BR112019019966A2 - biossíntese in vivo de alto nível e isolamento de canabinoides solúveis em água em sistemas de plantas - Google Patents

Abstract

a tecnologia inventiva se refere a sistemas e métodos para produção in vivo intensificada, acumulação e modificação de canabinoides. em uma modalidade, a invenção pode incluir sistemas e métodos para biossíntese in vivo intensificada de canabinoides solúveis em água quimicamente modificados em uma planta integral ou um sistema de cultura de suspensão de células.

Description

RELATÓRIO DESCRITUVO

BHOSSÍNTESE UN WO DÊ ALTO NÍVEL E ISOLAMENTO DÊ CANABUNOUDÊS SOLÚVEUS EM ÁGUA EM SISTEMAS DE PLANTAS [001 ] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade dos Pedidos Provisórios US 62/476.080, depositado em 24 de março de 2017 e 62/588.662, depositado em 20 de novembro de 2017 e 62/621.166, depositado em 21 de janeiro de 2018. Todos os relatórios descritivos e figuras dos pedidos mencionados acima estão aqui incorporados, na sua totalidade por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no Formato ASCII e é por este meio incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO [003] O campo da presente invenção refere-se geralmente à biologia molecular de plantas e biotecnologia de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a novos sistemas, métodos e composições para a produção in vivo, modificação e isolamento de compostos canabinoides de sistemas de plantas incluindo sistemas de culturas de plantas inteiras e/ou de células de plantas. Em certas modalidades preferidas, a tecnologia inventiva inclui um novo sistema de modificação genética de uma planta ou cultura de suspensão de célula de planta para produzir, modificar e/ou acumular um ou mais canabinoides alvos na Cannabis e/ou Nicotiana benthamiana e/ou Nicotiana tabacum

ANTECEDENTES [004] Canabinoides são uma classe de compostos especializados sintetizados por Cannabis. Eles são formados por condensação de precursores de terpenos e fenóis. Eles incluem estas formas mais abundantes: Delta-9-tetra-hidrocanabinol (THC), canabidiol (CBD), canabicromeno (CBC) e canabigerol (CBG). Outro canabinoide, o canabinol (CBN), é formado a partir de THC como um produto de degradação e pode ser detectado em algumas cepas de plantas. Tipicamente,

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THC, CBD, CBC e CBG ocorrem juntos no proporções diferentes nas várias linhagens de plantas.

[005] Os canabinoides são geralmente classificados em dois tipos, canabinoides neutros e ácidos de canabinoides, com base no fato de conterem um grupo carboxila ou não. Sabe-se que, nas plantas frescas, as concentrações de canabinoides neutros são muito menores do que as dos ácidos de canabinoides. Uma cepa de Cannabis sativa contém aproximadamente 61 compostos pertencentes à classe geral de canabinoides. Esses canabinoides são geralmente compostos lipofílicos, livres de nitrogênio, principalmente fenólicos, e são derivados biogeneticamente de um monoterpeno e fenol, os ácidos de canabinoides de um monoterpeno e ácido fenol carboxílico e têm uma C21 para material de base.

[006] Canabinoides também encontram seus ácidos carboxílicos correspondentes nos produtos vegetais. Em geral, os ácidos carboxílicos têm a função de um precursor biossintético. Por exemplo, esses compostos surgem in vivo dos ácidos carboxílicos THC por descarboxilação dos tetra-hidrocanabinóis Δ9- e A8-THC e CBD do canabidiol associado. Como geralmente mostrado na Fig. 28, o THC e o CBD podem ser derivados artificialmente do ácido tetra-hidrocanabinólico do seu precursor ácido (THCA) e do ácido canabidiólico (CBDA) por descarboxilação não enzimática.

[007] Os canabinoides são amplamente consumidos, em uma variedade de formas em todo o mundo. Preparações ricas em canabinoides de Cannabis, ou na erva (ou seja, maconha) ou na forma de resina (ou seja, óleo de haxixe), são usadas por uma quantidade estimada de 2,6 a 5,0% da população mundial (UNODC, 2012). Produtos farmacêuticos contendo canabinoides, que contêm extratos naturais de cannabis (Sativex®) ou canabinoides sintéticos dronabinol ou nabilona, estão disponíveis para uso médico em muitos países.

[008] Como observado acima, Δ-9-tetra-hidrocanabinol (também conhecido como THC) é um dos principais componentes biologicamente ativos na planta Cannabis que foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o controle de

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3/114 náuseas e vômitos associados à quimioterapia e, mais recentemente, para estimular o apetite de pacientes com AIDS que sofrem de síndrome do desperdício. O fármaco, no entanto, mostra outras atividades biológicas que se prestam a possíveis aplicações terapêuticas, como no tratamento do glaucoma, dores de cabeça, enxaqueca, espasticidade, ansiedade e como analgésico.

[009] De fato, é bem documentado que agentes, como canabinoides e endocanabinoides, que ativam os receptores canabinoides no o corpo modulam o apetite e aliviam náusea, vômito e dor (Martin B. R. and Wiley, J. L, Mechanism of action of cannabinoids: how it may lead to treatment of cachexia, emesis and pain, Journal of Supportive Oncology 2:1-10, 2004), esclerose múltipla (Pertwee, R. G., Cannabinoids and multiple sclerosis, Pharmacol. Ther. 95, 165-174, 2002) e epilepsia (Wallace, M. J., Blair, R. E., Falenski, K. WW., Martin, B. R., and DeLorenzo, R. J. Journal Pharmacology and Experimental Therapeutics, 307: 129137, 2003). Além disso, agonistas do receptor CB2 demonstraram ser eficazes no tratamento da dor (Clayton N., Marshall F. H., Bountra C , O'Shaughnessy C. T., 2002. CB1 and CB2 cannabinoid receptors are implicated in inflammatory pain. 96, 253-260; Malan T. P., Ibrahim Μ. M., Vanderah T. W., Makriyannis A., Porreca F., 2002. Inhibition of pain responses by activation of CB(2) cannabinoid receptors. Chemistry and Physics of Lipids 121,191 -200; Malan T. P., Jr., Ibrahim Μ. M., Deng H., Liu Q., Mata Η. P., Vanderah T., Porreca F., Makriyannis A., 2001. CB2 cannabinoid receptor-mediated peripheral antinociception. 93, 239-245.; Quartilho A., Mata Η. P., Ibrahim Μ. M., Vanderah T. W., Porreca F., Makriyannis A., Malan T. P., Jr., 2003. Inhibition of inflammatory hyperalgesia by activation of peripheral CB2 cannabinoid receptors. Anesthesiology 99, 955-960) e esclerose múltipla (Pertwee, R. G., Cannabinoids and multiple sclerosis, Pharmacol. Ther. 95, 165-174, 2002) em modelos de animal.

[0010] Mais recentemente, vários estados aprovaram o uso de Cannabis e produtos com infusão de canabinoides para uso recreativo e médico. À medida que esses novos mercados médicos e comerciais se desenvolvem, cresce a

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4/114 necessidade de desenvolver uma produção e um isolamento mais eficientes dos compostos canabinoides. Os métodos tradicionais de produção de canabinoides geralmente se concentram na extração e purificação de canabinoides de matériasprimas colhidas de Cannabis. No entanto, os métodos tradicionais de extração e purificação de canabinoides apresentam vários problemas técnicos e práticos que limitam sua utilidade.

Limitações dos Métodos Tradicionais de Produção e Extração de Canabinoides [0011] Por exemplo, no Patente US 6.403.126 (Webster et al.), os canabinoides e outros compostos relacionados são isolados de matérias-primas colhidas de Cannabis e tratados com um solvente orgânico, tipicamente um hidrocarboneto derivado de petróleo ou um álcool de baixo peso molecular para solubilizar os canabinoides para isolamento posterior. Este método tradicional é limitado no que depende de matéria vegetal cultivada naturalmente que pode ter sido exposta a vários pesticidas tóxicos, herbicidas e similares. Além disso, esses métodos tradicionais de extração são imprecisos, resultando em concentrações não confiáveis e variadas de THC extraído. Além disso, muitas cepas de Cannabis são cultivadas nos ambientes hidropônicos que também não são regulados e podem resultar na contaminação generalizada dessas cepas com compostos químicos e outros compostos indesejados.

[0012] Em outro exemplo, o pedido de Patente US 20160326130 (Lekhram et al.), os canabinoides e outros compostos relacionados são isolados de matérias-primas colhidas de Cannabis usando, novamente, uma série de solventes orgânicos para converter os canabanoides em um sal e então volte para a sua forma de ácido carboxílico original. Semelhante ao Webster, esse método tradicional é limitado já que é depende da matéria vegetal cultivada naturalmente que pode ter sido exposta a vários pesticidas tóxicos, herbicidas e similares. Além disso, vários solventes orgânicos usados neste processo tradicional devem estar recuperados e reciclados e/ou descartados adequadamente.

[0013] Outro método tradicional de extração de canabinoides envolve a geração de

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5/114 óleos de haxixe com o uso de dióxido de carbono supercrítico (SCO2) Sob esse método tradicional, novamente a matéria vegetal seca é terra e submetida a um ambiente de extração de SCO2. O extrato primário sendo inicialmente obtido e adicionalmente separado. Por exemplo, como geralmente descrito por CA2424356 (Muller et al.) os canabinoides são extraídos com a ajuda de SCO2 sob pressão supercrítica e condições de temperatura e por adição de solventes acessórios (modificadores) como álcoois. Nesse processo, esse CO2 supercrítico evapora e dissolve-se nos canabinoides. No entanto, esse processo tradicional também tem certas limitantes desvantagens. Por exemplo, devido à baixa solubilidade no SCO2 supercrítico, a recuperação de canabinoides de interesse é inconsistente. Além disso, todos os solventes utilizados devem ser reciclados e bombeados de volta para 0 extrator, para minimizar a os custos de operação.

[0014] Outro método utiliza butano para extrair canabinoides, nas concentrações particularmente elevadas de THC, provenientes de matérias-primas colhidas de Cannabis. Como 0 butano é não polar, esse processo não extrai subprodutos solúveis em água tal como clorofila e alcalóides vegetais. Dito isto, este processo pode levar até 48 horas e assim sendo é limitado na sua capacidade de expansão para máxima viabilidade comercial. A outra grande desvantagem dos processos tradicionais de extração à base de butano é em relação aos perigos potenciais do uso de solventes inflamáveis, assim como a necessidade de garantir que todo 0 butano é totalmente removido dos canabinoides extraídos.

[0015] Outro fator limitante na viabilidade desses métodos tradicionais de extração de canabinoides é a incapacidade de manter a integridade da cepa de Cannabis. Por exemplo, os canabanoides usados nas aplicações médicas e de pesquisa ou que estão sujeitos a ensaios clínicos controlados, são fortemente regulados por várias agências governamentais nos Estados Unidos e em outros lugares. Essas agências reguladoras exigem que as cepas de Cannabis permaneçam quimicamente consistentes ao longo tempo. Infelizmente, as composições genéticas/químicas das cepas de Cannabis mudam ao longo de gerações tal que

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6/114 elas não podem atender os mandatos regulatórios presentes na maioria dos ensaios clínicos ou certificados para uso em outras aplicações farmacêuticas.

[0016] Várias tentativas foram feitas para resolver essas questões. Por exemplo, esforços têm sido feitos para produzir canabinoides nos organismos geneticamente modificados. Por exemplo, no Pedido de Patente US 14/795.816 (Poulos, et al.). Neste caso, o requerente alega ter gerado uma cepa de levedura geneticamente modificada capaz de produzir um canabinoide por inserção de genes que produzem as enzimas apropriadas para esta produção metabólica. No entanto, essa aplicação é limitada na sua capacidade para produzir apenas um número único ou muito limitado de compostos canabinoides. Esta limitação é clinicamente significativa. Estudos clínicos recentes descobriram que o uso de um único canabinoide isolado como um agente terapêutico não é tão eficaz quanto o tratamento com o “ambiente” de ocorrência natural dos canabinoides primários e secundários associados a várias cepas selecionadas.

[0017] Tentativas adicionais têm sido feitas para sintetizar quimicamente canabinoides, como THC. Contudo, a síntese química de vários canabinoides é um processo caro quando comparado à extração de canabinoides de plantas de ocorrência natural. A síntese química de canabinoides também envolve o uso de produtos químicos que não são ecológicos, que podem ser considerados como um custo adicional à sua produção. Além disso, a produção química sintética de vários canabinoides foi classificada como menos farmacologicamente ativa do que com aqueles extraídos de plantas tal como Cannabis sativa.

[0018] Esforços para gerar culturas de célula de Cannabis em larga escala também levantaram uma série de problemas técnicos. O principal dentre eles é o fato de que os canabinoides são citotóxicos. Sob condições naturais os canabinoides são gerados e armazenados extracelularmente em pequenas estruturas glandulares chamadas tricomas. Os tricomas podem ser visualizados como pequeno pelos ou outros crescimentos da epiderme de uma planta de Cannabis. Como um resultado, nas culturas de célula de Cannabis, a incapacidade de armazenar canabinoides

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7/114 extracelularmente significa que qualquer acúmulo de canabinoides seria tóxico para as células cultivadas. Tais limitações prejudicam a capacidade das culturas de células de Cannabis para serem ampliadas para níveis industriais de produção. Toxicidade da Biossíntese de Canabinoide Limita Sistemas de Produção In Vivo [0019] Esforços para gerar cepas/culturas de células de Cannabis que produzem ou acumulam altos níveis de canabinoides levantaram vários problemas técnicos. O principal entre eles é o fato de que a síntese de canabinoides produz subprodutos tóxicos. Notavelmente, tanto CBDA quanto THCA sintases exigem oxigênio molecular, em conjunto com uma molécula de FAD, para oxidar ácido Canabigerólico (CBGA). Especificamente, como mostrando na Fig. 29, dois elétrons do substrato são aceitos por um FAD ligado a enzima e depois transferidos para oxigênio molecular para reoxidar o FAD. CBDA e THCA são sintetizados a partir dos intermediários iônicos através da ciclização estereosseletiva pelas enzimas. O íon de hidreto é transferido da flavina reduzida para oxigênio molecular, resultando em na formação de peróxido de hidrogênio e a reativação da flavina para a próxima ciclo. Como resultado, além de produzir CBDA e THCA, respectivamente, essa reação produz peróxido de hidrogênio (H2O2) que é naturalmente tóxico para a célula hospedeira. Devido a esta produção de um subproduto de peróxido de hidrogênio tóxico, a síntese de canabinoides gera um ciclo de feedback autolimitado que previne a produção de alto nível e/ou acúmulo de canabinoides nos sistemas in vivo. Uma maneira que as plantas Cannabis lidam com esses efeitos citotóxicos celulares é através do uso de tricomas para produção e acumulação de Canabinoide.

[0020] Plantas de cannabis lidam com essa toxicidade por sequestro da biossíntese de canabinoides e armazenamento extracelularmente em pequenas estruturas glandulares chamadas tricomas como observado acima. Por exemplo, THCA sintase é uma enzima solúvel em água que é responsável pela produção de THC. Por exemplo, a biossíntese de THC ocorre nos tricomas glandulares e começa com a condensação de geranil pirofosfato com ácido olivetólico para produzir ácido

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8/114 canabigerólico (CBGA); a reação é catalisada por uma enzima chamada geranilpirofosfato: olivatolato geranotransferase. O CBGA, em seguida, passa por ciclização oxidativa para gerar ácido tetra-hidrocanabinólico (THCA) na presença de THCA sintase. O THCA é então transformado em THC por descarboxilação não enzimática. Estudos de localização subcelular usando RT-PCR e análises de atividade enzimática demonstram que a THCA sintase é expressa em células secretoras de tricomas glandulares, e então é translocada para dentro da cavidade secretora onde o produto final de THCA se acumula. THCA sintase presente na cavidade secretora é funcional, indicando que a cavidade de armazenamento é o local para biossíntese e armazenamento de THCA. Sendo assim, a Cannabis é capaz de produzir canabinoides extracelularmente e assim evitar a efeitos citotóxicos desses compostos. Contudo, como resultado, a capacidade de acessar e alterar quimicamente os canabinoides in vivo é impedida por essa compartimentalização celular.

