 시스템의 또 다른 장점은, 종종 발현되는 표적 단백질이 숙주 세포에 독성을 가질 수 있거나 일반적으로 세포 발현과 양립할 수 없기 때문에, 단백질 발현에 대해 전적으로 비효율적인 수단이 아닌 경우에는 생체 내 시스템을 실행 불가능하게 만들 수 있는 점이다.
보다 구체적으로, 무세포 발현 시스템은 살아있는 세포를 사용하지 않고 표적 분자를 생성하며, RNA 종 및 단백질과 같은 복합체를 생성한다. 전형적인 무세포 발현 시스템은 세포 용해물에서 발견되는 생물학적 성분/기계(machinery)를 활용하여 하나 이상의 표적 유전자를 포함하는 DNA로부터 표적 분자를 생성할 수 있다. 전형적인 무세포 발현 시스템 반응의 통상적인 성분으로는 일반적으로 세포 배양 용해물로부터 유도된 세포 추출물, ATP와 같은 에너지원, 아미노산 공급원, 마그네슘과 같은 보조 인자, 및 전형적으로 플라스미드 합성 주형, 또는 선형 발현 (또는 합성) 주형 (LET 또는 LST)의 형태로의, 바람직한 유전자를 가지는 핵산 합성 주형을 포함할 수 있다. 세포 추출물은 해당 세포를 용해시키고, 원심분리 또는 기타 침전 방법을 통해 세포 벽, 게놈 DNA, 및 기타 파편을 제거하여 획득될 수 있다. 용해물의 나머지 부분, 또는 세포 추출물은 표적 분자를 발현시키기 위해 필요한 필수적인 세포 기계를 포함할 수 있다.
통상적인 무세포 발현 시스템은 무세포 단백질 합성 (cell-free protein systhesis, CFPS)을 포함한다. 하나 이상의 해당 단백질을 생성하기 위해, 전형적인 CFPS 시스템은 미생물, 식물, 또는 동물 세포의 미정제 용해물로부터 에너지 생성 및 단백질 합성에 필수적인 촉매 성분의 앙상블을 활용한다. 미정제 용해물은 DNA의 RNA로의 전사, RNA의 단백질로의 번역, 단백질 접힘, 및 에너지 대사에 필수적인 요소 (예로서, 리보솜, 아미노아실-tRNA 합성효소, 번역 개시 및 신장 인자, 리보솜 방출 인자, 뉴클레오타이드 재생 효소, 대사 효소, 샤페론, 폴데이즈(foldase), 등)을 포함할 수 있다. 현재 사용되는 통상적인 세포 추출물은 대장균 (Escherichia coli, ECE), 토끼 망상적혈구 (rabbit reticulocytes, RRL), 밀 배아 (wheat germ, WGE), 및 곤충 세포 (ICE), 및 심지어 포유류 세포 (MC)로부터 제조된다.
무세포 발현 시스템의 많은 유리한 측면에도 불구하고, 지금까지는 몇몇 장애가 단백질 생산 기술로서 이의 사용을 제한하였다. 이러한 장애는 활성 단백질 합성의 짧은 반응 시간, 낮은 단백질 생산 속도, 작은 반응 규모, 다중 다이설파이드 결합(disulfide bon)을 포함하는 단백질을 정확하게 접을 수 있는 제한된 능력, 및 “블랙 박스(black-box)”과학으로서의 초기 개발이 포함된다. 기존의 무세포 발현 시스템에서 발견되는 한 가지 뚜렷한 한계는 화학적 환경의 유해한 수반되는 변화 없이, 전사/번역에 필요한 단백질 합성의 강한 에너지 및 기질 필요성을 공급하기 어려운 점이다. 게다가, 고가의 시약 비용, 특히 뉴클레오타이드 형태의 고에너지 포스페이트 시약 및 2차 에너지원은 이러한 기존의 무세포 발현 시스템의 실질적인 사용을 제한한다.
시험관 내 무세포 발현 시스템에 대한 주요 제한 인자 중 하나는 에너지 재생이다. 예를 들어, 무세포 단백질 합성의 개시 이후, 생산은 전형적으로 기질 (예로서, ATP, 시스테인, 등) 중 하나가 고갈될 때까지, 또는 부산물 축적 (예로서, 무기 포스페이트)이 억제 농도에 도달할 때까지 지속된다. 이와 같이, 적당한 에너지원을 효율적으로 재생하지 못하는 것은 제한 인자로서 작용하여, 시스템의 전체 수행 시간(run time) 및 궁극적인 수율을 감소시킬 수 있다. 또한, 추가적인 ATP를 무세포 발현 시스템 내로 단순히 추가하면 고농도의 ATP가 단백질 발현을 실제로 억제할 수 있음에 따라, 이는 엄청나게 고가일 뿐만 아니라, 실행 불가능하다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 기존의 무세포 발현 시스템은 보충 에너지원, 주로 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트 키네이스 (PK) 또는 크레아틴포스페이트 (CP) 및 크레아틴키네이스 (CK) 또는 기타 유사한 화합물의 형태의 첨가에 의존한다. 그러나, 이러한 에너지 보충에는 상당한 한계가 존재한다. 먼저, 기질 PEP 및 CP 둘 모두는 시험관 내 조건하에서 기능적으로 제한된 수명을 가지며, 이의 반응 부산물인 피루베이트는 시험관 내 번역을 억제한다. 두 번째로, 전술한 바와 같이, 이러한 기질은 시험관 내 사용 비용을 상당히 증가시킨다. 세 번째로, 효소 PK 및 CK 둘 모두는 열화/불활성 이전에, 전체 전환수가 3-4 배로 제한되어, 에너지 재생원으로서의 유용성을 더욱 제안하는 것으로 입증되었다. 단백질 “전환율(turnover)”또는 전환수 (또한 k cat)는 주어진 효소 농도에 대하여 단일 촉매 부위가 실행하는 초당 기질 분자의 최대 화학적 전환율 수로서 정의될 수 있다. 결과적으로, 전환수가 낮기 때문에 PK 및 CK 두 효소 모두는 상당한 양으로 참가되어야 하며, 이는 시험관 내 사용의 수행 시간을 제한하고, 또한 비용을 증가시킨다.
보다 구체적인 예시에서, 현재 E. coli 기반의 무세포 시스템은 주된 에너지 재생 시스템으로서 주로 크레아틴 포스페이트/크레아틴 키네이스 또는 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트 키네이스 (PK)에 의존하지만, PK는 전체 전환수가 낮은 한 자리 수이며, 부산물 피루베이트는 번역 반응의 억제제인 것이 밝혀졌다. 이러한 방식으로, 본 발명의 세포 에너지 재생 시스템은 기존의 무세포 발현 시스템과는 거리가 멀 뿐만 아니라, 실제로, 기술 분야 내 공지된 기존의 무세포 발현 시스템에 대해 입증할 수 있는 개선을 나타낸다.
결과적으로, 보다 에너지 효율적이며 강력한 무세포 발현 시스템, 예를 들어, 반응 지속 시간이 길어지고, 단백질 합성 속도가 증가하여, 궁극적으로 단백질 수율이 높아질 수 있는 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 실제로, 무세포 발현 시스템, 및 특히 상기 발현 시스템 내에서의 에너지 재생에 관하여 전술한 문제점은, 이에 대한 효율적 - 및 경제적 - 해결책에 대한 오래도록 지속된 필요성을 나타낸다. 구현 요소를 사용할 수 있었지만, 이러한 요구를 충족시키기 위한 실제 시도는 어느 정도 부족했을 수 있다. 이는 당업자가 관련된 문제점 및 어려움의 본질을 완전히 인식하거나 이해하지 못했기 때문일 수 있다. 이러한 이해 부족의 결과로서, 오래도록 지속된 필요성을 충족시키기 위한 시도는 본 명세서에 식별된 하나 이상의 문제점 또는 어려움을 효과적으로 해결하지 못할 수 있다. 이러한 시도는 본 발명의 기술에 의해 제시된 기술적 방향으로부터 벗어날 수 있으며, 심지어 본 발명의 기술의 성취가 어느 정도는 현장에서 수행된 접근법의 예상치 못한 결과로 간주될 수도 있다.
하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 기술은 기존의 무세포 발현 시스템의 한계, 특히 에너지 사용 한계를 극복하면서, 반응 지속 시간을 연장시키고, 생성물 수율을 높이는, 에너지 효과적이며 강력한 시험관 내 무세포 발현 시스템의 목표를 충족시킨다.
일반적으로, 본 발명의 기술은 무세포 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 목표는 반응 시간을 연장시키고, 반응 효율을 높이며, 반응 안정성을 개선시켜, 궁극적으로 보다 높은 수율의 바람직한 발현 생성물을 생성하는, 신규의 조성물, 장치 및 절차를 포함하는 무세포 발현 방법을 제공할 수 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 무세포 발현 시스템을 제공할 수 있는 것이며, 하나의 구현예에서, 상기 시스템은 신규의 에너지 재생 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 기술은 신규의 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 시험관 내 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, 에너지 재생은 무기 폴리포스페이트 및 선택된 박테리아 균주로부터 분리 및 정제된 상승적 고효율 키네이스 단백질의 첨가를 통해 달성될 수 있다. 이러한 키네이스 단백질은 무세포 발현 시스템 내부에서 세포 에너지원인 아데노신 트라이포스페이트 (adenosine triphosphate, ATP)의 고효율 화학적 재생을 유도할 수 있다. 이러한 개선된 에너지 재생은 무세포 발현 시스템의 활성을 지속시켜, 단백질과 같은 대상 발현 산물의 수율을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 상기 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템은 다양한 무세포 발현 시스템에 적용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, 신규의 에너지 재생 시스템은 화학적 에너지가 고갈되기 전에 시스템의 수행 시간을 더 연장시킬 수 있으며, 무세포 번역 시스템으로부터 단백질과 같은 발현 산물의 수율을 더 높일 수 있다.
본 발명의 기술의 또 다른 목적은 에너지 의존적 과정 및/또는 진단 분석법에 관한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 기술은 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 가지는 개선된 시험관 내 ATP-의존적 과정 및/또는 분석법을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 에너지 재생 시스템은 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 가지는 시험관 내 ATP-의존적 단백질 활성 분석법을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 분석법 내의 에너지 재생은 선택된 박테리아 균주로부터 분리 및 정제된 상승적 고효율 키네이스 단백질의 첨가를 통해 달성될 수 있다. 이러한 키네이스 단백질은 ATP-의존적 분석에서 ATP의 고효율 화학적 재생을 유도할 수 있다. 상기 구현예는 화학적 에너지가 고갈되기 전에 분석 수행 시간을 더욱 연장시킬 수 있으며, 이는 결과적으로 개선된 분석 성능 및 감도를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 기술의 추가적인 목적은 본 명세서에 기재된 시스템과 같은 무세포 시험관 내 시스템에서, 증가된 안정성, 열안정성 및 효소 활성 및/또는 전환율을 나타내는, 특정 박테리아 균주로부터의 RNA 중합효소 (RNAP) 단백질의 식별, 분리, 정제 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 열안정성 박테리아 RNA 중합효소는 보다 높은 안전성 및 기존의 온도보다 높은 온도에서 DNA 구조물로부터 메신저 RNA (mRNA)를 생합성할 수 있도록 하며, 이는 특정 프로모터의 제어 유무와 관계없이, 게놈 또는 코스미드 DNA(Cosmid DNA)의 전개를 도울 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 매우 안정한 RNAP는 무세포 발현 시스템, 예컨대 시험관 내 전사, 시험관 내 cDNA 생산, 및 시험관 내 전사/번역 발현 시스템에서 발현 산물을 생성하도록 사용될 수 있다. 상기 매우 안정한 RNAP는 특정 효소를 가지는 무세포 발현 시스템에서 사용되어, 에너지원/기질, 예컨대 우리딘 트라이포스페이트 (UTP), 구아노신 트라이포스페이트 (GTP), 및/또는 사이티딘 트라이포스페이트 (CTP), 뿐만 아니라 일반적으로 본 명세서에 기재된 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템을 생성할 수 있다. 상기 구현예에서, RNA 중합효소 단백질의 안정성이 증가하면 일반적으로 본 명세서에 기재된 무세포 발현 시스템에서 수행 시간을 증가시키고 수율을 더 높일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 무세포 발현 시스템에서 사용하기 위해 최적화될 수 있는 하나 이상의 유전자 변형 박테리아 균주를 제공하는 것이다. 이러한 변형의 예로는, 예를 들어, 단백질 분해성의, 리보뉴클레이스, 및/또는 포자형성 활성 등을 가질 수 있는 특정 유전자의 제거를 포함할 수 있다. 추가적인 구현예는 선형 PCR 산물의 시험관 내 프로모터 인식을 용이하게 하며, 뿐만 아니라 RNAP를 상향조절할 수 있는 특정 시그마 인자를 과발현시키는 유전자 조작된 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규의 무세포 발현 시스템 성장 배지를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 무세포 발현 시스템에서 사용될 수 있는 변형된 성장 배지에 관한 것이다. 상기 신규의 배지는 최적의 박테리아가 독성의 금속 염 및/또는 금속 이온 킬레이트제의 존재 없이 성장하도록 할 수 있다.
본 발명의 기술의 추가적인 목적은 하기 기재되는 상세한 설명, 도면 및 청구항에서 더욱 명백해질 것이다.
본 명세서에 포함되어 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명의 하나 이상의 구현예를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술의 특정 양태를 설명하는 역할을 한다. 도면은 본 발명의 하나 이상의 바람직한 구현예를 예시하기위한 목적일 뿐이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1a : 하나의 구현예에서 내열성 무세포 발현 시스템 발효기의 일반적인 다이어그램을 도시한다;
도 1b : 하나의 구현예에서 무세포 발현 시스템 발효기의 일반적인 다이어그램을 도시한다;
도 2a : 하나의 구현예에서 Gst AdK 발현 벡터를 도시한다;
도 2b : 하나의 구현예에서 TaqPPK 발현 벡터를 도시한다;
도 3 : 천연의 RNAP 단백질 서브유닛 및 RpoD에 첨가되는 추가적인 아미노산의 목록.
도 4 : Gst AdK/PPK 결합된 에너지 재생 시스템을 사용하는 ATP 재생을 입증하는 ATPase 루시페레이스 분석. 데이터는 구체적으로 다음을 나타낸다: A열: 각 웰에서 200 ul 표준 ATPase 루시페레이스 분석 중 10 uM ATP; B열: 10 uM ATP, 표준 PEP/PK 조건 (200 uM PEP, 0.02 U/ml PK), C열: 10uM ATP, 전체 1 ug/ml 중 PPK/Gst AdK 비율 (4:1); D열: 10uM ATP, 전체 1 ug/ml 중 PPK/ Gst AdK 비율 (1:1); E열: 10uM ATP, 전체 1 ug/ml 중 PPK/ Gst AdK 비율 (1:4); 세로 1-3열: 1 ul (10mg/ml 폴리포스페이트); 세로 4-6열: 3 ul (10mg/ml 폴리포스페이트); 세로 7-9열: 6 ul (10mg/ml 폴리포스페이트); 세로 10-12열: 10 ul (10mg/ml 폴리포스페이트). 모든 반응은 Tecan 플레이트 판독기에서 96-웰 플레이트에서 137 분 동안 연속적으로 기록되었다 (각 웰에 대한 X 축). 전체 상대 발광을 기록하고 각각의 웰 (Y 축)에 대해 나타내었다.
도 5 : 도 4에서와 동일한 조건 하에서, ATPase 루시페레이스 분석 반응은 PEP/PK 및 Gst AdK/PPK PPi 시스템의 루시페레이스/D-루시페린 기반의 ATPase 분석을 392 분간 연속적으로 기록하여 상대 발광 ATP의 상대 발광의 모든 기록된 데이터 포인트를 선형으로 표시한다 (X 축). 상대 발광 (동일한 스케일링, 동일한 판독, 동일판 플레이트)은 Y 축으로 나타난다. 세 가지 모든 시스템의 분리는 시간이 지남에 따라 분명해진다.
도 6 : 루시페레이스/D-루시페린 기반의 ATPase 분석에서 상대 발광의 대수적 표현은 다음의 3회 반복 기록된 모든 데이터 포인트(5개의 독립적인 실험)의 평균이다: 200 ul 분석에서 10 uM ATP, PEP/PK 조건 (200 uM PEP, 0.02 U/ml PK)으로 10 uM ATP, 전체 1 ug/ml 단백질 및 3 ul (10mg/ml 폴리포스페이트) 중 PPK/AdK 비율 (4:1)에서 10uM ATP. 1008 분 후 추가적인 데이터 포인트에 대해 실험을 기록하였다. 모든 플레이트는 감쇄현상(photo bleaching)을 방지하기 위해 플레이트 판독기 내에 보관하였다.
도 7 : 재조합 단백질 Gst AdK 및 TaqPPK의 분리 및 정제를 입증.
도 8 : 다양한 폴리포스페이트 농도에서 ATP 에너지 재생 시스템을 입증.
도 9 : 분리된 ATP 에너지 생성 반응 산물을 도시하는 루시페레이스 분석.
도 10 : 루시페레이스 분석에 사용되는 Gst AdK/TaqPPK ATP 에너지 재생 시스템의 일반적인 반응식.
도 11 : 기질 공급원으로서 무기 폴리포스페이트 및 AMP로부터 ATP 에너지를 생성하는 상승적 Gst AdK 및 TaqPPK 효소.
도 12 : 문헌 및 재조합 PPK 단백질 서열의 비교;
도 13a-b : 하나의 구현예에서 무세포 발현 시스템을 위한 무세포 발현 생물 반응기.
도 14 : 하나의 구현예에서 세포 배양물을 생성하기 위한 세포 배양 장치.
본 발명은 상이한 방식으로 결합될 수 있 는다양한 양태를 포함한다. 다음의 설명은 요소를 열거하며 본 발명의 구현예 일부를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 요소는 초기 구현예와 함께 열거되지만, 임의의 방식으로 및 임의의 수로 결합되어 추가적인 구현예를 생성할 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 구현예는 본 발명을 명시적으로 기재된 시스템, 기법, 및 용도로만 제한하도록 해석되어서는 안된다. 또한, 본 명세서는 본 출원 또는 임의의 후속 출원에서, 임의의 수의 개시된 요소로, 각 요소를 단독으로, 및 또한 모든 요소의 임의의 및 모든 다양한 순열 및 조합으로, 다양한 구현예, 시스템, 기법, 방법, 장치, 및 용도 전체의 설명 및 청구 범위를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 기술은 무세포 발현 시스템에 사용하기 위한 용도를 가지는 신규의 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생을 포함하며, 이러한 시스템은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 시험관 내 전사 시스템 가지는 예를 들어, 세포 추출물 및/또는 UTP, GTP, CTP의 조절을 제공하는 보충 기질 및 효소; 시험관 내 번역 시스템; 시험관 내 (ATP-의존적) 단백질 활성 분석 시스템; 및 결합된 시험관 내 전사/번역 시스템.
특정 구현예에서, 무세포 발현 시스템에서 활용되는 이러한 에너지 상승적 유전자 산물로는 아데노실 키네이스 (AdK), 및/또는 폴리포스페이트 키네이스 (PPK)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, PPK는 ATP 및 무기 폴리포스페이트의 가역적 형성에 촉매작용을 한다:
ADP + PP i ↔ ATP + PP i -1
일반적으로, Adk는 아데노신 뉴클레오타이드의 상호 전환에 촉매작용을 하며, 즉 2개의 ADP는 하나의 ATP 및 하나의 AMP로 전환될 수 있다.
2 ADP ↔ 1 ATP + 1 AMP
어떤 경우에는, 이러한 에너지 상승적 유전자 산물이 일반적으로 열안정성일 수 있으며, 경우에 따라 무세포 발현 시스템에서의 사용을 위해 유전자 변형될 수 있다. 이러한 AdK/PPK 결합 에너지 조절 시스템은 무세포 발현 시스템, 뿐만 아니라 기타 ATP-의존적 반응, 진단 용도 및/또는 분석에 사용될 수 있다.
하기 상세히 설명되는 바와 같이, AdK/PPK 에너지 조절 시스템은 다양한 공급원으로부터, 예컨대 다양한 박테리아 종, 뿐만 아니라 재조합 발현으로부터 유도된 AdK 및/또는 PPK 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 특정 AdK 및/또는 PPK 유전자 또는 단백질은 구체적으로 식별될 수 있으나, AdK 및/또는 PPK의 식별은 일반적으로 모든 AdK 및/또는 PPK 유전자 또는 단백질 및 이의 상동유전자(homolog), 동종유사유전자(paralog) 및 이종상동유전자(ortholog), 뿐만 아니라 모든 유전자 변형 버전을 포함할 수 있음을 유의해야 한다. 이러한 유전적 변형은 단백질의 활성을 향상시킬 수 있는 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 기술은 선택된 박테리아 종으로부터 하나 이상의 에너지 상승적 유전자 산물의 식별 및 분리를 포함할 수 있다. 일반적으로 도 4를 참조하면, 하나의 바람직한 구현예에서, AdK는 일반적으로 상기 기재된 기법을 이용하여 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus)으로부터의 gDNA로부터 클로닝될 수 있다. 또한, PPK는 E. coli (ecPPK) (서열 번호 9)으로부터의 gDNA으로부터 클로닝될 수 있거나, 또는 하기 설명되는 바와 같이, 하나의 바람직한 구현예에서, PPK는 호열성 및/또는 내열성 박테리아, 예컨대 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus, TaqPPK)로부터 클로닝 및/또는 변형될 수 있다.
예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, G. 스테아로써모필러스로부터의 gDNA는 대략 20 ml 밤새 배양물로부터 분리되었다. G. 스테아로써모필러스 배양물은 펠릿화될 수 있으며, gDNA는, 예를 들어 시판된 키트, 예컨대 Macherey-Nagel NuceloSpin Microbial DNA Kit를 사용하여 분리될 수 있다. 그 다음, gDNA는 에탄올 침전법을 사용하여 농축될 수 있다. 이것은 일반적으로 gDNA을 포함하는 용액에 gDNA를 침전시킬 수 있는 염 및 에탄올을 첨가함으로써 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 이는 원심분리기를 사용하여 다시 펠릿화된 후, DNase/RNase를 포함하지 않는 물(DNase-/RNase-free water)에 재현탁될 수 있다. T. 아쿠아티쿠스에서 PPK 유전자를 포함하는 gNDA의 분리는 상기 기재된 바와 같은 유사한 수단에 의해 분리 및 농축될 수 있다.
