CN109963941B - 用于操纵腺毛中的大麻素和其他化合物的毛状体特异性启动子 - Google Patents
用于操纵腺毛中的大麻素和其他化合物的毛状体特异性启动子 Download PDFInfo
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Abstract
本技术提供了来自大麻的大麻素生物合成酶基因的毛状体特异性启动子、该毛状体特异性启动子的核苷酸序列以及该启动子用于调节生物体中大麻素和其他化合物的产生的用途。本技术还提供包含毛状体特异性启动子的嵌合基因、载体、以及转基因细胞和生物体，其包括植物细胞和植物。还提供了使用毛状体特异性启动子在细胞和生物体中表达核酸序列的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月20日提交的美国临时专利申请号62/397,212的优先权，其内容在此通过引用以其全部并入。
技术领域
一般而言，本技术涉及来自大麻的大麻素生物合成酶基因的毛状体特异性启动子，该毛状体特异性启动子的核苷酸序列，以及该启动子用于调节大麻素产生或用于调节生物体中生物化学物质的其他毛状体特异性产生的用途。本技术还涉及包含毛状体特异性启动子的转基因细胞和生物体，其包括植物细胞和植物。
背景技术
提供下面的描述以有助于读者理解。提供的信息或引用的参考文献都不被承认是现有技术。
植物毛状体是表皮突起，其包括分枝和未分枝的毛、囊泡、钩、刺和螫毛——覆盖叶、苞和茎。有两种主要类型的毛状体，可以根据它们产生和分泌或储存次级代谢物(即，腺毛和非腺毛)的能力来区分。非腺毛表现出低代谢活性并且主要通过物理手段为植物提供保护。相比之下，存在于许多植物物种(包括一些茄科物种(例如烟草、番茄)和大麻)的叶子上的腺毛具有高度代谢活性并积累代谢物，其可占叶干重的多达10-15％(Wagner et al.,Ann.Bot.93:3-11(2004))。腺毛能够分泌(或储存)次级代谢物作为防御机制。
大麻(Cannabis sativa L.)(大麻(cannabis)、大麻(hemp)、大麻(marijuana))是一种已经栽培了数千年的一年生草本植物，其含有一组独特的次级代谢物，称为大麻素，其构成一组单萜基团分子(terpenophenolics)。大麻素主要在腺毛中合成并积累，所述腺毛在雌花上以高密度存在并且在大麻植物的雄花上以较低密度存在。大麻素在毛状体贮藏腔中的积累对植物有益，因为已知大麻素对其他植物细胞具有细胞毒性，并已显示在大麻和烟草细胞悬浮培养物二者中诱导细胞凋亡(Sirikantaramas et al.,Plant CellPhysiol.46:1578-1582(2005))。大麻素通过三步生物合成过程形成：聚酮化合物形成、芳香族异戊二烯化和环化(图1)。大麻素途径由己酰基-CoA提供，所述己酰基-CoA的形成由己酰基-CoA合成酶催化。大麻素生物合成中的第一个酶促步骤是由四酮体(tetraketide)合成酶(TKS)(称为橄榄醇酸(olivetolic acid)合成酶(OLS1))形成3,5,7-三氧代癸酰-CoA。大麻素生物合成中的第二个酶促步骤是通过橄榄醇酸环化酶(OAC)形成橄榄醇酸。下一步是通过芳香族异戊烯转移酶使橄榄醇酸异戊二烯化形成大麻萜酚酸(CBGA)。CBGA是不同主要种类的大麻素生物合成的中心分支点中间体。CBGA的异戊二烯基侧链的可选环化产生Δ9四氢大麻酚酸(THCA)或其异构体，大麻二酚酸(CBDA)或大麻色烯酸(CBCA)。THCA和CBDA随后在储存或吸烟(smoking)期间通过非酶促反应脱羧，以分别产生Δ9-四氢大麻酚(THC)或大麻二酚(CBD)(图1)。
大麻素是有价值的植物来源的天然产物。大麻制品，如大麻和麻药，因为它们众所周知的精神活性作用已经使用了几个世纪。大麻素因其通过哺乳动物大麻素受体起作用的能力而引起了对医学应用的新兴趣。主要的大麻素包括Δ9-四氢大麻酚(THC)——负责大麻消耗的精神活性和治疗作用的化合物；和大麻二酚(CBD)，其具有神经保护特性。(Gaoni&Mechoulam,J.Am.Chem.Soc.86:1646-1647(1964)；Mechoulam et al.,J.Clin.Pharmacol.42:11S-19S(2002))。THCA是大麻的药物品种中的主要大麻素，而CBDA是纤维或种子生长的大麻形式的主导大麻素。目前正在研究大麻素用于治疗目的，包括治疗慢性疼痛、恶心，控制患有多发性硬化或癫痫的患者的痉挛状态和震颤，以及治疗关节炎。在毛状体中引导大麻素生成的可能性避免了对植物代谢途径和性能的干扰。因此，需要鉴定毛状体特异性启动子以调节生物体——包括转基因植物、转基因细胞及其衍生物——中大麻素的合成，其允许特异性地在毛状体中靶向基因表达。
发明内容
本文公开了毛状体特异性启动子和这些启动子用于引导编码核酸序列在植物毛状体中表达的用途。
在一个方面，本公开内容提供了合成DNA分子，其包含选自下列的核苷酸序列：(a)在SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(b)与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺(trichome gland)特异性转录活性的启动子，和其中所述核苷酸序列与异源核酸可操作地连接。
在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成DNA分子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞(Cannabis sativa cell)。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞(Nicotiana tabacum cell)。
在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成DNA分子。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于茄科。在一些实施方式中，工程化茄科植物是烟草植物。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于大麻科。在一些实施方式中，工程化大麻科植物是大麻植物。在一些实施方式中，本公开内容提供来自遗传工程化植物的种子，其中种子包含嵌合核酸构建体。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:5中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:6中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:8中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:9中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:9的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:11中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:11的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:12中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:12的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:13的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:14中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:14的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:16中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:16的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:17的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:18中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:18的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:19中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:19的