[0021] Para abordar essas questões, alguns propuseram modificar quimicamente compostos canabinoides para reduzir seus efeitos citotóxicos. Por exemplo, Zipp et al. propuseram a utilização de um método in vitro para produzir glicosídeos canabinoides. No entanto, esta aplicação é limitada a sistemas in vitro somente. Especificamente, como observado acima, as enzimas de canabinoides sintase, como THCA sintase, são proteínas solúveis em água que são exportadas para fora das células do tricoma basal para o compartimento de armazenamento onde isto é ativo e catalisa a síntese de THCA. Especificamente, para mediar eficazmente a exportação celular dessa canabinoide sintase, essa enzima contém um peptídeo sinal de 28 aminoácidos que direciona sua exportação para fora da célula e para o tricoma extracelular, onde ocorre a síntese de canabinoides. Como resultado dessa compartimentalização extracelular dependente de sinal, por exemplo, de THCA sintase, isso significa que a THCA é produzida fora do citoplasma e não seria acessível a enzimas de glicosilação geneticamente manipuladas. Como tal, a expressão simples de uma UDP glicosiltransferase nas células vegetais, como

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9/114 aludido vagamente em Zipp, et al., não resultaria na glicosilação eficaz de moléculas canabinoides na estrutura de tricoma compartimentalizada e extracelular onde ocorre a síntese de canabinoides. O método de Zipp também não pode gerar canabinoides acetilados, bem como moléculas de canabinoides de O acetil glicosídeo.

[0022] Os problemas anteriores relacionados à produção, desintoxicação e isolamento de canabinoides podem representar uma necessidade sentida de longa data de uma solução eficaz e econômica para os mesmos. Embora alguns elementos de implementação estejam disponíveis, tentativas reais para atender a essa necessidade podem ter falhado até certo ponto. Isso pode ter sido devido a uma falha daqueles com habilidades comuns na técnica de apreciar ou entender completamente a natureza dos problemas e desafios envolvidos. Como resultado dessa falta de entendimento, as tentativas de atender a essas necessidades sentidas podem não ter conseguido resolver eficazmente um ou mais dos problemas ou desafios aqui identificados. Essas tentativas podem até ter desviado as orientações técnicas adotadas pela presente tecnologia inventiva e podem até resultar nas realizações da presente tecnologia inventiva sendo consideradas, até certo ponto, um resultado inesperado da abordagem adotada por alguns no campo. [0023]Como será discutido em mais detalhes abaixo, a atual tecnologia inventiva supera as limitações dos sistemas tradicionais de produção de canabinoides, enquanto atende aos objetivos de um sistema de produção, modificação e isolamento de canabinoides verdadeiramente eficaz e escalável.

SUMÁRIO DA(S) INVENÇÃO(ÕES) [0024] A tecnologia inventiva pode abranger sistemas, métodos e composições para a produção in vivo, modificação e isolamento de compostos canabinoides de plantas Cannabis. Em especial, a invenção fornece sistemas e métodos para a biossíntese in vivo de alto nível de canabinoides solúveis em água.

[0025] A atual tecnologia inventiva inclui sistemas e métodos para melhorar a produção e/ou acúmulo de canabinoides. Em uma modalidade, a invenção pode

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10/114 incluir sistemas e métodos para aumentar a produção e/ou o acúmulo de canabinoides em um sistema in vivo, tal como uma planta ou cultura de célula de planta.

[0026] Outro alvo da presente invenção pode incluir a geração de plantas geneticamente modificadas que superexpressam certos genes endógenos/exógenos que resultam no excesso de produção e/ou acúmulo de canabinoides acima dos níveis do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, tais plantas transgênicas podem exibir produção melhorada e acúmulo localizado de compostos precursores de canabinoides, como THCA (ácido tetrahidrocanabinólico), CBCA (ácido canabicromênico), e CBDA (ácido canabidiólico). Essas plantas transgênicas podem exibir adicionalmente produção melhorada e acúmulo localizado de canabinoides, tal como THCs, CBCs e CBDs. Um objetivo adicional da presente invenção pode incluir a geração de plantas geneticamente modificadas que expressam certos endógenos/exógenos que resultam na modificação melhorada de canabinoides. Em uma modalidade preferida, tais plantas transgênicas podem exibir modificação melhorada de canabinoides, incluindo hidroxilação e/ou acetilação e/ou glicosilação. Em modalidades adicionais preferenciais, tais plantas transgênicas podem exibir modificação melhorada de canabinoides, incluindo acetilação e glicosilação, como uma forma de O acetil glicosídeo. Por exemplo, a acetilação adiciona um grupo acetila (-CH3OOH) para um canabinoide tal que 0 grupo carboxilato é ácido e carregado em pH neutro tornando-o altamente solúvel em água.

[0027] Um objetivo da atual tecnologia inventiva pode ser gerar uma planta de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que superexpressa um ou mais fatores de transcrição, como myb, que melhora 0 fluxo de metabólitos através da via biossintética dos canabinoides. Em uma modalidade preferida, esses fatores de transcrição podem incluir vários análogos. Em uma certa modalidade preferida, um ou mais desses transgenes pode ser operacionalmente ligado a um ou mais promotores.

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11/114 [0028] Outro objetivo da atual tecnologia inventiva pode ser gerar uma cultura de célula de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que superexpressa um ou mais fatores de transcrição que melhoram o fluxo de metabólitos através da via biossintética de canabinoide. Em uma modalidade preferida, esses transgenes podem estar operacionalmente ligados a um ou mais promotores.

[0029] Outro objetivo da atual tecnologia inventiva pode ser gerar uma planta de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que expressa um ou mais fatores de transcrição exógenos/heterólogos que regulam a formação de tricomas para aumentar a acumulação de canabinoides. Em certas modalidades preferidas, um ou mais desses transgenes exógenos podem estar operativamente ligados a um ou mais promotores.

[0030] Ainda outro objetivo da atual tecnologia inventiva pode ser gerar uma planta de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que expressa a enzima que é configurada para ser capaz de reduzir os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) que pode ser gerado durante a síntese de canabinoide. Em uma modalidade preferida, a atual tecnologia inventiva pode ser gerar uma planta de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que expressa uma proteína quimérica. Em uma modalidade, essa proteína quimérica pode incluir um primeiro domínio que pode reduzir os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) que podem ser gerados durante a síntese de canabinoides. Essa proteína quimérica/de fusão pode incluir ainda um segundo domínio que pode compreender um domínio de direcionamento de tricoma que pode permitir a localização direcionada da proteína quimérica para locais de síntese ativa de canabinoides. Em algumas modalidades, um terceiro domínio pode incluir um ligante que pode separar ainda 0 primeiro domínio do segundo domínio, tal que 0 dito primeiro domínio e 0 dito segundo domínio podem cada dobrar na sua forma tridimensional apropriada e reter sua atividade e ditas faixas de ligante e um comprimento.

[0031] Outro objetivo da atual tecnologia inventiva pode incluir a geração de uma ou mais das plantas ou culturas de células de plantas geneticamente modificadas

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12/114 acima mencionadas utilizando transformação mediada por Agrobacterium Tiplasmídeo.

[0032] Outro objetivo da presente tecnologia inventiva relaciona métodos e sistemas para localização celular in vivo da biossíntese e modificação de canabinoides. Mais especificamente, a presente tecnologia inventiva relaciona métodos e sistemas para a localização celular in vivo de hidroxilação, acetilação e/ou glicosilação de canabinoides. A tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos para modificação química localizada de alta eficiência e isolamento de compostos canabinoides de culturas em suspensão. Nesta modalidade, vários compostos canabinoides selecionados podem ser modificados quimicamente em configurações solúveis e não tóxicas.

[0033] Modalidades adicionais da tecnologia inventiva podem incluir a modificação transitória de compostos canabinoides para reduzir e/ou eliminar sua citotoxicidade em plantas ou sistemas de cultura de células de plantas. Em uma modalidade preferida, tais canabinoides transitoriamente modificados podem ser acumulados em níveis que normalmente teriam um efeito deletério na célula. Modalidades adicionais podem incluir o isolamento desses canabinoides transitoriamente modificados por conversão ou reconstituição enzimática para sua estrutura original e/ou parcialmente modificada.

[0034] Outro objetivo da invenção pode incluir a geração de uma planta transgênica e/ou culturas de células de plantas que podem expressar genes heterólogos que acoplaram a síntese de canabinoides e hidroxilação e/ou glicosilação na planta. Especificamente, um objetivo da tecnologia pode incluir o uso de Nicotiana benthamiana para demonstrar a síntese do CBDA de acoplamento e glicosilação na planta. Um objetivo adicional desta modalidade pode incluir modificações adicionais na molécula de CBDA, tal como hidroxilação e acetilação. Em ainda outro objetivo, essa modificação de canabinoide pode estar especificamente localizada, por exemplo no citosol e/ou tricoma.

[0035] Outro alvo da invenção pode incluir a geração de uma planta transgênica

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13/114 e/ou culturas de células de plantas que podem expressar genes endógenos que podem ser configurados para modificar canabinoides. O objetivo adicional pode incluir a coexpressão de fatores de transcrição heterólogos que podem aumentar a produção de canabinoides. Outro objetivo da invenção pode incluir a coexpressão de genes heterólogos que desintoxicam os subprodutos do peróxido de hidrogênio gerados pela biossíntese de canabinoides. A coexpressão de tais genes pode ser aditiva com a coexpressão de genes configurados para modificar e/ou localizar biomodificações de canabinoides.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0036] Fig. 1 Perfil de Eluição Cromatográfica Representativa dos Glicosídeos CBGA encontrado em Ensaios in vitro. Os cromatogramas A, B e C representam os cromatogramas de íons respectivos extraídos para cada produto de glicosídeo. O cromatograma D é representativo do cromatograma de íon total. As intensidades de pico são ilustradas como abundância relativa ao pico mais abundante em cada cromatograma respectivo.

[0037] Fig. 2. Perfis de Eluição Cromatográfica representativos de CBGA funcionalizado e Glicosídeos encontrados nos ensaios in vitro. Os cromatogramas A, B e C representam cromatogramas de ions com classificação de extrato respectivo para cada produto. O cromatograma D é representativo do cromatograma de íon total. As intensidades de pico são ilustradas como abundância relativa ao pico mais abundante em cada cromatograma respectivo.

[0038] Fig. 3. Perfil de Eluição Cromatográfica Representativa dos perfis de Glicosídeos de CBDA encontrado em Extratos de Folhas. Os cromatogramas A, B, C, e D representam os cromatogramas de ions com classificação de extrato respectivo para cada produto de glicosídeo. O cromatograma E é representativo do cromatograma de íon total. As intensidades de pico são ilustradas como abundância relativa ao pico mais abundante em cada cromatograma respectivo.

[0039] Fig. 4. Eluição Cromatográfica de CBDA Funcionalizado e Glicosídeos Funcionalizados em Extratos de Folhas. Os cromatogramas A, B, e C representam

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14/114 os cromatogramas de ions com classificação de extrato respectivo para cada produto. O cromatograma D é representativo do cromatograma de íon total. As intensidades de pico são ilustradas como abundância relativa ao pico mais abundante em cada cromatograma respectivo.

[0040] Fig. 5. Construto de gene para expressão do gene do citocromo P450 (CYP3A4), (SEQ ID NO. 1) expressando a proteína do citocromo P450 (CYP3A4) (SEQ ID NO. 2) e gene da P450 oxidorredutase (oxred) (SEQ ID NO. 3) expressando a proteína P450 oxidorredutase (SEQ ID NO. 4) em plantas. Ambos os genes foram dirigidos pelo promotor 35S constitutivo (35S) e apresentou regiões não traduzidas 5' de álcool desidrogenase de Arabidopsis thaliana (AtADH) como intensificadores de tradução.

[0041] Fig. 6. Confirmação da expressão do CYP3A4 e P450 oxidorredutase em folhas de tabaco. CB1-CB5, réplicas biológicas de folhas infiltradas com CYP3A4/P450 oxidorredutase; WT = folhas de tabaco do tipo selvagem sem infiltração. L = I kb mais escalonamento (Thermo Fisher Scientific, USA). As setas mostram a banda esperada (500 pb) indicando a expressão do transgene.

[0042] Fig. 7. Glicosilação intensificada de canabinoides em plantas de Nbenthamiana com superexpressão de P450. CB1-CB5 são réplicas biológicas que superexpressam CYP3A4+P450 oxidorredutase, o controle P é o supressor de silenciamento PI9 (controle de “vetor vazio”). O eixo vertical mostra quantidades relativas expressas como área de pico por g de peso fresco.

[0043] Fig. 8 Construto de gene para o sistema de produção de canabinoides da cultura de suspensão e do citosol. 35S, promotor 35S do mosaico de couve-flor; HSPt, terminador HSP; 35PPDK, promotor híbrido que consiste em intensificador 35S do vírus do mosaico de couve-flor fundido ao promotor basal de milho C4PPDK (Yoo et al. 2007); 76G1, UDP glicosiltransferase de Stevia rebaudiana; ABCG2, transportador de múltiplos fármacos humanos.

[0044] Fig. 9. Demonstra confirmação de RT-PCR da expressão de CBDA sintase (a), UDP glicosiltransferase (b) e ABCG2 (c) em folhas de tabaco. L é Ikb mais

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15/114 escalonamento (Thermo Fisher Scientific, USA). Os números nas faixas representam linhagens transgênicas independentes. As setas apontam para a banda esperada que mostra a expressão do transgene.

[0045] Fig. 10 Hidroxilação e glicosilação de canabinoides em tabaco transgênico (SUS, numerado) superexpressando CBDA sintase, UDP glicosiltransferase e ABC transportador. WTS1 e 2 são do tipo selvagem alimentados com substrato para reações endógenas. Houve alguma glicosilação endógena do CBGA, bem como evidências de atividade intensificada da glicosiltransferase transgênica (por exemplo, SUS2, SUS3 e SUS4). Os dados foram corrigidos para a área de pico por g de peso fresco.

[0046] Fig. 11. Modificação melhorada de canabinoides em plantas de Nbentamiana transgênicas coinfectadas com construtos para glicosilação, funcionalização mediada por P450 (hidroxilação) e desintoxicação do peróxido de hidrogênio pela catalase. SUS = construto para superexpressão de CBDA sintase, UDP glicosiltransferase e ABC transportador; M3S = construto para superexpressão de CBDA sintase, UDP glicosiltransferase e ABC transportador com Cannabis tipo MYB12 e Arabidopsis thaliana catalase.

[0047] Fig. 12 Atividade de glicosilação aumentada em plantas de N-Bentamiana transgênicas (TSA, TSB, TSC, SUS, SUS/P450) superexpressam uma glicosiltransferase em comparação com o tipo selvagem em ensaios de expressão transitória de 14 horas.

[0048] Fig. 13 Reação de mono-oxigenase exemplificadora, catalisada por citocromos P450.

[0049] Fig. 14 Construto de gene 1 para o sistema de produção de canabinoides de tricoma. Promotor 35S de mosaico de couve-flor; AtADH 5'-UTR, elemento intensificador da tradução (Matsui et al. 2012); tsCBDAs, ácido canabidiólico sintase com sua sequência alvo de tricoma original; HSP terminador; tsUGT76GI, UDP glicosiltransferase de Stevia rebaudiana com sequência alvo de tricoma de CBDAs.

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16/114 [0050] Fig. 15 Construto de gene 2 para o sistema de produção de canabinoides de tricoma, promotor 35S do mosaico de couve-flor; AtADH 5'-UTR, elemento intensificador; PM-UTR1, transportador de UDP-glicose/galactose de Arabidopsis thaliana direcionado para a membrana plasmática; HSP terminador. [0051] Fig. 16 RT-PCR de CBDA sintase alvo de tricoma (parte superior), UDP glicosiltransferase alvo de tricoma (76G1) UGT RT-PCR (parte inferior). A, B, e C são réplicas biológicas coletadas após 2DPI.

[0052] Fig. 17 PM-UTR1 RT-PCR. A, B e C são réplicas biológicas coletadas após 2DPI.