상기 언급된 설명과 유사하게, 하나의 바람직한 구현예에서, Gst AdK 및/또는 TaqPPK 둘 모두는 각 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계될 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 클로닝될 수 있다. 상기 구현예에서, 대상 유전자를 선택된 발현 벡터(들) 내로 도입하기 위한 특정 제한 부위를 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머 둘 모두가 생성될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 구체적으로 Gst AdK 및/또는 TaqPPK 유전자를 IBAStarGate Expression Vectors 내로 도입하기 위한 제한 부위를 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머가 생성될 수 있다. 대상 프라이머 및 Gst 및 E. coli로부터의 gDNA는 개별 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 거쳐, 각각 Gst AdK 및/또는 TaqPPK 유전자를 증폭시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, Gst AdK및/또는 ecPPK 유전자 모두에 대한 개별 PCR은 표준 MasterMix 반응 및 G. 스테아로써모필러스 및 E. coli로부터 각각 분리된 50 ng의 주입 gDNA를 사용하여 수행될 수 있다 (표 1).
바람직한 구현예에서, 열안정성 PPK 효소는 호열성 T. 아쿠아티쿠스 (TaqPPK)으로부터 유도될 수 있으며, 일반적으로 상기 식별된 Gst AdK(서열 번호 8)을 가지는 본 발명의 무세포 발현 시스템과 추가적으로 결합될 수 있다. 상기 구현예에서, PPK 문헌 단백질 서열 (서열 번호 10; 도 12)은 DNA로 역번역하도록 사용되었다. 이후 서열을 E. coli에 대해 코돈-최적화되고, 유전자는 발현을 위해 pET151/D-TOPO로 서브클로닝된다 (도 2b). 상기 구현예에서, 일반적으로 떼르무스 아쿠아티쿠스로부터 TaqPPK로서 식별되는 서브클로닝된 PPK 유전자는 N-말단에 천연에 존재하지 않는 추가적인 아미노산을 포함하도록 유전자 변형되었다. 이러한 천연에 존재하지 않는 추가적인 아미노산으로는 다음을 포함한다: 1) 6xHis-태그; 2) V5 에피토프 태그 및 3) TEV 절단 부위 (서열 번호 11). 표2에 언급된 바와 같이, 이러한 세 개의 유전적 변형체는 pET151 골격의 일부이며 발현 및 정제를 용이하게 할 수 있다. TaqPPK는 BL21(DE3)으로 발현되었으며 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 정제되었다.
하나의 구현예에서, PCR 과정을 통해 증폭된 Gst AdK 및 TaqPPK 유전자 DNA 서열은 분리될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, PCR 반응은 1% 에티듐 브로마이드 아가로스 겔 상에서 분석될 수 있고, Gst AdK 및/또는 PPK 유전자는 아가로스 겔 추출법 및/또는 당업계에 공지된 PCR 정제 방법, 예컨대 Macherey-Nagel NucleoSpin Gel 및/또는 PCR Clean-up에 의해 분리될 수 있다. 이러한 분리된 유전자는 적당한 전달 벡터 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 사전에 생성된 유전자 단편 및 선택된 벡터, 상기 구현예에서, 적당한 벡터 (예로서, 각각 도 2a-b를 참조)는, 선택된 제한 효소(들)로 소화되고, 예를 들어, 3:1 T4 DNA 연결효소 반응을 통해 연결될 수 있으며, 이는 Thermo Fisher Scientific Rapid DNA Ligation Kit로서 상업적으로 입수 가능하다. 상기 및 기타 모든 구현예에 있어서, 각각의 유전자 단편은 개별 전달 벡터 내로 별도로 연결되어, 선택된 박테리아 균주 또는 기타 적당한 세포로 형질전환될 수 있음을 유의한다. 다른 구현예는 다중 유전자 단편이 전달 벡터로 연결되고, 공통-발현되도록 선택된 박테리아 균주로 형질전환되는 것을 포함할 수 있다.
상기 구현예에서, 연결된 Gst AdK 및 TaqPPK 유전자, 및 플라스미드 벡터는 개별적으로 또는 집합적으로, 선택된 박테리아 균주로 형질전환될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 개별 연결된 벡터(들)은 고속의 형질전환 효율을 가지도록 구성될 수 있는 Top10 적격 E. coli 내로 형질전환될 수 있다. 상기 구현예에서, Top10 적격 E. coli는 recA 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있고, 이는 플라스미드 벡터 안정성을 촉진하는 DNA 재조합을 감소시킬 수 있으며, 플라스미드 벡터 수율 및 품질을 개선시키는 비특이적 엔도뉴클레이스 활성을 감소시킬 수 있는 또한 endA 유전자 녹아웃(knockout)을 포함할 수 있다.
성공적으로 형질전환된 박테리아는, 예를 들어 양성 유전자 검출 PCR, 또는 기타 공지된 방법을 통해 식별될 수 있고, 이후 성장 박테리아 콜로니 내에서 플라스미드 벡터의 다중 카피를 생성하도록 배양될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 플라스미드 벡터 DNA는 분리되어 또 다른 선택된 박테리아 균주로 하위-형질전환될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제조된 플라스미드 벡터 DNA는 최적의 단백질 발현을 위해 E. coli의 고발현 균주, 예컨대 BL21(DE3)로 하위-형질전환될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 기술은 각각 선택된 분자 태그를 가지는 Gst AdK 및 TaqPPK 단백질 둘 모두의 개별 발현을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, Gst AdK 및/또는 PPK 단백질은 각각 poly-His 또는 His-6 태그를 포함하도록 구성될 수 있으며, 이는 추후 단백질 정제에 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 발현된 Gst AdK 및/또는 PPK 단백질은 히스티딘 잔기의 스트링(string)이 적당한 완충 조건 하에서 니켈, 코발트 및 구리를 비롯한, 여러 유형의 고정화된 금속 이온에 결합하기 때문에 검출 및 정제될 수 있다.
하나의 구현예에서, 태그된 Gst AdK(서열 번호 8) 및/또는 TaqPPK (서열 번호 11)는 개별적으로 발현 및 정제될 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, 개별적으로 His-6 태그 Gst AdK 및/또는 PPK 단백질은 E. coli의 BL21(DE3) 균주로 발현될 수 있다. 상기 구현예에서, E. coli의 BL21(DE3) 균주는 NYZ 배지에서 배양될 수 있고, 무엇보다도, 이는 임의의 발현된 단백질을 잠재적으로 분해하여 전체 수율을 감소시킬 수 있는 특정 단백질 가수분해효소(protease)를 유도할 수 있는 락토스를 가지지 않을 수 있다. 단백질 발현은 박테리아 성장의 특정 광학 밀도 (OD)에서 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대략 OD 0.7에서, 단백질 발현은 30-32°C에서 6-8 시간 동안 0.25mM 아이소프로필 β-D-1-싸이오갈락토피라노사이드 (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 첨가함으로써 유도될 수 있다. IPTG는 플라스미드 벡터 DNA에서 락 오페론의 전사를 유발하는 락토스 대사물인 알로락토스를 모방하는 분자 시약으로, 여기서 대상 유전자, 상기 경우에는 각각 Gst AdK 및/또는 TaqPPK 유전자가 단백질 발현을 유도하며, 이는 락토스 작동자(lac operator)의 제어하에 있을 수 있다.
상기 바람직한 구현예에서, 개별 BL21(DE3) 배양물이 용해될 수 있으며, 용해물은 제조되어 금속 이온-충전 수지를 통과할 수 있다. 개별 용해물은 Ni-충전 IMAC 수지를 통과할 수 있으며, Gst AdK 및/또는 TaqPPK 단백질 상의 His-6 태그는 수지상의 고정화된 니켈-이온에 결합할 수 있다. 비결합 및 비특이적 결합 단백질은 추가로 제거될 수 있으며, 상기 구현예에서는, 5mM 이미다졸의 첨가에 의해 비결합 및 비특이적 결합 단백질이 제거될 수 있는 반면, Gst AdK 및 TaqPPK 단백질은 수지에 결합된 채로 남아있다. 또한, 전술한 바와 같이, 상기 언급된 단백질 정제 단계는 Gst AdK 및 TaqPPK 단백질 둘 모두에 대해 개별적으로 이루어질 수 있다.
이어서, Gst AdK 및/또는 TaqPPK 단백질은 300 mM 이미다졸의 첨가 또는 기타 공지된 방법에 의해 개별적으로 용리될 수 있다. 단백질의 존재는 SDS-PAGE를 통해 입증될 수 있으며 단백질 순도 또한 또한 FPLC UV-프로파일에 의해 나타날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 개별적으로 정제된 단백질은 추후 사용을 위해 -20°C에서 Gst AdK에 대한13mg/및 PPK에 대한 10mg/ml의 농도로 시험관 내 전사/번역 상용의 완충 조건에 저장될 수 있다.
또한, ATP 결정 분석이 수행되어 폴리포스페이트의 존재하에 Gst AdK 및/또는 PPK 단백질의 기능성을 검증할 수 있다. 이러한 분석은 아데노신 트라이포스페이트 (ATP)의 농도, 뿐만 아니라 ATP 생산을 정량화할 수 있다. ATP (도 6 참조)는 당 모이어티에 에스터화된 세 개의 인산기로 구성된 아데노신 뉴클레오타이드이며, 모든 살아있는 세포에서 발견된다. 아데노신 트라이포스페이트는 대사 과정, 뿐만 아니라 RNA 및 단백질 합성을 위한 에너지 생산에 관여한다.
바람직한 구현예에서, 무기 폴리포스페이트, 상기 경우에 소듐 폴리포스페이트는 시스템을 위한 에너지원으로서 시험관 내 ATP-의존적 시스템에 제공될 수 있다. 분리 및 정제된 Gst AdK 및/또는 TaqPPK는 상기 무세포 발현 시스템에 첨가될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, Gst AdK 대 TaqPPK가 무세포 발현 시스템, 또는 기타 분석, 진단 또는 시스템에 첨가될 수 있으며, 여기서 Gst AdK 대 TaqPPK의 비율은 TaqPPK와 비교하여 더 많은 양의 Gst AdK를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, Gst AdK 대 TaqPPK는 대략 3:1 내지 4:1의 대략적인 몰비로 상기 시스템이 첨가될 수 있다. 이러한 비율은 단지 예시적인 것이며 다른 비율이 본 발명의 범위 내에 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 다른 구현예에서, Gst AdK 대 TaqPPK는 상기 시스템에 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, 5:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 대략적인 몰비로 첨가될 수 있다 [농도 이메일 참조].
도 8에 도시된 바와 같이, 또 다른 바람직한 구현예에서, 분리 및 정제된 Gst AdK 및/또는 TaqPPK는 일정량의 무기 폴리포스페이트와 함께 상기 무세포 발현 시스템에 첨가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 무기 폴리포스페이트의 양은 최적의 폴리포스페이트 농도 범위를 포함할 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, 이러한 최적의 폴리포스페이트 농도 범위는 일반적으로 반응의 평형을 안정하게 유지하는 무기 폴리포스페이트 (PPi)의 농도로서 정의된다. 상기 바람직한 구현예에서, 최적의 폴리포스페이트 농도 범위는 대략 0.2-2 mg/ml PPi일 수 있다.
전술한 바와 같이, PPK는 폴리포스페이트 및 AMP으로부터 ADP를 합성할 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, Gst AdK 및 PPK의 결합 작용은, 두 개의 ADP를 하나의 ATP 및 하나의 아데노신 모노포스페이트 (AMP)로 전환함으로써 시스템으로부터 아데노신 다이포스페이트 (ADP)를 제거할 수 있다:
Figure pct00001
이러한 반응은 PPK의 평형 반응을 ADP의 생성으로 유도하기에 충분히 빠를 수 있다:
Figure pct00002
상기 시스템에서, 고농도의 AMP가 존재하면 TaqPPK 반응을 ADP로 더욱 유도할 수 있다.
또한, 도 4-6에 도시된 바와 같이, ATP 결정 분석에서, PPK/AdK 에너지 (ATP) 재생 시스템의 ATP 재생 비율은 기존의 PEP/PK 에너지 생산 시스템과 비교하여 상당히 높다. 일부 구현예에서, 초기 ATP 전환율은 유사한 조건하에서 기존의 PEP/PK 시스템과 비교하여 대략 10배 더 높을 수 있다. 또한, 도 4-6에서 추가적으로 입증된 바와 같이, Gst AdK 및 PPK는, 더 높은 전체 전환수를 가질 수 있어, 연장된 기간 동안 검출 가능한 ATP 재생을 야기하며, 상기 구현예에서는, 상기 기간이 최대 12 시간이었다.
TaqPPK의 혼입은 12 시간을 초과하여 검출 가능한 ATP 재생을 추가로 야기할 수 있다. 이러한 ATP 재생 전환율은 상기 기재된 기존의 시험관 내 ATP 재생 시스템보다 상당히 높다. 다른 구현예에서, Gst AdK 및/또는 TaqPPK는 기타 AdK 단백질에 대해 억제되는 염 농도에서 효소 활성 및/또는 전환율이 지속되도록 하는 개선된 염 내성을 포함할 수 있다. 이와 같이, 폴리포스페이트의 존재하에 Gst AdK 및 TaqPPK, (뿐만 아니라 호열성 및/또는 내열성 미생물 균주를 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 기타 박테리아로부터 유도된 AdK 및/또는 PPK 및 이의 상동체)가 무세포 발현 시스템 내에서 어떻게 상승적으로 작용하여 세포 에너지원 ATP를 재생성할 수 있는지 알 수 있다:
Figure pct00003
본 발명의 기술의 특정 구현예는 개선된 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 무세포 발현 시스템, 예컨대 시험관 내 전사 및/또는 번역 시스템은 선택된 박테리아 균주로부터의 열안정성 RNA 중합효소 (RNAP)를 추가로 포함할 수 있는 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 능력을 포함하도록 구성될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 무세포 단백질 발현 시스템에 사용하기 위해 박테리아 종 지오바실러스 스테아써모필러스로부터 RNAP 서브유닛 알파 (서열 번호 1), 베타 (서열 번호 2), 베타' 및 또는 베타' (opt) (각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4), 델타 (서열 번호 5) 및 오메가 (서열 번호 6)를 식별, 클로닝, 정제 및 제조하였다. G. 스테아로써모필러스 내부 세포막 및 두꺼운 세포벽을 특징으로 하는 그람 양성 호열성 박테리아임을 유의해야 한다. G. 스테아로써모필러스는 열수 분출공 또는 온천과 같은 호열성 서식지에서 발견되는 막대 모양의 혐기성 생물이다.
G. 스테아로써모필러스(Gst RNAP)로부터의 RNAP는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 식별, 클로닝, 발현된 후 정제될 수 있다. 상기 구현예에서, Gst RNAP는, 예를 들어, 극한 미생물(extremophile)이 아닌 박테리아, 예컨대 E. coli로부터의 표준 RNAP보다 더욱 안정할 수 있다. Gst RNAP는 개선된 열안정성, 뿐만 아니라 개선된 동역학적 안정성을 가질 수 있어, 기존의 무세포 발현 시스템에서 사용되는 기타 RNAP 변이체보다 시험관 내 시스템에서 mRNA의 생산을 더욱 오랜 기간 동안 촉매 작용을 지속할 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 열안정성 Gst RNAP는 클로닝되어 고발현 E. coli 균주로 형질전환될 수 있다. 상기 열안정성 Gst RNAP는 클로닝, 분리 및 정제된 다음, 표적 유전자 물질, 예컨대 하나 이상의 선택 유전자를 포함하는 플라스미드 및/또는 선형 DNA의 존재하에 무세포 발현 시스템으로 도입되고, 선택 유전자의 mRNA 전사물을 생성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 mRNA 전사물은 박테리아 또는 기타 세포 추출물로 도입되거나, 또는 이와 함께 결합될 수 있다. 추출물은 DNA에서 RNA로의 전사, RNA에서 단백질으로의 번역, 단백질 접힘, 및 에너지 대사에 필수적인 요소를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 구현예에서, 분리 및 정제된 TaqPPK 및 Gst AdK는, 예를 들어, 단백질 번역 동안 무세포 발현 시스템의 세포 추출물, 뿐만 아니라 일정량의 하나 이상의 폴리포스페이트에 첨가되어 개선된 ATP 재생의 메커니즘을 제공할 수 있다.
상기 바람직한 구현예에서, 표적 mRNA 전사물의 번역은 하나 이상의 선택 단백질(들)을 생성할 수 있고, TaqPPK, Gst AdK 및 폴리포스페이트의 상승적 활성은 향상된 ATP 재생을 제공하여, 원하는 경우, 가능한 보다 높은 온도에서, 무세포 발현 시스템의 수행 시간을 연장시키고, 전환수를 증가시켜, 전체 단백질 수율을 증가시킬 수 있다. 상기 구현예에서, 고안전성의 Gst RNAP가 존재하면, mRNA 전사물의 생산을 위해 가능한 보다 높은 온도에서 변성되지 않고 수행 시간을 연장시키고, 전환수를 증가시켜, mRNA 전사물 및 궁극적으로 무세포 발현 시스템 내에서의 단백질 수율을 증가시킨다.
본 발명은 또한 일반적으로 무세포 발현 시스템으로서 지칭되는 개선된 시험관 내 전사/번역 시스템에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 무세포 발현 시스템은 무세포 추출물 제조에 사용하기 위해 개발될 수 있는 호열성 또는 내열성 박테리아의 하나 이상의 유전자 변형 균주를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 호열성 박테리아의 유전자 변형 균주, 예컨대 지오바실러스 균주는 무세포 (CF) 추출물 제조 및 시험관 내 전사/번역을 위해 개발 및 사용될 수 있다. 지오바실러스 균주는 일반적으로 E. coli 와 비교하여 (35-37℃높은 성장 온도 (52-55℃를 나타낸다. 이러한 열적 차이는 CF 추출물 제조에서 보다 높은 단백질 안정성 및 보다 높은 단백질 밀도의 내성을 허용할 수 있다. 또한, 지오바실러스 균주의 호열성은 특성으로 인해 기타 효소-, 및 효소 기능, 예컨대, 비제한적으로: 아미노산-합성 효소; 리보솜; DNA-의존적 RNA 중합효소; 시그마 인자(들); 및 ATP 재생 및 해당 효소에 대한 안정성이 증가될 수 있다.
지오바실리 (Geobacilli) 속의 박테리아가 또한 CF 추출물 제조제 유리하다. 후벽균이기 때문에, 이는 특정 조건하에서 O2-내성 또는 엄격한 호기성이다. 혐기성 호열성 생물의 취급, 발효 및 추출물 제조는 상당히 복잡하고 비용이 높으며, 대기의 산화 조건으로 인해 효소 안정성과 관련된 추가적인 불확실성을 가질 수 있다. 또한, 지오바실래는 인체의 건강에 영향을 주지 않는 것으로 공지되어 있으며, 따라서, CF 시스템으로부터 임상 물질을 제조하기 적합하다.
본 발명의 유전자 변형 지오바실러스 균주와 관련하여, 리보솜 결합 부위 (RBS)는 유전자 분석에 의해 E. coli 단백질 발현 균주에 대한 발현 구성체의 표준 RBS와 동일하거나, 이와 유사한 것으로 예측 및 입증되어, 바람직한 구현예에서 본 발명의 기술이 유전자 구성체를 보존하고 이용할 수 있도록 하는 것으로 확인되었다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 유전자 변형 지오바실러스 균주는 tRNA 코돈 사용에 유리한 범위값을 나타냈다. 하나의 구현예에서, tRNA 집단 분포를 가지는 독점 소프트웨어를 사용하여 생체 정보 분석을 수행하여, 희귀 또는 커버되지 않은 tRNA 코돈으로 인한 시험관 내 번역 반응의 정지를 예방하기 위해 모든 또는 대부분의 잠재적 코돈을 커버하는 균주를 식별하였다. 상기 지오바실러스 균주의 추출물은 또한 균주의 아미노산 합성효소에 의해 인식되는 정제된 E. coli tRNA를 이용할 수 있다. 이것은 완전히 및 거의 동일하게 분포된 코돈 범위값을 허용할 수 있다. 상기 구현예는 다양한 균주, 예컨대 지오바실러스 스테아써모필러스, 및 써모필러스 아쿠아티쿠스의 tRNA 코돈 사용의 자연적인 불균형 분포를 열역학적 균형 분포에 유리하게 고려한다.
일반적으로 상기 논의된 바와 같이, 하나의 바람직한 구현예에서, 유전자 변형 박테리아 균주는 무세포 발현 시스템에 사용하기 위해 개발될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지오바실러스 균주는 유전자 변형되어, 특정 효소의 발현을 제거 및/또는 감소시키고, 발효 과정 동안 효소를 본질적으로 과생산하여 CF 추출 제조물의 사용을 촉진하였다. (이러한 유전자 변형 균주는 종종 일반적으로 “지오바실러스 CF”로서 지칭될 수 있다). 상기 구현예에서, 지오바실리를 유전자 변형하여 강력한 단백질 분해효소 OmpT-상동체, RNaseI, 및 DNA-메틸화 의존적 DNase를 녹아웃하였다. 상기 구현예에서, 유전자 녹아웃 변형은 박테리아 게놈으로부터 이들 유전자의 전사 조절을 선택적으로 제거함으로써 이루어졌다. 기술 분야에서 일반적으로 공지되어 있고 이해되는 다른 녹아웃 방법이 또한 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 활성은 유전적 변형에 의해 제거되어 (녹아웃되어) 포자형성 과정을 늦추고 배양물 내 박테리아 밀도를 증가시켜, 효율을 더 높이고 CF 추출물 수율을 개선하였다.