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:21中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:21的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:22中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:22的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:23中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:23的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:24中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:24的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:25中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:25的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:26的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:28中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:28的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:29中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:29的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:31中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:31的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:32中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:32的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在SEQ ID NO:33中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与SEQ ID NO:33的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一个方面，本公开内容提供了遗传工程化植物或植物细胞，其包含整合到其基因组中的嵌合基因，该嵌合基因包含与同源或异源核酸序列可操作地连接的毛状体特异性启动子，其中该启动子选自：(a)SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列；和(b)与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。
在一些实施方式中，遗传工程化植物或植物细胞属于茄科。在一些实施方式中，茄科植物是烟草。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于大麻科。在一些实施方式中，工程化大麻科植物是大麻。
在一个方面，本公开内容提供了用于在植物毛状体中表达多肽的方法，其包括(a)将包括如此核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：(i)在SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(ii)与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地连接至编码多肽的一种或多种核酸序列；和(b)在允许多肽表达的条件下使植物生长。
在另一个方面，本公开内容提供了用于增加宿主植物毛状体中的大麻素的方法，其包括(i)将包括如此核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：(a)在SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(ii)与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地连接至编码大麻素生物合成途径的酶的一种或多种核酸序列；和(b)在允许大麻素生物合成途径酶表达的条件下使植物生长；其中大麻素生物合成途径酶的表达导致相对于在类似条件下生长的对照植物具有增加的大麻素含量。
在该方法的一些实施方式中，大麻素生物合成途径酶是大麻二酚酸(CBDA)合成酶、大麻色烯酸(CBCA)合成酶或Δ9四氢大麻酚酸(THCA)合成酶。
在一些实施方式中，该方法进一步包括给植物提供大麻萜酚酸(CBGA)。
在一些实施方式中，本公开内容提供了用于产生遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物相对于对照植物具有增加的Δ9-四氢大麻酚(THC)、大麻色原烯(CBC)和/或大麻二酚(CBD)含量。
本文描述和要求保护的技术具有许多属性和实施方式，其包括但不限于本发明内容中阐述或描述或引用的那些。其并非旨在包括所有内容，并且本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中标识的特征或实施方式或被其限制，包括其仅出于说明的目的而不是限制的目的。可以在下面的具体实施方式中公开另外的实施方式。
在一个方面，本公开内容提供了包括核苷酸序列的合成DNA分子，所述核苷酸序列选自：(a)在SEQ ID NO:31、32或33中任一个中列出的核苷酸序列；和(b)与SEQ ID NO:31、32或33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子，其中核苷酸序列可操作地连接至异源核酸。
在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成DNA分子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞。
在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成DNA分子。在一些实施方式中，工程化植物是烟草植物。在一些实施方式中，工程化植物是大麻植物。
在一些实施方式中，本公开内容提供了来自5的任一种的工程化植物的种子，其中所述种子包括嵌合核酸构建体。
在一个方面，本公开内容提供了包括如在SEQ ID NO:33中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成DNA分子。
在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞。
在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成DNA分子。在一些实施方式中，工程化植物是烟草植物。在一些实施方式中，工程化植物是大麻植物。
在一些实施方式中，本公开内容提供了来自工程化植物的种子，其中种子包含嵌合核酸构建体。
附图说明
图1描绘导致大麻中主要大麻素Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)和大麻二酚酸(CBDA)形成的大麻素生物合成途径。
图2A-2B显示了本文所述实验中使用的启动子：报道基因设计。每个启动子与GUS报道基因融合，并且染色后通过蓝色指示启动子活性(图2A)。图2B是烟草毛状体中大麻素生物合成酶基因启动子的毛状体特异性表达的完整叶视图。显示了代表性启动子(CBDA合成酶20800基因启动子)的结果。来自大麻素生物合成途径中的其他启动子的结果是定性相同的(未显示)。图2B显示报道基因的表达局限于毛状体。
图3显示来自烟草毛状体中完整大麻素生物合成途径的启动子的毛状体特异性表达。由GUS报道基因的活性引起的蓝色表示启动子活性。来自该途径中每个基因的代表性启动子显示毛状体特异性表达，并且因此来自该途径中基因的所有启动子将引导在毛状体中的表达。
图4A显示本技术的4x大麻素On(CANON)片段合成启动子的设计。图4B显示本技术的4x CANON片段合成启动子的毛状体特异性表达。合成启动子的活性由GUS报道基因活性引起的蓝色指示。
具体实施方式
I.介绍