[0053] Fig. 18 Construto de gene para o sistema de produção de canabinoides citossólicos. Promotor 35S de mosaico do couve-flor; AtADH 5'-UTR, elemento intensificador; cytCBDAs, ácido canabidiólico sintase com a sequência alvo do tricoma removida; HSP terminador; cytUGT76GI, UDP glicosiltransferase de Stevia rebaudiana.

[0054] Fig. 19 SUS-A para SUS-C são réplicas biológicas para a transformação de suspensão de células (201 -SUS) após 1 DPI.

[0055] Fig. 20. cytUGT RT-PCR (parte superior), cytCBDAs RT-PCR (parte inferior). A, B, e C são réplicas biológicas para infiltração de construto citossólico após 2DPI. [0056] Fig. 21. Detecção de canabinoides em folhas infiltradas com tricoma ou construtos de suspensão de células e alimentados com CBGA 2,7 mM. O código de cores se refere ao compartimento alvo para acúmulo de proteínas CBDAs e UGT76G1, quer de tricoma ou citostol em suspensão de células. Eixo Y: CBGA e CBDA expressas como partes por milhão (ppm). Glicosídeos primários, secundários, e acilados expressos como área de pico.

[0057] Fig. 22. Detecção de canabinoides em folhas infiltradas com construto de suspensão de células ou citossólica e alimentado com CBGA 2.7mM e UDP-glicose 4 mM. O código de cores se refere ao compartimento alvo para acúmulo de proteínas CBDAs e UGT76G1. Eixo Y: CBGA expressa como partes por milhão (ppm). Todos os outros derivados de canabinoides expressos como área de pico

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17/114 (sem padrões disponíveis).

[0058] Fig. 23. Cromatogramas de íons Extraídos de R-OH Funcionalizado 1 x Análogo de CBDA Glicosilado. (A) traço cromatográfico, íon m/z, composição elementar calculada, confirmando a presença de níveis traços do análogo de CBDA (B) Ausência de análogo de CBDA no extrato de controle (C) Ausência de análogo de CBDA no extrato de controle duplicado biológico.

[0059] Fig. 24. Espectro de Massa de Infusão Direta de extrato de Cannabis sativa. As inserções espectrais representam CBDA com uma glicosilação única (519,2546 m/z), e CBDA funcionalizada com R-OH e uma glicosilação única (535,2543 m/z). As intensidades de pico são ilustradas como abundância relativa ao íon mais intenso.

[0060] Fig. 25. Abundância relativa de CBDA em extratos de várias cepas de Cannabis sativa infiltradas com culturas de Agrobacterium contendo combinações de CBDA sintase (CBDAs) e de plasmídeos UGT. Dados normalizados de abundância relativa são apresentados como a intensidade do íon de cada composto dividida pela intensidade do íon do padrão interno 7hidroxicumarina (20 ppm).

[0061] Fig. 26. Abundância relativa de CBDA modificada (glicosilada e/ou hidroxilada) em extratos de várias cepas de Cannabis sativa infiltradas com culturas de Agrobacterium contendo combinações de CBDAs e de plasmídeos UGT. Dados normalizados de abundância relativa são apresentados como a intensidade de íons de cada composto dividida pela intensidade de ions do padrão interno 7- hidroxicumarina (20 ppm).

[0062] Fig. 27. Construto de gene usado para reforçar a produção de canabinoides e mitigar a toxicidade. CsMYBI 2, fator de transcrição de MYB de Cannabis sativa previsto para intensificar a biossíntese de flavonol; HSPt, terminadorde transcrição eficiente do gene18,2 da proteína de choque térmico Arabidopsis thaliana; 35S, promotor constitutivo do vírus do mosaico da couve-flor; Catalase, gene da catalase de Arabidopsis thaliana.

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18/114 [0063] Fig. 28. Síntese de THC e CBD a partir do precursor de CBGA comum. [0064] Fig. 29. Geração de peróxido de hidrogênio durante a biossintese de canabinoides.

[0065] Fig. 30. Hidroxilação seguida de oxidação de THC por CYP2C9/ [0066] Fig. 31. Transferência de um componente de ácido glucurônico para urn substrato de canabinoide por UGT.

[0067] Fig. 32. Síntese do ácido olivetólico, urn precursor de CBGA.

[0068] Fig. 33. Comparação da sequência de aminoácidos das sequências de proteínas da catalase de Arabidopsis exemplificadora.

[0069] Fig. 34. Diagrama esquemático do aumento da produção de canabinoides associado ao sistema de dano oxidativo reduzido em uma modalidade do mesmo. MODO(S) PARA REALIZAR A(S) INVENÇÃO(ÕES) [0070] A presente invenção inclui uma variedade de aspectos, que podem ser combinados de diferentes maneiras. As descrições a seguir são fornecidas para listar os elementos e descrever algumas das modalidades da presente invenção. Esses elementos são listados com modalidades iniciais, no entanto deve-se entender que eles podem ser combinados de qualquer maneira e de qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos descritos de várias maneiras e modalidades preferidas não devem ser interpretados para limitar a presente invenção para apenas os sistemas técnicas e aplicações explicitamente descritos. Além disso, esta descrição deve ser compreendida para apoiar e abranger as descrições e reivindicações de todas as várias modalidades, sistemas, técnicas, métodos, dispositivos e aplicações com qualquer número dos elementos divulgados, com cada elemento sozinho, e também com quaisquer e todas as várias permutações e combinações de todos os elementos nesta ou em qualquer aplicação subsequente.

[0071] A tecnologia inventiva inclui sistemas e métodos para produção de alto nível de compostos canabinoides. Como usado aqui, o termo “alto nível” nesta modalidade pode significar maior do que a biossintese ou acúmulo do tipo

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19/114 selvagem de um ou mais canabinoides na planta ou célula de planta. Em uma modalidade, uma suspensão ou raiz pilosa ou cultura de suspensão de célula de uma ou mais cepas de plantas pode ser estabelecida. Em uma modalidade preferida, uma suspensão ou raiz pilosa ou cultura de suspensão de célula de uma ou mais cepas de Cannabis ou plantas de tabaco pode ser estabelecida. Deve-se notar que o termo cepa pode se referir a uma cepa de planta, bem como a uma cultura de células ou a linhagem de células derivada de uma planta, como a Cannabis.

[0072] Em uma modalidade preferida, uma suspensão ou raiz pilosa ou cultura de suspensão de células de Cannabis sativa ou planta de tabaco pode ser estabelecida em um fermentador ou outro aparelho similar. Deve-se notar que o uso de C. sativa nesta modalidade é apenas exemplificador. Por exemplo, em certas outras modalidades, várias cepas de Cannabis, misturas de cepas, híbridos ou clones de diferentes cepas, bem como variedades diferentes podem ser usados para gerar uma suspensão ou cultura de raiz pilosa. Por exemplo, cepas tais como C. sativa, C. indica e C. ruderalis podem ser usadas com a tecnologia inventiva. Em ainda outras modalidades, outras plantas produtoras de canabinoides ou do tipo canabinoide podem ser usadas. Por exemplo, em uma certa modalidade uma suspensão de células ou cultura de raiz pilosa pode ser estabelecida para uma ou mais das seguintes: Echinacea; Acmella Oleracea; Helichrysum Umbraculigerum; Radula Marginata (erva do fígado), Theobroma Cacau ou tabaco.

[0073] Em certas modalidades, tais fermentadores podem incluir grandes fermentadores de escala industrial, permitindo ampla quantidade de células de C. sativa produtoras de canabinoides para ser cultivada. Nesta modalidade, pode ser possível cultivar uma ampla quantidade de células não adulteradas de uma cepa única de, por exemplo, tabaco ou C. sativa, que pode estabelecer uma cultura de células com produção e/ou modificação consistente de compostos canabinoides em ambos dentre a quantidade e o tipo. Tal crescimento cultivado pode ser continuamente sustentado com a suplementação de nutrientes e outros fatores de

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20/114 crescimento à cultura. Tais características podem ser automatizadas ou realizadas manualmente.

[0074] Outra modalidade da tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos para produção de alto nível de compostos canabinoides modificados. Em uma modalidade, uma suspensão ou cultura de raízes pilosas de uma ou mais linhagens de plantas de tabaco pode ser estabelecida. Deve-se notar que o termo cepa pode se referir a uma cepa de planta, bem como a uma cultura de células ou linhagem de células derivadas de uma planta de tabaco. Em uma modalidade preferida, uma suspensão ou cultura de raiz pilosa de planta de Nicotiana benthamiana pode ser estabelecida em um fermentador ou outro aparelho similar. Deve-se notar que o uso de N. benthamiana nesta modalidade é apenas exemplificador. Por exemplo, em certas outras modalidades, várias cepas de Nicotiana, misturas de cepas, híbridos de diferentes cepas ou clones, bem como variedades diferentes podem ser usados para gerar uma suspensão de células ou cultura de raiz pilosa.

[0075] Em certos casos, esses fermentadores podem incluir fermentadores de ampla escala industrial, permitindo que uma ampla quantidade de células de N. benthamiana seja cultivada. Nesta modalidade, os canabinoides colhidos podem ser introduzidos nesta cultura de suspensão e modificados como geralmente descrito aqui. Similarmente, tal crescimento cultivado de células de tabaco pode ser continuamente sustentado com a contínua adição de nutrientes e outros fatores de crescimento sendo adicionados à cultura. Tais características podem ser automatizadas ou realizadas manualmente.

[0076] Outra modalidade da invenção pode incluir a produção de Cannabis e/ou células do tabaco geneticamente modificadas para expressar genes exógenos e/ou endógenos variáveis que podem modificar a estrutura química dos compostos canabinoides. Tais cepas transgênicas podem ser configuradas para produzir e/ou modificar grandes quantidades de compostos canabinoides em geral, bem como aumentos direcionados à produção de canabanoides específicos, tais como THC, Canabidiol (CBD) ou Cannabinol (CBN) e similares.

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21/114 [0077] Outra modalidade da invenção pode incluir a produção de culturas de células de Cannabis geneticamente modificadas que expressam uma mistura de canabinoides que podem ser otimizados para o tratamento de condições médicas específicas. Por exemplo, CBD é um canabinoide não psicoativo que pode ser usado para tratar convulsões naquelas pessoas com epilepsia. No entanto, décadas de criação seletiva resultaram na maioria de cepas de Cannabis com baixas concentrações de CBD quando comparadas ao canabinoide psicoativo THC. Assim sendo, em certas modalidades, as culturas de células específicas da doença ou síndrome podem ser desenvolvidas as quais expressam uma mistura calibrada de canabinoides para o tratamento a jusante de tais condições.

[0078] Modalidades adicionais da tecnologia inventiva podem incluir novos sistemas, métodos e composições para a produção e modificação in vivo de compostos canabinoides em um sistema de planta. Em certa modalidade, estas modificações in vivo podem levar à produção de diferentes formas de canabinoides com propriedades especiais, por exemplo, pró-fármacos ou canabinoides solúveis em água, de liberação lenta. Em uma modalidade preferida, a tecnologia inventiva pode incluir novos sistemas, métodos e composições para a hidroxilação, acetilação e/ou glicosilação. Os canabinoides modificados podem ser solúveis em água, por exemplo, por glicosilação.

[0079] Como observado acima, a produção e/ou o acúmulo de altos níveis de canabinoides seriam tóxicos para um hospedeiro de célula de planta. Como tal, uma modalidade da tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos para modificar transitoriamente canabinoides in vivo. Um dos objetivos da presente invenção pode incluir o uso de mono-oxigenases do citocromo P450 (CYP) para modificar ou funcionalmente transitoriamente a estrutura química dos canabinoides. Os CYPs constituem uma família de enzimas principais capazes de catalisar a biotransformação oxidativa de muitos compostos químicos farmacologicamente ativos e outros xenobióticos lipofílicos. Por exemplo, como mostrado na Fig. 13, a reação mais comum catalisada pelos citocromos P450 é uma reação de mono

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22/114 oxigenase, por exemplo, inserção de um átomo de oxigênio na posição alifática de um substrato orgânico (RH) enquanto o outro átomo de oxigênio é reduzido a água. [0080] Vários canabinoides, incluindo THC, demonstraram servir como substrato para os CYPs humanos (CYP2C9 e CYP3A4). Da mesma forma, foram identificados CYPs que metabolizam o canabidiol (CYPs 2C19, 3A4); canabinol (CYPs 2C9, 3A4); JWH-018 (CYPs 1A2, 2C9); e AM2201 (CYPs 1A2, 2C9). Por exemplo, como mostrado geralmente na Fig. 30, em um sistema exemplificador, o CYP2C9 pode “funcionalizar” ou hidroxila uma molécula de THC resultante em uma forma de hidroxila de THC. Oxidação adicional da forma de hidroxila do THC pelo CYP2C9 pode converter o mesmo para uma forma de ácido carboxílico que perde suas capacidades psicoativas, tornando o mesmo um metabólito inativo.

[0081] Como tal, outra modalidade da invenção pode incluir a criação de uma cepa ou cultura de células de Cannabis que pode ser transformada com construtos de genes criados artificialmente que codificam um ou mais CYPs exógenos. Em uma modalidade preferida, os genes que codificam uma ou mais isoformas e/ou análogos não humanos, bem como possivelmente outros CYPs que podem funcionalizar canabinoides, podem ser expressos no Cannabis sativa transgênico ou outra planta. Em outra modalidade preferida, os genes que codificam uma ou mais isoformas e/ou análogos não humanos, bem como possivelmente outros CYPs que podem funcionalizar canabinoides, podem ser expressos nas cepas de Cannabis sativa transgênicas ou de tabaco em uma cultura de suspensão. Modalidades adicionais podem incluir elementos de controle genético, como promotores e/ou intensificadores, bem como elementos reguladores póstranscricionais que também podem ser expressos nas cepas de Cannabis transgênicas tais que a presença, a quantidade e a atividade de qualquer CYP na suspensão ou cultura de raiz pilosa podem ser modificadas e/ou calibradas.

[0082] Outra modalidade da invenção pode incluir a criação de uma cepa de tabaco ou a cultura de células pode ser transformada com construtos de gene criados artificialmente que codificam um ou mais CYPs exógenos. Em uma modalidade

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23/114 preferida, os genes que codificam uma ou mais isoformas e/ou análogos não humanos, bem como possivelmente outros CYPs que podem funcionalizar canabinoides introduzidos em uma cultura de suspensão ou plantas de Nbenthamiana transgênicas. Modalidades adicionais podem incluir elementos de controle genético, como promotores e/ou intensificadores, bem como elementos reguladores pós-transcricionais que também podem ser expressos em cepas de Nbenthamiana transgênicas tais que a presença, a quantidade e a atividade de qualquer CYP na suspensão ou cultura de raiz pilosa pode ser modificada e/ou calibrada.

[0083] Outro objetivo da invenção pode ser modificar adicionalmente, in vivo, canabinoides e/ou canabinoides já funcionalizados. Em uma modalidade preferida, a glicosilação de canabinoides e/ou canabinoides funcionalizados pode converter os mesmos a uma forma solúvel em água. Em uma modalidade exemplificadora mostrada na Fig. 31, a tecnologia inventiva pode utilizar uma ou mais enzimas glicosiltransferase, como a UDP-glicosiltransferase (UGT), para catalisar, in vivo a glucuronosilação ou glucuronidação de canabinoides, como canabinoides primários (CBD, CBN) e secundários (THC, JWH-018, JWH-073). Em uma modalidade, glucuronidação pode consistir na transferência de um componente de ácido glucurônico do ácido glucurônico de difosfato de uridina para um substrato de canabinoide por qualquer um dos vários tipos de glicosiltransferases, como descrito aqui. O ácido glucurônico é um ácido de açúcar derivado de glicose, com seu sexto átomo de carbono oxidado para um ácido carboxílico.

[0084] Ainda outra modalidade da invenção atual pode incluir a conversão in vivo de um canabinoide funcionalizado, neste exemplo, uma forma de carboxílico ácido do canabinoide, para uma forma glicosilada de canabinoide que pode ser tanto solúvel em água como não tóxica para a célula hospedeira. Estas modificações químicas podem permitir maiores níveis de acúmulo de canabinoides em uma cultura de célula de planta sem os efeitos citotóxicos deletérios que poderíam ser vistos com canabinoides não modificados devido a esta solubilidade em água.