또한, 일반적으로 상기 논의된 바와 같이, 특정 구현예에서, 유전자 변형 박테리아 균주는 선형 PCR 산물로부터 바람직한 시험관내 전사를 위한 특정 프로모터를 인식하기 위해 시그마 인자, RpoD를 과발현시키도록 개발되었다. 바람직한 구현예에서, 지오바실러스 CF는 균주의 발효 동안 시그마 인자, RpoD를 과발현시키도록 유전자 변형되었다. 이러한 RpoD의 유전자 변형 과발현은 상기 시그마 인자의 발현을 시그마 70의 천연 세포 농도 이상으로 증가시켰으며, 이는 결국 유전자 변형 지오바실러스 균주에서 박테리아 RNAP의 농도를 증가시켰다. 마지막으로, 유전자 변형 박테리아 지오바실러스 균주는 기술 분야 내 공지된 E. coli 단백질 발현 균주와 유사한 성장 속도를 나타냈다. CF 추출물 제조를 위한 유전자 변형 지오바실리균주의 사용의 추가적인 장점으로는 다음을 포함한다: 1) 높은 성장 온도 (대략 52-55℃로 배양물의 잠재적 오염을 현저히 감소시킴; 및 2) “사용된” 발효 배지는 단순하고 무해하여, 혐기성 호열성 생물에 요구되는 폐기물 처리 필요성을 감소시킴.
추가적인 구현예에서, 세포 추출물은 다수의 상이한 미생물로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 세포 추출물은 대장균 (ECE), 토끼 망상적혈구 (RRL), 밀 배아 (WGE), 및 곤충 세포 (ICE), 그리고 심지어 포유류 세포 (MC)로부터 생성될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 미세조류로부터의 세포-추출물이 생성될 수 있다. 이러한 구현예는 인트론을 인식하고 제거하는 임의의 메커니즘을 제공하지 않기 때문에 유리할 수 있다. 한편, 나노클로롭시스 (nannochloropsis)와 같은 미세조류는, 미세조류 세포 추출물의 천연 구성 요소인 인트론을 가지며, 세포 기계가 이를 제거하여, 본 발명이 식물 단백질 및 기타 발현 산물의 생산에 적용 가능하도록 한다.
본 명세서에 사용된 시험관 내 무세포 발현은 생물학적 추출물 및/또는 한정된 무세포 반응 성분을 포함하는 반응 혼합물 또는 용액에서 폴리펩타이드의 무세포 합성을 지칭한다. 반응 혼합물은 거대분자의 생산을 위한 주형, 또는 유전자 주형, 예를 들어 DNA, mRNA, 등; 합성되는 거대분자를 위한 단량체, 예를 들어 아미노산, 뉴클레오타이드, 등, 및 합성에 필수적인 보조 인자, 효소 및 기타 시약, 예를 들어 리보솜, tRNA, 중합효소, 전사 인자, 등을 포함할 수 있다. 무세포 합성 반응, 및/또는 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템 성분은 배치, 연속 흐름, 또는 반-연속 흐름으로 수행/첨가될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 다수의 분석, 및 기타 진단 용도에 적용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, PPi 및 AMP와 함께 이중 효소 Adk/PPK의 첨가는 임의의 ATP 에너지 의존적 분석 또는 진단 용도, 예컨대 루시페레이스 분석에 ATP 재생을 허용할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 제1 수량의 Gst AdK, 및 제1 수량의 TaqPPK가 제1 수량의 PPi 및 제1 수량의 AMP와 함께 ATP 의존적 분석 또는 진단에 첨가될 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, 세포 ATP 에너지 재생은 분석 및/또는 진단 수행 시간, 생산량, 감도를 개선할 뿐만 아니라, 기존의 에너지 보충 기법과 비교하여 성분의 저렴한 특성으로 인해 비용을 절감시킬 수 있다. 상기 언급된 성분 각각은 특정 시간 경과에 따라 추가적으로 보충될 수 있다.
이러한 ATP-의존적 적용의 예로는 에너지-의존적 광반응 또는 유리할 수 있는 효소 반응, 예컨대 에피머화효소(Epimerase), 탈수효소(Dehydratase), NADPH-수화물-탈수효소(NADPH-Hydrate-Dehydratase), 섬유소 분해효소(Cellulase), 염색질-재구성-효소(Chromatin-remodeling-enzyme), ATP-의존적 펩타이드 연결효소(ATP-dependent peptide ligase) 반응, DNA 연결, 및 기존의 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 시스템은 다음의 생성에 사용될 수 있다: 합성효소; 인산화 과정; CoA 의존적 효소 (세제, 향료 산업); 아미노산 아마이드 (D'Ala-D'Ala-연결효소)
전술한 바와 같이, 본 발명의 하나의 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 무기 폴리포스페이트 (PPi)의 첨가를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 제1 수량의 PPi의 첨가를 포함할 수 있는 한편, 또 다른 구현예는 일정량의 PPi의 첨가를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 일정량의 PPi는 예정된 시간 간격으로 첨가될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 대략적인 평형 상태로 에너지 조절을 유지, 및/또는 최대, 또는 바람직한 수준의 ATP를 생성하기 충분한 농도 범위를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 대략 0.1 내지 50 mg/ml PPi 이상의 농도를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 에너지 조절 반응을 대략적인 평형 상태로 유지하기에 충분한 농도 범위를 포함할 수 있으며, 이러한 범위는 대략 0.3 내지 4 mg/ml PPi이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 에너지 조절 반응을 대략적인 평형 상태로 유지하기에 충분한 농도 범위를 포함할 수 있으며, 이러한 범위는 대략 0.2 내지 2 mg/ml PPi이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 결합된 Adk/PPK 에너지 재생 시스템을 가지는 무세포 발현 시스템은 에너지 조절 반응을 대략적인 평형 상태로 유지하기 충분한 농도 범위를 포함할 수 있으며, 이러한 범위는 대략 0.5 내지 0.6 mg/ml PPi이다. 물론, 이러한 모든 비율은 무세포 발현 반응의 크기, 지속 시간 및 에너지 요건에 기초하여 요구될 수 있음에 따라 확대 또는 축소될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기능적 범위는 또한 추가적인 PPi를 포함하지 않거나, 또는 0 mg/ml일 수 있다.
일반적으로 도 13a-b를 참조하면, 하나의 구현예에서, 본 발명은 무세포 발현 생물 반응기 (22)에 관한 것이다 (요소 10-20 참조). 다중 무세포 시스템이 본 발명으로 구현될 수 있음에 따라 이러한 이중 반응기는 단지 예시적임에 유의해야 한다. 본 발명의 생물 반응기는 무세포 발현이 기존의 온도보다 높은 온도에서 이루어질 수 있으며, 예를 들어 공급 반응 용액으로부터 배치, 연속 또는 반-연속식으로 가동되도록 구성될 수 있다.
또한, 도 14를 참조하면, 상기 구현예에서, 본 발명은 무세포 배양 장치 (21) (요소 1-9 참조)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 세포 배양 장치는 호열성 박테리아를 배양하도록 구성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발효 용기는 제거 가능하며 별도로 가압 멸균할 수 있다(autoclavable). 또한, 상기 무세포 배양 장치 (21)는 호기성, 뿐만 아니라 혐기성 유기체와 함께 성장을 수용할 수 있도록 구성될 수 있다. 또한, 무세포 발현 생물 반응기 (22) 및 무세포 배양 장치 (21) 둘 모두는 다양한 세포 배양물, 예컨대 미세조류, 식물 세포 등을 수용할 수 있다.
다음의 무세포 단백질 발현 시스템은 본질적으로 예시이며, 상이한 구성 및 시스템이 상기 언급된 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템과 함께 혼입될 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 신규의 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템은 공지된 다양한 무세포 발현 시스템에 응용할 수 있고, 또한 조정가능한키트 내에 구성될 수 있다.
본 발명이 유전자 변형 유기체의 생산을 포함하고 재조합 DNA 기법을 포함하기 때문에, 본 발명의 설명을 돕기 위해 다음의 정의가 제공된다. 본 명세서에 사용된 용어 “분리된”, “정제된”, 또는 “생물학적으로 순수한”은, 본래의 상태에 또는 물질이 생성될 때 일반적으로 물질을 수반하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 가지지 않는 물질을 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 분석화학 기법, 예컨대 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 순도 및 균질성이 결정된다. 제조물 내 존재하는 지배적인 종인 핵산 또는 특정 박테리아는 실질적으로 정제된다. 예시적인 구현예에서, 용어 “정제된”은 전기영동 겔에서 하나의 밴드를 필수적으로 발생시키는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 전형적으로, 분리된 핵산 또는 단백질은 범위서 표현되는 순도 수준을 가진다. 성분에 대한 순도 범위의 하단은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 순도 범위의 상단은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 초과이다.
본 명세서에 사용된 용어 “핵산”은 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, “핵산” 중합체는 단일 또는 이중 가닥 형태로 존재하지만, 3개 이상의 가닥을 포함하는 구조를 형성하는 것으로도 공지되어 있다. 용어 “핵산”은 천연 존재의 핵산 중합체, 뿐만 아니라, 합성, 천연 존재, 및 천연에 존재하지 않는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결부를 포함하는 핵산을 포함하며, 이는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사된다. 예시적인 유사체로는 포스포싸이오에이트(phosphorothioate), 포스포아마데이트(phosphoramidate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate), 카이랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 및 펩타이드-핵산 (PNA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "DNA", "RNA", "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열", "올리고뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "핵산 단편", 및 "분리된 핵산 단편"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 핵산에 대하여, 크기는 킬로베이스 (kb) 또는 염기쌍(bp)으로 제공된다. 추정치는 전형적으로 아가로스 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동으로부터, 시퀀싱된 핵산으로부터, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래한다. 단백질에 대하여, 크기는 킬로달톤 (kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 주어진다. 단백질 크기는 겔 전기영동으로부터, 시퀀싱된 단백질으로부터, 유도된 아미노산 서열로부터, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열 또한 명시적으로 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예로서, 퇴화 코돈 치환), 상보적 (또는 보체) 서열, 및 역보체 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (예로서, Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) 참조). 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 코돈의 퇴화된 성질 이외에도, 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산을 생성하지만, 인코딩된 폴리펩타이드의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 폴리뉴클레오타이드의 변화가 또한 기술 분야 내 공지되어 있다. "보존적 아미노산 치환"은 기준 폴리펩타이드의 특성을 가장 적게 방해할 것으로 예측되는 치환이다. 즉, 보존적 아미노산 치환은 기준 단백질의 구조 및 기능을 실질적으로 보존한다. 이에 따라, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은, 보다 소수성이 적은 또 다른 잔기, 예컨대 글라이신, 또는 보다 소수성이 큰 잔기, 예컨대 발린, 류신, 또는 아이소류신을 인코딩하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 유사하게, 하나의 음으로 하전된 잔기를 또 다른 잔기로 치환, 예컨대 아스파트산을 글루탐산으로, 또는 하나의 양으로 하전된 잔기를 또 다른 잔기로, 예컨대 라이신을 아르기닌 또는 히스티딘으로의 치환을 야기하는 변화가, 기능적으로 동등한 단백질 또는 폴리펩타이드을 생성하는 것으로 또한 예상될 수 있다. 예시적인 보존적 아미노산 치환은 당업자에게 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조를, 예를 들어, 베타 시트 또는 알파 나선형 입체구조로서, (b) 치환 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측면 사슬의 벌크를 유지한다.
상동성 (예로서, 상동성 백분율, 서열 동일성 + 서열 유사성)은 쌍서열 정렬을 계산하는 임의의 상동성 비교 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 두 개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 정렬될 때 동일한 두 개의 서열의 잔기에 대한 언급을 포함한다. 단백질에 대하여 서열 동일성이 백분율이 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 종종 상이하며, 이러한 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들어 전하 또는 소수성)을 가지는 다른 아미노산 잔기로 치환되어, 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는 것으로 인식된다. 보존적 치환에서 서열이 상이한 경우, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향조절될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가진다. 이러한 조정의 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로 이러한 수단은 보존적 치환을 완전 불일치가 아닌 부분적 불일치로서 점수를 매겨, 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것을 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, 동일한 아미노산은 1점이 부여되고, 비-보존적 치환은 0점이 부여되는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 점수가 부여된다. 보존적 치환의 점수는, 예를 들어, Henikoff S 및 Henikoff JG의 알고리즘에 따라 계산한다 [Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9 참조],
특정 구현예에 따르면, 상동 서열은 본 명세서에 제공되는 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)과 최소 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 동일하거나 또는 완전히 동일하다. 서열 번호 1-22의 50%-99% 상동 서열이 본 발명의 특정 구현예에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “프라이머”는 적합한 조건하에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 조건으로는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 4가지 상이한 뉴클레오사이드 트라이포스페이트 및 연장제 (예로서, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)의 존재하에, 적당한 완충제 및 적합한 온도에서 유도되는 조건을 포함한다.
프라이머는 바람직하게는 단일 가닥 DNA이다. 프라이머의 적당한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 의존하지만, 전형적으로 약 6 내지 약 225 개의 뉴클레오타이드 범위이며, 중간 범위, 예컨대 15 내지 35개의 뉴클레오타이드, 18 내지 75개의 뉴클레오타이드 및 25 내지 150개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 차가운 온도를 필요로 한다. 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 한다. 주어진 표적 서열의 증폭을 위한 적합한 프라이머의 디자인은 기술 분야 내 공지되어 있으며 본 명세서에 언급된 문헌에 기재되어 있다
본 명세서에 사용된 바와 같이, “중합효소”는 뉴클레오타이드의 중합에 촉매 작용을 하는 효소를 지칭한다. “DNA 중합효소”는 디옥시리보뉴클레오타이드의 중합에 촉매 작용을 한다. 공지된 DNA 중합효소로는, 예를 들어, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus , Pfu) DNA 중합효소, E. coli DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소 및 떼르무스 아쿠아티쿠스 (Taq) DNA 중합효소 등을 포함한다. “RNA 중합효소”는 리보뉴클레오타이드의 중합에 촉매 작용을 한다. DNA 중합효소의 전술한 예가 또한 DNA-의존적 DNA 중합효소로서 공지되어 있다. RNA-의존적 DNA 중합효소는 또한 DNA 중합효소의 범위 내에 포함된다. 레트로바이러스에 의해 인코딩되는 바이러스 중합효소를 포함하는 역전사 효소는 RNA-의존적 DNA 중합효소의 한 예이다. RNA 중합효소 (“RNAP”의 공지된 예로는, 예를 들어, T3 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소 및 E. coli RNA 중합효소 등을 포함한다. RNA 중합효소의 전술한 예는 또한 DNA-의존적 RNA 중합효소로서 공지되어 있다. 임의의 상기 효소의 중합효소 활성은 기술 분야 내 공지된 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “반응 혼합물” 또는 “무세포 반응 혼합물”은 주어진 반응을 수행하는데 필수적인 시약을 포함하는 용액을 지칭한다. A 무세포 발현 시스템 “반응 혼합물” 또는 “반응 용액” 전형적으로 미정제 또는 부분 정제된 추출물 (예컨대 박테리아, 식물 세포, 미세조류, 진균류, 또는 포유류 세포로부터의 추출물), 뉴클레오타이드 번역 주형, 및 번역 주형으로부터 무세포 단백질 합성을 촉진하기 위한 적합한 반응 완충제를 포함한다. 일부 양태에서, CF 반응 혼합물은 외인성 RNA 번역 주형을 포함할 수 있다. 기타 양태에서, CF 반응 혼합물은 DNA-의존적 RNA 중합효소에 대한 프로모토 요소에 작동가능하게 연결된 개방 판독 프레임을 인코딩하는 DNA 발현 주형을 포함할 수 있다. 상기 기타 양태에서, CF 반응 혼합물은 또한 개방 판독 프레임을 인코딩하는 RNA 번역 주형의 전사를 지시하기 위한 DNA-의존적 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. 상기 기타 양태에서, 추가적인 NTP 및 2가 양이온 보조 인자가 CF 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 반응 혼합물은 반응을 가능하게 하는 필수적인 모든 시약을 포함하는 경우에는 완전하고, 필수적인 시약의 하위 세트만을 포함하는 경우에는 불완전한 것으로 지칭된다. 당업자는 편리성, 저장 안정성의 이유로, 또는 성분 농도를 용도-의존적으로 조정할 수 있도록, 반응 성분이 용액 각각이 전체 성분의 하위 세트를 포함하는, 별개의 용액으로서 일상적으로 저장되며, 반응 성분이 반응 전에 조합되어 완전한 반응 혼합물을 생성하는 것을 이해할 것이다. 게다가, 당업자는 반응 성분이 상용화를 위해 별도로 패키지화 되며 유용한 상용의 키트가 본 발명의 반응 성분의 임의의 하위 세트를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 특정 구현예에서 사용되는 반응 혼합물 내 일부 성분이 무세포 발현 산물을 생성하는데 필수적인 것은 아님을 이해할 것이다.
용어 “무세포 발현 산물”은 무세포 발현 시스템을 통해 생성되는 임의의 생물학적 생성물일 수 있다.
용어 “약” 또는 “대략”은 예컨대 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 기간, 온도, 압력 또는 부피 값의 통계적으로 의미있는 범위 내를 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 10배 이내, 전형적으로 20% 이내, 더욱 전형적으로 10% 이내, 및 더욱 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. “약” 또는 “대략”을 포괄되는 허용 가능한 변동은 연구 중인 특정 시스템에 의존할 것이다. 용어 “포함하는(comprising)” “가지는(having)” “포함하는(including)” 및 “포함하는(containing)”은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어로 해석되어야 한다 (즉, “포함하지만, 이에 제한되지 않는”을 의미한다).
본 명세서의 값의 범위 인용은 단지 범위 내에 속하는 각 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭의 방법으로서 역할하도록 의도되며, 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한 범위를 정의하는 종점 경계를 포함하고, 각 개별 값은 본 명세서에 인용된 것과 같이 본 명세서 내에 포함된다.
용어 “재조합” 또는 “유전자 변형”이, 예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 관련하여 사용되는 경우, 세포, 유기체, 핵산, 단백질 또는 벡터는, 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연의 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 이와 같이 변형된 세포로부터 유도되었음을 나타낸다. 이에 따라, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비재조합 또는 야생형) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나, 과발현되거나, 저발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연의 유전자를 발현할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “형질전환” 또는 “유전자 변형”은 하나 이상의 핵산 분자(들)의 세포내로의 전이를 지칭한다. 미생물은 핵산 분자가 안정적으로 복제될 때 형질도입된 핵산 분자에 의해 박테리아 또는 세포 또는 유기체 내로 “형질전환” 또는 “유전자 변형”된다. 본 명세서에 사용된 용어 “형질전환” 또는 “유전자 변형”은 핵산 분자가 세포 또는 유기체, 예컨대 박테리아 내로 도입될 수 있는 모든 기법을 포괄한다.
본 명세서에 사용된 용어 “프로모터”는 전사 개시로부터 업스트림에 있을 수 있고, 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소 및 기타 단백질의 인식 및 결합에 관여할 수 있는 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
용어 “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용되는 경우, 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미치는 것을 의미한다. “조절 서열” 또는 “제어 요소”는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 가공 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 선도 서열; 인트론; 인핸서(enhancer); 스템-루프(stem-loop) 구조; 리프레서(repressor) 또는 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화(polyadenylation) 인식 서열; 등을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 이에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중 가닥 핵산 분자의 관련 상보적 가닥에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “게놈”은 세포 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하며, 또한 세포의 세포 내 성분에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 박테리아에 적용되는 용어 “게놈”은 박테리아 세포 내 염색체 및 플라스미드 둘 모두를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 분자가 박테리아 내로 도입되어 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 통합될 수 있다. 상기 및 추가의 구현예에서, DNA 분자는 안정한 플라스미드로서 염색체적으로 통합되거나, 또는 안정한 플라스미드 내에 위치할 수 있다.
용어 “유전자” 또는 “서열”은 어떤 방식으로 유전자 산물 (예로서, 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA)의 발현을 조절할 수 있는 적당한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 지칭한다. 유전자는 코딩 영역 (개방 판독 프레임, ORF)의 이전 (업스트림) 및 이후 (다운스트림) DNA의 전사되지 않은 조절 영역 (예로서, 프로모터, 인핸서, 리프레서, 등), 뿐만 아니라, 적용 가능한 경우, 개별 코딩 영역 (즉, 엑손) 사이의 개재 서열 (즉, 인트론)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "구조 유전자"는 mRNA으로 전사된 후 특정 폴리펩타이드의 특징적인 아미노산 서열로 전사되는 DNA 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 “발현” 또는 “코딩 서열의 발현” (예로서, 유전자 또는 전이 유전자(transgene))은 핵산 전사 단위 (예로서, 게놈 DNA 또는 cDNA 포함)의 코딩된 정보가 세포의 작동, 비-작동, 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정을 지칭하며, 종종 단백질의 합성을 포함한다. 유전자 발현은 다음의 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 세포, 조직, 또는 유기체의 노출. 유전자은 발현은 또한 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질로의 경로 어느 곳에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, 열화에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 만들어진 후 활성화, 비활성화, 구획화, 또는 열화를 통해, 또는 이의 조합에 의해 일어난다. 유전자 발현은 기술 분야 내 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준으로 측정될 수 있으며, 이러한 방법으로는 노던 블롯(Northern blot), RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western blot), 또는 시험관 내, 생체 내, 또는 생체 내 단백질 활성 분석(들)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 “벡터”는 DNA, RNA, 단백질, 또는 폴리펩타이드가 숙주 내로 도입될 수 있는 어떤 수단을 지칭한다. 숙주 내로 도입되는 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 및 폴리펩타이드는 사실상 치료적 또는 예방적일 수 있고; 항원을 인코딩할 수 있거나 또는 항원일 수 있고; 사실상 조절 벡터일 수 있다. 바이러스, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 및 박테리아를 포함하는 다양한 유형의 벡터가 존재한다.