本技术涉及发现参与大麻素生物合成途径的酶的二十三种毛状体特异性启动子的核酸序列：(1)橄榄醇(olivetol)合成酶(OLS；也称为四酮体合成酶)启动子；(2)OLS1启动子；(3)OLS2启动子；(4)橄榄醇酸环化酶(OAC)启动子；(5)OAC1启动子；(6)芳香族异戊烯转移酶(PT)启动子；(7)PT1启动子；(8)己酰基-CoA合成酶(AAE1-1)启动子；(9)己酰基-CoA合成酶(AAE1-1')启动子；(10)己酰基-CoA合成酶(AAE3)启动子；(11)己酰基-CoA合成酶(AAE12)启动子；(12)CBDA合成酶(CBDAS)启动子；(13)CBDA合成酶1(CBDAS1)启动子；(14)CBDA合成酶(CBDAS)20800启动子；(15)CBDA合成酶(CBDAS)20800'启动子；(16)THCA合成酶(THCAS)19603启动子；(17)THCA合成酶(THCAS)19603'启动子；(18)THCA合成酶(THCAS)50320启动子；(19)THCA合成酶(THCAS)50320'启动子；(20)THCA合成酶(THCAS)1330启动子；(21)THCA合成酶(THCAS)1330'启动子；(22)CBDA合成酶(CBDAS)3498启动子；(23)CBDA合成酶(CBDAS)3498'启动子。
已经确定了每种启动子的核酸序列。(i)橄榄醇合成酶(OLS)启动子、(ii)OLS1启动子和(iii)OLS2启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中列出，并且OLS的开放阅读框(ORF)在SEQ ID NO:4中列出。橄榄醇酸环化酶(OAC)启动子的核酸序列在SEQ ID NO:5列出，OAC1启动子的核酸序列在SEQ ID NO:6中列出和OAC的ORF在SEQ ID NO:7中列出。芳香族异戊烯转移酶(PT)启动子的核酸序列在SEQ ID NO:8中列出，PT1启动子的核酸序列在SEQ ID NO:9中列出，并且PT的ORF在SEQ ID NO:10中列出。(i)己酰基-CoA合成酶(AAE1-1)启动子、(ii)己酰基-CoA合成酶(AAE1-1')启动子、(iii)己酰基-CoA合成酶(AAE3)启动子和(iv)己酰基-CoA合成酶(AAE12)启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:11、12、13和14中列出，并且己酰基-CoA(AAE-1)的ORF在SEQ ID NO:15中列出。(i)CBDA合成酶(CBDAS)启动子、(ii)CBDAS合成酶1(CBDAS1)启动子、(iii)CBDA合成酶(CBDAS)20800启动子和(iv)CBDA合成酶(CBDAS)20800'启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:16、17、18和19中列出，并且CBDA合成酶(CBDAS)的ORF的核酸序列在SEQ ID NO:20中列出。(i)THCA合成酶(THCAS)19603启动子、(ii)THCA合成酶(THCAS)19603'启动子、(iii)THCA合成酶(THCAS)50320启动子、(iv)THCA合成酶(THCAS)50320'启动子、(v)THCA合成酶(THCAS)1330启动子和(vi)THCA合成酶(THCAS)1330'启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26中列出，并且THCAS的ORF在SEQ ID NO:27中列出。CBCA合成酶(CBCAS)3498启动子的核酸序列在SEQ IDNO:28中列出，CBCA合成酶(CBCAS)3498'启动子的核酸序列在SEQ ID NO:29中列出，和CBCA合成酶(CBCAS)的ORF在SEQ ID NO:30中列出。
本技术还涉及发现足以引导毛状体特异性表达的“大麻素On”或“CANON”启动子片段的核酸序列。足以在腺毛中引导毛状体特异性表达的CANON片段的核酸序列在SEQ IDNO:31中列出。包括共有CANON片段的四个拷贝的4x CANON片段合成启动子的核酸序列在SEQ ID NO:33中列出。
鉴于大麻素如THC对植物细胞的已知细胞毒性作用，在强的遍在启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S下驱动其产生的基因的表达可能导致整个植物中代谢途径的扰动并且可能对植物发育和生理学具有有害后果。因此，毛状体作为与植物其余部分具有有限通信的独特实体，代表了代谢工程化的潜在目标。
因此，在一些实施方式中，本技术提供来自大麻素生物合成基因或其生物活性片段的先前未发现的毛状体特异性启动子，其可用于遗传操纵宿主植物中大麻素(例如，THC、CBD、CBC、CBG)的合成，所述宿主植物例如大麻、茄科的植物，以及不天然产生大麻素的其他植物科和种。
II.定义
本说明书中使用的所有技术术语在生物化学、分子生物学和农业中通常使用；因此，本技术所属领域的技术人员可以理解它们。那些技术术语可以在例如以下中发现：Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook and Russel(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)；CurrentProtocols In Molecular Biology,ed.Ausubel等人(Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience,New York,1988)(包括定期更新)；Short Protocols InMolecular Biology:A Compendium Of Methods From Current Protocols In MolecularBiology 5th ed.,vol.1-2,ed.Ausubel等人(John Wiley&Sons,Inc.,2002)；GenomeAnalysis:A Laboratory Manual,vol.1-2,ed.Green等人(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997)。涉及植物生物学技术的方法在此处描述，并且也在论文比如Methods In Plant Molecular Biology:A Laboratory CourseManual,ed.Maliga等人(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995)中详细描述。
“嵌合核酸”包含与核苷酸序列连接的编码序列或其片段，所述核苷酸序列不同于天然存在编码序列的细胞中与其相关联的核苷酸序列。
术语“编码(encoding)”和“编码(coding)”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程，从该细胞可以将一系列氨基酸组装成特定的氨基酸序列以产生活性酶。由于遗传密码的简并性，DNA序列中的某些碱基变化不会改变蛋白质的氨基酸序列。
“内源核酸”或“内源序列”对于待遗传工程化的植物或生物体是“天然的”，即固有的。它是指存在于待遗传工程化的植物或生物体的基因组中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。
“外源核酸”是指通过人类的努力引入细胞(或细胞的祖先)的核酸、DNA或RNA。这种外源核酸可以是在其所引入的细胞中天然发现的序列的拷贝或其片段。
如本文所用，“表达”表示通过基因的转录或由核苷酸序列编码的多肽产物的产生来产生RNA产物。“过表达”或“上调”用于表示相对于对照细胞或植物，通过遗传工程化增加了细胞或植物——包括其衍生的所有后代植物——中特定基因序列或其变体的表达。
“遗传工程化”包括用于将核酸或特定突变引入宿主生物体的任何方法。例如，当用抑制基因表达的多核苷酸序列转化植物时——使得与对照植物相比靶基因的表达降低，植物被遗传工程化。在本背景下，“遗传工程化”包括转基因植物和植物细胞。遗传工程化的植物或植物细胞可以是任何天然方法的产物(即，不涉及外源核苷酸序列)——通过仅引入源自宿主植物物种或性相容的植物物种的核酸序列实施。参见，例如，美国专利申请号2004/0107455。
“异源核酸”或“同源核酸”是指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体之间的关系，尤其是在转基因生物体的背景下。在宿主物种中天然存在同源序列(例如，用大麻基因转化的大麻植物)，而在宿主细胞中不天然存在异源序列(例如，用来自大麻植物的序列转化的烟草植物)。此类异源核酸可包含片段，所述片段是天然存在于其所引入的细胞中的序列的拷贝或其片段。取决于上下文，术语“同系物”或“同源的”可替代地指代为来自共同祖先序列的后代的序列(例如，它们可以是直向同源物)。