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24/114 [0085] Outra modalidade da invenção pode incluir a geração de cepas transgênicas ou geneticamente modificadas de Cannabis, ou outras plantas como tabaco, tendo construtos genéticos artificiais que podem expressar um ou mais genes que podem aumentar a solubilidade dos canabinoides e/ou diminuir a citotoxicidade dos canabinoides. Por exemplo, a tecnologia inventiva pode incluir a geração de cepas de plantas transgênicas ou linhagens de células com construtos genéticos artificiais que podem expressar uma ou mais glicosiltransferases endógenas e/ou exógenas ou outras enzimas capazes de glicosilar compostos canabinoides. Por exemplo, em uma modalidade uma ou mais glicosiltransferases de N-benthamiana, ou outras plantas que não sejam de cannabis podem ser introduzidas em uma planta de cannabis ou cultura de célula e configuradas para canabinoides glicosilados in vivo. Em uma outra modalidade, as glicosiltransferases endógenas de N-benthamiana podem ser superexpressas para aumentar a glicosilação de canabinoide in vivo.

[0086] Em um modalidade adicional, a tecnologia inventiva pode incluir a geração de construtos de gene artificiais com genes que codificam uma ou mais glicosiltransferases, incluindo análogos não humanos daqueles aqui descritos assim como outras isoformas, que podem ser expressas no Cannabis sativa transgênico, N-benthamiana ou outro sistema de planta que pode ainda ser crescido em uma cultura de suspensão. Modalidades adicionais podem incluir elementos de controle genético tais como promotores e/ou intensificadores bem como elementos de controle regulatório pós-transcricional que também podem ser expressos em um sistema de plantas transgênicas de modo que a presença, a quantidade e a atividade de quaisquer glicosiltransferases presentes na suspensão ou cultura de raiz pilosa podem ser reguladas.

[0087] A modalidade adicional da invenção pode incluir construtos de gene artificiais com um ou mais genes que codificam uma ou mais UDP- e/ou ADPglicosiltransferases com sequências ou domínios de localização que podem auxiliar no movimento da proteína para uma certa porção do célula, como os locais celulares que eram canabinoides e/ou os canabinoides funcionalizados podem ser

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25/114 modificados, produzidos, armazenados e/ou excretados da célula.

[0088] A modalidade adicional da invenção pode incluir construtos de gene artificiais tendo um ou mais genes que codificam uma ou mais UDP- e/ou ADPglicosiltransferases sendo co-expressas com um ou mais genes exógenos que podem ajudar no movimento da proteína para uma certa porção da célula, como os locais celulares que eram canabinoides e/ou canabinoides funcionalizados podem ser armazenados, e/ou excretados da célula.

[0089] Uma modalidade preferida da tecnologia inventiva pode incluir a produção in vivo de alto nível de canabinoides glicosilados, solúveis em água, geralmente referidos como canabinoides transitoriamente modificados que podem ser colhidos de uma planta ou uma cultura de células. Em uma modalidade, os canabinoides transitoriamente modificados podem se acumular dentro da célula que é parte de uma cultura de suspensão. Neste exemplo, a cultura de célula pode ser deixada crescer para um nível desejado da célula ou densidade óptica ou em outros casos até um nível desejado de canabinoides transitoriamente modificados ter se acumulado nas células de Cannabis. Esses genes exógenos podem ser localizados, por exemplo, no citosol ou tricoma como geralmente descrito aqui, e podem ainda ser coexpressos com outros genes exógenos que podem reduzir a toxicidade da biossíntese de canabinoides e/ou facilitar o transporte de canabinoides através, ou fora da célula.

[0090] Todas ou uma porção das células de Cannabis contendo os canabinoides transitoriamente modificados acumulados podem ser colhidas da cultura, que em uma modalidade preferida pode ser um fermentador em escala industrial ou outro aparelho adequado para o cultivo em larga escala de células de plantas. As células de Cannabis colhidas podem ser lisadas de modo que os canabinoides transitoriamente modificados acumulados possam ser liberados para o lisado circundante. Etapas adicionais podem incluir o tratamento deste lisado. Exemplos desse tratamento podem incluir filtragem ou triagem deste lisado para remover material vegetal estranho bem como tratamentos químicos para melhorar

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26/114 rendimentos de canabinoide posteriores.

[0091] Outra modalidade da tecnologia inventiva pode incluir a geração in vivo de alto nível de canabinoides glicosilados e solúveis em água, geralmente referidos como canabinoides transitoriamente modificados que podem ser colhidos de uma planta ou uma cultura de célula. Em uma modalidade, os canabinoides podem ser introduzidos em uma cultura de células não produtoras de canabinoide, tal como Nbenthamiana. Nesta modalidade preferida, a cultura de células não produtoras de canabinoide pode ser geneticamente modificada para expressar um ou mais genes endógenos ou exógenos que podem modificar os canabinoides, por exemplo, através de hidroxilação, acetilação e/ou glicosilação. Tais genes endógenos ou exógenos podem ser localizados, por exemplo, no citosol ou tricoma como geralmente descrito aqui, e podem ser ainda coexpressos com outros genes exógenos que podem reduzir a toxicidade da biossíntese de canabinoides e/ou facilitar o transporte de canabinoides através, ou fora da célula.

[0092] Esta cultura de células não produtoras de canabinoide pode ser deixada crescer para um desejado nível da célula ou densidade óptica, ou em outros casos até um desejado nível de canabinoides transitoriamente modificados ter se acumulado nas células cultivadas. Todas ou uma porção das células de Nbenthamiana contendo os canabinoides acumulados podem ser colhidas da cultura, que em uma modalidade preferida pode ser um fermentador de escala industrial ou outro aparelho adequado para a cultura em larga escala de células de plantas. As células N-benthamiana colhidas podem ser lisadas de modo que os canabinoides transitoriamente modificados acumulados podem ser liberados para o lisado circundante. Etapas adicionais podem incluir o tratamento deste lisado. Exemplos de tal tratamento podem incluir filtrar ou peneirar esse lisado para remover o material vegetal estranho bem como os tratamentos químicos para melhorar os rendimentos posteriores de canabinoides.

[0093] Outro objetivo da tecnologia inventiva pode incluir métodos para isolar e purificar os canabinoides modificados transitoriamente a partir de uma planta ou

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27/114 cultura de suspensão. Em uma modalidade preferida, um Cannabis lisado pode ser gerado e processado utilizando cromatografia de afinidade ou outros métodos de purificação. Nesta modalidade preferida, a coluna de afinidade com um ligante ou receptor de proteína configurado para se ligar com os canabinoides transitoriamente modificados, por exemplo, através da associação com um grupo funcional de glicosil ou ácido glicurônico entre outros, pode ser imobilizada ou acoplada a um suporte sólido. O lisado pode então ser passado sobre a coluna de modo que os canabinoides transitoriamente modificados, tendo uma afinidade de ligação específica ao ligante, se tornem ligados e imobilizados. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação não específicas e não ligantes que podem estar presentes no lisado podem ser removidas. Finalmente, os canabinoides transitoriamente modificados podem ser eluídos ou deslocados da coluna de afinidade, por exemplo, um açúcar correspondente ou outro composto que pode deslocar ou interromper a ligação de canabinoide-ligante. Os canabinoides transientes modificados eluídos podem ser coletados e ainda purificados ou processados.

[0094] Um alvo da invenção pode incluir a modalidade em que os canabinoides modificados transitoriamente são passivamente e/ou ativamente excretados de uma célula ou em uma parede celular. Em um modelo exemplificador, o transportador de cassete exógeno de ligação a ATP (transportadores ABC) ou outra estrutura molecular semelhante pode reconhecer o grupo funcional de ácido glucurônico ou glicosil (conjugado) no canabinoide transitoriamente modificado e transportar ativamente o mesmo através da parede/membrana celular no meio circundante. Em uma modalidade, a cultura de célula pode deixar crescer até um parâmetro de saída ser alcançado. Em um exemplo, um parâmetro de saída pode incluir deixar que a cultura de células cresça até uma célula/densidade óptica desejada ser atingida ou uma concentração desejada de canabinoide transitoriamente modificado ser alcançada. Nesta modalidade, o meio de cultura contendo os canabinoides transitoriamente modificados pode ser colhido para

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28/114 posterior extração de canabinoides. Em algumas modalidades, esse meio colhido pode ser tratado de maneira semelhante para o lisado geralmente descrito acima. Além disso, os canabinoides transitoriamente modificados presentes no meio bruto e/ou tratado podem ser isolados e purificados, por exemplo, por cromatografia de afinidade de maneira semelhante à descrita acima.

[0095] Em certas modalidades, esse isolado canabinoide purificado pode conter uma mistura de canabanoides glicosilados primários e secundários. Como observado acima, esses canabinoides glicosilados purificados podem ser solúveis em água e metabolizados mais lentamente que os canabinoides não modificados, fornecendo uma capacidade de liberação lenta que pode ser desejável em certas aplicações farmacêuticas, tal como para uso em aplicações específicas de tecido, ou como um pró-fármaco. Assim sendo, é um objetivo da invenção incorporar esses canabinoides glicosilados purificados em uma variedade de aplicações farmacêuticas e/ou nutracêuticas.

[0096] Por exemplo, os canabinoides glicosilados purificados podem ser incorporados em vários vetores de liberação de sólidos e/ou líquidos para uso em aplicações farmacêuticas. Como observado acima, esses canabinoides transitoriamente modificados podem não possuir mais seu componente psicoativo, tornando sua aplicação em pesquisa terapêutica e aplicações farmacêuticas especialmente vantajosa. Por exemplo, o tratamento de crianças pode ser realizado através da administração de uma dose terapêutica de canabinoides modificados transitoriamente purificados e isolados, sem o efeito psicoativo indesejado. Aplicações terapêuticas adicionais podem incluir a colheita e a administração posterior de uma dose de um “ambiente” de canabinoides modificados transitoriamente purificados e isolados.

[0097] Outra modalidade da invenção pode incluir um sistema para converter ou reconstituir canabinoides transitoriamente modificados. Em uma modalidade preferida, os canabinoides glicosilados podem ser convertidos para canabinoides não glicosilados através do seu tratamento com uma ou mais glicosidases

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29/114 generalizadas ou específicas. O uso e a disponibilidade de enzimas glicosidases pode ser reconhecido pelos versados na técnica sem exigir experimentação indevida. Nesta modalidade, essas enzimas glicosidases podem remover uma porção de açúcar. Especificamente, essas glicosidases podem remover a porção de glicosil ou ácido glucurônico reconstituindo o composto canabinoide para uma forma exibindo atividade psicoativa. Esse processo de reconstituição pode gerar um “ambiente” altamente purificado de canabinoides primários e secundários. Esses compostos canabinoides reconstituídos também podem ser incorporados em vários vetores de liberação sólidos e/ou líquidos para uso em uma variedade de aplicações farmacêuticas e outras aplicações comerciais.

[0098] Como observado acima, em uma modalidade da invenção, as cepas produtoras de canabinoides de Cannabis, bem como outras plantas podem ser utilizadas com a tecnologia inventiva. Em certas modalidades preferidas, em vez de cultivar a planta produtora de canabinoide alvo em uma cultura de células, o material vegetal bruto pode ser colhido e sofrer extração de canabinoide utilizando um ou mais dos métodos aqui descritos. Estes canabinoides tradicionalmente extraídos podem então ser modificados a partir de suas formas nativas através da aplicação in vitro de um ou mais CYPs que podem gerar formas de hidroxil e ácido carboxílico desses canabinoides, respectivamente. Estes canabinoides funcionalizados podem ser ainda modificados através da aplicação in vitro de uma ou mais glicosiltransferases, como geralmente descrito aqui. Nesta modalidade, os novos canabinoides transitoriamente modificados podem ser isolados e purificados através de um processo de cromatografia de afinidade ou outro protocolo de extração, e então aplicados a vários usos comerciais e outros usos terapêuticos. Em outras modalidades, os canabinoides transitoriamente modificados podem ser restaurados e reconstituídos através da aplicação in vitro de uma ou mais enzimas glicosidases. Esses canabinoides restaurados também podem ser aplicados a vários usos comerciais e outros usos de terapêuticos.

[0099] Outra modalidade da invenção pode incluir o uso de outras plantas não

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30/114 produtoras de canabinoides, em vez de cultivar uma planta produtora de canabinoides em uma cultura de células. Aqui, o canabinoide pode ser introduzido em plantas geneticamente modificadas ou culturas de células vegetais que expressam um ou mais CYPs que podem gerar formas de hidroxil e ácido carboxílico desses canabinoides, respectivamente. Estes canabinoides funcionalizados podem ser ainda modificados através da ação de uma ou mais glicosidases que também podem ser expressas na cultura de plantas ou células não produtoras de canabinoides. Em uma modalidade preferida, uma cultura de células não produtoras de canabinoides pode incluir plantas de tabaco ou culturas de células.

[00100] Uma modalidade da invenção pode incluir um método in vivo de acumulação e modificação de canabinoides direcionados a tricomas. Uma modalidade preferida deste sistema in vivo pode incluir a criação de uma proteína recombinante que pode permitir a translocação de um CYP ou glicosiltransferases para um local de síntese extracelular de canabinoides em uma planta inteira. Mais especificamente, nesta modalidade preferida, um ou mais CYPs ou glicosiltransferases podem ser modificados para expressar toda ou parte da sequência alvo extracelular N-terminal como presente na proteína canabinoide sintase, como THCA sintase ou CBDA sintase.

[00101 ] Uma outra modalidade da invenção pode incluir um método in vivo de biossíntese, acumulação e/ou modificação de canabinoides de alto nível direcionados a tricomas. Uma modalidade preferida deste sistema in vivo pode incluir a criação de uma proteína recombinante que pode permitir a translocação de uma catalase para um local de síntese extracelular de canabinoide em uma planta inteira. Mais especificamente, nesta modalidade preferida, uma ou mais enzimas catalase podem ser manipuladas para expressar toda ou parte da sequência alvo extracelular N-terminal como presente na proteína canabinoide sintase, tal como THCA sintase ou CBDA sintase. Nesta modalidade, a catalase pode ser direcionada para o local da biossíntese de canabinoides, permitindo neutralizar de

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31/114 maneira mais eficiente os subprodutos do peróxido de hidrogênio.

[00102] Nesta modalidade preferida, essa sequência ou domínio de direcionamento de tricoma N-terminal pode geralmente incluir os primeiros 28 resíduos de aminoácidos de uma sintase generalizada. Uma sequência alvo de tricoma exemplificadora para THCA sintase é identificada SEQ ID NO. 40, enquanto a sequência alvo de tricoma para CBDA sintase é identificada SEQ ID NO. 41. Essa sequência alvo extracelular pode ser reconhecida por a planta célula e causar o transporte da glicosiltransferase de citoplasma ao tricrômico da planta, e Em uma modalidade em particular o compartimento de armazenamento do tricrômico da planta em que a glicosilação extracelular de canabinoide maio ocorrer. Mais especificamente, nesta modalidade preferida, uma ou mais glicosiltransferases, como a UDP glicosiltransferase, podem ser manipuladas para expressar toda ou parte da sequência alvo extracelular N-terminal, como presente em uma enzima sintase exemplificadora.

[00103] Outra modalidade da invenção pode incluir um método in vivo de produção, acumulação e/ou modificação de canabinoides direcionados ao citosol. Uma modalidade preferida deste sistema in vivo pode incluir a criação de uma proteína recombinante que pode permitir a localização de canabinoides sintases e/ou glicosiltransferases no citosol.

[00104] Mais especificamente, nesta modalidade preferida, uma ou mais canabinoides sintases podem ser modificadas para remover toda ou parte da sequência alvo extracelular N-terminal. Uma sequência alvo de tricoma exemplificadora para THCA sintase é identificada SEQ ID NO. 40, enquanto a sequência alvo de tricoma para CBDA sintase é identificada SEQ ID NO. 41. A coexpressão com esta sintase alvo citossólica com uma CYP alvo citossólica ou glicosiltransferase pode permitir a localização da síntese, acumulação e modificação de canabinoides no citosol. Tais enzimas alvos citossólicas podem ser coexpressas com catalase, transportador ABC ou outros genes que podem reduzir a toxicidade da biossíntese de canabinoides e ou facilitar o transporte através, ou

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32/114 fora da célula.