“발현 벡터”는 선택된 숙주 세포 또는 유기체를 복제할 수 있는 핵산이다. 발현 벡터는 자율적인 구조로서 복제할 수 있거나, 또는 대안적으로, 전체 또는 부분적으로, 숙주 세포 염색체 또는 소기관의 핵산 내로 통합될 수 있거나, 또는 외래 DNA를 세포로 전달하기 위한 셔틀로서 사용되어, 숙주 세포 게놈과 함께 복제될 수 있다. 이에 따라, 발현 벡터는 선택된 숙주 세포, 소기관, 또는 유기체, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 핵산 단편에서 복제될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이며, 이러한 발현 벡터 상의 특정 유전자 (해당 유전자 포함)는 세포, 소기관 또는 유기체; 또는 “발현 카세트(expression cassette)”를 포함하는 기술 분야 내 공지된 임의의 적합한 구조체(construct) 내의 폴리펩타이드 또는 단백질에서 전사 및 번역된다. 대조적으로, 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이, "카세트"는 본 발명의 발현 백터의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 카세트를 사용하면 발현 벡터의 조립을 돕는다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 키메라 바이러스, 또는 코스미드와 같은 레플리콘(replicon)이며, 발현 제어 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일반적으로 본 명세서에 기재된 무세포 발현 시스템에서 발현된 단백질에 관련된 용어 “발현 생성물”은 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로 약 5개 초과의 아미노산을 가지는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩타이드는 상동성이거나, 또는 외인성일 수 있으며, 이는 무세포 추출물이 유래된 유기체, 예컨대 무세포 추출물에서 생성된 인간 단백질, 식물 단백질, 바이러스 단백질, 효모 단백질, 등에 대해 이종성, 즉, 외래성임을 의미한다.
“무세포 추출물” 또는 “용해물”은 다양한 유기체 및/또는 세포로부터 유래할 수 있으며, 박테리아, 호열성 박테리아, 내열성 박테리아, 고세균, 후벽균, 진균류, 조류, 미세조류, 식물 세포 배양물, 및 식물 현탁 배양물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 단수 형태 (“a”“an” 및 “the”)는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, “세포”에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하며, “배양”에 대한 언급은 하나 이상의 배양물 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 달리 명백하게 지시되지 않는 한 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
이제 일반적으로 기재되는 본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 구현예의 특정 양태를 예시하기 위한 목적으로 포함된다. 상기 교시 및 다음의 실시예로부터 기타 실시예 및 방법이 청구 범위를 만족시킬 수 있고, 청구되는 발명의 범위를 벗어나지 않고 사용될 수 있음을 당업자가 인식할 것임에 따라, 실시예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본 발명이 이의 바람직한 구현예를 참조하여 특히 도시 및 기재되어 있지만, 당업자는 첨부된 청구 범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에 의해 형태 및 세부 사항의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1: G. 스테아로써모필러스 로부터 열안정성 Gst RNAP의 생성
상기 바람직한 구현예에서, 본 발명자들은 G. 스테아로써모필러스로부터의 RNA 중합효소 (Gst RNAP)가 G. 스테아로써모필러스 배양물로부터 분리된 게놈 DNA (gDNA)으로부터 클로닝될 수 있음을 입증하였다. 상기 구현예에서, 대략 20 ml의 G. 스테아로써모필러스가 밤새 배양에서 성장한 후, 예를 들어 원심분리기를 사용하여 펠릿화될 수 있다. 이어서 gDNA는, 상기 실시예에서 시판된 gDNA 정제 키트, 예컨대 Macherey-Nagel NuceloSpin Microbial DNA Kit를 사용하여 분리될 수 있다. 이어서 에탄올 침전법을 사용하여 gDNA를 농축시킬 수 있다. 이는 일반적으로 gDNA를 포함하는 용액에 염 및 에탄올을 첨가하여 gDNA를 침전시킬 수 있고, 예를 들어 원심분리기를 사용하여 다시 펠릿화한 다음, DNase/RNase를 포함하지 않는 물에 현탁시킴으로써 달성될 수 있다.
상기 바람직한 구현예에서, Gst RNAP의 서브유닛은 각 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계될 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 클로닝될 수 있다. 서브유닛 유전자를 발현 벡터 내로 도입하기 위해 특정 제한 부위를 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머가 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 구체적으로 서브유닛 유전자를 IBAStarGate Expression Vectors(들) 내로 도입하기 위한 제한 부위를 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머가 생성될 수 있다. 그 다음, 대상 프라이머 및 gDNA는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 거쳐 Gst RNAP 서브유닛 유전자를 증폭시킬 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, PCR은 표준 MasterMix 반응 및 50 ng의 G. 스테아로써모필러스로부터 분리된 주입 gDNA를 사용하여 수행할 수 있다.
전술한 바와 같이, 아마도 내부 제한 부위의 존재로 인해 최적화된 유전자 서열로서 작용하기 위해 Gst RNAP 서브유닛을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로 표 1을 참조하면, Gst RNAP 서브유닛 베타' (opt) (서열 번호 4)는 상기 기재된 방식과 유사한 방식으로 식별 및 클로닝될 수 있다. 또한 표 1을 참조하면, 전사 인자, 상기 경우에는 RpoD (서열 번호 7)가 시판된 코돈 최적화 유전자 합성 (Invitrogen)으로부터 사용되고 발현 벡터 내로 직접 클로닝될 수 있다.
하나의 구현예에서, PCR 과정을 통해 증폭된 Gst RNAP 서브유닛 DNA 서열이 분리될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, PCR 반응은 1% 에티듐 브로마이드 아가로스 겔 상에서 분석될 수 있으며 서브유닛 단편은 아가로스 겔 추출법 및/또는 당업계에 공지된 PCR 정제 방법 예컨대 Macherey-Nagel NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up에 의해 분리될 수 있다. 이러한 유전자 단편은 이후 적당한 전달 벡터 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 사전에 생성된 유전자 단편 및 선택된 벡터, 상기 구현예에서는, 시판된 StarGate 벡터 (예를 들어 도 2 참조)는 선택된 제한 효소(들)로 소화되고, 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 Thermo Fisher Scientific Rapid DNA Ligation Kit인 3:1 T4 DNA 연결효소 반응을 통해 연결될 수 있다.
그 다음, 상기 구현예에서, 연결된 유전자 단편 및 플라스미드 벡터는 선택된 박테리아 균주로 형질전환될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 연결된 벡터(들)은 박테리아 대장균, 특히 고속의 형질전환 효율을 가지도록 구성될 수 있는 Top10 적격 E. coli으로 형질전환될 수 있다. Top10 적격 E. coli는 recA 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있고, 이는 플라스미드 벡터 안정성을 촉진하는 DNA 재조합을 감소시킬 수 있으며, 플라스미드 벡터 수율 및 품질을 개선시키는 비특이적 엔도뉴클레이스 활성을 감소시킬 수 있는 또한 endA 유전자 녹아웃을 포함할 수 있다.
성공적으로 형질전환된 박테리아는, 예를 들어 양성 유전자 검출 PCR, 또는 기타 공지된 방법을 통해 식별될 수 있고, 이후 성장 박테리아 콜로니 내에서 플라스미드 벡터의 다중 카피를 생성하도록 배양될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 플라스미드 벡터 DNA는 분리되어 또 다른 선택된 박테리아 균주로 하위-형질전환될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제조된 플라스미드 벡터 DNA는 최적의 단백질 발현을 위해 E. coli의 고발현 균주, 예컨대 BL21(DE3)로 하위-형질전환될 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 발현된 RNAP 서브유닛 단백질은 분자 태그를 가지도록 구성될 수 있다. 도 3을 참조하면, RNAP 베타' (opt) 서브유닛은 poly-His 또는 His-6 태그를 포함하도록 구성될 수 있으며, which may be used later 이는 추후 단백질 정제에 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 발현된 His-태그된 RNAP 베타' (opt) 서브유닛은 히스티딘 잔기의 스트링이 적당한 완충 조건하에서 고정화된 금속 이온, 포함하는 니켈, 코발트 및 구리를 비롯한 여러 유형의 고정화된 금속 이온에 결함함에 따라 용이하게 정제 및 검출될 수 있다.
하나의 구현예에서, 태그된 Gst RNAP는 발현 및 정제될 수 있다. 상기 바람직한 구현예에서, His-6 태그된 베타' (opt) 서브유닛은 E. coli의 BL21(DE3) 균주로 발현될 수 있다. 상기 구현예에서, E. coli의 BL21(DE3) 균주는 NYZ 배지에서 배양될 수 있고, 무엇보다도, 이는 임의의 발현된 단백질을 잠재적으로 분해하는 특정 단백질 분해 효소를 유도하여, 전체 수율을 감소시킬 수 있는 락토스를 가지지 않을 수 있다. 단백질 발현은 박테리아 성장의 특정 광학 밀도 (OD)에서 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, OD 0.7에서, 단백질 발현은 30-32°C에서 6-8 시간 동안 0.25mM 아이소프로필 β-D-1-싸이오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가함으로써 유도될 수 있다 IPTG는 플라스미드 벡터 DNA에서 락 오페론의 전사를 유발하는 락토스 대사물인 알로락토스를 모방하는 분자 시약으로, 락토스 작동자의 제어하에 Gst RNAP 서브유닛 유전자의 단백질 발현을 유도한다 (참조 도 2a).
상기 바람직한 구현예에서, BL21(DE3) 배양물이 용해될 수 있으며, 용해물은 제조되어 금속 이온-충전 수지를 통과할 수 있다. 상기 용해물은 Ni-충전 IMAC 수지를 통과할 수 있으며, 여기서 베타' (opt) 서브유닛 상의 His-6 태그는 수지 상의 고정화된 니켈 이온에 결합할 수 있다. 상기 구현예에서, 비결합 및 비특이적 결합 단백질은 5mM 이미다졸의 첨가에 의해 추가적으로 제거될 수 있는 반면, 베타' (opt) 서브유닛은 수지에 결합된 채로 남아있다.
그 다음, 나머지 Gst RNAP 서브유닛의 발현 및 분리가 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 나머지 Gst RNAP 서브유닛에 대한 단백질 발현 균주의 결합된 용해물이 제조되어 대략 2-3 시간 동안 베타'(opt)-로딩된 수지를 사용하여 배양될 수 있다. 비결합 및 비특이적 결합 단백질은 다시 5mM 이미다졸을 첨가하여 제거될 수 있다. 발현된 서브유닛은 베타' (opt) 서브유닛을 통해 수지에 결합된 RNAP 복합체를 형성하도록 조립될 수 있고, 조립된 Gst RNAP는 이후 300 mM 이미다졸을 첨가하거나 또는 기타 공지된 방법에 의해 용리될 수 있다. Gst RNAP의 조립은 SDS-PAGE에 의해 입증될 수 있으며. 추후 사용을 위해 -20℃에서 10mg/ml 농도로 시험관 내 전사/번역 상용의 완충 조건에서 추가로 저장될 수 있다. 또한, Gst RNAP 복합체의 조립 및 기능을 검증하기 위해 단백질 활성 분석을 수행할 수 있다. mRNA 전사물의 존재는 성공적인 Gst RNAP 분리 및 조립을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 25 μl 분석이 수행될 수 있으며, 다음을 포함한다:
- 각 4 mM 리보뉴클레이스 트라이포스페이트 (rNTP);
- 250 ng DNA;
- 2 μl Gst RNAP;
- 20 U RNase 억제제; 및
- 5 μl 5x 반응 완충제
실시예 2: Gst AdK / TagPPK 분리 및 정제.
본 발명자들은 Gst AdK 및 TaqPPK의 분리 및 정제를 입증하였으며, 정제된 단백질은 하기 기재된 바와 같이 추후 분석에서 사용되었다. 구체적으로, Gst AdK 및 TaqPPK는 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 발현 및 분리되었다. 도 7을 참조하면, 정제된, 재조합 단백질은 4-20% SDS PAGE 상에서 분석되었다. 겔은 쿠마시 염료로 염색된다.
구체적으로, 정제된 단백질의 분취량을 SDS PAGE 상에서 순도 및 정확한 크키에 대해 분석하였다. 앞서 시험-정제된 PPK 단백질 (PPK)을 재조합 TaqPPK (PPK 분획 1-3)의 로트 정제를 위한 추가적인 크기 마커로서 사용하였다. 정제 컬럼으로부터 용리된 모든 분획은 순수한 것으로 입증되었으며 정확한 크기가 약 74 kDa임을 나타낸다. 정제된 Gst AdK는 오염 단백질을 가지지 않으며 정확한 크기가 약 25 kDa이다.
실시예 3: 결합된 AdK / PPK ATP 에너지 재생.
본 발명자들 시판된 ATP 결정 분석을 통해 본 발명의 결합된 AdK/PPKATP 재생 능력을 입증하였다. 본 발명에서, 본 발명자들은 Life technologies의, D-루시페린, A22066를 사용하여 ATP 재생에서 Gst AdK 및/또는 PPK 단백질(상기 구현예에서, E. coli으로부터 유래)의 기능성을 검증하였다.
상기 구현예에서, 표준 200 μl 분석 성분 이외에도, 다음의 물질을 분석에 첨가하였으며, 결과는 도 4-6에 제공된다.
i) 10 μM ATP
ii) 5 μl Gst AdK
iii) 5 μl E. coli 유래의 PPK (단지 예시적)
iv) 50 μl 폴리포스페이트 (1 mg/ml 저장 용액)
도 4-6에서 입증된 바와 같이, 이러한 데이터는 일반적으로 본 발명의 AdK/PPK-PPi ATP 에너지 재생 시스템의 향상된 ATP 재생 능력, ATP 단독, 뿐만 아니라 기존의 PEP/PK 에너지 보충에 대한 개선을 입증한다. 구체적으로, 데이터는 명확하게 분리된다: 최저: ATP, 중간 PEP/PK, 및 최고: AdK/PPK-PPi
실시예 4: 가변적인 폴리포스페이트 농도에서의 AdK / PPK 에너지 재생
본 발명자들의 입증된 결합된 Gst AdK/TaqPPK 에너지 재생은 시판된 ATP 결정 분석을 통해 가변적인 폴리포스페이트 농도에서 달성될 수 있다. 구체적으로, 표준 반응 설정은 첨가된 PPi의 양에서 달라졌다. 루시페레이스 신호 (RLU)는 시간 (분)에 걸쳐 측정되었다.
도 8에서 입증된 바와 같이, 반응 평형을 유지하는 하나의 농도 범위는 대략 0.2-2 mg/ml PPi으로 측정되었다. 기타 농도 범위는 반응 평형을 유지하도록 측정되었다. 구체적으로, 이러한 범위는 0.1-4 mg/ml PPi, 및/또는 0.5- 0.6 mg/ml, 및/또는 0.1-7 mg/ml으로 측정되었다. 도 8에서 입증된 바와 같이, 일부 추가적인 ATP 재생이 기능적 범위 내에서 발견되었으며, 이는 대략 0-48 mg/ml 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구현예에서, 100μl 루시페레이스 분석에 대한 표준 반응 설정은 다음을 포함할 수 있다:
표준 최종 농도
20x 완충제 5 1x
100 mM DTT 1 1 mM DTT
3 mg/mL D-루시페린 5 150 μg/ml 루시페린
5 mg/mL 루시페레이스 0.2 10 mg/ml 루시페레이스
25 mM AMP 10 2.5 mM AMP
0.34 mg/ml TaqPPK 67 228 μg/ml PPK
13 mg/ml Gst AdK 0.2 .226 mg/ml AdK
100 mg/ml 소듐 폴리포스페이트 0.5 0.5 mg/ml
dH2O 11.1
전체 100
또한, 도 8에서 입증된 바와 같이, ATP 재생은 5 시간 이상 지속되었으며,이 시점에서 측정이 중단되었다. 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 더 높거나, 더 낮은 PPi 주입이 Gst AdK/TaqPPK의 안정적인 반응 주기를 방해할 수 있고, 기능을 할 때, 최고 수준의 연속 에너지 재생을 초래하지 않음을 입증한다. 물론 이러한 범위는 근사치이며 제한되지 않는다.
실시예 5: AMP/ PPi으로부터 분리된( decoupled ) AdK / PPK ATP 에너지 재생
본 발명자들은 Gst AdK/TaqPPK 시스템이 공급원으로서 저렴한 재료, 예컨대 PPi 및 AMP로부터 에너지 (ATP)를 생성할 수 있음을 입증하였다. 상기 신규의 ATP 재생 시스템을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자는 루시페레이스 분석으로부터 Gst AdK/TaqPPK의 반응을 분리시켰다. 구체적으로, 본 발명자들은 먼저 정제된Gst AdK 및 TaqPPK ATP 단백질을 사용하여 AMP/PPi로부터 ATP를 생성하고, 반응을 정제하고, 루시페레이스 분석을 수행하기 위해 샘플을 사용하였다 - 상기 분석은 전술한 바와 같이, 빛을 방출하기 위해 ATP를 필요로 한다.
도 9에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 오직 모든 반응 성분을 가지는 표준 설정만이 루시페레이스 발광 반응에 충분한 ATP를 제공하는 것을 증명한다. 개별 화합물/효소 또는 이의 조합을 가지지 않는 대조군은, 성공적인 루시페레이스 반응에 ATP를 제공하지 않았다. ATP 에너지가 상기 분석에서 재생되지 않음에 따라, 루시페레이스 신호는 시간에 따라 약해지며, 약 7분 후에는 거의 백그라운드에 도달하였고, 이전에 생성된 모든 ATP가 소진되었다.
실시예 6: AMP/ PPi으로부터의 ATP 에너지 생성 및 Gst AdK / TaqPPK에 의한 이의 재생
본 발명자들은 AMP 및 PPI으로부터 ATP 에너지의 생성 및 Gst AdK/TaqPPK 에너지 재생 시스템 중 최소 하나의 구현예를 통한 ATP 재생을 입증하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 루시페레이스 분석을 수행하여, 보통 요구되는 ATP를 AMP로 대체하고, 에너지 재생 시스템 성분, (즉, Gst AdK, TaqPPK, 및 PPi)을 첨가하였다. 대조 실험에서, 본 발명자들은 각 성분 및 이의 조합을 생략하였다.
Gst AdK/TaqPPK ATP 에너지 재생 시스템의 반응식은, 발광을 위한 ATP-사용의 루시페레이스 반응의 맥락에서, 일반적으로 도 10에 설명되어 있다. 제1 단계에서, ADP는 공급원으로서 AMP 및 PPI를 사용하여 PPK에 의한 불가역적 반응에서 생성된다. ADP는 PPK 및 AdK에 의해 ATP로 전환될 수 있고, PPK 및 AdK 둘 모두는 가역적 반응에서 AMP, ADP 및 ATP의 양을 균형있게 유지한다. ATP는 이후 루시페레이스에 의해 사용되어 루시페린을 전환시키고 빛을 방출한다.
도 11에 도시된 바와 같이, 표준 에너지 재생 시스템 성분은 발광 반응을 지지하기에 충분한 ATP가 생성된 후 루시페레이스 신호 (RLU)가 증가하는 것을 보여주었다. 신호는 시간에 걸쳐 증가하여 약 7시간 후 최대에 도달하였다. 에너지 재생 시스템을 가지지 않는 대조군 반응은 임의의 RLU를 나타내지 않는다. 이와 같이, 본 발명자는 기질 공급원으로서 저렴한 폴리포스페이트 및 AMP로부터 에너지 (ATP)를 생성하는 결합된, 또는 상승적인 Gst AdK 및 TaqPPK 효소임을 입증한다. 본 발명자들은 발광 반응을 대략 20 시간 동안 측정할 수 있었으며 (도시되지 않음), 이는 또한 이의 신규의 시스템으로부터 강력한 에너지 재생이 가능함을 입증하였다.
실시예 7: 무세포 추출물 제조
정의된 바와 같이, 유전자 변형 유기체 미첨가 (GMO-free), 정제된 대두 펩톤 및 동물성 원료 미첨가 (ASM-free) 카제인 트립톤에 기초한, 비독성의, 무해한 배지가 유전자 변형 지오바실러스 균주의 발효를 위해 본 발명자들에 의해 개발되었다. 상기 배지는 유전자 변형 지오바실러스 균주의 생산적인 발효를 위해 잠재적으로 독성의 금속 염 또는 금속 이온 킬레이트제, (예로서, 나이트릴 트라이-아세트산, 등)의 첨가를 필요로 하지 않는다. 발효 온도 범위는 대략 52-55℃에서 안정하게 유지될 수 있지만, 보다 고온의 범위가 또한 고려되며 가능하다. 배양은 대략 pH 7.2-7.6에서 유지될 수 있지만, 보다 높은 pH 범위가 또한 고려되며 가능하다. 필요에 따라 10 mM의 HEPES 완충액이 첨가될 수 있다. 필요에 따라 비독성의, 실리콘 기반의 소포제가 제어된 발효 과정을 위해 첨가될 수 있다.
리보솜 RNA (rRNA)는 발효 과정 중 상이한 단계에서 성장하는 배양물로부터 분리되며, 이의 농도는 배양 단위당 리보솜 농도의 척도로서 측정되었다. rRNA의 최대 농도는 새로운 배지에서 6-7 시간 이후 관찰되었다. 일부 구현예에서, 배양물은 여러 단계로 성장하면서 부피가 증가할 수 있고, 최종 7.5 L일 수 있다. 배양물을 OD600 0.5으로 접종하고 6-8 시간 동안 성장시켜 52-55℃및 pH 7.2-7.6에서 최종 OD600 2.5-2.8으로 성장시켰다.
용해물은 수집된 세척 세포 (3x)로부터 -80℃에서 밤새 단일 동결/해동 주기 이후 제조된다. 동결/해동 주기 이후, 세포는 RNase 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 HEPES 완충 식염수 완충액에 재현탁되고 (세포 대 완충제 비율은 1.25:1) 2-4℃에서 5 분 미만으로 입증된 프로토콜을 사용하여 초음파에 의해 분쇄된다 (10 초 “켜짐”, 30 초 “꺼짐” 주기). 사용된 용해 완충제인 CF-L1은, 비독성이며 무해하다. 미립자는 원심분리 (12,000 g, 4℃, 10 분)에 의해 용해물로부터 제거되고, 반응 완충제 CF-1와 조성이 유사하지만, 20% v/v 글리세롤을 포함하고 단백질 분해효소 억제제를 포함하지 않는 비독성의 저장 완충제, CF-St에 대해 투석된다. 추출물을 더욱 명확하게 하기 위한 30 분의 런 오프(run-off) 반응 (250 rpm 및 30℃의 밀봉된 튜브에서 진탕) 및 추가적인 원심분리 (동일한 조건)는 보통 요구되지 않는다. 잠재적 생존 박테리아 및/또는 박테리아 및 진균 오염은 용해물 및 펠릿화된 파편의 샘플을 mLB/CS-배지, NB, ISP2, 혈액-뇌 아가의 아가 플레이트에 도말하고 30℃ 및 55℃에서 이틀간 배앙하여 측정한다. 세포 분쇄율은 일정하게 99.95% 이상 (200 μL의 재현탁된 파편 당 <1의 생존 및 용해물 mL당 <1 콜로니 형성 단위 (CFU))이다. 하나의 구현예에서, 7.5 L 발효기의 가공은 대략 30 ml의 추출물을 생성할 수 있다. 물론, 작동자의 요구 및/또는 필요에 기초하여, 이러한 양/부피는 그에 따라 규모를 확대 및/또는 축소될 수 있다.