“增加”、“减少”、“调节”、“改变”等是指与在未经导致增加、减少、调节或改变的修饰的相似条件下生长的类似品种、品系或细胞的比较。在一些情况下，这可以是非转化的对照、模拟转化的对照或载体转化的对照。
“分离的核酸分子”是指已从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本技术的目的，认为DNA构建体中包含的重组DNA分子是分离的。分离的DNA分子的进一步实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中部分或基本纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本技术的DNA分子的体外RNA转录物。根据本技术，分离的核酸分子还包括合成产生的这种分子。
“植物”是包括完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、分化或未分化的植物细胞及其后代的术语。植物材料包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、茎、果实、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“植物细胞培养物”是指植物单元的培养物，例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵和处于不同发育阶段的胚。在本技术的一些实施方式中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中转基因组织或细胞培养物包含本技术的核酸分子。
“启动子”意指转录起始上游的DNA区，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。“组成型启动子”是在植物的整个寿命期间和在大多数环境条件下具有活性的启动子。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成一类“非组成型启动子”。与在植物的根、叶、茎或其他组织中的表达相比，“毛状体特异性启动子”是优先引导毛状体组织中可操作地连接基因的表达的启动子。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，“可操作地连接”意指连接的核酸序列是连续的。
在两个多核苷酸(核酸)或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括提及当在特定区内对齐以获得最大对应性时，两个序列中相同的残基。当使用序列同一性百分比提及蛋白质时，认识到不同一的残基位置的差异通常在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有类似化学性质(比如电荷和疏水性)的氨基酸残基置换，并且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守置换方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正置换的保守性质。据说通过这种保守置换而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评分为部分而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当给予相同的氨基酸得分为1并且给予非保守置换得分为零时，保守置换被给予0和1之间的得分。例如根据Meyers&Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)的算法，计算保守置换的得分，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中实施的。
在本说明书中使用序列同一性百分比表示通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的值，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)。通过确定在两个序列中出现同一核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比，来计算百分比。
术语“抑制”或“下调”同义使用以指示相对于对照细胞或植物，通过遗传工程化降低了细胞或植物(包括其衍生的所有后代植物)中其特定基因序列变体的表达。
“毛状体”在本文中涵盖不同类型的毛状体，腺毛和/或非腺毛二者。
“毛状体细胞”是指构成毛状体结构例如腺或分泌细胞、基础细胞和茎、或条纹细胞、细胞外腔和角质层细胞。毛状体也可以由一个单细胞组成。
“大麻”或“大麻植物”是指大麻属中产生大麻素的任何物种，例如大麻及其种间杂种。
“变体”是偏离特定基因或多肽的标准或给定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语“同工型(isoform)”、“同种型(isotype)”和“类似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。通过添加、去除或置换一个或多个氨基酸或核苷酸序列的改变而改变的氨基酸序列可以被认为是变体序列。多肽变体可具有“保守”变化，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸置换亮氨酸。多肽变体可具有“非保守”变化，例如用色氨酸取代甘氨酸。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如Vector NTI Suite(InforMax,MD)软件，找到确定哪些氨基酸残基可被置换、插入或缺失的指导。变体也可以指“改组基因”，例如在Maxygen受让的专利中描述的那些(参见，例如，美国专利号6,602,986)。
如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且将在一些程度上取决于其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在其所使用的上下文中对于本领域普通技术人员而言是不清楚的，则“约”将意味着多至特定术语的加或减10％。
术语“生物活性片段”或“功能片段”或“具有启动子活性的片段”是指能够在一种或多种不同类型的植物组织和器官上发现的一种或多种毛状体类型和/或一种或多种毛状体细胞中赋予转录的核酸片段。生物活性片段赋予毛状体特异性和/或至少毛状体优选的表达，并且它们优选具有与SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11-15的启动子至少相似的强度(或更高强度)。这可以通过用这样的片段——优选地可操作地连接到报道基因——转化植物，并定性地(时空转录)和/或定量地测定毛状体中的启动子活性来测试。在一些实施方式中，当在腺毛中测量时，本技术的启动子和/或启动子片段的强度定量地与CaMV 35S启动子的强度相同或更高。在一些实施方式中，本文所述的毛状体启动子的生物活性片段可为启动子的全长序列核酸序列的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在其他实施方式中，本文描述的毛状体启动子的生物活性核酸片段可以是，例如，至少约10个连续核酸。在又其他实施方式中，本文所述的毛状体启动子的生物活性核酸片段可以是(1)OLS启动子(例如，SEQID NO:1)的约10个连续核酸上至约554个连续核酸；(2)OLS1启动子(SEQ ID NO:2)的约10个连续核酸上至约550个连续核酸；(3)OLS2启动子(SEQ ID NO:3)的约10个连续核酸上至约558个连续核酸；(4)OAC启动子(例如，SEQ ID NO:5)的约10个连续核酸上至约996个连续核酸；(5)OAC1启动子(例如，SEQ ID NO:6)的约10个连续核酸上至约992个连续核酸；(6)PT启动子(例如，SEQ ID NO:8)的约10个连续核酸上至约1361个连续核酸；(7)PT1启动子(例如，SEQ ID NO:9)的约10个连续核酸上至约1357个连续核酸；(8)AAE1-1启动子(例如，SEQID NO:11)的约10个连续核酸上至约805个连续核酸；(9)AAE1-1'启动子(例如，SEQ ID NO:12)的约10个连续核酸上至约800个连续核酸；(10)AAE3启动子(例如，SEQ ID NO:13)的约10个连续核酸上至约1000个连续核酸；(11)AAE12启动子(例如，SEQ ID NO:14)的约10个连续核酸上至约869个连续核酸；(12)CBDA合成酶启动子(例如，SEQ ID NO:16)的约10个连续核酸上至约420个连续核酸；(13)CBDAS1启动子(例如，SEQ ID NO:17)的约10个连续核酸上至约416个连续核酸；(14)CBDAS 20800启动子(例如，SEQ ID NO:18)的约10个连续核酸上至约535个连续核酸；(15)CBDAS 20800'启动子(例如，SEQ ID NO:19)的约10个连续核酸上至约531个连续核酸；(16)THCAS 19603启动子(例如，SEQ ID NO:21)的约10个连续核酸上至约800个连续核酸；(17)THCAS 19603'启动子(例如，SEQ ID NO:22)的约10个连续核酸上至约796个连续核酸；(18)THCAS 50320启动子(例如，SEQ ID NO:23)的约10个连续核酸上至约796个连续核酸；(19)THCAS 50320'启动子(例如，SEQ ID NO:24)的约10个连续核酸上至约792个连续核酸；(20)THCAS 1330启动子(例如，SEQ ID NO:25)的约10个连续核酸上至约720个连续核酸；(21)THCAS 1330'启动子(例如，SEQ ID NO:26)的约10个连续核酸上至约716个连续核酸；(22)CBCAS 3498启动子(例如，SEQ ID NO:28)的约10个连续核酸上至约804个连续核酸；或(23)CBCAS 3498'启动子的(例如，SEQ ID NO:29)约10个连续核酸上至约800个连续核酸。