[00105] Outra modalidade da invenção pode incluir a geração de um vetor de expressão compreendendo esse polinucleotídeo, ou seja, uma sequência alvo extracelular N-terminal da canabinoide sintase e genes da glicosiltransferase, operacionalmente ligados a um promotor. Uma planta geneticamente alterada ou partes da mesma e sua progênie compreendendo este polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor, em que a referida planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a referida proteína quimérica, é ainda outra modalidade. Por exemplo, as sementes e o pólen contêm esta sequência de polinucleotídeos ou um homólogo da mesma, uma célula vegetal geneticamente alterada compreendendo esse polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor, de modo que a referida célula vegetal produz a referida proteína quimérica. Outra modalidade compreende uma cultura de tecidos compreendendo uma pluralidade de células vegetais geneticamente alteradas.

[00106] Outra modalidade da invenção fornece uma planta ou célula geneticamente alterada que expressa uma proteína quimérica ou de fusão com uma sequência alvo extracelular N-terminal de canabinoide sintase N (ver, por exemplo, SEO ID NO: 40-41; ver também SEQ ID NO. 42 para a sequência completa de aminoácidos da THCA sintase) acoplada a um gene de UDP glicosiltransferase, operacionalmente ligado a um promotor. Outra modalidade fornece um método para construir uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma com glicosilação de canabinoides no compartimento de armazenamento extracelular do tricoma da planta em comparação com uma planta ou parte da mesma não geneticamente alterada, o método compreendendo as etapas de: introduzir um polinucleotídeo que codifica a proteína acima em uma planta ou parte da mesma para fornecer uma planta ou parte da mesma geneticamente alterada, em que a referida proteína quimérica compreende um primeiro domínio, um segundo domínio, e em que o referido primeiro domínio compreende uma sequência alvo extracelular N-terminal da canabinoide sintase e um o segundo

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33/114 domínio compreende uma sequência de glicosiltransferase. Esses domínios podem ser separados por um terceiro domínio ou ligante. Este ligante pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que pode separar um primeiro domínio de um segundo domínio, de modo que o primeiro domínio e o segundo domínio possam cada um dobrar em sua forma tridimensional apropriada e reter sua atividade.

[00107] Uma modalidade preferida da invenção pode incluir uma planta ou célula geneticamente alterada que expressa uma proteína canabinoide sintase de alvo citossólico tendo uma sequência alvo extracelular N-terminal de canabinoide sintase (SEQ ID NOs. 40-41) inativada ou removida. Em uma modalidade, uma THCA sintase de alvo citossólico (ctTHCAs) pode ser identificada como SEQ ID NO. 46, enquanto em outra modalidade a CBDA sintase de alvo citossólico (cytCBDAs) é identificada como SEQ ID NO. 22-23). Essa proteína canabinoide sintase de alvo citossólico pode ser operacionalmente ligada a um promotor. Outra modalidade fornece um método para construir uma planta ou parte da mesma geneticamente alterada com glicosilação de canabinoides no citosol da planta em comparação com uma planta ou parte da mesma não geneticamente alterada, o método compreendendo as etapas de: introduzir um polinucleotídeo que codifica a proteína acima em uma planta ou parte da mesma para fornecer uma planta ou parte da mesma geneticamente alterada, em que a referida sequência alvo extracelular N-terminal de canabinoide sintase foi interrompida ou removida.

[00108] Ainda outra modalidade da invenção pode incluir um método in vivo de glicosilação de canabinoides em uma cultura de células de cannabis. Em uma modalidade preferida, para facilitar a glicosilação de canabinoides na cultura de células de cannabis, que carecería de uma estrutura de tricoma extracelular, um gene de canabinoide sintase pode ser geneticamente modificado para remover ou interromper, por exemplo, através de uma mutação direcionada, o domínio de alvo N-terminal extracelular que pode ser usado para transformar uma célula vegetal de Cannabis em uma cultura células. Nesta modalidade, sem esse domínio de alvo, a canabinoide sintase, por exemplo, THCA ou CBDA sintase, pode permanecer

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34/114 dentro da célula vegetal, em vez de ser transportada ativamente para fora da célula, onde pode ser expressa com uma ou mais glicosiltransferases, como UDP glicosiltransferase no citoplasma.

[00109] Outra modalidade da tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos para produção e/ou acumulação melhoradas de compostos canabinoides em um sistema in vivo. Em uma modalidade preferida, a invenção pode incluir a geração de uma planta de Cannabis geneticamente modificada ou transgênica que pode produzir e/ou acumular um ou mais canabinoides a níveis mais altos do que os do tipo selvagem. Em uma modalidade, uma planta transgênica de Cannabis pode ser gerada para expressar um ou mais fatores de transcrição de Cannabis sativa que podem melhorar a(s) via(s) metabólica(s) de canabinoides. Em uma modalidade preferida, pode ser gerado um polinucleotídeo que codifica um ou mais genes de fatores de transcrição myb de Cannabis sativa e/ou um ou mais genes ortólogos exógenos que aumentam o fluxo de metabólitos através da via biossintética de canabinoide.

[00110] Nesta modalidade preferida, pode ser gerado um polinucleotídeo que codifica um ou mais genes de fatores de transcrição myb de Cannabis sativa, como CAN833 e/ou CAN738. Como mostrado na Fig. 32, esses fatores de transcrição podem impulsionar a produção de ácido olivetólico, que é um precursor de CBGA, que por sua vez é um precursor na via biossintética de THCs, CBDs e CBC. Em uma modalidade alternativa, pode ser gerado um polinucleotídeo que codifica um ou mais ortólogos de genes de fatores de transcrição myb de Cannabis sativa, especificamente cannabis Mybl2 (SEQ ID NOs. 11-12), Myb8 (SEQ ID NO. 43), AtMybl2 (SEQ ID N0.44), e/ou MYB1 12 (SEQ ID NO. 45) que também pode impulsionar a produção de ácido olivetólico, que é um precursor do CBGA, que por sua vez é um precursor na via biossintética de THCs, CBDs e CBC.

[00111] Em uma modalidade preferida, a invenção pode incluir métodos para gerar um polinucleotídeo que expressa uma ou mais das SEQ IDs relacionadas à produção melhorada de canabinoides aqui identificados. Em certas modalidades

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35/114 preferidas, as proteínas da invenção podem ser expressas usando qualquer um de vários sistemas para obter as quantidades desejadas da proteína. Tipicamente, o polinucleotídeo que codifica a proteína ou seu componente é colocado sob o controle de um promotor que é funcional na célula hospedeira desejada. Uma variedade extremamente ampla de promotores pode estar disponível e pode ser usada nos vetores de expressão da invenção, dependendo da aplicação específica. Normalmente, o promotor selecionado depende da célula na qual o promotor deve estar ativo. Outras sequências de controle de expressão, tais como sítios de ligação ao ribossomo, sítios de terminação da transcrição e similares, também estão opcionalmente incluídas. Os construtos que incluem uma ou mais dessas sequências de controle são denominados “cassetes de expressão” ou “construtos”. Portanto, os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos unidos são incorporados para expressão de alto nível em uma célula hospedeira desejada. [00112] Modalidades adicionais da invenção podem incluir a seleção de uma planta ou parte da mesma geneticamente alterada que expressa a proteína do fator de transcrição da produção de canabinoides, em que a proteína expressa tem capacidades aumentadas de biossíntese de canabinoides. Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica a proteína do fator de transcrição da produção de canabinoides é introduzido através da transformação da referida planta com um vetor de expressão compreendendo o referido polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor. A proteína do fator de transcrição de produção de canabinoide pode compreender uma SEQ ID selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11-2 ou 43-45, ou um homólogo da mesma.

[00113] Como observado acima, uma modalidade da invenção pode incluir sistemas e métodos para desintoxicação geral e/ou localizada da biossíntese de canabinoides em um sistema in vivo. Em uma modalidade preferida, a invenção pode incluir a geração de uma Cannabis geneticamente modificada ou transgênica ou outra planta que possa ser configurada para ser capaz de desintoxicar subprodutos do peróxido de hidrogênio resultantes da biossíntese de canabinoides

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36/114 em níveis mais altos do que os do tipo selvagem. Além disso, essa desintoxicação pode ser configurada para ser localizada na estrutura do citosol e/ou tricoma da planta Cannabis, onde os canabinoides estão sendo sintetizados ativamente em um sistema de planta inteira. Nesta modalidade preferida da invenção, uma planta transgênica, como uma planta ou célula de cannabis ou tabaco, que expressa um ou mais genes podem sobre regular a desintoxicação do peróxido de hidrogênio. [00114] Em uma modalidade preferencial, um polinucleotídeo pode ser gerado que codifica para um ou mais genes da catalase de transcrição endógena e/ou exógena e/ou ortólogos que catalisam a redução do peróxido de hidrogênio: Catalase

Ψ

H2O2 -> 2 H2O + O2 [00115] Como tal, em uma modalidade, a invenção compreende a geração de um polinucleotídeo que codifica uma proteína catalase exógena que pode ser expressa dentro de uma planta transformada e/ou cultura de células. Em uma modalidade preferencial, uma enzima catalase configurada reduz 0 peróxido de hidrogênio (H202) gerado durante a síntese de canabinoide pode ser usada para transformar uma cannabis ou outra planta, tal como uma planta de tabaco. Embora várias enzimas genéricas da catalase possam ser incluídas no neste primeiro domínio, como meramente um modelo exemplar, um primeiro domínio pode incluir uma catalase exógena derivada de Arabidopsis (SEQ ID NO. 13-14; veja também Fig. 33), ou Escherichia coli (SEQ ID NO. 15-16), ou qualquer ortólogo de catalase, fragmento de proteína ou catalase apropriada com uma homologia entre cerca de 70% e aproximadamente 100%, conforme aqui definido.

[00116] Outra modalidade da presente invenção pode incluir a localização da enzima catalase em uma estrutura de tricoma. Tal como geralmente descrito acima, nesta modalidade uma sequência de alvo de tricoma a partir de uma sintase de canabinoides pode ser acoplada com um ou mais enzimas catalase em uma fusão ou quimera - os termos que são geralmente intermutáveis no presente

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37/114 pedido. Este gene da catalase de alvo do tricoma artificial pode ser usado para transformar uma planta com estruturas de tricoma, como Cannabis ou tabaco. Em uma modalidade preferencial, uma catalase alvo de tricoma de Arabidopsis thaliana com um domínio de alvo de tricoma da THCA sintase é identificada como SEQ ID NO. 47, enquanto uma catalase Arabidopsis thaliana de alvo ao tricoma com um domínio alvo do tricoma da CBDA sintase é identificada como SEQ ID NO. 48) Em outra modalidade, uma catalase alvo de tricoma de Escherichia collalvo de tricoma com um domínio de alvo de tricoma da THCA sintase é identificada como SEQ ID NO. 49, enquanto uma catalase Escherichia colide alvo ao tricoma com um domínio alvo do tricoma da CBDA sintase é identificada como SEQ ID NO. 50) [00117] Outra modalidade da invenção compreende a geração de um polinucleotídeo de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de catalase quimérica/ de fusão. Outra modalidade inclui um vetor de expressão compreendendo este polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor. Uma planta geneticamente modificada ou partes da mesma e sua progênie compreendendo este polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor, em que a referida planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a referida proteína de fusão é ainda outra modalidade. Por exemplo, sementes e pólen contêm esta sequência de polinucleotídeos ou um homólogo do mesmo, uma célula de planta geneticamente modificada compreendendo esse polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor tal que a referida célula de planta produz a referida proteína quimérica. Outra modalidade compreende uma cultura de tecidos compreendendo uma pluralidade de células vegetais geneticamente modificadas.

[00118] Em uma modalidade preferencial, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de alvo de tricoma pode ser operacionalmente ligado a um promotor que pode ser apropriado para a expressão da proteína em uma Cannabis, tabaco ou outra planta. Promotores exemplares podem incluir, mas não se limitar a: um promotor não constitutivo; um promotor induzível, um promotor preferencial para tecidos; um promotor específico de tecido, um promotor específico de planta

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38/114 ou um promotor constitutivo. Em uma modalidade preferencial, um ou mais genes selecionados podem estar operacionalmente ligados a um promotor de gene específico da folha, como Cabl. Os promotores adicionais e configurações operáveis para expressão, assim como a coexpressão de um ou mais dos genes selecionados são geralmente conhecidos na técnica.

[00119] Outra modalidade da invenção pode fornecer um método para o construto de uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma com resistência aumentada à citotoxicidade do peróxido de hidrogênio gerado durante a síntese de canabinoides em comparação com uma planta não geneticamente modificada ou parte da mesma, o método compreendendo as etapas de: introduzir um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão em uma planta ou parte da mesma para fornecer uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma, em que a referida proteína de fusão compreende uma catalase e uma sequência de alvo de tricoma a partir de uma canabinoide sintase.

[00120] Em uma modalidade, a invenção pode abranger um sistema para aumentar a produção e acúmulo geral de canabinoides em tricomas, enquanto evita possíveis efeitos de citotoxicidade. Tal como geralmente mostrado na Fig. 34, o sistema pode incluir, em uma modalidade preferencial, a criação de um Cannabis transgênico, tabaco ou outras plantas ou cultura em suspensão de planta que superexpressa, pelo menos, um fator de transcrição Myb para aumentar a biossíntese total de canabinoides. De acordo com outras modalidades preferenciais, esta planta transgênica pode coexpressar uma enzima catalase para reduzir o dano oxidativo resultante da produção de peróxido de hidrogênio associado à síntese de canabinoides, reduzindo a toxicidade de células. Em certas modalidades preferenciais, esta catalase pode ser fundida com um domínio de alvo do tricoma da sintase N-terminal, por exemplo, da THCA e/ou CBDA sintase, ajudando a localizar a catalase no tricoma no caso de sistemas de plantas integrais e reduzir os níveis potencialmente tóxicos de peróxido de hidrogênio produzido pela atividade da THCA, CBCA e/ou CBDA sintase.

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39/114 [00121] Outra modalidade da invenção pode compreender um polinucleotídeo de combinação de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma combinação de: 1) uma proteína do fator de transcrição da produção de canabinoides, como um gene myb; e/ou uma proteína catalase, ou qualquer homólogo da mesma, que pode incluir ainda um alvo de tricoma ou sinal de localização. Uma planta geneticamente modificada ou partes da mesma e sua progênie compreendendo esta combinação de polinucleotídeos operacionalmente ligados a um promotor, em que a referida planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a referida proteína de fusão é ainda outra modalidade. Por exemplo, sementes e pólen contêm esta sequência de polinucleotídeos ou um homólogo do mesmo, uma célula de planta geneticamente modificada compreendendo esse polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor tal que a referida célula de planta produz a referida proteína. Outra modalidade compreende uma cultura de tecidos compreendendo uma pluralidade de células vegetais geneticamente modificadas.

[00122] Outra modalidade da invenção pode fornecer um método para o construto de uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma com: 1) aumentar a produção de canabinoides em comparação com uma planta não geneticamente modificada ou parte da mesma; e/ou 2) maior resistência à citotoxicidade do peróxido de hidrogênio gerado durante a síntese de canabinoides em comparação com uma planta não geneticamente modificada ou parte da mesma, o método compreendendo as etapas de: introduzir um polinucleotídeo de combinação em uma planta ou parte da mesma para fornecer uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma.

[00123] Modalidades adicionais da invenção podem incluir a seleção de uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma que expressa uma ou mais das proteínas, em que a (s) proteína (s) expressa (s) pode (m) : 1) aumentar a capacidade de produção de canabinoides, por exemplo, através da superexpressão de um gene myb endógeno; e 2) catalase com/ou sem capacidade de localização

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40/114 de tricoma, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um polinucleotídeo de combinação que codifica as proteínas é introduzido através da transformação da referida planta com um vetor de expressão compreendendo o referido polinucleotídeo de combinação operacionalmente ligado a um promotor. A proteína do fator de transcrição de produção de canabinoide pode compreender uma SEQ ID selecionada a partir das sequências aqui identificadas ou homólogos das mesmas. Naturalmente, essas combinações e estratégias de combinação de expressão, identificadas nas Tabelas 7-8, 10 abaixo e em outros lugares, são exemplares, uma vez que várias combinações dos elementos como aqui descrito estão incluídas na invenção.