세척된 용해물 중 전체 RNA 추출물은 리보솜 농도를 결정하도록 사용될 수 있다. 용해물의 전체 단백질 농도는 UV/Vis 분광법에 의해 측정되며, 일정하게 150-160 mg/mL의 범위이다. 용해물의 분취량은 -80℃에서 저장되고, Cas9-sfGFP 구조체의 추출물의 안정성 (침전 없음) 및 일관된 시험관 내 전사/번역 속도를 측정함으로써 (UV/Vis 흡수 및 형광 측정에 의해 결정) 입증되는 바와 같이, 6 개월 이상 동안 안정할 수 있다. 용해물 및 시험관 내 전사/번역 반응은 대략 pH 7.8-8.0 범위로 유지될 수 있다. CF 반응 조건에 대한 염 농도는 가변적일 수 있다. 각각의 용해물 배치는 Cas9-sfGFP 선형 구조체 (일관된 접힘을 가지는 더 큰 단백질의 생성) 및 루시페레이스 구조체 (효소 활성)의 시험관 내 전사/번역 활성에 의해 평가될 수 있다.
실시예 8: 유전자 변형 지오바실러스 균주를 사용하여 생성된 무세포 추출물
전술한 바와 같이, 본 발명자는 (지오바실러스으로부터의) 시그마 인자 RpoD의 과발현이 E. coli 및 지오바실러스의 박테리아 배양에서 박테리아 RNA 중합효소 (RNAP)를 상향 조절하는 것을 발견하였다. 재조합 유전자 구조체는 지오바실리에서 조작된 버전인 RpoDx를 구성적으로 발현시키도록 생성되었다. 유전자 구조체의 기능적 신뢰성 및 단백질 발현 수준을 측정하였고, 동일한 지오바실러스 균주로 형질전환된sfGFP 구조체를 사용하여 모니터링하고, 제조된 용해물의 510 nm 형광 판독으로 모니터링한다.
본 발명자들은 시험관 내 전사를 위해 박테리아 RNAP와 함께 RhIII 프로모터를 추가적으로 사용하였다. 보다 엄격한 RpoD/프로모터 인식을 위해 재조합 변형된 RhIII 프로모터가 일부 구현예에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, T7 RNAP 중합효소가 CF 반응에 첨가되는 경우, T7 프로모터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 T7로부터 천연의 RNAP와 비교하여 하나 이상의 단일 점 돌연변이를 가지는 독점적 유전자 변형 T7 RNAP (T7x)가 사용될 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 이중 가닥 DNA의 용융을 더 빠르게 하고 RNAP와 단일 가닥 주형 DNA의 복합체 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 구현예에서, T7x는 상용의 T7-RNAP와 비교하여 현저하게 적은 불완전한 전사물을 유발하고 일정하게 더 높은 mRNA 농도를 생성할 수 있다. 본 발명자들은 두 RNAP 모두 최대 45,000 염기 길이의 구조체에 대해 재현성 및 예측 가능한 결과로 신뢰성 있게 수행하는 것을 입증하였다.
실시예 9: 시험관 내 무세포 발현 시스템 가지는 신규의 ATP 에너지 재생 시스템.
상술한 바와 같이, 본 발명은, 특정 구현예에서, 세포 에너지원인, ATP가 이중 효소 시스템을 사용하여 무기 폴리포스페이트로부터 재생되는 무세포 발현 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템에 대한 하나의 효소는, E. coli로부터 클로닝 및 생성된 상동체 효소 (ecPPK 또는 PPK)에 대해 폴리포스페이트 가수분해 활성이 관찰되었음을 입증한 후 써모필러스 아쿠아티쿠스 (TaqPPK)로부터 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (PPK)를 사용하여 개발되었다. 보고된 PPK 활성 이외에도, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)으로부터 분리되어, TaqPPK 및 ecPPK는 바람직하게 AMP및 가수분해된 무기 폴리포스페이트 (iPPi)로부터 ADP를 생성한다. 제2 효소 단계에서, 두 분자의 ADP는 열안정성 아데노신 키네이스 (AdK)에 의해 재배열되어 하나의 단위의 ATP 및 AMP를 형성한다.
상기 시스템은 최소 32 시간 동안 효과적으로 작동할 수 있는 것으로 증명되었으며, 이는 10 nM AMP, 150 μg/ml 루시페린, 1 mg/ml iPPi 및 촉매량의 효소의 용액에 루시페레이스를 첨가한 후 루시페린의 발광을 측정하여 결정되었다. 전체 효소 전환수는 최소 300 쌍의 Gst AdK/TaqPPK에 대해 결정되었다. 상기 효소 루프는 최소 72 시간 및 최대 최소 1 주 이상 활성을 유지할 수 있다. 하나의 구현예에서, 공급 용액 내 ATP 농도는 안정한 1.5 mM ATP로 유지될 수 있다. 본 발명자들은 TaqPPK가 최대 전체 전환수가 대략 3,000일 수 있으며, 따라서 본 발명의 무세포 발현 시스템에서 TaqPPK의 단백질 농도를 더욱 감소시킬 수 있음을 추가로 입증하였다. 파이로포스페이트를 무세포반응에 축적시켜 피드백을 억제할 수 있는 폴리포스페이트의 무작위 가수분해를 방지 또는 최소화하여, 바람직한 수준의 ATP를 생성/유지할 수 있다.
현재의 E. coli 기반의 무세포 시스템은 주된 에너지 재생 시스템으로서 주로 크레아틴 포스페이트/크레아틴 키네이스 또는 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트 키네이스 (PK)에 의존하지만, PK는 전체 전환수가 낮은 한자리 수이며, 부산물 피루베이트는 번역 반응의 억제제임인 것이 밝혀졌음에 따라, 이러한 신규의 에너지 재생 특성이 중요하다. 이러한 방식으로, 본 발명은 기존의 무세포 발현 시스템으로부터 벗어날 뿐만 아니라, 사실상, 기술 분야 내 공지된 기존의 무세포 발현 시스템의 입증가능한 개선을 나타낸다.
본 발명자의 무세포 발현 시스템의 산화환원 전위는 소르비톨-탈수소효소 (Sorbitol-dehydrogenase, SDH)에 의해 안정화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 SDH는 열안정성 (tSDH)일 수 있다(이러한 t 표기는 본 명세서에 참조된 다른 분자에도 일반적으로 적용 가능). 정제된 단백질 샘플로 NADH에 대한 340 nm 흡수를 사용하는 효소 분석은 소르비톨 및 NAD/NAD(P)으로부터 프럭토스 및 NADH/NAD(P)H으로의 정방향 전환이 역반응과 비교하여 8배 빠른 것을 입증하였다. 본 발명자들은 지오바실러스 스테아써모필러스로부터의 이러한 유전자 변형 열안정성 효소를 클로닝 및 생산하였으며, 이는 또한 본 명세서에 전술한 바와 같이 발현을 위한 E. coli 로 최적화되어 (Gst SDH), 200 mM 소르비톨과 함께 공급 용액에 첨가될 수 있다. 반응 생성물은 또한 해당과정을 통해 추가적인 에너지 공급원을 제공하며 반응 혼합물에 축적되지 않는다.
특정 구현예에서, 무세포 발현 시스템은 용기 내에서 연속 교환 및 균질 반응 조건을 보장하기 위해 무세포 반응 부피에 대해 5 ml의 초기 부피, 및 공급 용액에 대해서는80 ml의 초기 부피를 포함할 수 있다. 반응 부피가 0.5 ml 내지 2 리터 이상인 무세포 발현 시스템이 추가적으로 고려될 수 있다.
실시예 10: 무세포 발현 시스템 반응 설정
하나의 구현예에서, CF 시스템은 공급 및 반응 구획에서 TRIS-아세테이트 완충제 (CF-1)를 사용하여 pH 7.9-8.0 범위로 조정 및 안정화될 수 있다. 반응 용기 내 용해물의 최종 농도는 100-110 mg/ml 전체 단백질일 수 있지만, 주형 DNA가 (대안적으로 사전 실행의 RNA/RNAP 반응으로서 또한 함께) 보조 인자, 아미노산 및 뉴클레오타이드와 함께 용해물에 첨가된다. 공급 용액은 동일한 농도의 뉴클레오타이드 및 모든 천연 아미노산을 포함한다. 보조 인자, 소르비톨 및 상기 언급된 효소가 또한 첨가된다. 상세한 재료 목록이 하기 제공되며 일반적으로 무세포 반응 성분로서 지칭될 수 있다. 또한, 이중-효소 ATP 재생 시스템의 일반적인 성분이 포함될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 이러한 성분은 일정량의 Gst AdK, 일정량의 TaqPPK, 및/또는 일정량의 PPi, 및/또는 일정량의 AMP를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적인 구현예는 일정량의 Gst SDH 및 소르비톨을 포함할 수 있다.
상기 예시적인 무세포 반응은 대략 35-37℃C의 배양기에서 진행될 수 있으며, 반응기는 대략 ~300 rpm에서 16 시간 동안 교반된다. 특정 구현예에서, 결합된 시험관 내 전사/번역 반응의 이러한 반응 설정 또는 반응 혼합물은 3일 초과 동안 표적 단백질을 생성하기에 적합할 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명의 무세포 발현 시스템은 36 시간 초과 동안 단백질을 생성하기 위한 안정성을 제공할 수 있다.
하나의 특정 구현예에서, 무세포 반응 성분은 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다:
- 아미노산
- 폴리포스페이트
- Tris-아세테이트
- Mg(OAc)2
- K+-글루타메이트
- 아미노-아세테이트
- NaCl
- KCl
- MgCl2
- DTT
- 옥틸-b-글리코사이드
- NAD (시스템에서 NADH로 전환)
- NADP (시스템에서 NADPH로 전환)
- 소르비톨
- FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생)
- ATP
- 각각의 GTP, UTP, CTP
- CoA
- PLP
- SAM
하나의 특정 구현예에서, 무세포 반응 성분 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다:
- 2 mM의 각각의 천연 아미노산
- 1 mg/ml 폴리포스페이트
- 5 mM Tris-아세테이트
- 4 mM Mg(OAc)2
- 12 mM K+-글루타메이트
- 1 mM 아미노-아세테이트
- 100 mM NaCl
- 10 mM KCl
- 5 mM MgCl2
- 0.1 mM DTT
- 0.2% 옥틸-b-글리코사이드
- 0.8 mM NAD (시스템에서 NADH로 전환)
- 0.4 mM NADP (시스템에서 NADPH로 전환)
- 200 mM 소르비톨
- 0.5 mM FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생)
- 1.5 mM ATP
- 1 mM의 각각의 GTP, UTP, CTP
- 1 mM CoA
- 2 mM PLP
- 0.2 mM SAM
임의의 무세포 반응 성분의 모든 양, 농도, 부피 및 비율은, 반응 부피, 지속 시간, 또는 생성되는 발현 생성물, 및 기타 변수에 기초하여 변할 수 있음에 따라 오직 예시적일 뿐이다. 무세포 반응 성분은 세포 추출물에 의해 제공되거나, 또는 세포 추출물에 첨가되는지의 여부와 관계없이 전사/번역 메커니즘에 필수적인 모든 기타 성분, 아미노산, 뉴클레오타이드, 에너지를 제공하며 합성에 필수적인 대사 성분을 추가로 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 무세포 반응 성분은 사용될 수 있는 박테리아, 조류, 미세조류 고세균, 진균류 및/또는 후벽균의 균주에 대한 특이적인 일정량의 tRNA를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 구현예에서, 상기 기재된, 천연 지오바실러스tRNA가 첨가될 수 있다. 또한, 무세포 반응 성분은 희귀 코돈으로 인한 번역 중단을 극복할 수 있는 일정량의 tRNA를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, E. coli Mre600 으로부터의 tRNA가 무세포 반응에 포함되어 희귀 코돈으로 인한 번역 중단을 극복할 수 있다.
실시예 11: 시험관 내 무세포 발현에 의한 클로리스리듐 테타니 ( Clostridium tetani ) E88 텐톡실리신(Tentoxilysin)의 고효율 생성
본 발명자들은 입증, 예시적인 구현예로서, 본 발명의 무세포 발현 시스템의 최소 하나의 구현예를 사용하는 텐톡실리신 (파상풍 신경독소)의 시험관 내 발현이 일반적으로 본 명세서에 기재된 결합된 Gst AdK/TaqPPK ATP 에너지 재생을 사용하는 것을 입증한다.
텐톡실리신 (TetNT)은 150 kDa 단일 사슬 프로토 단백질로서 자연적으로 생성된다. TetNT는 엔도펩티데이스(endopeptidase)모티프, M232HELIHVL239에서 Zn2 + 양이온과 배위결합하여, A457과 S458 사이 전장 폴리펩타이드의 단백질 분해 절단을 가능하게 한다. 두 시스테인 잔기 (C439 및 C467)의 선택적 산화는 두 사슬 사이에 다이설파이드 가교를 형성하고 단쇄, M1-A457, 및 장쇄, S458-A1319와 일치하는 활성 파상풍 독소 단백질 복합체를 형성하게 한다. 이러한 단백질은 이후 Cl. tetani 과의 자연 생성 균주에 의해 선택적으로 수출된다.
TetNT는 내재화(internalizing) Zn2 +-의존적 엔도펩티데이스이며, 이는 독소/강글리오사이드 수용체 복합체 형성을 통해 Gln76 및 Phe77 사이의 시냅토브레빈-2를 가수분해한다. 시냅스 소포에서 시냅토브레빈-2 수용체를 가수분해하면 억제 신경전달물질 감마-아미노뷰티르산 (GABA)이 시냅스 간극 내로 방출되는 것을 방지한다. 이것은 궁극적으로 파상풍(Tetanus)으로 기재되는 환자의 뻣뻣한 근육 경련 이외에도 기타 증상을 유발한다. tetX 유전자는 Cl. tetani E88 게놈에 위치하였으며 사전에 E. coli 단백질 발현 플라스미드 CTC_p60에서 추가로 인코딩되었다. 유전자 산물은 단백질 활성을 확인하고 고분해능 구조 단백질 연구를 수행하기 위해 사전에 이종성 단백질로서 클로닝 및 발현되었다. TetNT의 잠재적인 N-아세틸-b-뉴라민산 변형 활성은 이미 기재되어 있으며 또한 기술 분야 내에 공지되어 있다.
FDA 규정에 따르면, 인간 백신 접종에 적합한 현재 tetX 톡소이드는 활성 Cl. tetani 배양물로부터 유래한다. 완전히 접혀 수출된 독소는 알루미늄 설페이트 및 암모늄 설페이트의 첨가로 인한 응집에 의해 활성 배양물로부터 제거된다. 추출된 독소는 이후 폼알데하이드의 첨가에 의해 불활성화되어 백신 접종에 적합한 톡소이드를 수득한다. FDA는 SDS-PAGE, FPLC 또는 HPLC 프로파일 및 정제의 형태로 품질 관리 조치를 제안하며, 현재 요구되는 것은 아니다.
현재 기술 분야 내 공지되어 있는 확립된 분리 및 제조 프로토콜은 위험을 수반한다. FDA는 7세 이상의 어린이, 및 성인에게만 파상풍 백신 접종을 권장하기 때문에, 이러한 위험은 당국에 의해 인정된다. 백신 접종은 5%의 Cl. tetani 감염 위험을 수반한다. Tet 톡소이드의 발효 기반의 생산에 있어서 가장 큰 어려움은 독소의 완전환 비활성화를 보장하기 위해 폼알데하이드의 농도를 제어하고, 최종 제품 내 톡소이드 농도를 제어하여 모든 백신 접종의 40%를 비효과적으로 만드는 것이다.
예시적인 구현예로서, 발효 과정을 본 발명의 시험관 내 전사/번역 기반의 생산 방법으로 대체함으로써 이러한 어려움 및 생산 제한이 해결될 수 있다. 포자 및 임의의 기타 콜로니 형성자의 전이(carry-over)는 존재하지 않으며 활성 약제학적 성분 (API)의 완전한 무균성을 보장한다. 전체 단백질 농도는 전체 과정 동안 모니터링 되고, 최종 제품은 표준 실험실 방법에 의해 제어될 수 있다.
본 발명자들은 TetNT 발현을 위한 유전자 구조체를 생성하였다. 상기 구현예에서, 유전자 구조체는 유전자 합성을 위해, 구체적으로, 선형 PCR 주형으로서 시험관 내 전사/번역, 또는 무세포 발현 반응에 공급되도록 설계되었다. 본 발명의 무세포 발현 시스템의 선형 DNA의 사용은, 재조합, 복제 또는 형질감염이 불가능하여, 일부 바람직한 구현예에서 전달될 수 없으므로 바람직할 수 있다. 선형 유전자 구조체는 다음의 기본적인 구성을 포함한다: ((프로모터)-(RBS) - (시작)(발현 생성물 절단 부위-검출 태그 + 정제 태그)(정지). 하나의 특정 구현예에서, 이러한 구성은 다음을 포함할 수 있다: (프로모터)-(RBS) - (시작)(TetNTTEV mCherry H6)(정지).
상기 구현예에서, 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: RhIII 프로모터 서열 (서열 번호 18), 또는 대안적으로 T7 프로모터 서열 (서열 번호 19). RBS (리보솜 결합 부위)는 지오바실러스 서열 (서열 번호 20)과 일치하는 T7 유전자 파지로부터 유래할 수 있다 (물론 다수의 프로모터가 이러한 예시적인 실시예와 별개로 사용될 수 있다). 재조합 TetNT 유전자는 서열 번호 21을 포함할 수 있다. 상기 재조합 TetNT 유전자에서, 정지 서열이 제거된다. 마지막으로, TEV부위, mCherry, His6는 서열 번호 22를 포함할 수 있으며, 또한, 정지 서열은 mCherry로부터 제거된다. 유전자 구조체는 개별 서열로서 제공되면서, 일반적으로 기재된 DNA의 단일 선형 PCR 단편으로서 존재할 수 있음에 유의해야 한다.
상기 경우에, 안전성 및 보안 문제로 인해, 전장 파상풍 독소에 대한 DNA 코딩, 바람직한 구현예에서, 유전자 합성은 두 개의 별도의 원형 구조체로서 진행될 수 있으며, 증폭을 위해 실험실에서 단일 플라스미드로 재조합될 것이다. 예를 들어, 제1 구조체는 자동촉매 단백질 분해효소 부위 (서열 번호 13) 및 다이설파이드 가교 형성 시스테인을 가지는 TetNT 경쇄 (서열 번호 12)를 코딩한다. 제2 구조체는 부분적으로 통합된 TEV 부위 (서열 번호 15) 및 mCherry-His6 (서열 번호 16)을 포함하는 TetNT 중쇄 (서열 번호 14)를 코딩할 것이다. 재조합 단백질이 개별 유전자 구조체 및 아미노산 서열로 나타나지만, 이러한 서열은, 폴리뉴클레오타이드 서열에 상응할 수 있는 PCR 증폭된 선형 DNA 구조체로서, 궁극적으로 단일 선형 폴리펩타이드 (서열 번호 17)를 생성할 수 있는 단일 구조체의 일부일 수 있다. 추가적인 구현예는 단일 선형 폴리펩타이드를 형성할 수 있는 개별 구조체를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 상기 기재된 이중 효소 ATP 재생 시스템을 추가로 사용하여 무세포 단백질 합성에 의한 전장 150 kDa 독소전구물질(pro-toxin)의 발현을 입증하였다. 상기 특정 구현예에서, 무세포 단백질 합성에 의한 전장 150 kDa 독소전구물질의 발현은 기재된 조건에 따라 5 ml의 반응기에서 일어날 수 있다. 반응 진행은 여기 파장이 587nm이며, 적색 편이(red-shifted) 형광으로 태그된 mCherry의 일광 형광에 의해 모니터링될 수 있다. 단백질 농도의 증가가 더 이상 관찰되지 않은 이후, 반응 용기의 내용물은 50 ml 반응 튜브로 옮겨질 것이다. 반응 시간 및 달성되는 단백질 농도는 연속적으로 측정될 수 있다.
락토스, 200 mM NaCl, 1 mM DTT를 포함하는 pH 8.0의 10 mM HEPES 완충액을 반응 혼합물에 첨가하여 10배 희석할 수 있다. 1-2 mL의 Ni-IDA 수지가 상기 용액에 첨가되고, 대략 20-25℃에서 제한된 교반으로 1시간 동안 배양될 것이다. 상기 수지의 결합 능력은 최대 60 mg의 His6-태그된 단백질에 충분할 수 있다. His6-태그된 독소전구물질이 수지에 결합된 후, 수지는 수집되고, 상청액 세척 완충제가 제거될 것이다. 형광은 TetNT 독소전구물질이 상청액에 존재하지 않음을 즉시 확인할 것이다.
수집된 단백질-충전된 수지는 락토스, 200 mM NaCl를 포함하는 pH 8.0의 HEPES 완충액 50 ml로 세척하고, 환원제는 사용하지 않고 주위 온도에서 배양할 수 있다. 환원제의 부재하에, 다양한 시간 동안, 다양한 농도의 O2 (2%부터 대기)에 노출하에, 자발적인 접힙/재접힘, 천연의 다이설파이드 가교의 산화 형성이, TetNT의 장쇄 내부 및 TetNT의 장쇄와 단쇄 사이에서 개시될 것이다.