在又其他实施方式中，毛状体启动子的生物活性片段可以是这两个量之间的任何值的连续核酸，例如但不限于约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250或约1300个连续核酸。
III.使用毛状体特异性启动子对宿主细胞和生物体的遗传工程化
A.毛状体特异性启动子
本技术的公开内容涉及鉴定二十三种启动子，其能够调节在毛状体细胞中与其可操作地连接的编码核酸序列的转录。
因此，本技术提供了分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中的任一个中描述的核酸序列至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一的核酸序列，其中核酸序列能够调节在毛状体细胞中可操作地连接至其的编码核酸序列的转录。两个核酸序列之间的差异可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，单独地散布在参考序列中的核苷酸之间或参考序列内的一个或多个连续基团中。
本技术还包括SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的生物活性“变体”，其中一个或更多个碱基缺失、置换、插入或添加，其中核酸序列能够调节在毛状体细胞中可操作地连接至其的编码核酸序列的转录。SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的变体包括核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的核酸序列同一性，并且它们的活性是毛状体特异性的。
在本技术的一些实施方式中，使用本领域已知的方法，例如基于PCR的DNA修饰或标准诱变技术，或通过化学合成修饰的多核苷酸，来修饰多核苷酸(启动子)以产生分子序列的变异，比如以增强其促进(promoting)活性。
因此，在SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的序列可以被截短或缺失并仍然保留引导可操作连接的核酸序列在毛状体中转录的能力。启动子区的最小长度可以通过本领域已知的标准技术系统地从分离的多核苷酸的5'和3'末端去除序列来确定，其包括但不限于去除限制酶片段或用核酸酶消化。
本技术的毛状体特异性启动子也可用于表达将降低或抑制植物中天然基因表达的核酸。此类核酸可编码反义核酸、核酶、有义抑制剂或抑制天然基因表达的其他产品。
本技术的毛状体特异性启动子也可用于在“分子农业”应用中表达蛋白质或肽。此类蛋白质或肽包括但不限于工业酶、抗体、治疗剂和营养产品。
在一些实施方式中，可以通过许多方法设计或工程化新的杂交启动子。许多启动子含有上游序列，其激活、增强或限定启动子的强度和/或特异性。参见，例如，Atchison,Ann.Rev.Cell Biol.4:127(1988)。例如，T-DNA基因含有限定转录起始位点的“TATA”盒，并且位于转录起始位点上游的其他上游元件调节转录水平。
B.用于毛状体特异性表达的大麻素On(CANON)片段
在一些实施方式中，本技术的公开内容还涉及鉴定称为“大麻素On”或“CANON”片段的核酸分子，其足以引导可操作地连接至其的编码核酸序列的毛状体特异性表达。
171-碱基对CANON片段(SEQ ID NO:31)在下表1中示出。共有的CANON片段(突出显示的)与推定的TATA盒(粗体下划线)、5'UTR和起始密码子(以粗体下划线示出的“atg”)一起如表1中的SEQ ID NO:32所示。该共有序列衍生自来自THCA合成酶19603、1330和50320，CBCA合成酶3498和CBDA合成酶20800的毛状体特异性启动子。171-碱基对CANON片段(SEQID NO：31)足以引导烟草(和大麻)的腺毛中的毛状体特异性表达。
在最小启动子(即TATA盒，转录起始和第一个ATG)的一个拷贝前面包含四个拷贝的CANON片段的核酸序列(其称为“4x CANON片段合成启动子”)也如表1中的SEQ ID NO:33所示。SEQ ID NO:33的第一个CANON片段以粗体显示，接着是以下划线显示的第二个片段，接着是粗体的第三个片段，以及下划线的第四个片段。
CANON片段足以以功能获得启动子中引导毛状体特异性表达。不希望受理论束缚，据信CANON片段负责许多大麻素生物合成酶基因(包括THCA、CBDA和CBCA合成酶)的毛状体特异性表达。
C.核酸构建体
在一些实施方式中，本技术的毛状体特异性启动子序列和CANON片段或其生物活性片段可以并入核酸构建体例如表达构建体(即表达载体)中，其可以在宿主细胞如植物毛状体细胞中引入并复制。此类核酸构建体可包括与本技术的任何启动子序列或CANON片段可操作地连接的异源核酸。因此，在一些实施方式中，本技术提供SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的任何启动子或CANON片段或其生物活性片段用于在重组细胞或生物体(例如植物细胞或植物)中表达同源或异源核酸序列的用途。在一些实施方式中，该用途包括可操作地连接SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的任何启动子或CANON片段或其生物活性片段至同源或异源核酸序列，以形成核酸构建体；和转化宿主，例如植物或植物细胞。在一些实施方式中，编码参与生产大麻素的生物合成途径的酶的各种基因(例如，SEQ ID NO:4、7、10、15、20、27或30中列出的核酸序列的至少一种)可以适合作为可以与本技术的毛状体特异性启动子或CANON片段可操作地连接的转基因。在一些实施方式中，本技术的核酸构建体调节一种或多种调节大麻素生物合成的蛋白质的表达。在一些实施方式中，本技术的核酸构建体可用于调节毛状体细胞中大麻素或其他化合物(例如萜烯)的表达。
在一些实施方式中，表达载体包含启动子或CANON片段，所述启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，植物细胞系包含表达载体，所述表达载体包含启动子或CANON片段，所述启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，转基因植物包含表达载体，所述表达载体包含启动子或CANON片段，所述启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，提供了用于遗传调节大麻素产生的方法，包括：引入包含启动子或CANON片段的表达载体，所述启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。
在另一个实施方式中，表达载体包含一种或多种启动子或CANON片段，所述一种或多种启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，植物细胞系包含一种或多种启动子，所述一种或多种启动子包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，转基因植物包含一种或多种启动子或CANON片段，所述一种或多种启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。在另一个实施方式中，提供了用于遗传调节大麻素产生水平的方法，包括：向宿主细胞中引入包含一种或多种启动子或CANON片段的表达载体，所述一种或多种启动子或CANON片段包含选自SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其与编码多肽的cDNA可操作地连接，所述多肽例如橄榄醇酸成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一种或多种。