[00124] Em uma modalidade preferencial, a tecnologia da invenção pode incluir sistemas, métodos e composições de altos níveis de hidroxilação canabinoide in vivo, acetilação e/ou glicosilação e/ou uma combinação dos três. Em uma modalidade preferencial, a hidroxilação de canabinoides in vivo,, acetilação e/ou glicosilação e/ou uma combinação de todos os três podem ocorrer em um sistema de planta ou cultura de células produtoras de canabinoides. Enquanto em modalidades alternativas pode incluir uma planta não produtora de canabinoides ou um sistema de cultura de células, como uma planta de tabaco, como N. benthamiana.

[00125] Em uma modalidade, a invenção pode incluir um sistema de produção, acumulação e modificação de canabinoides. Em uma modalidade preferencial, uma planta, tal como cannabis ou tabaco, pode ser geneticamente modificada para expressar um ou mais genes heterólogos do citocromo P450. Nesta modalidade preferencial, um citocromo humano heterólogo P450 (CYP3A4) SEQ ID NO. 1 pode ser expresso em uma planta produtora de canabinoide ou sistema de cultura de células. Enquanto em modalidades alternativas um citocromo humano heterólogo P450 (CYP3A4) pode ser expresso por planta não produtora de canabinoides ou sistema de cultura de células, como uma planta de tabaco, como N. benthamiana. Nesta modalidade, a superexpressão de uma proteína

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41/114 heteróloga do citocromo P450 humano, identificada como SEQ ID NO. 2, podem funcionalizar canabinoides criados endogenamente para que possam ser mais eficientemente glicosilados e/ou acetilados in vivo, tornando-os solúveis em água. [00126] Em uma modalidade alternativa, a invenção pode incluir um sistema de produção, acumulação e modificação de canabinoides. Em uma modalidade preferencial, uma planta, tal como cannabis ou tabaco, pode ser geneticamente modificada para expressar um ou mais genes heterólogos da oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo. Nesta modalidade preferencial, uma oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo (oxred) identificada como SEQ ID NO. 3 pode ser expressa em uma planta produtora de canabinoide ou sistema de cultura de células. Enquanto em modalidades alternativas uma oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo (oxred) pode ser expressa por planta não produtora de canabinoides ou sistema de cultura de células, como uma planta de tabaco, como N. benthamiana. Nesta modalidade, a superexpressão de uma proteína oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo (oxred) identificada como SEQ ID NO. 4, podem funcionalizar canabinoides criados endogenamente para que possam ser mais eficientemente glicosilados e/ou acetilados in vivo, tornando-os solúveis em água.

[00127] Em uma modalidade, a invenção pode incluir um sistema de produção, acumulação e modificação de canabinoides em uma planta não produtora de canabinoides. Em uma modalidade preferencial, uma planta, tal como tabaco, pode ser geneticamente modificada para expressar um ou mais genes heterólogos da oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo. Nesta modalidade preferencial, uma oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo (oxred) identificada como SEQ ID NO. 3 pode ser expresso em uma planta produtora de canabinoide ou sistema de cultura de células. Em modalidades alternativas, enquanto em modalidades alternativas uma oxidorredutase do citocromo P450 heterólogo (oxred) pode ser expressa por planta não produtora de canabinoides ou sistema de cultura de células, como uma planta de tabaco, como N. benthamiana. Nesta modalidade, a superexpressão de uma proteína oxidorredutase do citocromo P450

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42/114 heterólogo (oxred) identificada como SEQ ID NO. 4, pode ajudar a funcionalizar canabinoides introduzidos no sistema de cultura de células vegetais ou vegetais geneticamente modificados, para que possam ser mais eficientemente glicosilados e/ou acetilados, in vivo, tornando-os solúveis em água.

[00128] Em uma modalidade preferencial, citocromo 450 e P450 oxidorredutase são co-expressos.

[00129] Em outra modalidade, a invenção pode incluir a expressão de um ou mais genes exógenos ou heterólogos, os termos sendo geralmente permutáveis, gene da canabinoide sintase em um sistema de cultura de células ou plantas não produtoras de canabinoides. Em uma modalidade preferencial, esse gene pode incluir um ou mais dos genes CBG, THCA, CBDA ou CBCA sintase. Por exemplo, em uma modalidade, uma ácido canabidiolico (CBDA) sintase, identificado como SEQ ID NO. 5 (gene) ou SEQ ID NO. 6 (proteína) de Cannabis sativa podem utilizar expressos em uma planta não produtora de canabinoides, tais como cultura em suspensão ou célula de planta de N. benthamiana. Em outra modalidade preferencial, uma ácido tetra-hidrocanabinólico (THCA) sintase, identificado como SEQ ID NO. 42 (gene) de Cannabis sativa podem utilizar expressos em uma planta não produtora de canabinoides, tais como cultura em suspensão ou célula de planta de N. benthamiana.

[00130] Em outra modalidade preferencial, esses genes de canabinoides sintase expressos em uma cultura de plantas canabinoides e/ou não canabinoides ou suspensão de células vegetais podem ser alvo ou localizados em certas partes de uma célula. Por exemplo, em uma modalidade preferencial, a produção de canabinoides pode ser localizada no citosol, permitindo que os canabinoides se acumulem no citoplasma. Em uma modalidade exemplar, uma proteína sintase de canabinoides sintase modificada artificialmente pode ser gerada. Nesta modalidade exemplar, uma CBDA sintase pode ter a sequência de alvo de tricoma removida, formando uma CBDA sintase citossólica (cytCBDAs) identificada como SEQ ID NO. 22, (gene) ou 23 (proteína). Modalidades alternativas incluiríam a geração de outros

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43/114 genes sintase alvo do citosol artificial, como a THCA sintase citossólica (cyTHTHs) identificada como SEQ ID NO. 46 (gene).

[00131] Estas modalidades preferenciais podem ser particularmente adequadas para sistemas de expressão de canabinoides de cultura de suspensão de células canabinoides, uma vez que esses sistemas de cultura carecem dos tricomas presentes em plantas inteiras. Como tal, em uma modalidade preferencial, uma planta produtora de canabinoide pode ser transformada em um ou mais genes sintase de canabinoides alvos citossólicos artificiais sem um sinal de alvo de tricoma. Em uma modalidade alternativa, esses genes sintase de canabinoides alvo citossólicos artificiais podem ser expressos em uma cultura de suspensão de plantas produtoras de canabinoides em que o correspondente gene da sintase endógena do tipo selvagem foi inibido e/ou eliminado.

[00132] Em uma modalidade, a invenção pode incluir um sistema de produção, acumulação e modificação de canabinoides que pode gerar canabinoides solúveis em água. Em uma modalidade preferencial, uma planta, tal como cannabis ou tabaco, pode ser geneticamente modificada para expressar um ou mais genes da glicosiltransferase heterólogos, como a UDP glicosiltransferase. Nesta modalidade preferencial, a UDP glicosiltransferase (76G1) (SEQ ID NO. 7) (gene)/SEQ ID NO. 8 (proteína) de Stevia rebaudiana podem ser expressa em plantas produtoras de canabinoides ou em suspensão de células. Em uma modalidade preferencial, a cultura de plantas ou suspensão de células produtoras de canabinoides pode ser Cannabis. Em outra modalidade, uma ou mais glicosiltransferase de Nicotiana tabacum e/ou uma glicosiltransferase homóloga de Nicotiana benthamiana, podem ser expressas em uma planta produtora de canabinoides, como a cannabis, ou podem ser superexpressas em uma planta e/ou célula de planta endógena sistema de cultura. Em uma modalidade preferencial, um gene e/ou proteína de glicosiltransferase pode ser selecionado a partir da planta exemplar, como Nicotiana tabacum. Esse gene e/ou proteína de glicosiltransferase pode incluir, mas não está limitado a: Glicosiltransferase

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44/114 (NtGT5a) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 26) (aminoácido); Glicosiltransferase (NtGT5a) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 27) (DNA); Glicosiltransferase (NtGT5b) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 28) (aminoácido); Glicosiltransferase (NtGT5b) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 29) (DNA); UDP-glicosiltransferase 73C3 (NtGT4) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 30) (aminoácido); UDPglicosiltransferase 73C3 (NtGT4) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 31) (DNA); Glicosiltransferase (NtGTIb) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 32) (aminoácido); Glicosiltransferase (NtGTIb) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 33) (DNA); Glicosiltransferase (NtGTIa) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 34) (aminoácido); Glicosiltransferase (NtGTIa) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 35) (DNA); Glicosiltransferase (NtGT3) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 36) (aminoácido); Glicosiltransferase (NtGT3) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 37) (DNA); Glicosiltransferase (NtGT2) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 38) (aminoácido); e/ou glicosiltransferase (NtGT2) Nicotiana tabacum (SEQ ID NO. 39) (DNA). As sequências de Nicotiana tabacum são exemplificativas apenas porque outras glicosiltransferase de tabaco podem ser usadas.

[00133] Como observado acima, essas glicosiltransferases podem glicosilar os canabinoides e/ou canabinoides funcionalizados em uma cultura de suspensão de células vegetais ou vegetais, como geralmente descrito aqui. Naturalmente, outros genes de glicosiltransferase de fontes alternativas podem ser incluídos na presente invenção.

[00134] Como observado acima, em uma modalidade, uma ou mais glicosiltransferases podem ser alvo ou localizados em uma porção da célula de planta. Por exemplo, nesta modalidade preferencial, a glicosilação de canabinoide pode ser localizada para o tricomas permitindo canabinoides a acumular-se superior que em seguida, os níveis de tipo selvagem em que a estrutura. Em uma modalidade exemplar, uma glicosiltransferase modificada artificialmente pode ser gerada. Nesta modalidade de exemplo, uma UDP glicosiltransferase (76G1) pode ser fundida com uma sequência de alvo de tricoma na sua cauda N-terminal. Esta

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45/114 sequência de alvo de tricoma pode ser reconhecida pela célula e faz com que seja transportada para a tricomas. Este construto genético artificial é identificado como SEQ ID NO. 19 (gene), ou SEQ ID NO. 20 (proteína). Em uma modalidade, uma sequência ou domínio de alvo de tricoma pode ser derivado de qualquer número de sintases. Por exemplo, em uma modalidade, um domínio THCA Sintase Tricoma (SEQ ID NO. 40) pode ser acoplado com uma glicosiltransferase como geralmente descrito acima. Além disso, em outro exemplo, um domínio de alvo do CBDA Sintase Tricoma (SEQ ID NO. 41) pode ser acoplado com uma glicosiltransferase como geralmente descrito acima.

[00135] Em outra modalidade, a invenção pode incluir uma modalidade em que os canabinoides transientemente modificados podem ser passivamente e/ou ativamente excretados de uma célula ou para uma parede de células. Em um modelo exemplar, um transportador de cassete de ligação a ATP exógeno (transportadores ABC ou ABCt) ou outra estrutura molecular similar pode reconhecer o ácido glicosil ou glucurônico ou grupo funcional acetil (conjugado) no canabinoide modificado transitoriamente e transportá-lo ativamente através da parede de células /membrana e no meio circundante.

[00136] Em uma modalidade, uma planta pode ser transformada para expressar um ABC transportador heterólogo. Nesta modalidade, um ABCt pode facilitar o transporte de canabinoides para fora das células em culturas em suspensão, como uma cultura de suspensão de células de cannabis ou tabaco. Nesta modalidade preferencial, uma humana multi-fármaco transportada (ABCG2) pode ser expressa numa cultura em suspensão de células de plantas da mesma, respectivamente. ABCG2 é uma proteína alvo de membrana plasmática e pode ainda ser identificada como SEQ ID NO. 9 (gene) ou 10 (proteína).

[00137] Geralmente, uma estrutura de tricoma, como em Cannabis ou tabaco, terá muito pouco ou nenhum substrato para uma enzima glicosiltransferase usar para efetivar a glicosilação. Para resolver este problema, em uma modalidade, a invenção pode incluir sistemas, métodos e composições para aumentar

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46/114 substratos para glicosiltransferase, ou seja, açúcares selecionados em um tricoma. Em uma modalidade preferencial, a invenção pode incluir a localização ou alvo do transporte de açúcar para o tricoma. Nesta modalidade preferencial, uma UDPglucose/UDP-galactose exógena ou endógena, transportador (UTR1) pode ser expresso numa unidade de produção de tricomas, tais como canabis ou de tabaco e similares. Nesta modalidade, o transportador UDP-glicose/UDP-galactose (UTR1) pode ser modificado para incluir uma sequência e/ou domínio de alvo da membrana plasmática.

[00138] Com este domínio de alvo, o transportador UDP-glicose/UDPgalactose (UTR1) pode permitir que a proteína de fusão artificial seja ancorada à membrana plasmática. Nesta configuração, os substratos de açúcar do citosol podem passar através do transportador UDP-glicose/UDP-galactose (PM-UTR1) ligado à membrana plasmática para o tricoma. Nesta modalidade, os substratos para a glicosiltransferase podem ser localizados no tricoma e deixar acumular ainda mais, permitindo uma glicosilação aprimorada de canabinoides no tricoma. Em um exemplo, SEQ ID NO. 21 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para um transportador de UDP-glicose/galactose (UTR1) heterólogo de Arabidopsis thaliana possuindo uma sequência de alvo da membrana plasmática substituindo uma sequência de alvo de tonoplastos. A sequência de alvo da membrana plasmática desta proteína de fusão exemplar pode incluir a seguinte sequência (ver SEQ ID NO 21)

TGCTCCATAATGAACTTAATGTGTGGGTCTACCTGCGCCGCT, ou uma sequência com 70-99% de homologia com a sequência.

[00139] Deve-se notar que várias combinações e permutações dos genes/proteínas aqui descritos podem ser co-expressas e, assim, atingir um ou mais dos objetivos da presente invenção. Tais combinações são exemplos de modalidades preferenciais somente, e não limitantes em qualquer modo.

[00140] Em uma modalidade, um gene, tal como uma canabinoide sintase, ou um fragmento de gene correspondente a, por exemplo, um domínio de sinal

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47/114 pode ser inibido, regulado negativamente, interrompido ou pode até ser nocauteado. Um versado na técnica reconhecerá os vários processos que podem realizar sem experimentação indevida. Em outra modalidade, um nocaute pode significar superexpressão de um gene endógeno ou exógeno modificado em comparação com a versão em peso.

[00141] Por exemplo, em uma modalidade, altos níveis de glicosilação de canabinoide podem ser gerados coexpressando a oxidorredutase do CYP3A4 e CYP (citocromo P450 com oxidorredutase P450) e pelo menos uma glicosiltransferase endógena em N. benthamiana. Em outra modalidade, um ou mais dos genes endógenos ou exógenos podem ser expressos em vegetais ou cultura de células vegetais com a coexpressão de myb e/ou uma catalase. Nesta configuração, existe um efeito aditivo de superexpressar um fator de transcrição Myb e uma catalase, um ou mais dos quais podem ser alvos ou localizados, na síntese de canabinoides solúveis em água (glicosilados e hidroxilados) em Cannabis sativa.

[00142] Em certas modalidades, os endocanabinoides podem ser funcionalizados e/ou acetilados e/ou glicosilados, como geralmente descrito aqui.

[00143] Todas as sequências aqui descritas incluem sequências com entre 70-99% de homologia com a sequência identificada [00144] Os compostos canabinoides modificados da presente invenção são úteis para uma variedade de aplicações terapêuticas. Por exemplo, os compostos são úteis para o tratamento ou alívio de sintomas de doenças e distúrbios envolvendo receptores CB1 e CB2, incluindo perda de apetite, náusea e vômito, dor, esclerose múltipla e epilepsia. Por exemplo, eles podem ser usados para tratar a dor (isto é, como analgésicos) em uma variedade de aplicações, incluindo, entre outros, o tratamento da dor. Em modalidades adicionais, esses compostos canabinoides modificados podem ser usados como um inibidor de apetite. Modalidade adicional pode incluir a administração de compostos canabinoides modificados.