접힘/재접힘 이후, ZnCl2는 2 mM의 최종 농도로 단백질 용액에 첨가될 수 있다. 이는 수지-흡수된 TetNT의 장쇄와 단쇄 사이의 펩타이드 결합을 절단하기 위한 내부 자가단백질 분해 활성을 활성화한다. 초기에 20-25℃에서 대략 2 시간의 배양 시간이 사용될 수 있다. 이 시점까지는, mCherry 및 His6-태그로 조작된 변형이 자연적인 표적의 인식 및 결합 부위에 대한 입체 장애로 인해 이의 활성을 방지할 것임에 따라, 독소는 비활성이다. 게다가, 비드 크기의 수지는 전체 입자 크기를 현저하게 증가시키고 단백질이 에어로졸화되거나 흡수되는 위험을 감소시킨다. mCherry 형광을 쉽게 감지하게 되면, 단백질을 추적하고, 이러한 단계에서 잠재적으로 독성이 있는 물질의 원하지 않는 노출 또는 의도하지 않은 처리를 방지할 수 있다. 완충제는 다이설파이드 가교를 형성하지 않은 불완전하게 접힌 모든 독소 단편을 제거하고, 용액으로부터 과량의 ZnCl2를 제거하도록 교환될 수 있다.
정제된 His6-태그된 TEV 단백질 분해효소는 반응 혼합물에 첨가될 수 있고, 샘플은 대략 20-25℃에서 수 시간 동안 배양된다. TEV 단백질 분해효소는 또한 수지에 흡착될 수 있고 결합된 상태를 유지하는 반면, 활성화된 파상풍 독소는 TEV 단백질 분해효소 부위를 절단하여 수지로부터 방출된다. 상기 과정은 mCherry의 누락된 N-말단과 결과적인 형광 단백질의 부분적인 전개가 중첩하는 TEV 부위의 절단으로 인한 mCherry 형광의 ?칭에 의해 모니터링될 수 있다. 형광이 검출되지 않으면, 전개된 mCherry-His6 및 TEV-His6 단백질 분해효소로 여전히 충전되어 있는 수지는 수집되고, 상청액은 멸균되고 바람직한 완충제에서 오직 순수한 TetNT만을 포함해야 한다.
상청액은 본 발명자들에 의해 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석에서 정확한 단백질 접힘을 확인하기 위해 독점적 항-Tet Fab로 시험할 수 있고, 샘플의 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE 및 FPLC 프로파일로 시험할 수 있다. 단백질 농도가 결정된 후, 요구되는 양의 폼알데하이드가 첨가되어 비활성화된 톡소이드를 수득할 수 있다. 최종 샘플에서 정확하게 접힌 활성 단백질의 정도를 확인하여 유효량을 결정하기 위한 동물 분석이 추가로 수행될 수 있다. 물론, 상기 기재된 바와 같은, 상기 프로토콜은 본질적으로 예시적인 것이다. 당업자는 기타 클로스트리디아(Clostridia)와 유사한 단백질, 뿐만 아니라 기타 해당 단백질을 생성하기 위해 과도한 실험을 하지 않고, 이러한 프로토콜이 유사하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
참조 문헌:
다음의 참조 문헌은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다:
[1] Carlson, Erik D. et al. “Cell-Free Protein Synthesis: Applications Come of Age.”Biotechnology advances 30.5 (2012): 1185-1194. PMC. Web. 1 Jan. 2018.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 참조로 포함된다. 경우에 따라, 아미노산에 대한 단일 문자 명칭이 본 명세서에서 제공되는 반면, 3 문자 명칭은 전자제출된 형식으로 제공되었다. 미국 가출원 번호 62/440,975에 개시된 모든 이전 서열 데이터는 본 명세서에 참조로 포함된다.
표 1: 서열 목록
서열 번호 1
SGSSMIEIEKPKIETVELSEDAKYGKFVVEPLERGYGTTLGNSLRRILLSSLPGAAVTSVQIDGVLHEFSTIDGVVEDVTAIILNIKKLALKIYSDEEKTLEIDVQGEGVVTAADITHDSDVEILNPDLHIATLAEGGRLRMRMTAKRGRGYVPAEANKREDQPIGVIPIDSIYTPVSRVSYQVENTRVGQVTDYDKLTIDVWTDGSIGPKEAISLGAKILTEHLNIFVGLTDEAQNAEIMVEKEDDQKEKVLEMTIEELDLSVRSYNCLKRAGINTVQELTQKTEEDMMKVRNLGRKSLEEVKAKLAELGLSLRKDDGRRAA
서열 번호 2
SGSSMTGRLVQYGRHRQRRSYARISEVLELPNLIEIQTSSYQWFLDEGLREMFREISPIEDFSGNLSLEFIDYSLGEPKYTVEEAKERDVTYAAPLRVKVRLINKETGEVKEQDVFMGDFPLMTETGTFIINGAERVIVSRLVRSPSVYYSDKVDKNGKRGYSATVIPNRGAWLEYETDAKDVVYVRIDRTRKLPVTVLLRALGFSSDQEIIDLLGDNEYLRNTLEKDNTDSTEKALIEIYERLRPGEPPTLENAKNLLASRFFDPKRYDLASVGRYKINKKLHIKNRLFNQRLAETIIDPETKEVIAEAGAMIDRRTLNRLLPYLEKGVGLQTYRPAEGVVDGDISVQTIKIYAPNDPDGEKVINVIGNGFIAEDVKHITPADIIASISYFFNLLHGVGDTDDIDHLGNRRLRSVGELLQNQFRIGLSRMERVVRERMSIQDTNTITPQQLINIRPVIAAIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRERAGFEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSTYAKVNKFGFIETPYRRVDPETGRVTDQIDYLTADEEDNYVVAQANVPLAEDGTFLEENVVARFRGENIVVKRDRVDYMDVSPKQVVSAATACIPFLENDDSNRALMGANMQRQAVPLLEPEAPIVGTGMEYVSAKDSGAAVICKHRGIVERVEAKEIWVRRLIEVDGKEVKGDLDKYRLLKFVRSNQGTCYNQRPIVKKGDIVEKGEILADGPSMDKGELALGRNVLVAFMTWDGYNYEDAIIMSERLVKEDVYTSIHIEEYEAESRDTKLGPEEITRDIPNVGEDALKNLDERGIVRIGAEVKDGDLLVGKVTPKGMTELTAEERLLHAIFGEKAREVRDTSLRVPHGGGIVLDVKVFNREDGDELPPGVNQLVRVYIVQKRKISEGDKMAGRHGNKGVISRILPEEDMPFLPDGTPIDIMLNPLGVPSRMNIGQVFELHLGMAAKKLGLHIASPVFDGATEEDVWNILEEAGLARDAKTVLYDGRTGEPFDNRVSVGIMYMIKLAHMVDDKLHARSTGPYSLVTQQPLGGKAQFGGQRFGEMEVWALEAYGAAYTLQEILTVKSDDVVGRVKTYEAIVKGENIPEPGVPESFKVLIKELQSLGMDVTILTSDEQEVNMENFDDDDDHAPDAIMVDVKPAEREEAGEEKDAVTKEGRRAA
서열 번호 3
SGSSMLDVNKFEYMKIGLASPEKIRSWSYGEVKKPETINYRTLKPEKDGLFERIFGPTKDWECHCGKYKRVRYKGVVCDRCGVEVTRSKVRRERMGHIELAAPVSHIWYFKGIPSRMGLVLDMSPRALEEVIYFASYVVTDPGDTPLEKKQLLSEKEYRAYREKYGQSFQASMGAEAIKKLLQDIDLDKEVAALKEELKTAQGQRRARIIKRLEVLEAFRSSGNDPAWMVLDVLPVIPPELRPMVQLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLDLGAPNIIVQNEKRMLQEAVDALIDNGRRGRPVTGPGNRPLKSLSHMLKGKKGRFRQNLLGKRVDYSGRSVIVVGPNLKMYQCGLPKEMALELFKPFVMKELVERGLAHNIKSAKRKIERVHPEVWDVLEDVIKEHPVLLNRAPTLHRLGIQAFEPTLVEGRAIRLHPLVCTAYNADFDGDQMAVHVPLSAEAQAEARLLMLAAQNILNPKDGKPVVTPSQDMVLGNYYLTMEREGAIGEGMVFKDTDEALLAYHNGYVHLHSRIAIHAGSLKNETFTEEQNNKLLLTTVGKLIFNEILPNSFPYINEPTTENIEGRTPDKYFLDKGVNVREEIRKRELVPPFKKKVLGQIIAEVFKRFKITETSKMLDRMKDLGFQYSTKAGITIGVADIVVLPEKQEILDEAQAKVDTVLKQFRRGLITDEERYERVISIWSAAKDKIQDRLMKSLDKRNPIFMMSDSGARGNASNFTQLAGMRGLMANPAGRIIELPIKSSFREGLTVLEYFISTHGARKGLADTALKTADSGYLTRRLVDVAQDVIVREEDCGTDRGILARALTDGTEVVVKLEERLVGRYAHKTVRHPETGEVIVRKDEMITEDIANEIIKAGITEVWIRSVFACNTRHGVCKKCYGRNMATGMDVEVGEAVGIIAAQSIGEPGTQLTMRTFHTGGVAGDDITQGLPRVQELFEARNPKGQAVISEIDGTVISINETRDNQYEIVVQSEVETRTYVAPYNARLKVEEGQRVERGQELTEGSVDPKQLLRVRDITSVQEYLLREVQKVYRMQGVEISDKHIEVMVRQMLRKVRVIDAGDTDVLPGTLLDVHQFTDVNAKALREGKRPATARQVLLGITKASLETDSFLSAASFQETTRVLTDAAIKGKRDELLGLKENVIIGKLVPAGTGMARYRKVKPAVKKETAGGTVSSKGRRAA
서열 번호 4
SGSSMLDVNKFEYMKIGLASPEKIRSWSYGEVKKPETINYRTLKPEKDGLFCERIFGPTKDWECHCGKYKRVRYKGVVCDRCGVEVTRSKVRRERMGHIELAAPVSHIWYFKGIPSRMGLVLDMSPRALEEVIYFASYVVTDPGDTPLEKKQLLSEKEYRAYREKYGQSFQASMGAEAIKKLLQDIDLDKEVAALKEELKTAQGQRRARIIKRLEVLEAFRSSGNDPAWMVLDVLPVIPPELRPMVQLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLDLGAPNIIVQNEKRMLQEAVDALIDNGRRGRPVTGPGNRPLKSLSHMLKGKKGRFRQNLLGKRVDYSGRSVIVVGPNLKMYQCGLPKEMALELFKPFVMKELVERGLAHNIKSAKRKIERVHPEVWDVLEDVIKEHPVLNRAPTLHRLGIQAFEPTLVEGRAIRLHPLVCTAYNADFDGDQMAVHVPLSAEAQAEARLLMLAAQNILNPKDGKPVVTPSQDMVLGNYYLTMEREGAIGEGMVFKDTDEALLAYHNGYVHLHSRIAIHAGSLKNETFTEEQNNKLLLTTVGKLIFNEILPNSFPYINEPTTENIEGRTPDKYFLDKGVNVREEIRKRELVPPFKKKVLGQIIAEVFKRFKITETSKMLDRMKDLGFQYSTKAGITIGVADIVVLPEKQEILDEAQAKVDTVLKQFRRGLITDEERYERVISIWSAAKDKIQDRLMKSLDKRNPIFMMSDSGARGNASNFTQLAGMRGLMANPAGRIIELPIKSSFREGLTVLEYFISTHGARKGLADTALKTADSGYLTRRLVDVAQDVIVREEDCGTDRGILARALTDGTEVVVKLEERLVGRYAHKTVRHPETGEVIVRKDEMITEDIANEIIKAGITEVWIRSVFACNTRHGVCKKCYGRNMATGMDVEVGEAVGIIAAQSIGEPGTQLTMRTFHTGGVAGDDITQGLPRVQELFEARNPKGQAVISEIDGTVISINETRDNQYEIVVQSEVETRTYVAPYNARLKVEEGQRVERGQELTEGSVDPKQLLRVRDITSVQEYLLREVQKVYRMQGVEISDKHIEVMVRQMLRKVRVIDAGDTDVLPGTLLDVHQFTDVNAKALREGKRPATARQVLLGITKASLETDSFLSAASFQETTRVLTDAAIKGKRDELLGLKENVIIGKLVPAGTGMARYRKVKPAVKKETAGGTVSSKGRRAA
서열 번호 5
SGSSMSLQQQYSPEELQEMSFVELANLILLDKREALPFDQLVREAAALAGISEEEMEARLAQYYTDLNIDGRFICVGENVWGRAWYPFDQTEDETVTIVKPKKKKKALDDEYDEYDELLEDEDLDYDDLDEYDEEELELDEDELLEDEEFDLDEDVAFDDDILGDEEFELGDAPLDEELDLEEPEEDEGRRAA
서열 번호 6
SGSSMLYPSIDLLMQKVDSKYKLVTVVAKRARELQDGAELMVKKPVSKKFVGQALEEIAGDKVELVEEEKGRRAA
서열 번호 7
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMAEKPAQSKQAEAAGESLEQVKEQLAELGKKRGILTYEEIAERLSGFDLDSDQMDEYYEYLAEQGIEVISESDLEADPDIDDLAKEEEFDLNDLSVPPGVKINDPVRMYLKEIGRVPLLSAEEEIELAKRIEQGDEEAKRRLTEANLRLVVSIAKRYVGRGMLFLDLIQEGNMGLIKAVEKFDYRKGYKFSTYATWWIRQAITRAIADQARTIRIPVHMVETINKLIRVQRQLLQDLGREPTPEEIAEEMDLTPEKVREILKIAQEPVSLETPIGEEDDSHLGDFIEDQDATSPSEHAAYELLKEQLEDVLDTLTDREENVLRLRFGLDDGRTRTLEEVGKVFGVTRERIRQIEAKALRKLRHPSRSKRLKDFLE
서열 번호 8
SGSSMNLVLMGLPGAGKGTQAGKIVEAYGIPHISTGDMFRAAIKEGTPLGLQAKQYMDRGDLVPDELQAKQYMDRGDLVPDEGFLLDGFPRTVAQAEALETLLSEIGRKLDYVIHIDVRQEVLMERLTGRRICRNCGATYHLVFHPPAKPGVCDKCGGDLYQRPDNEATVANRLEVNMKQMKLLLDFYEQKGYLRHINGEQEMEKVFADICEVLGGLARGRRAA
서열 번호 9
SGSSMGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMELMSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRKVRAQLAIYDYIKSLEQPEGRRAA
서열 번호 10
MRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPLLERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEAAPHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLPQDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSRWRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEVYATLYRIGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKVHAKALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQYTDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLNLLKTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTLTLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEGKAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRILAW
서열 번호 11
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPLLERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSEAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEAAPHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLPQDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSRWRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEVYATLYRIGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKVHAKALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQYTDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLNLLKTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTLTLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEGKAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRIAW
서열 번호 12
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTA
서열 번호 13
MHELIHVL
서열 번호 14
SLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTNDGSA
서열 번호 15
ENLYFQS
서열 번호 16
GSGSNGSSGSVSMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYRSGGGHHHHHHGDL
서열 번호 17
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTNDGSAENLYFQSGSGSNGSSGSVSMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYRSGGGHHHHHHGDL
서열 번호 18
ATTCTGCAAAATCCTATTGTTTATCATACCTGATATAATGAAAAGATACGACACTAGGAGTGAATGGCCATG
서열 번호 19
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC
서열 번호 20
CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC
서열 번호 21
ATGCCAATAACCATAAATAATTTTAGATATAGTGATCCTGTTAATAATGATACAATTATTATGATGGAGCCACCATACTGTAAGGGTCTAGATATCTATTATAAGGCTTTCAAAATAACAGATCGTATTTGGATAGTGCCGGAAAGGTATGAATTTGGGACAAAACCTGAAGATTTTAACCCACCATCTTCATTAATAGAAGGTGCATCTGAGTATTACGATCCAAATTATTTAAGGACTGATTCTGATAAAGATAGATTTTTACAAACCATGGTAAAACTGTTTAACAGAATTAAAAACAATGTAGCAGGTGAAGCCTTATTAGATAAGATAATAAATGCCATACCTTACCTTGGAAATTCATATTCCTTACTAGACAAGTTTGATACAAACTCTAATTCAGTATC/TTTTAATTTATCAGAACAAGACCCCAGTGGAGCAACTACAAAATCAGCAATGCTGACAAATTTAATAATATTTGGACCTGGGCCTGTTTTAAATAAAAATGAGGTTAGAGGTATTGTATTGAGGGTAGATAATAAAAATTACTTCCCATGTAGAGATGGTTTTGGTTCAATAATGCAAATGGCATTTTGCCCAGAATATATACCCACTTTTGATAATGTAATAGAAAATATTACGTCACTCACTATTGGCAAAAGCAAATATTTTCAAGATCCAGCATTACTATTAATGCACGAACTTATACATGTACTACATGGTTTATACGGAATGCAGGTATCAAGCCATGAAATTATTCCATCCAAACAAGAAATTTATATGCAGCATACATATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGCTAATCTTATAAGTATTGATATAAAAAACGATTTATATGAAAAAACTTTAAATGATTATAAAGCTATAGCTAACAAACTTAGTCAAGTCACTAGCTGCAATGATCCCAACATTGATATTGATAGCTACAAACAAATATATCAACAAAAATATCAATTCGATAAAGATAGCAATGGACAATATATTGTAAATGAGGATAAATTTCAGATACTATATAATAGCATAATGTATGGTTTTACAGAGATTGAATTGGGAAAAAAATTTAATATAAAAACTAGACTTTCTTATTTTAGTATGAATCATGACCCTGTAAAAATTCCAAATTTATTAGATGATACAATTTACAATGATACAGAAGGATTTAATATAGAAAGCAAAGATCTGAAATCTGAATATAAAGGTCAAAATATGAGGGTAAATACAAATGCTTTTAGAAATGTTGATGGATCAGGCCTAGTTTCAAAACTTATTGGCTTATGTAAAAAAATTATACCACCAACAAATATAAGAGAAAATTTATATAATAGAACTGCATCATTAACAGATTTAGGAGGAGAATTATGTATAAAAATTAAAAATGAAGATTTAACTTTTATAGCTGAAAAAAATAGCTTTTCAGAAGAACCATTTCAAGATGAAACAGTTAGTTATAATACAAAAAATAAACCATTAAATTTTAATTATTCGCTAGATAAAATTATTTTAGATTATAATCTACAAAGTAAAATTACATTACCTAATGATAGGACAACCCCAGTTACAAAAGGAATTCCATATGCTCCAAAATATAAAAGTAATGCTGCAAGTACAATAGAAATACATAATATTGATGACAATACAATATATCAATATTTGTATGCTCAAAAATCTCCTACAACTCTACAAAGAATAACTATGACTAATTCTGTCGATGACGCATTAATAAATTCCACCAAAATATATTCATATTTTCCATCTGTAATCAGTAAAGTTAACCAAGGTGCACAAGGAATTTTATTCTTACAGTGGGTGAGAGATATAATTGATGATTTACCAATGAATCTTCACAAAAAACTACTATTGATAAAATTTCAGATGTATCCACTATTGTTCCTTATATAGGACCCGCATTAAACATTGTAAAACAAGGCTATGAGGGAAACTTTATAGGTGCTTTAGAAACTACCGGAGTGGTTTTATTATTGGAATATATTCCAGAAATTACTTTACCAGTAATTGCAGCTTTATCTATAGCAGAAAGTAGCACACAAAAAGAAAAGATAATAAAAACAATAGATAACTTTTTAGAAAAAAGATATGAAAAATGGATTGAAGTATATAAACTAATAAAAGCAAAATGGTTAGGCACAGTTAATACGCAATTCCAAAAAAGAAGTTATCAAATGTATAGATCTTTAGAATATCAAGTAGATGCAATAAAAAAAATAATAGACTATGAATATAAAATATATTCAGGACCTGATAAGGAACAAATTGCCGACGAAATTAATAATCTGAAAAACAAACTTGAAGAAAAGGCTAATAAAGCAATGATAAACATAAATATATTTATGAGGGAAAGTTCTAGATCATTTTTAGTTAATCAAATGATTAACGAAGCTAAAAAGCAGTTATTAGAGTTTGATACTCAAAGCAAAAATATTTTAATGCAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAAAAAAATTAGAATCAAAAATAAACAAAGTTTTTTCAACACCAATTCCATTTTCTTATTCTAAAAATCTGGATTGTTGGGTTGATAATGAAGAAGATATAGATGTTATATTAAAAAAGAGTACAATTTTAAATTTAGATATTAATAATGATATTATATCAGATATATCTGGGTTTAATTCATCTGTAATAACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCCGGAATAAATGGCAAAGCAATACATTTAGTAAACAATGAATCTTCTGAAGTTATAGTGCATAAAGCTATGGATATTGAATATAATGATATGTTTAATAATTTTACCGTTAGCTTTTGGTTGAGGGTTCCTAAAGTATCTGCTAGTCATTTAGAACAATATGGCACAAATGAGTATTCAATAATTAGCTCTATGAAAAAATATAGTCTATCAATAGGATCTGGTTGGAGTGTATCACTTAAAGGTAATAACTTAATATGGACTTTAAAAGATTCCGCGGGAGAAGTTAGACAAATAACTTTTAGTGATTTATCTGATAAATTTAATGCTTATTTAGCAAATAAATGGGTTTTTATAACTATTACTAATGATAGATTATCTTCTGCTAATTTGTATATAAATGGAGTACTTATGAAAAATGCAGAAATTACCGGTTTAGGAGCTATTAGAGAGGATAATAATATAACATTAAAACTAGATAGATGTAATAATAATAATCAATACGTTTCTATTGATAAATTTAGGATATTTTGCAAAGCATTAAATCCAAAAGAGATTGAAAAATTATACACAAGTTATTTATCTATAACCTTTTTAAGAGACTTCTGGGGAAACCCTTTACGATATGATACAGAATATTATTTAATACCAGTAGCTTCTAGTTCTAAAGATGTTCAATTGAAAAATATAACAGATTATATGTATTTGACAAATGCGCCATCGTATACTAACGGAAAATTGAATATATATTATAGAAGGTTATATAGTGGACTAAAATTTATTATAAAAAGATATACACCTAATAATGAAATAGATTCTTTTGTTAAATCAGGTGATTTTATTAAATTATATGTATCATATAACAATAATGAGCACATTGTAGGTTATCCGAAAGATGGAAATGCCTTTAATAATCTTGATAGAATTCTAAGAGTAGGTTATAATGCCCCAGGTATCCCTCTTTATAAAAAAATGGAAGCAGTAAAATTGCGTGATTTAAAAACCTATTCTGTACAACTTAAATTATATGATGATAAAAATGCATCTTTAGGACTAGTAGGTATCCGTAATGGTCAAATAGGCAACGATCCAAATAGGGATATATTAATTGCAAGCAACTGGTACTTTAATCATTTAAAAGATAAAACTTTAACATGTGATTGGTACTTTGTACCTACAGATGAAGGATGGACAAATGATTAA
서열 번호 22
GAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGTAGTGGGAGCAACGGCAGCAGCGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTCCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
표 2: 다음을 나타내는, 재조합 TaqPPK에 대한 아미노산 서열: 6xHis -태그; V5 에피토프 태그 및 TEV 절단 부위 ( 서열 번호 11)
His6 V5 태그 TEV ＼/ TaqPPK
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPL
LERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSEAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEA
APHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLP
QDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQ
ALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSR
WRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEVYATLYR
IGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKVHA
KALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQYTDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLN
LLKTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTL
TLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEG
KAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRILAW
SEQUENCE LISTING <110> NTxBio, LLC <120> CELL-FREE EXPRESSION SYSTEM HAVING NOVEL INORGANIC POLYPHOSPHATE-BASED ENERGY REGENERATION <130> 90125.00011 <150> 62/440,975 <151> 2016-12-30 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Geobacillus Stearothermphilus <400> 1 Ser Gly Ser Ser Met Ile Glu Ile Glu Lys Pro Lys Ile Glu Thr Val 1 5 10 15 Glu Leu Ser Glu Asp Ala Lys Tyr Gly Lys Phe Val Val Glu Pro Leu 20 25 30 Glu Arg Gly Tyr Gly Thr Thr Leu Gly Asn Ser Leu Arg Arg Ile Leu 35 40 45 Leu Ser Ser Leu Pro Gly Ala Ala Val Thr Ser Val Gln Ile Asp Gly 50 55 60 Val Leu His Glu Phe Ser Thr Ile Asp Gly Val Val Glu Asp Val Thr 65 70 75 80 Ala Ile Ile Leu Asn Ile Lys Lys Leu Ala Leu Lys Ile Tyr Ser Asp 85 90 95 Glu Glu Lys Thr Leu Glu Ile Asp Val Gln Gly Glu Gly Val Val Thr 100 105 110 Ala Ala Asp Ile Thr His Asp Ser Asp Val Glu Ile Leu Asn Pro Asp 115 120 125 Leu His Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gly Gly Arg Leu Arg Met Arg Met 130 135 140 Thr Ala Lys Arg Gly Arg Gly Tyr Val Pro Ala Glu Ala Asn Lys Arg 145 150 155 160 Glu Asp Gln Pro Ile Gly Val Ile Pro Ile Asp Ser Ile Tyr Thr Pro 165 170 175 Val Ser Arg Val Ser Tyr Gln Val Glu Asn Thr Arg Val Gly Gln Val 180 185 190 Thr Asp Tyr Asp Lys Leu Thr Ile Asp Val Trp Thr Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Gly Pro Lys Glu Ala Ile Ser Leu Gly Ala Lys Ile Leu Thr Glu His 210 215 220 Leu Asn Ile Phe Val Gly Leu Thr Asp Glu Ala Gln Asn Ala Glu Ile 225 230 235 240 Met Val Glu Lys Glu Asp Asp Gln Lys Glu Lys Val Leu Glu Met Thr 245 250 255 Ile Glu Glu Leu Asp Leu Ser Val Arg Ser Tyr Asn Cys Leu Lys Arg 260 265 270 Ala Gly Ile Asn Thr Val Gln Glu Leu Thr Gln Lys Thr Glu Glu Asp 275 280 285 Met Met Lys Val Arg Asn Leu Gly Arg Lys Ser Leu Glu Glu Val Lys 290 295 300 Ala Lys Leu Ala Glu Leu Gly Leu Ser Leu Arg Lys Asp Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Ala <210> 2 <211> 1198 <212> PRT <213> Geobacillus Stearothermphilus <400> 2 Ser Gly Ser Ser Met Thr Gly Arg Leu Val Gln Tyr Gly Arg His Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Ser Tyr Ala Arg Ile Ser Glu Val Leu Glu Leu Pro Asn 20 25 30 Leu Ile Glu Ile Gln Thr Ser Ser Tyr Gln Trp Phe Leu Asp Glu Gly 35 40 45 Leu Arg Glu Met Phe Arg Glu Ile Ser Pro Ile Glu Asp Phe Ser Gly 50 55 60 Asn Leu Ser Leu Glu Phe Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Glu Pro Lys Tyr 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Ala Lys Glu Arg Asp Val Thr Tyr Ala Ala Pro Leu 85 90 95 Arg Val Lys Val Arg Leu Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Val Lys Glu 100 105 110 Gln Asp Val Phe Met Gly Asp Phe Pro Leu Met Thr Glu Thr Gly Thr 115 120 125 Phe Ile Ile Asn Gly Ala Glu Arg Val Ile Val Ser Arg Leu Val Arg 130 135 140 Ser Pro Ser Val Tyr Tyr Ser Asp Lys Val Asp Lys Asn Gly Lys Arg 145 150 155 160 Gly Tyr Ser Ala Thr Val Ile Pro Asn Arg Gly Ala Trp Leu Glu Tyr 165 170 175 Glu Thr Asp Ala Lys Asp Val Val Tyr Val Arg Ile Asp Arg Thr Arg 180 185 190 Lys Leu Pro Val Thr Val Leu Leu Arg Ala Leu Gly Phe Ser Ser Asp 195 200 205 Gln Glu Ile Ile Asp Leu Leu Gly Asp Asn Glu Tyr Leu Arg Asn Thr 210 215 220 Leu Glu Lys Asp Asn Thr Asp Ser Thr Glu Lys Ala Leu Ile Glu Ile 225 230 235 240 Tyr Glu Arg Leu Arg Pro Gly Glu Pro Pro Thr Leu Glu Asn Ala Lys 245 250 255 Asn Leu Leu Ala Ser Arg Phe Phe Asp Pro Lys Arg Tyr Asp Leu Ala 260 265 270 Ser Val Gly Arg Tyr Lys Ile Asn Lys Lys Leu His Ile Lys Asn Arg 275 280 285 Leu Phe Asn Gln Arg Leu Ala Glu Thr Ile Ile Asp Pro Glu Thr Lys 290 295 300 Glu Val Ile Ala Glu Ala Gly Ala Met Ile Asp Arg Arg Thr Leu Asn 305 310 315 320 Arg Leu Leu Pro Tyr Leu Glu Lys Gly Val Gly Leu Gln Thr Tyr Arg 325 330 335 Pro Ala Glu Gly Val Val Asp Gly Asp Ile Ser Val Gln Thr Ile Lys 340 345 350 Ile Tyr Ala Pro Asn Asp Pro Asp Gly Glu Lys Val Ile Asn Val Ile 355 360 365 Gly Asn Gly Phe Ile Ala Glu Asp Val Lys His Ile Thr Pro Ala Asp 370 375 380 Ile Ile Ala Ser Ile Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Leu His Gly Val Gly 385 390 395 400 Asp Thr Asp Asp Ile Asp His Leu Gly Asn Arg Arg Leu Arg Ser Val 405 410 415 Gly Glu Leu Leu Gln Asn Gln Phe Arg Ile Gly Leu Ser Arg Met Glu 420 425 430 Arg Val Val Arg Glu Arg Met Ser Ile Gln Asp Thr Asn Thr Ile Thr 435 440 445 Pro Gln Gln Leu Ile Asn Ile Arg Pro Val Ile Ala Ala Ile Lys Glu 450 455 460 Phe Phe Gly Ser Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Thr Asn Pro 465 470 475 480 Leu Ala Glu Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu Gly Pro Gly 485 490 495 Gly Leu Thr Arg Glu Arg Ala Gly Phe Glu Val Arg Asp Val His Tyr 500 505 510 Ser His Tyr Gly Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu Gly Pro Asn 515 520 525 Ile Gly Leu Ile Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Ala Lys Val Asn Lys Phe 530 535 540 Gly Phe Ile Glu Thr Pro Tyr Arg Arg Val Asp Pro Glu Thr Gly Arg 545 550 555 560 Val Thr Asp Gln Ile Asp Tyr Leu Thr Ala Asp Glu Glu Asp Asn Tyr 565 570 575 Val Val Ala Gln Ala Asn Val Pro Leu Ala Glu Asp Gly Thr Phe Leu 580 585 590 Glu Glu Asn Val Val Ala Arg Phe Arg Gly Glu Asn Ile Val Val Lys 595 600 605 Arg Asp Arg Val Asp Tyr Met Asp Val Ser Pro Lys Gln Val Val Ser 610 615 620 Ala Ala Thr Ala Cys Ile Pro Phe Leu Glu Asn Asp Asp Ser Asn Arg 625 630 635 640 Ala Leu Met Gly Ala Asn Met Gln Arg Gln Ala Val Pro Leu Leu Glu 645 650 655 Pro Glu Ala Pro Ile Val Gly Thr Gly Met Glu Tyr Val Ser Ala Lys 660 665 670 Asp Ser Gly Ala Ala Val Ile Cys Lys His Arg Gly Ile Val Glu Arg 675 680 685 Val Glu Ala Lys Glu Ile Trp Val Arg Arg Leu Ile Glu Val Asp Gly 690 695 700 Lys Glu Val Lys Gly Asp Leu Asp Lys Tyr Arg Leu Leu Lys Phe Val 705 710 715 720 Arg Ser Asn Gln Gly Thr Cys Tyr Asn Gln Arg Pro Ile Val Lys Lys 725 730 735 Gly Asp Ile Val Glu Lys Gly Glu Ile Leu Ala Asp Gly Pro Ser Met 740 745 750 Asp Lys Gly Glu Leu Ala Leu Gly Arg Asn Val Leu Val Ala Phe Met 755 760 765 Thr Trp Asp Gly Tyr Asn Tyr Glu Asp Ala Ile Ile Met Ser Glu Arg 770 775 780 Leu Val Lys Glu Asp Val Tyr Thr Ser Ile His Ile Glu Glu Tyr Glu 785 790 795 800 Ala Glu Ser Arg Asp Thr Lys Leu Gly Pro Glu Glu Ile Thr Arg Asp 805 810 815 Ile Pro Asn Val Gly Glu Asp Ala Leu Lys Asn Leu Asp Glu Arg Gly 820 825 830 Ile Val Arg Ile Gly Ala Glu Val Lys Asp Gly Asp Leu Leu Val Gly 835 840 845 Lys Val Thr Pro Lys Gly Met Thr Glu Leu Thr Ala Glu Glu Arg Leu 850 855 860 Leu His Ala Ile Phe Gly Glu Lys Ala Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser 865 870 875 880 Leu Arg Val Pro His Gly Gly Gly Ile Val Leu Asp Val Lys Val Phe 885 890 895 Asn Arg Glu Asp Gly Asp Glu Leu Pro Pro Gly Val Asn Gln Leu Val 900 905 910 Arg Val Tyr Ile Val Gln Lys Arg Lys Ile Ser Glu Gly Asp Lys Met 915 920 925 Ala Gly Arg His Gly Asn Lys Gly Val Ile Ser Arg Ile Leu Pro Glu 930 935 940 Glu Asp Met Pro Phe Leu Pro Asp Gly Thr Pro Ile Asp Ile Met Leu 945 950 955 960 Asn Pro Leu Gly Val Pro Ser Arg Met Asn Ile Gly Gln Val Phe Glu 965 970 975 Leu His Leu Gly Met Ala Ala Lys Lys Leu Gly Leu His Ile Ala Ser 980 985 990 Pro Val Phe Asp Gly Ala Thr Glu Glu Asp Val Trp Asn Ile Leu Glu 995 1000 1005 Glu Ala Gly Leu Ala Arg Asp Ala Lys Thr Val Leu Tyr Asp Gly 1010 1015 1020 Arg Thr Gly Glu Pro Phe Asp Asn Arg Val Ser Val Gly Ile Met 1025 1030 1035 Tyr Met Ile Lys Leu Ala His Met Val Asp Asp Lys Leu His Ala 1040 1045 1050 Arg Ser Thr Gly Pro Tyr Ser Leu Val Thr Gln Gln Pro Leu Gly 1055 1060 1065 Gly Lys Ala Gln Phe Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val 1070 1075 1080 Trp Ala Leu Glu Ala Tyr Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Glu Ile 1085 1090 1095 Leu Thr Val Lys Ser Asp Asp Val Val Gly Arg Val Lys Thr Tyr 1100 1105 1110 Glu Ala Ile Val Lys Gly Glu Asn Ile Pro Glu Pro Gly Val Pro 1115 1120 1125 Glu Ser Phe Lys Val Leu Ile Lys Glu Leu Gln Ser Leu Gly Met 1130 1135 1140 Asp Val Thr Ile Leu Thr Ser Asp Glu Gln Glu Val Asn Met Glu 1145 1150 1155 Asn Phe Asp Asp Asp Asp Asp His Ala Pro Asp Ala Ile Met Val 1160 1165 1170 Asp Val Lys Pro Ala Glu Arg Glu Glu Ala Gly Glu Glu Lys Asp 1175 1180 1185 Ala Val Thr Lys Glu Gly Arg Arg Ala Ala 1190 1195 <210> 3 <211> 1207 <212> PRT <213> Geobacillus Stearothermphilus <400> 3 Ser Gly Ser Ser Met Leu Asp Val Asn Lys Phe Glu Tyr Met Lys Ile 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ser Pro Glu Lys Ile Arg Ser Trp Ser Tyr Gly Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Glu Thr Ile Asn Tyr Arg Thr Leu Lys Pro Glu Lys Asp 35 40 45 Gly Leu Phe Glu Arg Ile Phe Gly Pro 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Asn Asn Arg Leu Lys 260 265 270 Arg Leu Leu Asp Leu Gly Ala Pro Asn Ile Ile Val Gln Asn Glu Lys 275 280 285 Arg Met Leu Gln Glu Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Asn Gly Arg Arg 290 295 300 Gly Arg Pro Val Thr Gly Pro Gly Asn Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ser 305 310 315 320 His Met Leu Lys Gly Lys Lys Gly Arg Phe Arg Gln Asn Leu Leu Gly 325 330 335 Lys Arg Val Asp Tyr Ser Gly Arg Ser Val Ile Val Val Gly Pro Asn 340 345 350 Leu Lys Met Tyr Gln Cys Gly Leu Pro Lys Glu Met Ala Leu Glu Leu 355 360 365 Phe Lys Pro Phe Val Met Lys Glu Leu Val Glu Arg Gly Leu Ala His 370 375 380 Asn Ile Lys Ser Ala Lys Arg Lys Ile Glu Arg Val His Pro Glu Val 385 390 395 400 Trp Asp Val Leu Glu Asp Val Ile Lys Glu His Pro Val Leu Leu Asn 405 410 415 Arg Ala Pro Thr Leu His Arg Leu Gly Ile Gln Ala Phe Glu Pro Thr 420 425 430 Leu Val Glu Gly Arg Ala Ile Arg Leu His Pro Leu Val Cys Thr Ala 435 440 445 Tyr Asn Ala Asp Phe Asp Gly Asp Gln Met Ala Val His Val Pro Leu 450 455 460 Ser Ala Glu Ala Gln Ala Glu Ala Arg Leu Leu Met Leu Ala Ala Gln 465 470 475 480 Asn Ile Leu Asn Pro Lys Asp Gly Lys Pro Val Val Thr Pro Ser Gln 485 490 495 Asp Met Val Leu Gly Asn Tyr Tyr Leu Thr Met Glu Arg Glu Gly Ala 500 505 510 Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Lys Asp Thr Asp Glu Ala Leu Leu Ala 515 520 525 Tyr His Asn Gly Tyr Val His Leu His Ser Arg Ile Ala Ile His Ala 530 535 540 Gly Ser Leu Lys Asn Glu Thr Phe Thr Glu Glu Gln Asn Asn Lys Leu 545 550 555 560 Leu Leu Thr Thr Val Gly Lys Leu Ile Phe Asn Glu Ile Leu Pro Asn 565 570 575 Ser Phe Pro Tyr Ile Asn Glu Pro Thr Thr Glu Asn Ile Glu Gly Arg 580 585 590 Thr Pro Asp Lys Tyr Phe Leu Asp Lys Gly Val Asn Val Arg Glu Glu 595 600 605 Ile Arg Lys Arg Glu Leu Val Pro Pro Phe Lys Lys Lys Val Leu Gly 610 615 620 Gln Ile Ile Ala Glu Val Phe Lys Arg Phe Lys Ile Thr Glu Thr Ser 625 630 635 640 Lys Met Leu Asp Arg Met Lys Asp Leu Gly Phe Gln Tyr Ser Thr Lys 645 650 655 Ala Gly Ile Thr Ile Gly Val Ala Asp Ile Val Val Leu Pro Glu Lys 660 665 670 Gln Glu Ile Leu Asp Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp 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Claims (145)

  1. 다음을 포함하는, 열안정성 무세포 단백질 발현 시스템(thermostable cell-free protein expression system):
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 호열성 미생물 배양물로부터 유래한 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물로서, 상기 호열성 미생물은 다음을 위해 유전자 변형되는 반응 혼합물:
    - OmpT-상동체의 녹아웃(knock-out) 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 일정량의 정제된 열안정성 RNAP;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 정제된 아데노실 키네이스 (AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
    - 여기서 상기 AdK 및 PPK 효소는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생하는 것인, 열안정성 무세포 단백질 발현 시스템.
  2. 다음을 포함하는, 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기(cell-free expression bioreactor):
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 열안정성 아데노실 키네이스 (Gst AdK) 효소; 및
    - 일정량의 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (TaqPPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
    - 여기서 상기 AdK 및 PPK 효소는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 열안정성 Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 열안정성 TaqPPK 효소는 서열 번호 11을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  5. 청구항 4에 있어서, G. 스테아로써모필러스(G. stearothermophilus)로부터 유래한 일정량의 RNAP(Gst RNAP)를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  6. 청구항 5에 있어서, G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 상기 Gst RNAP는 다음의 RNAP 서브유닛을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 서열 번호 1을 가지는 서브유닛 알파;
    - 서열 번호 2를 가지는 서브유닛 베타;
    - 서브유닛 베타' 가지는 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4를 가지는 서브유닛 베타' (opt);
    - 서열 번호 5를 가지는 서브유닛 델타; 및
    - 서열 번호 6을 가지는 서브유닛 오메가.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 세포 추출물은 지오바실러스 세포 추출물을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 지오바실러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  9. 청구항 2에 있어서, 일정량의 소르비톨-탈수소효소 (SDH)를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 SDH는 지오바실러스 스테아써모필러스로부터 유래한 재조합 소르비톨-탈수소효소(Gst SDH)를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  11. 청구항 10에 있어서, 일정량의 소르비톨을 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  12. 청구항 2에 있어서, 추가로 포함하는 상기 세포 추출물을 재생하기 위해 사용된 동일한 유형의 미생물로부터 분리된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  13. 청구항 12에 있어서, 세포 추출물과 동일한 유기체로부터 상기 tRNA의 양은 지오바실러스 tRNA의 양을 포함하며, 상기 세포 추출물은 지오바실러스로부터 유래하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  14. 청구항 13에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  15. 청구항 14에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 상기 tRNA의 양은 E. coli로부터 분리된 일정량의 tRNA를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  16. 청구항 2에 있어서, 상기 최소 하나의 핵산 합성 주형은 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 선형 DNA 주형은 다음을 가지는 선형 DNA 주형을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 프로모터에 작동 가능하게 연결된 최소 하나의 표적 발현 생성물 유전자;
    - 최소 하나의 리보솜 결합 부위 (RBS);
    - 최소 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
    - 최소 하나의 태그.
  18. 청구항 17에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 표적 발현 생성물 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 자동촉매 단백질 분해효소 부위 (서열 번호 13) 및 다이설파이드 가교 형성 시스테인을 가지는 TetNT 경쇄 (서열 번호 12)를 코딩하는 재조합 제1 구조체, 및 부분적으로 통합된 TEV 부위 (서열 번호 15) 및 mCherry-His6 (서열 번호 16)를 포함하는 TetNT 중쇄 (서열 번호 14)를 코딩하는 제2 구조체를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 서열 번호 21로 식별되는 재조합 TetNT 유전자를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자는 서열 번호 18으로 식별되는 RhIII 프로모터, 또는 서열 번호 19으로 식별되는 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 RBS는 서열 번호 20으로 식별되는 RBS를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  23. 청구항 18에 있어서, 상기 발현 생성물 절단 부위는 서열 번호 17으로 식별되는 TEV부위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  24. 청구항 18에 있어서, 상기 최소 하나의 태그는 서열 번호 16으로 식별되는 mCherry-His6 태그를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  25. 청구항 18에 있어서, 상기 최소 하나의 태그는 His6 태그를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  26. 청구항 4에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양은 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양이 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템은, 상기 Gst Adk:TaqPPK 효소의 몰비가 대략 3:1인 무세포 단백질 발현 시스템을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  28. 청구항 2 및 청구항 27에 있어서, 상기 PPi의 양은 ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  29. 청구항 28에 있어서, ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 상기 PPi의 양은 100μl 부피 ATP 재생 반응에서 대략 0.2-2 mg/ml PPi의 농도 범위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  30. 다음을 포함하는, 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 정제된 아데노실 키네이스 (AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
    - 여기서 상기 AdK 및 PPK 효소는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 세포 추출물은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 추출물을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    박테리아 세포 추출물; 혐기성 박테리아 세포 추출물; 호기성 박테리아 세포 추출물; 조건 혐기성 박테리아 세포 추출물; 식물 세포 추출물; 미세조류 세포 추출물; 고세균 세포 추출물; 진균 세포 추출물; 후벽균 세포 추출물; 토끼 망상적혈구 (RRL); 밀 배아 세포 추출물 (WGE); 곤충 세포 추출물 (ICE); 및 포유류 세포 추출물 (MC).