构建体可以包含在载体内，例如适于在合适的宿主(植物)细胞中表达的表达载体内。应当理解，能够产生包含引入的DNA序列的植物的任何载体都将是足够的。
合适的载体是本领域技术人员熟知的，并且描述于一般技术参考文献中，例如Pouwels et al.,Cloning Vectors,A Laboratory Manual,Elsevier,Amsterdam(1986)。已经描述了用于植物转化的载体(参见，例如，Schardl et al.,Gene 61:1-14(1987))。在一些实施方式中，核酸构建体是质粒载体或二元载体。合适载体的实例包括Ti质粒载体。
能够在毛状体特异性调节序列(例如，启动子、CANON片段)控制下引入核苷酸序列或嵌合基因的重组核酸构建体(例如，表达载体)可以使用本领域公知的标准技术制备。为了生成嵌合基因，表达载体通常包含以5'至3'方向可操作地连接的毛状体特异性启动子序列或CANON序列——其引导下游同源或异源核酸序列的转录，并且任选地随后是3'非翻译核酸区(3'-UTR)——其编码多腺苷酸化信号，该信号在植物细胞中起作用以引起转录终止和将多聚腺苷酸核苷酸添加至编码蛋白质的mRNA的3'末端。同源或异源核酸序列可以是编码蛋白质或肽的序列，或者它可以是转录成活性RNA分子的序列，例如适合于沉默宿主细胞或生物体中基因或基因家族的有义和/或反义RNA。表达载体通常还含有可选择标记。典型的5'至3'调节序列包括转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
在一些实施方式中，本技术的表达载体可以含有终止序列，其位于本技术的核酸分子的下游，使得终止mRNA的转录，并添加polyA序列。示例性终止子包括根癌土壤杆菌胭脂氨酸合成酶终止子(Tnos)、根癌土壤杆菌甘露氨酸合成酶终止子(Tmas)和CaMV 35S终止子(T35S)。终止区包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基终止区(TrbcS)或Tnos终止区。表达载体还可含有增强子、起始密码子、剪接信号序列和靶向序列。
在一些实施方式中，本技术的表达载体可含有选择标记，通过该选择标记可在培养物中鉴定转化的细胞。标记可以与异源核酸分子相关联——即与启动子可操作地连接的基因。如本文所用，术语“标记”是指编码性状或表型的基因，其允许选择或筛选含有标记的植物或细胞。例如，在植物中，标记基因将编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或转染的细胞中选择转化细胞。
合适的可选择标记的实例包括但不限于腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦和草铵膦抗性、以及氨基糖苷3'-O-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。这些标记可包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。该构建体还可含有可选择标记基因bar，其赋予对除草剂膦丝菌素类似物如草铵膦铵盐(ammonium gluphosinate)的抗性。参见，例如，Thompson et al.,EMBO J.9:2519-23(1987)。也可以使用本领域已知的其他合适的选择标记。
可以使用可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。还描述了基于细胞分裂控制来鉴定或选择转化植物的方法。参见，例如WO 2000/052168和WO 2001/059086。
还可包括细菌或病毒来源的复制序列，以允许将载体克隆到细菌或噬菌体宿主中。优选地，使用广泛宿主范围的原核复制起点。可以包括细菌的可选择标记以允许选择携带所需构建体的细菌细胞。合适的原核可选择标记还包括对抗生素如卡那霉素或四环素的抗性。
如本领域已知的，编码额外功能的其他核酸序列也可以存在于载体中。例如，当土壤杆菌是宿主时，可以包括T-DNA序列以促进随后转移至和并入植物染色体。
本技术的核酸序列或其生物活性片段是否能够在毛状体中特异性地赋予转录以及活性是否“强”，可以使用各种方法确定。定性方法(例如，组织学GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)染色)用于确定启动子或CANON片段的时空活性(即，启动子或CANON片段在某些组织或器官(例如，毛状体，或在某些环境/发育条件下)中是否有活性。定量方法(如荧光GUS分析)也量化与对照相比的活性水平。合适的对照包括但不限于转化有空载体(阴性对照)的植物或转化有包含其他启动子例如拟南芥CER6启动子(其在烟草的表皮和毛状体中具有活性)的构建体的植物。
为了测试或量化本技术的启动子或CANON片段的活性，如SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的核酸序列或其生物活性片段可以与已知的核酸序列(例如，报道基因，例如gusA，或编码特定蛋白质的任何基因)可操作地连接，并且可以用于使用已知方法转化植物细胞。例如，可以通过定量RT-PCR或其他基于PCR的方法检测毛状体细胞中下游核酸序列的RNA转录物水平来测定(和任选地定量)启动子或CANON片段的活性。可选地，如果报道基因是gus基因，则可以通过例如荧光GUS分析来测定和定量报道蛋白或者报道蛋白的活性。
在一些实施方式中，本技术的启动子可用于驱动毛状体细胞中目的异源核酸的表达。异源核酸可以编码任何人造重组或天然存在的多肽或蛋白质，比如分别在SEQ ID NO:4、7、10、15、20、27和30中列出的大麻素生物合成途径酶，橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、THCA合成酶或CBCA合成酶。
D.宿主植物和细胞以及植物再生
本技术的核酸构建体可用于转化宿主细胞，例如植物细胞。在一些实施方式中，本技术的核酸构建体用于转化植物细胞的至少一部分。这些表达载体可以短暂引入宿主植物细胞或稳定整合到宿主植物细胞的基因组中，以通过本领域技术人员已知的各种方法生成转基因植物。
将核酸构建体引入细胞或植物的方法是本领域熟知的。用于将核酸构建体(例如，表达载体)引入植物毛状体以生成转基因植物的合适方法包括但不限于土壤杆菌介导的转化、粒子枪递送、显微注射、电穿孔、聚乙二醇辅助原生质体转化和脂质体介导的转化。转化双子叶植物的方法主要使用根癌土壤杆菌。
发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可用于产生植物的转基因毛状根培养物，所述植物包括大麻和烟草，如Guillon et al.,Curr.Opin.Plant Biol.9:341-6(2006)所描述的。“烟草毛状根”是指烟草根，其具有来自发根土壤杆菌的Ri质粒的T-DNA，该Ri质粒整合在基因组中并在培养物中在不补充生长素和其他植物激素的情况下生长。
另外，植物可以通过根瘤菌(Rhizobium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)或中生根瘤菌(Mesorhizobium)转化进行转化。(Broothaerts et al.,Nature 433:629-633(2005))。
在转化植物细胞或植物后，可以通过诸如抗生素抗性、除草剂抗性、对氨基酸类似物的耐受性或使用表型标记的方法选择其中并入了所需DNA的那些植物细胞或植物。
转基因植物可用于常规植物育种方案，例如杂交、自交或回交，以产生含有转基因的额外转基因植物。