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48/114 [00145] Por “tratar” os inventores da presente invenção dizem que o composto é administrado, a fim de aliviar os sintomas da doença ou distúrbio a ser tratado. Os especialistas na técnica reconhecerão que os sintomas da doença ou distúrbio que é tratado podem ser completamente eliminados ou podem simplesmente ser diminuídos. Além disso, os compostos podem ser administrados em combinação com outros medicamentos ou modalidades de tratamento, como quimioterapia ou outros medicamentos contra o câncer.

[00146] A implementação pode geralmente envolver a identificação de pacientes que sofrem dos distúrbios indicados e a administração dos compostos da presente invenção de uma forma aceitável por uma via apropriada. A dosagem exata a ser administrada pode variar dependendo da idade, sexo, peso e estado geral de saúde de cada paciente, bem como a etiologia precisa da doença. No entanto, em geral, para administração em mamíferos (por exemplo, humanos), dosagens na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 30 g de composto por kg de peso corporal por 24 η. E mais preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 10 mg de composto por kg de peso corporal por 24 horas são eficazes.

[00147] A administração pode ser oral ou parenteral, incluindo intravenosa, intramuscular, subcutânea, injeção intradérmica, injeção intraperitoneal, etc., ou por outras vias (por exemplo, liberação transdérmica, sublingual, oral, retal e bucal, inalação de um aerossol, etc.). Em uma modalidade preferencial da invenção, os análogos de canabinoides solúveis em água são fornecidos por via oral ou intravenosa.

[00148] Em particular, os ésteres fenólicos da presente invenção (Fórmula

1) são preferencialmente administrados por via sistêmica, a fim de fornecer uma oportunidade para ativação metabólica por divagem in vivo do éster. Além disso, os compostos solúveis em água com porções azol na cadeia lateral pentila (Fórmula 2, por exemplo, com porções imidazol) não requerem ativação in vivo e podem ser adequados para administração direta (por exemplo, injeção específica no local).

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49/114 [00149] Os compostos podem ser administrados na forma pura ou numa formulação farmaceuticamente aceitável incluindo elixires adequados, ligantes, e similares (geralmente referido um “veículos”) ou como sais farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, sais de metais alcalinos, tais como sódio, potássio, cálcio sais de lítio, amônio etc.) ou outros complexos. Deve ser entendido que as formulações farmaceuticamente aceitáveis incluem materiais líquidos e sólidos convencionalmente utilizados para preparar formas de dosagem injetáveis e formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas e formas de dosagem em aerossol. Além disso, os compostos podem ser formulados com veículos aquosos ou à base de óleo. A água pode ser utilizada como veículo para a preparação de composições (por exemplo, composições injetáveis), que também podem incluir tampões e agentes convencionais para tornar a composição isotônica. Outros aditivos em potencial e outros materiais (preferencialmente aqueles que são geralmente considerados seguros [GRAS]) incluem: corantes; aromas; agentes tensoativos (TWEEN, ácido oleico, etc.); solventes, estabilizadores, elixires e ligantes ou encapsulantes (lactose, lipossomas, etc.). Os diluentes sólidos e excipientes incluem lactose, amido, agentes desintegrantes convencionais, revestimentos e similares. Conservantes como metil parabeno ou cloreto de benzalcônio também podem ser usados. Dependendo da formulação, espera-se que a composição ativa irá consistir em cerca de 1 % a cerca de 99% da composição e o “veículo” veicular irá constituir cerca de 1% a cerca de 99% da composição. As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir quaisquer aditivos ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis adequados, na medida em que eles não prejudiquem ou interfiram no efeito terapêutico do composto ativo.

[00150] A administração dos compostos da presente invenção pode ser intermitente, dose em bolus ou a uma taxa gradual ou contínua, constante ou controlada para um paciente. Além disso, a hora do dia e o número de vezes por dia em que a formulação farmacêutica é administrada podem variar e são melhor determinados por um profissional especializado, como um médico. Além disso, a

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50/114 dose eficaz pode variar dependendo de fatores como o modo de entrega, sexo, idade e outras condições do paciente, bem como a extensão ou progressão da doença. Os compostos podem ser fornecidos sozinhos, em uma mistura contendo dois ou mais dos compostos, ou em combinação com outros medicamentos ou modalidades de tratamento. Os compostos também podem ser adicionados ao sangue ex vivo e depois fornecidos ao paciente.

[00151 ] Os genes que codificam por um polinucleotídeo de combinação e/ou um homólogo do mesmo podem ser introduzidos em uma planta e/ou célula de planta usando vários tipos de abordagens de transformação desenvolvidas para a geração de plantas transgênicas. Técnicas de transformação padrão, tais como transformação mediada por Agro bacterium, plasmídeo Ti, bombardeio de partículas, microinjeção e eletroporação podem ser utilizadas para construir plantas transgênicas transformadas de maneira estável.

[00152] Como usado aqui, um - “canabinoide” é um composto químico (como canabinol, THC ou canabidiol) que é encontrado nas espécies vegetais Cannabis, entre outras como Echinacea; Acmella Oleracea; Helichrysum Umbraculigerum; Radula Marginata (Liverwort) e Theobroma Cacao, e metabolitos e análogos sintéticos dos mesmos que podem ou não ter propriedades psicoativas. Portanto, os canabinoides incluem (sem limitação) compostos (como THC) que possuem alta afinidade pelo receptor canabinoide (por exemplo, Ki<250 nM) e compostos que não possuem afinidade significativa pelo receptor canabinoide (como o canabidiol, CBD). Os canabinoides também incluem compostos que possuem uma estrutura característica de anel de dibenzopirano (do tipo visto no THC) e canabinoides que não possuem um anel de pirano (como o canabidiol). Portanto, uma lista parcial de canabinoides inclui THC, CBD, dimetil heptilpentil canabidiol (DMHP-CBD), 6,12di-hidro-6-hidroxi-canabidiol (descrito na Patente US 5.227.537, incorporada por referência); Homólogos e derivados de (3S, 4R)-7-hidroxi-A6-tetra-hidrocanabinol descritos na Patente US 4.876.276, incorporada por referência; (+)-4-[4-DMH-2,6diacetoxi-fenil]-2-carboxi-6,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-2-eno e outros derivados de

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4-fenilpineno divulgados na Patente US 5.434.295, que é incorporada por referência; e análogos de canabidiol (-)(CBD) tais como éter monometílico (-)CBD, éter dimetílico (-)CBD; diacetato de (-)CBD; (-)3’-acetil-CBD monoacetato; e ± AF1 1, todos divulgados em Consroe et al., J. Clin. Phannacol. 2 1 : 428S-436S, 1981, que também é incorporada por referência. Muitos outros canabinoides são igualmente divulgados em Agurell et al., Pharmacol. Rev. 38: 31-43, 1986, que também é incorporado por referência.

[00153] Como reivindicado aqui, o termo “canabinoide” também pode incluir diferentes formas modificadas de um canabinoide, como um canabinoide hidroxilado ou ácido carboxílico canabinoide. Por exemplo, se uma glicosiltransferase foram capazes de glicosilar um canabinoides, que incluiría o canabinoide termo como definido em outro local, bem como as formas modificadas acima mencionados. Pode ainda incluir várias porções de glicosilação.

[00154] Exemplos de canabinoides são tetra-hidrocanabinol, canabidiol, canabigerol, cannabicromeno, cannabiciclol, cannabivarina, cannabielsoin, canabicitrano, ácido canabigerólico, monometiléter de ácido canabigerólico, monometiléter de canabigerol, ácido canabigerovarínico, canabigerovarina, ácido canabicromênico, ácido canabicromovarínico, canabicromovarina, ácido canabidólico, monometiléter canabidiol, canabidio-C4, ácido canabidivarínico, canabidiorcol, ácido delta-9-tetra-hidrocanabinólico A, ácido delta-9-tetrahidrocanabinólico B, ácido delta-9-tetra-hidrocanabinólico-C4, ácido delta-9-tetrahidrocanabivarínico, delta-9-tetra-hidrocannabivarina, ácido delta-9-tetrahidrocanabiorcolico, delta-9-tetra-hidrocanabiorcol,delta-7-cis-iso-tetrahidrocanabiol, ácido delta-8-tetra-hidrotetra-hidrocanabiliólico, delta-8-tetrahidrocanabino, ácido canabiciclólico, canabicilovarina, ácido canabielsoico A, ácido canabielsoico B, ácido canabinólico, canabinol metiléter, canabinol-C4, canabinolC2, canabiorcol, 10-etoxi-9-hidroxi-delta-6a-tetra-hidrocanabinol, 8,9-di-hidroxidelta-6a-tetra-hidrocanabinol, cannabitriolvarina, etóxi-cannabitriolvarina, dehidrocanabifurano, canabifurano, canabicromanona, canabicitrana, 10-oxo-delta

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6a-tetra-hidrocanabinol, delta-9-cis-tetra-hidrocanabinol, 3, 4, 5, 6-tetra-hidro-7hidroxi-alfa-alfa-2-trimetil-9-n-propil-2, 6-metano-2H-l-benzoxocina-5-metanolcanabiripsol, tri-hidroxi-delta-9-tetra-hidrocanabinol e canabinol. Exemplos de canabinoides no contexto desta divulgação incluem tetra-hidrocanabinol e canabidiol.

[00155] O termo “endocanabinoide” se refere a compostos, incluindo etanolamida araquidonoil (anandamida, AEA), 2-araquidonoil etanolamida (2-AG), 1-araquidonoil etanolamida (1-AG), e docosa-hexaenoil etanolamida (DHEA, sinaptamida), oleoil etanolamida (OEA), eicsapentaenoil etanolamida, prostaglandina etanolamida, docosa-hexaenoil etanolamida, linolenoil etanolamida, ácido 5(Z),8(Z),1 1 (Z)- eicosatrienóico etanolamida (ácido mead etanolamida), heptadecanoul etanolamida, estearoil etanoilamida, docosaenoil etanolamida, nervonoil etanolamida, tricosanoil etanolamida, lignoceroil etanolamida, miristoil etanolamida, pentadecanoil etanolamida, palmitoleil etanolamida, ácido docosahexaenoico (DHA). Endocanabinoides particularmente preferenciais são AEA, 2AG, 1 -AG e DHEA.

[00156] A hidroxilação é um processo químico que introduz um grupo hidroxila (-OH) em um composto orgânico. A acetilação é uma reação química que adiciona um grupo químico acetila. Glicosilação é o acoplamento de um doador de glicosil a um aceitador de glicosil formando um glicosídeo.

[00157] O termo “pró-fármaco” se refere a um precursor de um agente farmacêutico biologicamente ativo (fármaco). Os pró-fármacos devem passar por uma conversão química ou metabólica para se tornar um agente farmacêutico biologicamente ativo. Um pró-fármaco pode ser convertido ex vivo no agente farmacêutico biologicamente ativo por processos transformadores químicos. In vivo, um pró - fármaco é convertido no agente farmacêutico biologicamente ativo pela ação de um processo metabólico, um processo enzimático ou um processo degradativo que remove a fração de pró-fármaco para formar o agente farmacêutico biologicamente ativo.

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53/114 [00158] Como aqui utilizado, o termo “homólogo” em relação a uma sequência de ácido nucleico contígua, refere-se a sequências de nucleotídeos contíguas que hibridam sob condições apropriadas com a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, sequências homólogas podem ter cerca de 70% a 100, ou mais geralmente 80% a 100% de identidade de sequência, como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91 %; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada à hibridação específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não-, específica do ácido nucleico para sequências não-alvo em condições em que é desejada a ligação específica, por exemplo, sob condições de hibridação rigorosas.

[00159] O termo ‘Operacionalmente ligado”, quando usado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligada. “Sequências reguladoras” ou “elementos de controle” se referem a sequências de nucleotídeos que influenciam o tempo e o nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências de líderes de tradução; introns; melhoradores; estruturas de haste-loop; sequências de ligação ao repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operacionalmente ligada a ela. Além disso, sequências reguladoras particulares ligadas operacionalmente a uma sequência codificadora podem estar localizadas na fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.

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54/114 [00160] Como aqui utilizado, o termo “promotor” se refere a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação da polimerase RNA e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula. Um “promotor de planta” pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que iniciam preferencialmente a transcrição em certos tecidos, como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como “tecido preferencial”. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como “específicos de tecido”.

[00161] Um promotor “específico do tipo de célula” direciona principalmente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou folhas. Um promotor “induzível” pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos para tecidos, preferenciais para tecidos, específicos para tipos de células e indutíveis constituem a classe de promotores “não constitutivos”. Um promotor “constitutivo” é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de células ou tecidos.

[00162] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Veja Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; Gene In2 do

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55/114 milho que responde aos agentes de proteção dos herbicidas bcnzenossulfonamida; Repressor Tet de TIO; e o promotor induzível a partir de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glicocorticosteroide são exemplos gerais (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).

[00163] Como aqui utilizado, o termo “transformação” ou “geneticamente modificado” se refere à transferência de uma ou mais molécula (s) de ácido nucleico para uma célula. Uma planta é “transformada” ou “geneticamente modificada” por uma molécula de ácido nucleico transduzido para a planta quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicado pela planta. Como aqui utilizado, o termo “transformação” ou “geneticamente modificado” abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida, como uma planta. [00164] O termo “vetor” se refere a alguns meios pelos quais DNA, RNA, uma proteína ou polipeptídeo podem ser introduzidos em um hospedeiro. Os polinucleotídeos, proteína e polipeptídeo que são para ser introduzidos num hospedeiro pode ser terapêutico ou profilático na natureza; pode codificar ou ser um antígeno; pode ser de natureza reguladora, etc. Existem vários tipos de vectores, incluindo vírus, plasmídeo, bacteriófagos, cosmídeos, e bactérias.

[00165] Como é conhecido na técnica, diferentes organismos utilizam preferencialmente diferentes códons para gerar polipeptídeos. Tais preferências de “uso de códons” podem ser utilizados na concepção de moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas e as quimeras da presente invenção, a fim de otimizar a expressão num sistema de célula hospedeira particular.

[00166] Um “vetor de expressão” é um ácido nucleico capaz de se replicar em uma célula ou organismo hospedeiro selecionado. Um vetor de expressão pode replicar como uma estrutura autônoma ou, alternativamente, pode integrar, no todo ou em parte, nos cromossomos da célula hospedeira ou os ácidos nucleicos de uma organela, ou é usado como um serviço de transporte para a entrega de DNA estranho para células, e assim replicar junto com o genoma da célula hospedeira.

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Assim, um vetor de expressão são polinucleotídeos capazes de replicar em uma célula hospedeira, organela ou organismo selecionado, por exemplo, um plasmídeo, vírus, cromossomo artificial, fragmento de ácido nucleico e para os quais certos genes no vetor de expressão (incluindo genes de interesse) são transcritos e traduzidos em um polipeptídeo ou proteína dentro da célula, organela ou organismo; ou qualquer construto adequado conhecida na técnica, que compreende uma “cassete de expressão”. Em contraste, como descrito nos exemplos deste documento, um “cassete” é um polinucleotídeo contendo uma seção de um vetor de expressão desta invenção. A utilização dos cassetes auxilia na montagem dos vetores de expressão. Um vetor de expressão é um replicon, como plasmídeo, fago, vírus, vírus quimérico ou cosmídeo, e que contém a sequência de polinucleotídeos desejada operacionalmente ligada à (s) sequência (s) de controle de expressão.

[00167] Uma sequência de polinucleotídeos está operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão (por exemplo, um promotor e, opcionalmente, um intensificador) quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e/ou tradução dessa sequência de polinucleotídeo. [00168] A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degenerados), a sequência complementar (ou complemento) e a sequência complemento reversa, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códons degenerados podem ser alcançadas através da geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais selecionados (ou todos) códons é substituído com base mista e/ou resíduos desoxi-inosina (ver, por exemplo, Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:26052608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Devido à degenerescência dos códons de ácido nucleico, pode-se usar vários polinucleotídeos diferentes para codificar polipeptídeos idênticos. A tabela 1,

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57/114 abaixo, contém informações sobre quais códons de ácido nucleico codificam quais aminoácidos.