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 세포 추출물은 호열성 박테리아 세포 추출물 및/또는 열안정성 박테리아 세포 추출물을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 호열성 박테리아 세포 추출물 및/또는 열안정성 박테리아 세포 추출물은 지오바실러스 세포 추출물을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 지오바실러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 유전자 변형 지오바실러스는 지오바실러스 스테아써모필러스의 유전자 변형 균주를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  36. 청구항 34에 있어서, 상기 무세포 반응 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 무세포 반응 성분을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 아미노산;
    - 폴리포스페이트;
    - Tris-아세테이트;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-글루타메이트;
    - 아미노-아세테이트;
    - NaCl;
    - KCl;
    - MgCl2;
    - DTT;
    - 옥틸-b-글리코사이드;
    - NAD (시스템에서 NADH로 전환 수 있음);
    - NADP (시스템에서 NADPH로 전환될 수 있음);
    - 소르비톨;
    - FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생될 수 있음);
    - ATP;
    - GTP, UTP, 및/또는 CTP;
    - CoA;
    - PLP; 및
    - SAM, 또는 이의 임의의 조합.
  37. 청구항 34에 있어서, 상기 무세포 반응 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 무세포 반응 성분을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 2 mM의 각각의 천연 아미노산;
    - 1 mg/ml 폴리포스페이트;
    - 5 mM Tris-아세테이트;
    - 4 mM Mg(OAc)2;
    - 12 mM K+-글루타메이트;
    - 1 mM 아미노-아세테이트;
    - 100 mM NaCl;
    - 10 mM KCl;
    - 5 mM MgCl2;
    - 0.1 mM DTT;
    - 0.2% 옥틸-b-글리코사이드;
    - 0.8 mM NAD (시스템에서 NADH로 전환 수 있음);
    - 0.4 mM NADP (시스템에서 NADPH로 전환될 수 있음);
    - 200 mM 소르비톨;
    - 0.5 mM FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생될 수 있음);
    - 1.5 mM ATP;
    - 1 mM의 각각의 GTP, UTP, CTP;
    - 1 mM CoA;
    - 2 mM PLP; 및
    - 0.2 mM SAM, 또는 이의 임의의 조합.
  38. 청구항 30에 있어서, 일정량의 열안정성 RNA 중합효소 (RNAP)를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 열안정성 RNAP는G . 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 RNAP (Gst RNAP)를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 Gst RNAP로부터 유래한 G. 스테아로써모필러스는 다음의 RNAP 서브유닛을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 서열 번호 1을 가지는 서브유닛 알파;
    - 서열 번호 2를 가지는 서브유닛 베타;
    - 서브유닛 베타' 가지는 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4를 가지는 서브유닛 베타' (opt);
    - 서열 번호 5를 가지는 서브유닛 델타; 및
    - 서열 번호 6을 가지는 서브유닛 오메가.
  41. 청구항 33에 있어서, 상기 세포 추출물을 재생하기 위해 사용된 동일한 유형의 유기체로부터 분리된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  42. 청구항 41에 있어서, 세포 추출물과 동일한 미생물로부터 상기 tRNA의 양은 지오바실러스 tRNA의 양을 포함하며, 상기 세포 추출물은 지오바실러스로부터 유래하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  43. 청구항 42에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  44. 청구항 43에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 tRNA의 양 E. coli로부터 분리된 상기 일정량의 tRNA를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  45. 청구항 43에 있어서, 일정량의 소르비톨-탈수소효소 (SDH)를 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 SDH는 지오바실러스 스테아써모필러스로부터 유래한 재조합 소르비톨-탈수소효소(Gst SDH)를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  47. 청구항 46에 있어서, 일정량의 소르비톨을 추가로 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  48. 청구항 30에 있어서, 상기 거대분자는 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  49. 청구항 30에 있어서, 상기 핵산 합성 주형은 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 선형 DNA 주형은 코돈 최적화 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 선형 DNA 주형은 다음을 가지는 선형 DNA 주형을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 프로모터에 작동 가능하게 연결된 최소 하나의 표적 발현 생성물 유전자;
    - 최소 하나의 리보솜 결합 부위 (RBS);
    - 최소 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
    - 최소 하나의 태그.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 18으로 식별되는 RhIII 프로모터, 또는 서열 번호 19으로 식별되는 T7 프로모터를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  53. 청구항 51에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 최소 하나의 표적 발현 생성물 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  54. 청구항 53에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 자동촉매 단백질 분해효소 부위 (서열 번호 13) 및 다이설파이드 가교 형성 시스테인을 가지는 TetNT 경쇄 (서열 번호 12)를 코딩하는 재조합 제1 구조체, 및 부분적으로 통합된 TEV 부위 (서열 번호 15) 및 mCherry-His6 (서열 번호 16)를 포함하는 TetNT 중쇄 (서열 번호 14)를 코딩하는 제2 구조체를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  55. 청구항 53에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 서열 번호 21로 식별되는 재조합 TetNT 유전자를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  56. 청구항 54에 있어서, 상기 RBS는 서열 번호 20으로 식별되는 RBS를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 발현 생성물 절단 부위는 서열 번호 15로 식별되는 TEV부위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  58. 청구항 51에 있어서, 상기 표적 발현 생성물은 서열 번호 17로 식별되는 무세포 단백질 발현 시스템.
  59. 청구항 30에 있어서, 상기 정제된 AdK 효소의 양은 일정량의 정제된 열안정성 AdK 효소를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 정제된 열안정성 AdK 효소의 양은 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 정제된 열안정성 AdK 효소(Gst Adk) 의 양을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  62. 청구항 30에 있어서, 상기 정제된 PPK 효소의 양은 정제된 열안정성 PPK 효소의 양을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 정제된 열안정성 PPK 효소의 양은 떼르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 유래한 일정량의 정제된 열안정성 효소(TaqPPK)의 양을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 TaqPPK 효소는 서열 번호 11을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  65. 청구항 63에 있어서, 상기 정제된 AdK 효소의 양 및 상기 정제된 PPK 효소의 양은 서열 번호 8로 식별되는 정제된 Gst AdK 효소의 일정량, 및 서열 번호 11로 식별되는 정제된 태그 PPK 효소의 일정량을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양은 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 Gst Adk 효소의 양을 가지는 상기 무세포 단백질 발현 시스템은 상기 Gst Adk:TaqPPK의 몰비가 대략 3:1인 무세포 단백질 발현 시스템을 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  68. 청구항 30 및 청구항67에 있어서, 상기 PPi의 양은 ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  69. 청구항 68에 있어서, ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 상기 PPi의 양은 100μl 부피 ATP 재생 반응에서 대략 0.2-2 mg/ml PPi의 농도 범위를 포함하는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  70. 청구항 30에 있어서, 상기 세포 ATP 에너지 재생 시스템 성분은 배치, 연속 흐름, 또는 반-연속 흐름으로 상기 무세포 발현 생물 반응기에 첨가될 수 있는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  71. 청구항 30에 있어서, 상기 무세포 반응 성분은 배치, 연속 흐름, 또는 반-연속 흐름으로 상기 무세포 발현 생물 반응기에 첨가될 수 있는 것인, 무세포 단백질 발현 시스템.
  72. 다음을 포함하는, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 박테리아 배양물로부터 유래한 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 아데노실 키네이스 (AdK) 효소; 및
    - 일정량의 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
    - 여기서 상기 AdK 및 PPK는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 AdK 효소의 양은 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 AdK 효소 (Gst Adk)를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 PPK 효소의 양은 떼르무스 아쿠아티쿠스로부터 유래한 일정량의 정제된 열안정성 효소(TaqPPK)를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  75. 청구항 73에 있어서, 상기 Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  76. 청구항 74에 있어서, 상기 TaqPPK는 서열 번호 11를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  77. 청구항 75에 있어서, 일정량의 RNAP는 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 RNAP (Gst RNAP)를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  78. 청구항 77에 있어서, G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 상기 Gst RNAP는 다음의 RNAP 서브유닛을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 서열 번호 1을 가지는 서브유닛 알파;
    - 서열 번호 2를 가지는 서브유닛 베타;
    - 서브유닛 베타' 가지는 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4를 가지는 서브유닛 베타' (opt);
    - 서열 번호 5를 가지는 서브유닛 델타; 및
    - 서열 번호 6을 가지는 서브유닛 오메가.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 세포 추출물은 지오바실러스 세포 추출물을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  80. 청구항 79에 있어서, 상기 지오바실러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  81. 청구항 72에 있어서, 일정량의 소르비톨-탈수소효소 (SDH)를 추가로 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  82. 청구항 81에 있어서, 상기 SDH는 지오바실러스 스테아써모필러스로부터 유래한 재조합 소르비톨-탈수소효소 (Gst SDH)를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
    XX190 청구항 82에 있어서, 일정량의 소르비톨을 추가로 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  83. 청구항 72에 있어서, 상기 세포 추출물을 재생하기 위해 사용된 동일한 유형의 박테리아로부터 분리된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  84. 청구항 83에 있어서, 상기 세포 추출물을 생성하기 위해 사용된 동일한 박테리아로부터 상기 tRNA의 양은 지오바실러스 tRNA의 양을 포함하며, 상기 세포 추출물은 지오바실러스로부터 유래한 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  85. 청구항 84에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  86. 청구항 85에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 상기 tRNA의 양은 E. coli로부터 분리된 일정량의 tRNA를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  87. 청구항 72에 있어서, 상기 최소 하나의 핵산 합성 주형은 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 선형 DNA 주형은 다음을 가지는 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 프로모터에 작동 가능하게 연결된 최소 하나의 표적 발현 생성물 유전자;
    - 최소 하나의 리보솜 결합 부위 (RBS);
    - 최소 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
    - 최소 하나의 태그.
  89. 청구항 88에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 표적 발현 생성물 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  90. 청구항 89에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 서열 번호 21로 식별되는 재조합 TetNT 유전자를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  91. 청구항 75 및 청구항 XX120에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양은 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양이 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템은 상기 Gst Adk:TaqPPK 효소의 몰비가 대략 3:1인 무세포 단백질 발현 시스템을 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  93. 청구항 72 및 청구항92에 있어서, 상기 PPi의 양은 ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  94. 청구항 93에 있어서, ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 상기 PPi의 양은 100μl 부피 ATP 재생 반응에서 대략 0.2-2 mg/ml PPi의 농도 범위를 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  95. 청구항 72에 있어서, 상기 무세포 반응 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 무세포 반응 성분을 포함하는 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 아미노산;
    - 폴리포스페이트;
    - Tris-아세테이트;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-글루타메이트;
    - 아미노-아세테이트;
    - NaCl;
    - KCl;
    - MgCl2;
    - DTT;
    - 옥틸-b-글리코사이드;
    - NAD (시스템에서 NADH로 전환 수 있음);
    - NADP (시스템에서 NADPH로 전환될 수 있음);
    - 소르비톨;
    - FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생될 수 있음);
    - ATP
    - GTP, UTP, 및/또는 CTP;
    - CoA;
    - PLP; 및
    - SAM, 또는 이의 임의의 조합.
  96. 다음을 포함하는, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 박테리아 배양물로부터 유래한 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 정제된 아데노실 키네이스 (AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
    - 여기서 상기 AdK 및 PPK는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  97. 청구항 96에 있어서, 상기 AdK 효소의 양은 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 AdK 효소 (Gst Adk)를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  98. 청구항 97에 있어서, 상기 PPK 효소의 양은 떼르무스 아쿠아티쿠스로부터 유래한 일정량의 정제된 열안정성 효소 (TaqPPK)를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  99. 청구항 97에 있어서, 상기 Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  100. 청구항 98에 있어서, 상기 TaqPPK는 서열 번호 11를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  101. 청구항 99에 있어서, 일정량의 RNAP는 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 RNAP (Gst RNAP)를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  102. 청구항 101에 있어서, G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 상기 Gst RNAP는 다음의 RNAP 서브유닛을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 서열 번호 1을 가지는 서브유닛 알파;
    - 서열 번호 2를 가지는 서브유닛 베타;
    - 서브유닛 베타' 가지는 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4를 가지는 서브유닛 베타' (opt);
    - 서열 번호 5를 가지는 서브유닛 델타; 및
    - 서열 번호 6을 가지는 서브유닛 오메가.
  103. 청구항 102에 있어서, 상기 세포 추출물은 지오바실러스 세포 추출물을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  104. 청구항 103에 있어서, 상기 지오바실러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  105. 청구항 97에 있어서, 일정량의 소르비톨-탈수소효소 (SDH)를 추가로 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  106. 청구항 105에 있어서, 상기 SDH는 지오바실러스 스테아써모필러스로부터 유래한 재조합 소르비톨-탈수소효소 (Gst SDH)를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  107. 청구항 106에 있어서, 일정량의 소르비톨을 추가로 포함하는 것인, 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템.
  108. 청구항 97에 있어서, 상기 세포 추출물을 재생하기 위해 사용된 동일한 유형의 박테리아로부터 분리된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  109. 청구항 108에 있어서, 상기 세포 추출물을 생성하기 위해 사용된 동일한 박테리아로부터 상기 tRNA의 양은 지오바실러스 tRNA의 양을 포함하며, 상기 세포 추출물은 지오바실러스로부터 유래한 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  110. 청구항 109에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 일정량의 tRNA를 추가로 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  111. 청구항 110에 있어서, 희귀 코돈으로 인한 번역 정지를 방지하도록 구성된 상기 tRNA의 양은 E. coli로부터 분리된 일정량의 tRNA를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  112. 청구항 111에 있어서, 상기 최소 하나의 핵산 합성 주형은 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  113. 청구항 112에 있어서, 상기 선형 DNA 주형은 다음을 가지는 선형 DNA 주형을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 프로모터에 작동 가능하게 연결된 최소 하나의 표적 발현 생성물 유전자;
    - 최소 하나의 리보솜 결합 부위 (RBS);
    - 최소 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
    - 최소 하나의 태그.
  114. 청구항 113에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 표적 발현 생성물 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 텐톡실리신 (TetNT) 유전자를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  115. 청구항 114에 있어서, 상기 TetNT 유전자는 서열 번호 21로 식별되는 재조합 TetNT 유전자를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  116. 청구항 99 및 청구항 XX120에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양은 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  117. 청구항 116에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양이 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템은 상기 Gst Adk:TaqPPK 효소의 몰비가 대략 3:1인 무세포 단백질 발현 시스템을 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  118. 청구항 97및 청구항 117에 있어서, 상기 PPi의 양은 ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 것인, 시험관 내 무세포 단백질 발현 시스템.
  119. 청구항 118에 있어서, ATP 재생 반응의 평형을 유지하는 농도 범위를 포함하는 상기 PPi의 양은 100μl 부피 ATP 재생 반응에서 대략 0.2-2 mg/ml PPi의 농도 범위를 포함하는 시험관 내 단백질 발현 시스템.
  120. 청구항 97에 있어서, 상기 무세포 반응 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 무세포 반응 성분을 포함하는 시험관 내 단백질 발현 시스템:
    - 아미노산;
    - 폴리포스페이트;
    - Tris-아세테이트;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-글루타메이트;
    - 아미노-아세테이트;
    - NaCl;
    - KCl;
    - MgCl2;
    - DTT;
    - 옥틸-b-글리코사이드;
    - NAD (시스템에서 NADH로 전환 수 있음);
    - NADP (시스템에서 NADPH로 전환될 수 있음);
    - 소르비톨;
    - FADH (NADH/FADH 세포 과정에 의해 재생될 수 있음);
    - ATP
    - GTP, UTP, 및/또는 CTP;
    - CoA;
    - PLP; 및
    - SAM, 또는 이의 임의의 조합.
  121. 다음을 포함하는, 에너지 보충 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 일정량의 소르비톨-탈수소효소 (SDH); 및
    - 일정량의 소르비톨.
  122. 다음을 포함하는, 무세포 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 시스템:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 핵산 합성 주형;
    - 다음을 포함하는, 세포 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 에너지 재생 시스템:
    - 일정량의 정제된 열안정성 아데노실 키네이스 (Gst AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (TaqPPK) 효소.
  123. 다음을 포함하는, 열안정성 에너지 보충 무세포 단백질 발현 시스템:
    - 다음을 가지는, 무세포 발현 생물 반응기:
    - 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 모든 무세포 반응 성분을 가지는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물;
    - 최소 하나의 핵산 합성 주형;
    - 일정량의 열안정성 소르비톨-탈수소효소 (tSDH); 및
    - 일정량의 소르비톨.
  124. 다음을 포함하는, 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템:
    - 다음으로 보충되는, ATP-의존적 시스템:
    - 일정량의 정제된 아데노실 키네이스 (AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
  125. 청구항 124에 있어서, 상기 AdK 효소의 양은 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 AdK 효소 (Gst Adk)를 포함하는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템.
  126. 청구항 125에 있어서, 상기 PPK 효소의 양은 떼르무스 아쿠아티쿠스로부터 유래한 일정량의 정제된 열안정성 효소(TaqPPK)를 포함하는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템.
  127. 청구항 125에 있어서, 상기 Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템.
  128. 청구항 126에 있어서, 상기 TaqPPK는 서열 번호 11를 포함하는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템.
  129. 청구항 XX101 및 청구항 XX102에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양은 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템.
  130. 청구항 129에 있어서, 상기 Gst Adk 효소의 양이 상기 TaqPPK 효소의 양보다 많은 무세포 단백질 발현 시스템은 상기 Gst Adk:TaqPPK 효소의 몰비가 대략 3:1인 무세포 단백질 발현 시스템을 포함하는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템.
  131. 다음을 포함하는, 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템:
    - 다음으로 보충되는 ATP-의존적 시스템:
    - 일정량의 정제된 열안정성 아데노실 키네이스 (Gst AdK) 효소; 및
    - 일정량의 정제된 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (TaqPPK) 효소;
    - 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi); 및
    - 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP),
  132. 다음의 단계를 포함하는, 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 무세포 단백질 발현 방법:
    - 호열성 지오바실러스 미생물을 설정하는 단계로서, 상기 호열성 지오바실 러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 단계:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
    - 상기 유전자 조작된 호열성 지오바실러스 미생물의 세포 배양물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 배양물의 세포 용해물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 용해물로부터 유래한 세포 추출물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 추출물에 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 성분을 가지는 반응 혼합물을 형성하는 하나 이상의 무세포 반응 성분을 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 상기 호열성 지오바실러스 미생물과 동일한 균주로부터 유래한 정제된 tRNA를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 E. coli로부터 유래한 정제된 tRNA를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 열안정성 소르비톨-탈수소효소 (Gst SDH)를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 소르비톨로 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 열안정성 아데노실 키네이스 (AdK) 효소를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi)를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP)를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 정제된 열안정성 RNAP (Gst RNAP)를 보충하는 단계;
    - 하나 이상의 발현 산물을 생성하도록 구성된 선형 DNA 합성 주형을 도입하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물을 무세포 발현 생물 반응기에서 배양하는 단계;
    - 상기 무세포 발현 생물 반응기에서 상기 하나 이상의 발현 산물을 생성하는 단계; 및
    - 상기 반응 혼합물로부터 하나 이상의 상기 발현 산물을 분리 및 정제하는 단계.
  133. 다음의 단계를 포함하는, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법:
    - 호열성 지오바실러스 미생물의 세포 배양물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 배양물의 세포 용해물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 용해물로부터 유래한 세포 추출물을 생성하는 단계;
    - 상기 세포 추출물에 시험관 내 거대분자 합성에 필수적인 성분을 가지는 반응 혼합물을 형성하는 하나 이상의 무세포 반응 성분을 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 열안정성 아데노실 키네이스 (AdK) 효소를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 열안정성 폴리포스페이트 키네이스 (PPK) 효소를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 무기 폴리포스페이트 (PPi)를 보충하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물에 일정량의 아데노신 모노포스페이트 (AMP)를 보충하는 단계;
    - 하나 이상의 발현 산물을 생성하도록 구성된 핵산 합성 주형을 도입하는 단계;
    - 상기 반응 혼합물을 무세포 발현 생물 반응기에서 배양하는 단계;
    - 상기 무세포 발현 생물 반응기에서 상기 하나 이상의 발현 산물을 생성하는 단계; 및
    - 상기 반응 혼합물로부터 하나 이상의 상기 발현 선물을 분리 및 정제하는 단계로서, 상기 발현 생성물은 단백질인 단계.
  134. 청구항 133에 있어서, 상기 반응 혼합물에 일정량의 정제된 열안정성 RNAP (Gst RNAP)를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  135. 청구항 133에 있어서, 상기 호열성 지오바실러스는 다음을 위해 유전자 변형되는 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  136. 청구항 133에 있어서, 상기 열안정성 AdK 효소의 양은 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 AdK 효소 (Gst Adk)를 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  137. 청구항 133에 있어서, 상기 열안정성 PPK 효소의 양은 떼르무스 아쿠아티쿠 스로부터 유래한 일정량의 정제된 열안정성 효소 (TaqPPK)를 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  138. 청구항136에 있어서, Gst Adk 효소는 서열 번호 8을 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  139. 청구항 137에 있어서, 상기 TaqPPK는 서열 번호 11를 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  140. 청구항 138에 있어서, 상기 반응 혼합물에 G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 일정량의 RNAP (Gst RNAP)를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  141. 청구항 140에 있어서, G. 스테아로써모필러스로부터 유래한 상기 Gst RNAP는 다음의 RNAP 서브유닛을 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법:
    - 서열 번호 1을 가지는 서브유닛 알파;
    - 서열 번호 2를 가지는 서브유닛 베타;
    - 서브유닛 베타' 가지는 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4를 가지는 서브유닛 베타' (opt);
    - 서열 번호 5를 가지는 서브유닛 델타; 및
    - 서열 번호 6을 가지는 서브유닛 오메가.
  142. 청구항 141에 있어서, 상기 세포 추출물은 지오바실러스 세포 추출물을 포함하는 것인, 무세포 발현 시스템을 통한 단백질 생성 방법.
  143. 무세포 발현 시스템에 사용하기 위한 유전자 변형 호열성 미생물로서, 상기 호열성 지오바실러스 균주는 다음을 위해 유전자 변형되는 유전자 변형 호열성 미생물:
    - OmpT-상동체의 녹아웃 발현;
    - RNaseI의 녹아웃 발현;
    - DNA-메틸화 의존적 DNase의 녹아웃 발현;
    - 배양 밀도-의존적 포자형성 오페론의 발현 감소;
    - 시그마 인자 RpoD 과발현; 및
    - RNA 중합효소 (RNAP), 또는 이의 임의의 조합의 과발현.
  144. 서열 번호 8로 식별되는 재조합 아데노실 키네이스 Gst Adk 폴리펩타이드.
  145. 서열 번호 11로 식별되는 재조합 폴리포스페이트 키네이스 TaqPPK 폴리펩타이드.
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