适合的宿主细胞包括植物细胞。任何植物可以是适合的宿主，包括单子叶植物或双子叶植物，比如，例如玉米/谷物(玉蜀黍属物种，例如玉蜀黍、二倍体多年生类玉米(Z.diploperennis)(chapule)、大刍草(Zea luxurians)(危地马拉墨西哥类蜀黍(Guatemalan teosinte))、玉蜀黍亚种、huehuetenangensis(圣安东尼奥Huista墨西哥类蜀黍)、玉蜀黍亚种mexicana(墨西哥类蜀黍)、玉蜀黍亚种亚种parviglumis(巴尔萨斯河墨西哥类蜀黍)、四倍体多年生类玉米(Z.perennis)(多年生墨西哥类蜀黍)和Z.ramosa)，小麦(小麦属物种)，大麦(例如，栽培大麦(Hordeum vulgare))，燕麦(例如，栽培燕麦(Avenasativa))，高粱(栽培高粱(Sorghum bicolor))，黑麦(栽培黑麦(Secale cereale))，大豆(甘氨酸某些种，例如栽培大豆(G.max))，棉(棉属物种，例如，陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))，芸苔属植物某些种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、芜青(B.rapa)等)，向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthus annus))，烟草(烟草属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(稻属物种，例如，栽培稻籼稻品种群(O.sativa indica cultivar-group)或粳稻品种群)，饲草，狼尾草(狼尾草属物种，例如，御谷(P.glaucum))，树物种，蔬菜物种，比如，番茄属某些种(最近重新分类为属于茄属植物)，例如番茄(L.esculentum，同义Solanum lycopersicum)，比如例如，樱桃番茄、观赏番茄变种(var.cerasiforme)或当前番茄、醋栗番茄变种(var.pimpinellifolium)或树番茄(S.betaceum，同义Cyphomandra betaceae)，土豆(马铃薯)和其他茄属植物物种，比如茄子(栽培茄(Solanum melongena))，茄瓜(S.muricatum)，可可娜(S.sessiliflorum)和奎东茄(S.quitoense)；胡椒(川椒(Capsicum annuum)、观赏辣椒(Capsicum frutescens))，豌豆(pea)(例如，豌豆(Pisum sativum))，豆科植物(例如，菜豆属物种)，胡萝卜(Daucus carona)，莴苣属物种(比如叶用莴苣(Lactuca sativa)、山莴苣(Lactuca indica)、山莴菊(Lactuca perennis))，黄瓜(cucumber)(黄瓜(Cucumissativus))，甜瓜(香瓜)，绿皮西葫芦(zucchini)(西葫芦(Cucurbita pepo))，南瓜属植物(笋瓜(Cucurbita maxima)、西葫芦、墨西哥南瓜(Cucurbita mixta))，南瓜(pumpkin)(西葫芦)，西瓜(watermelon)(西瓜(Citrullus lanatus)，同义西瓜(Citrullus vulgaris))，肉果物种(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、甜瓜)，观赏植物物种(例如，玫瑰、矮牵牛花、菊花、百合花、郁金香、非洲菊物种)，木本树木(例如，杨属、柳属、栎属、桉属的物种)，纤维物种，例如，亚麻(亚麻科植物亚麻(Linum usitatissimum))，和大麻类植物(大麻)。在一些实施方式中，植物是大麻。在一些实施方式中，植物是烟草。
因此，在一些实施方式中，本技术考虑使用毛状体特异性启动子和/或CANON片段，其包含在SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的核酸序列，或其生物活性片段，以遗传操纵大麻素(例如，THC、CBD、CBC)或宿主植物(例如大麻)、茄科植物(例如烟草)和不天然产生大麻素的其他植物科和种中的其他分子的合成。
本技术还预期细胞培养系统(例如，植物细胞培养物、细菌或真菌细胞培养物、人或哺乳动物细胞培养物、昆虫细胞培养物)，其包含用本文所述核酸分子转化的遗传工程化细胞。在一些实施方式中，提供了包含含有本技术的启动子或CANON片段的细胞的细胞培养物。
可以使用各种分析来确定植物细胞是否显示基因表达的变化，例如，RNA印迹或定量逆转录酶PCR(RT-PCR)。可以通过常规方法从转化细胞再生整个转基因植物。这些转基因植物可以繁殖并自花授粉以产生纯合系。这些植物产生含有引入性状的基因的种子，并且可以生长以产生将产生所选表型的植物。
为了增强目的分子在毛状体细胞中的表达和/或积累和/或促进从毛状体细胞中纯化分子，可以使用下调植物毛状体内源的至少一种分子的方法。已知毛状体含有许多化合物和代谢物，其干扰毛状体细胞中其他分子的产生。这些化合物和代谢物包括，例如，蛋白酶、多酚氧化酶(PPO)、多酚、酮、萜类化合物和生物碱。已经描述了这种毛状体组分的下调。参见，例如，美国专利号7,498,428。
实施例
仅以说明的方式而不是以限制性的方式提供以下实施例。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。这些实施例决不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
实施例1：鉴定毛状体特异性启动子
(i)橄榄醇合成酶(OLS)启动子、(ii)OLS1启动子和(iii)OLS2启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中列出，和OLS的开放阅读框(ORF)在SEQ ID NO:4中列出。橄榄醇酸环化酶(OAC)启动子的核酸序列在SEQ ID NO:5中列出，OAC1启动子的核酸序列在SEQ IDNO:6中列出，和OAC的ORF在SEQ ID NO:7中列出。芳香族异戊烯转移酶(PT)启动子的核酸序列在SEQ ID NO:8中列出，PT1启动子的核酸序列在SEQ ID NO:9中列出，和PT的ORF在SEQID NO:10中列出。(i)己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)启动子、(ii)己酰基-CoA合成酶(AEE1-1’)启动子、(iii)己酰基-CoA合成酶(AEE3)启动子和(iv)己酰基-CoA合成酶(AAE12)启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:11、12、13和14中列出，和己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)的ORF在SEQ ID NO:15中列出。(i)CBDA合成酶(CBDAS)启动子、(ii)CBDA合成酶1(CBDAS1)启动子、(iii)CBDA合成酶(CBDAS)20800启动子和(iv)CBDA合成酶(CBDAS)20800’启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:16、17、18和19中列出，和CBDA合成酶(CBDAS)的ORF的核酸序列在SEQ ID NO:20中列出。(i)THCA合成酶(THCAS)19603启动子、(ii)THCA合成酶(THCAS)19603′启动子、(iii)THCA合成酶(THCAS)50320启动子、(iv)THCA合成酶(THCAS)50320′启动子、(v)THCA合成酶(THCAS)1330启动子和(vi)THCA合成酶(THCAS)1330′启动子的核酸序列分别在SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26中列出，和THCAS的ORF在SEQ ID NO:27中列出。CBCA合成酶(CBCAS)3498启动子的核酸序列在SEQ ID NO:28中列出，CBCA合成酶(CBCAS)3498′启动子的核酸序列在SEQ ID NO:29中列出，和CBCA合成酶(CBCAS)的ORF在SEQ IDNO:30中列出。
通过利用大麻素生物合成途径中的生物合成酶基因的编码区使用BLAT检索设备检索大麻的草拟基因组序列来鉴定毛状体特异性启动子。对于每个基因组序列命中，运行基因预测程序(使用FGENESH程序)以建立第一个ATG。然后通过将基因组序列与NCBI NR数据库中最长的可用cDNA序列进行比较来建立转录起始。多序列比对(对于CBDA和THCA合成酶基因)和查询PLACE数据库都建立了TATA盒区利用起始密码子、转录起始和建立的TATABox，验证了启动子的位置和序列。
实施例2：用于引导烟草中的大麻素产生的毛状体特异性启动子
在大麻毛状体中合成和积累大麻素。橄榄醇合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、芳香族异戊烯转移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶是大麻素生物合成途径的酶。因此，预期这些酶中的每一种的启动子将引导编码核酸在毛状体细胞中的表达。该实施例证明了本技术的毛状体特异性启动子或其生物活性片段在不天然产生大麻素的植物和植物细胞中表达大麻素生物合成酶的用途。
方法
载体构建体。启动子序列(SEQ ID NO:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33)置于适于在烟草细胞中表达的载体例如Ti质粒载体中的GUS-A标记的前面。将构建体并入根瘤土壤杆菌中，并根据本领域已知的方法用于转化烟草。在卡那霉素选择下转化和再生构建体，并使初级再生体(T0)生长至种子。
作为对照，将含有烟草NtCPS2启动子的构建体转化到烟草中。已显示NtCPS2启动子在引导烟草中的毛状体特异性表达方面高度有效(Sallaud et al.,The Plant Journal72:1-17(2012))。
表达分析。对T1植物进行定量和定性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性分析。启动子活性的定性分析使用组织学GUS测定和通过使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)实施。对于GUS分析，将各种植物部分在37℃下在大气氧存在下与Xglue(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐)底物在磷酸盐缓冲液(1mg/mL，K2HPO4，10μM，pH 7.2，0.2％TritonX-100)中孵育过夜。通过用乙醇反复洗涤使样品脱色。非转基因植物用作阴性对照。预计具有OLS:GUS、OAC:GUS、PT:GUS、AAEE1-1:GUS、CBDAS:GUS、CBCAS:GUS和THCAS:GUS的转基因植物的毛状体将显示明亮的蓝色毛状体，而这些转基因植物的非毛状体组织和非转基因对照植物的毛状体不会被着色。
使用荧光GUS分析进行启动子活性的定量分析。总蛋白质样品由幼叶材料制备；由合并的叶片制备样品。使用金属珠在PBS中研磨新鲜叶材料，然后离心并收集上清液。
结果
用包含本技术的启动子的表达载体或其生物活性片段遗传工程化的植物和植物细胞展现出毛状体特异性转录活性。如图2B所示，用CBDAS 20800:GUS转化的转基因植物的毛状体显示明亮的蓝色毛状体，而植物的非毛状体组织未着色。大麻素生物合成途径中其他启动子的毛状体特异性表达定性地相似(图3)。图3中示出的结果展示来自烟草毛状体中完整大麻素生物合成途径的启动子的毛状体特异性表达。因此，这些结果证明，与在植物的根、叶、茎或其他组织中的表达相比，来自本文所述的完整大麻素生物合成途径的启动子可用于优先引导可操作连接的基因在毛状体组织中的表达。这种毛状体特异性表达将是操纵毛状体特异性生化化合物(例如细胞毒性大麻素)的生物合成的关键工具。此外，这些启动子对于旨在使用烟草或大麻毛状体作为特定生化化合物控制生产的生物工厂的策略至关重要。
实施例3：鉴定用于引导烟草中的毛状体特异性表达的“大麻素On”(“CANON”)片段
“大麻素On”(“CANON”)片段的核酸序列在SEQ ID NO:31中列出。CANON片段的氨基酸序列连同推定的TATA盒、5’UTR和起始密码子在SEQ ID NO:32中列出。4xCANON片段合成启动子的核酸序列在SEQ ID NO:33中列出。共有CANON片段衍生自来自THCA合成酶19603、1330、50320，CBCA合成酶3498和CBDA合成酶20800的毛状体特异性启动子。
方法
通过使用BLAT检索工具检索紫色库什基因组序列来鉴定CANON片段。使用THCA合成酶基因对紫色库什基因组序列进行BLAT检索，得到以下结果：
BLAT检索结果
选择突出显示的启动子用于进一步分析，并比较五种启动子的序列。五种启动子显示从翻译起始到推定的TATA盒上游的约160个碱基对的高序列相似性，但在TATA盒上游的序列相似性很小。
共有序列衍生自5个启动子，并且该序列用于使用称为“4x CANON片段合成启动子”的合成启动子测试烟草毛状体中的毛状体特异性启动子活性。4x CANON片段合成启动子包含在自然界中未发现的共有CANON片段的4个拷贝——在最小启动子(TATA Box、转录起始和第一个ATG)的一个拷贝的前面。如实施例2中所述，用位于GUS-A标记前面的4×CANON片段合成启动子转化烟草，并进行GUS表达分析。
结果
如图4B所示，4×CANON片段合成启动子引导在毛状体中的表达。因此，这些结果证明CANON片段足以以功能获得启动子引导毛状体特异性表达，并且因此负责许多大麻素生物合成酶基因(包括THCA、CBDA和CBCA合成酶)的毛状体特异性表达。
等同
本技术不限于本申请中描述的特定实施方式，其旨在作为本技术的各个方面的单个说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中也是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本技术仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。应理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不拟是限制性的。
另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据马库什组的任何单个成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并且使得相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有语言例如“上至”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所述的数字并指如上所述可以随后分解成子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
本文提及或引用的所有公共可获得的文件，比如专利、专利申请、临时申请和出版物——包括基因库登录号，通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
所附权利要求书中列出了其他实施方式。
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Claims (17)
1. 一种合成DNA分子，其包括选自下列的核苷酸序列：
在SEQ ID NO: 1-3中任一个中列出的核苷酸序列；并且
其中所述核苷酸序列与异源核酸可操作地连接。
2.一种表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的权利要求1所述的DNA分子。
3.一种用于工程化宿主细胞的方法，其中所述宿主细胞被遗传工程化以包含权利要求2所述的表达载体。
4.权利要求3所述的方法，其中所述细胞是大麻细胞。
5.权利要求3所述的方法，其中所述细胞是烟草细胞。
6.一种用于工程化植物的方法，其中所述植物被遗传工程化，以包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含权利要求1所述的合成DNA分子。
7.权利要求6所述的方法，其中所述植物是烟草植物。
8.权利要求6所述的方法，其中所述植物是大麻植物。
9.一种用于工程化种子的方法，其中所述种子获得自权利要求6-8中任一项所述的植物，其中所述种子包括所述嵌合核酸构建体。
10.一种用于工程化植物或植物细胞的方法，其中所述植物或植物细胞被遗传工程化以包含整合到其基因组中的嵌合基因，所述嵌合基因包含与同源或异源核酸序列可操作地连接的毛状体特异性启动子，其中所述启动子选自：
SEQ ID NO: 1-3中任一个的核苷酸序列。
11.权利要求10所述的方法，其中所述植物是烟草植物。
12.权利要求10所述的方法，其中所述植物是大麻植物。
13.一种用于表达植物毛状体中的多肽的方法，其包括：
(a)将包括核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：
在SEQ ID NO: 1-3中任一个中列出的核苷酸序列；
其中所述核苷酸序列可操作地连接至编码多肽的一种或多种核酸序列；和
(b)在允许所述多肽表达的条件下使所述植物生长。
14.一种用于增加宿主植物毛状体中的大麻素的方法，其包括
(a)将包括核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：
在SEQ ID NO: 1-3中任一个中列出的核苷酸序列；
其中所述核苷酸序列可操作地连接至编码大麻素生物合成途径的酶的一种或多种核酸序列；和
(b)在允许所述大麻素生物合成途径酶表达的条件下使所述植物生长；
其中所述大麻素生物合成途径酶的表达导致所述植物相对于对照植物具有增加的大麻素含量。
15.权利要求14所述的方法，其中所述大麻素生物合成途径酶是大麻二酚酸(CBDA)合成酶、大麻色烯酸(CBCA)合成酶或Δ9四氢大麻酚酸(THCA)合成酶。
16.权利要求15所述的方法，进一步包括给所述植物提供大麻萜酚酸(CBGA)。
17.一种用于工程化植物的方法，其中所述植物是通过权利要求14所述的方法产生的遗传工程化植物，其中所述植物相对于对照植物具有增加的Δ9-四氢大麻酚(THC)、大麻色原烯(CBC)和/或大麻二酚(CBD)含量。
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