TABELA 4 Códons de ácido nucleico de Aminoácido

Aminoácido	Códons de ácido nucleico
Ala/A	GCT, GCC, GCA, GCG
Arg/R	CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Asn/N	AAT, AAC
Asp/D	GAt, GAC
Cys/	TGT, TGC
Gln/Q	CAA, CAG
Glu/E	GAA, GAG
Gly/G	GGT, GGC, GGA, GGG
His/H	CAT, CAC
lle/l	ATT, ATC, ATA
Leu/L	TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG
Lys/K	AAA, AAG
Met/M	ATG
Phe/F	TTT, TTC
Pro/P	CCT, CCC, CCA, CCG
Ser/S	TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
Thr/T	ACT, ACC, ACA, ACG
Trp/W	TGG
Tyr/Y	TAT, TAC
Val/V	GTT, GTC, GTA, GTG

00169] O termo “planta” ou “sistema de planta” inclui plantas inteiras, órgãos vegetais, progênie de plantas inteiras ou órgãos vegetais, embriões, embriões somáticos, estruturas similares a embriões, protocormos, corpos similares a protocormos (PLBs) e cultura e/ou suspensões de células vegetais. Os órgãos

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58/114 vegetais compreendem, por exemplo, órgãos/estruturas vegetativas da brotação (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma, e semente de revestimento) e frutas (maduro do ovário), o tecido da planta (por exemplo, tecido vascular, tecido solo, e outros semelhantes) e células (por exemplo, células guarda, células ovo, tricomas e semelhantes). A invenção também pode incluir Cannabaceae e outras cepas de Cannabis, como C. sativa em geral.

[00170] O termo “expressão”, como usado aqui, ou “expressão de uma sequência de codificação” (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual as informações codificadas de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico) ou cDNA) é convertido em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, geralmente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte do caminho, do DNA ao RNA e à proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, através de controles que atuam na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, como mRNA, ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas depois que elas são feitas, ou por combinações dos mesmos. A expressão gênica pode ser medida ao nível do RNA ou o nível de proteína por qualquer método conhecido na arte, incluindo, sem limitação, transferência de Northern, RT-PCR, Western blot, ou in vitro, in situ, ou no ensaio de atividade da proteína in vivo (s) [00171] O termo “ácido nucleico” ou “moléculas de ácido nucleico “ incluem formas de DNA de fita simples e dupla; formas de RNA de fita simples; e formas de fita dupla de RNA (dsRNA). O termo “sequência de nucleotídeos” ou “ sequência

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59/114 de ácido nucleico “ se refere às cadeias de sentido e anti-sentido de um ácido nucleico como cadeias individuais ou no duplex. O termo “ácido ribonucleico” (RNA) é incluído de RNAi (RNA inibidor), RNAdc (RNA de cadeia dupla), siRNA (pequeno RNA interferente), RNAm (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), RNAhp (RNA gancho de cabelo), tRNA (RNA de transferência), carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). O termo “ácido desoxirribonucleico” (DNA) é incluído de cDNA, DNA genômico, e híbridos de DNA-RNA. Os termos “segmento de ácido nucleico” e “de segmento sequência de nucleotídeos”, ou mais em geral, “segmento”, vai ser compreendido pelos peritos na especialidade como um termo funcional que inclui ambas as sequências genômicas, sequências de RNA ribossomal, sequências de RNA transferência, as sequências de RNA mensageiro, sequências de operon e sequências de nucleotídeos manipuladas menores que codificaram ou podem ser adaptadas para codificar, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[00172] O termo “gene” ou “sequência” se refere a uma região de codificação operacionalmente ligada a sequências reguladoras apropriadas capazes de regular a expressão do produto do gene (por exemplo, um polipeptídeo ou um RNA funcional) de alguma maneira. Um gene inclui regiões reguladoras não traduzidas do DNA (por exemplo, promotores, intensificadores, repressores, etc.) precedendo (a montante) e seguindo (a jusante) a região de codificação (quadro de leitura aberto, ORF), bem como, quando aplicável, sequências intermediárias (isto é, introns) entre regiões codificadoras individuais (ou seja, éxons). O termo “gene estrutural”, tal como aqui utilizado pretende significar uma sequência de ADN que é transcrita em mRNA, que é então traduzido para uma sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

[00173] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases

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60/114 nucleotídicas não naturais ou derivadas, tal como será prontamente apreciado pelos peritos na arte. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriéteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo “molécula de ácido nucleico” também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, fita dupla, parcialmente duplex, triplex, trincada, hair-pinned, circular e com cadeado. [00174] Como aqui utilizado em relação ao DNA, o termo “sequência codificante”, “sequência de nucleotídeos estrutural” ou “molécula de ácido nucleico estrutural” se refere a uma sequência nucleotídica que é finalmente traduzida em um polipeptídeo, via transcrição e mRNA, quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. No que diz respeito ao RNA, o termo “sequência de codificação” se refere a uma sequência de nucleotídeos que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de início da tradução no terminal 5’ e um códon de parada da tradução no terminal 3'. As sequências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeos recombinantes.

[00175] O termo “identidade de sequência” ou “identidade”, como aqui utilizado no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, referese aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para a correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.

[00176] O termo “recombinante” quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, organismo, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificada pela introdução de um ácido

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61/114 nucleico heterólogo ou proteína, ou a modificação de um ácido nucleico ou proteína nativo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes podem expressar genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante ou do tipo selvagem) da célula ou expressar genes nativos que de outra forma são anormalmente expressos superexpressos, subexpressos ou não expressos.

[00177] Os termos “aproximadamente” e “cerca de” se referem a uma quantidade, nível, valor ou quantidade que varia em até 30%, ou em outra modalidade em até 20% e em uma terceira modalidade em até 10% a uma quantidade, nível, valor ou quantidade de referência. Conforme usado aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o, a” incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[00178] Como usado aqui, “heterólogo” ou “exógeno” em referência a um ácido nucleico é um ácido nucleico que se origina de uma espécie estranha, ou é projetado sinteticamente, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa na composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Uma proteína heteróloga pode se originar de uma espécie estranha ou, se pertencer à mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada. Por “célula hospedeira” significa uma célula que contém um construto de ácido nucleico introduzido e suporta a replicação e/ou expressão do construto. As células hospedeiras podem ser células procarióticas como E. coli ou células eucarióticas, como células de fungos, leveduras, insetos, anfíbios, nematoides ou mamíferos. Alternativamente, as células hospedeiras são células vegetais monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de milho

EXEMPLOS

Exemplo 1: Funcionalização de canabinoides por citocromo P450s.

[00179] Os presentes inventores demonstraram que os canabinoides podem

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62/114 ser funcionalizados num sistema in vivo em planta. Especificamente, os presentes inventores utilizaram mono-oxigenases do citocromo P450 (CYP) para modificar ou funcionalizar a estrutura química dos canabinoides. Como mostrado abaixo, os CYPs fazem isso inserindo um átomo de oxigênio nas moléculas hidrofóbicas para torná-las mais reativas e hidrofílicas. Uma reação representativa pode incluir a reação generalizada na Fig. 13.

[00180] O sistema enzimático P450 envolve várias espécies de citocromo P450 e oxidoredutases inespecíficas do citocromo P450. Como mostrado na Fig. 5, os presentes inventores usaram um citocromo humano P450 (CYP3A4) em um construto dupla com uma exemplificativa oxidorredutase do citocromo P450 humano exemplar, ambos expressos sob o controle do promotor constitutivo de CaMV 35S com regiões não traduzidas em 5‘ para melhorar a tradução. As sequências de proteínas e DNA para a funcionalização de canabinoides (oxidorredutase do CYP3A4 e P450) são identificadas como SEQ ID NOs. 1 -4. A expressão foi confirmada usando RT-PCR utilizando os iniciadores direto e reverso identificados na Tabela 3 abaixo. Como observado acima, os presentes inventores demonstraram que a superexpressão de P450s gerou canabinoides funcionalizados que poderíam então ser glicosilados, tornando os mesmos solúveis em água.

Exemplo 2: A superexpressão do P450 melhora a hidroxilação e a glicosilação in vivo de canabinoides em sistemas vegetais.

[00181] Os presentes inventores demonstraram que a superexpressão aumentou a hidroxilação e glicosilação in vivo de CBDA em um sistema de planta exemplar. Especificamente, como geralmente mostrado na Fig. 6, os presentes inventores demonstram que a infiltração de folhas de tabaco com Agrobacterium transportando o CYP3A4 e P450 oxidorredutase foi realizada tal como descrito no presente documento. A confirmação da expressão foi realizada usando RT-PCR 23 dias após a infiltração (Fig. 6).

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63/114 [00182] Tal como geralmente mostrado na Fig. 7, os presentes inventores demonstraram que a superexpressão do construto oxidorredutase CYP3A4+P450 e subsequente alimentação de, pelo menos, um canabinoides, neste caso, CBDA, após a confirmação da expressão resultou na glicosilação in vivo de CBDA em folhas de tabaco (Fig. 7). Em média, a glicosilação aumentou 3 vezes em plantas transgênicas de N. benthamiana em comparação com o controle, enquanto a hidroxilação aumentada até 13 vezes. Como tal, em certa modalidade, as glicosiltransferases de tabaco podem ser utilizadas como alvos principais na atual tecnologia inventiva para glicosilação de canabinoides.

Exemplo 3: Identificação de canabinoides solúveis em água modificados por espectrometria de massa.

[00183] Os presentes inventores demonstraram a biossíntese de funcionalizado modificado, bem como canabinoides solúveis em água, tanto in vitro como in vivo, bem como sistema de planta. Especificamente, os presentes inventores identificaram as biotransformações de canabinoides associados com os construtos de genes em ambos os ensaios in vitro e a expressão transiente da folha. Através do uso de medições precisas de espectrometria de massa, os presentes inventores foram capazes de identificar e confirmar a biossíntese de canabinoides solúveis em água modificados.

[00184] Especificamente, como geralmente mostrado nas Figs. 1-4, os presentes inventores foram capazes de identificar os canabinoides solúveis em água glicosilados na análise cromatográfica e foram capazes de produzir cromatogramas de íons extraídos para integração de pico. Por exemplo, a Fig. 1, painel B, ilustra a identificação de múltiplos isômeros constitucionais de canabinoides de uma única fração glicosídica, enquanto na Fig. 2 painel B, um exemplo de múltiplos isômeros constitucionais da oxidação do citocromo P450 é ilustrado. As áreas de pico para cada molécula identificada foram usadas para quantificação relativa entre os tratamentos. Com base nesses resultados,

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64/114 confirmamos a biossíntese de moléculas canabinoides modificadas contendo até duas porções de glicosídeos, O acetil glicosídeo, bem como biotransformações de hidroxilação (R-OH).

[00185] As Tabelas 1 e 2 são fornecidas abaixo demonstrando ainda mais a produção das moléculas de canabinoides modificadas selecionadas. Geralmente com referência a Tabelas 1-2 abaixo, os presentes inventores demonstraram que, com base no tempo de retenção reduzido na água: o gradiente de HPLC de acetonitrila, os canabinoides glicosilados e hidroxilados, que eluíram mais cedo do que as suas formas não modificadas, são demonstradas a ser mais água solúvel do que as suas formas não modificadas.

Exemplo 4: Geração de síntese citossólica heteróloqa e construtos de genes de glicosilação para expressões em folhas de tabaco e suspensões de células.

[00186] Como mostrado na Fig. 8, os presentes inventores geraram um construto de gene tripla para expressão da ácido canabidiólico (CBDA) sintase na qual a sequência de alvo do tricoma havia sido removida e a glicosiltransferase 76G1 de Stevia rebaudiana. Nesse construto, o veículo ABC de múltiplos medicamentos ABCG2 também foi incluído.

[00187] Em uma modalidade da presente tecnologia inventiva, o construto genético pode ser usado para transformar uma célula de planta que pode ainda ser configurada para ser cultivada em uma cultura de suspensão. Em uma modalidade preferencial, uma célula de cannabis pode ser transformada com o construto geralmente delineado na Fig. 8. Nesta modalidade preferencial, os canabinoides produzidos pelas células de cannabis na cultura de células podem ser funcionalizados através da superexpressão da oxidorredutase do CYP3A4+P450, conforme descrito acima, e ainda glicosilados pela expressão e ação da glicosiltransferase UDP heteróloga (76G1) da Stevia rebaudiana referenciar acima. Além disso, como geralmente num esquema aqui, os canabinoides podem ser modificados de modo a ser funcionalizados e/ou glicosilados, ou em geral, solúveis

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65/114 em água, e pode então ser segregada para a área da parede da célula, no caso de uma planta inteira, ou torno meios em culturas em suspensão, com o auxílio do transportador ABC. Em uma modalidade, este construto pode ser usado para síntese e modificação de canabinoides em culturas de suspensão de células, utilizando células amarelas brilhantes de tabaco ou células de cannabis.

[00188] Tal como geralmente mostrado na Fig. 9, a expressão in vivo de CBDA sintase, UDP glicosiltransferase 76G1 e ABCG2 foi confirmada. Os iniciadores reverso e direto usados nas reações de RT-PCR são fornecidos abaixo na Tabela 4 abaixo.

[00189] As identificações de sequência de genes e proteínas para CBDA sintase são fornecidas como SEQ ID NO's 5 e 6, respectivamente. Deve-se notar que uma variedade de genes/proteínas de canabinoides sintase pode ser usada com a tecnologia inventiva atual, sendo a CBDA sintase apenas exemplar. De fato, é especificamente contemplado que a enzima sintase associada a qualquer um dos canabinoides aqui identificados pode ser incorporada na presente invenção sem experimentação indevida. Em uma modalidade, uma ou mais dessas enzimas sintase exógena ou endógena podem ainda ter a sequência de alvo do tricoma excisada, novamente, uma etapa que pode ser prontamente realizada sem experimentação indevida. Exemplo pode ser THCA-sintase, CBG sintase, THCAsintase, CBDA sintase ou CBCA sintase, que pode, nesta modalidade ter a sua sequência de alvo de tricomas tinha sido removido.

[00190] As identificações de sequência de genes e proteínas para a glicosiltransferase 76G1 de Stevia rebaudiana são fornecidas como SEQ ID NOs. 7 e 8, respectivamente. As identificações de sequência de gene e proteína para o transportador ABC multi-fármaco ABCG2 são fornecidas como SEQ ID NO's 9 e 10, respectivamente.

Exemplo 5: Síntese citossólica in vivo e qlicosilação de canabinoides em folhas de N. benthamiana e suspensões de células.

[00191] Como mostrado na Fig. 10, os inventores da presente invenção

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66/114 demonstram que, em plantas, nesta modalidade N. benthamiana, expressando o construto citossólico acima referenciado, a glicosilação de CBGA ocorreu, bem como formação de CBDA modificado ou hidroxilado. A glicosilação de CBGA evidencia glicosilação in vivo de canabinoides por superexpressão de uma glicosiltransferase em plantas de N. benthamiana. A presença de canabinoides glicosilados em plantas do tipo selvagem sugere a presença de uma forte glicosiltransferase no tabaco. Como tal, em uma modalidade, a superexpressão de uma glicosiltransferase de tabaco heteróloga ou homóloga pode ser expressa ou superexpressa, resultando na biossíntese in vivo aprimorada de canabinoides solúveis em água em plantas inteiras, bem como em culturas em suspensão. Por exemplo, em uma modalidade, uma glicosiltransferase de tabaco heteróloga pode ser expressa em uma cultura de plantas de cannabis ou célula resultando na biossíntese in vivo de canabinoides solúveis em água na planta Cannabis e/ou de culturas em suspensão de cannabis.

Exemplo 6: Sistemas de produção de canabinoides solúveis em água utilizando fator de transcrição MTB e/ou catalase.

[00192] Os presentes inventores desenvolveram uma pluralidade de sistemas para a biossíntese e modificação de canabinoides com base na localização de células usando novos métodos de alvo de proteínas. Como mostrado na Tabela 10, os presentes inventores projetaram esses novos sistemas e métodos para melhorar a produção e modificação (glicosilação, acetilação e funcionalização) de canabinoides, bem como para mitigar a toxicidade resultante da acumulação de canabinoides. Certas modalidades, incluíram a expressão de um fator de transcrição MYB e uma catalase (Fig. 27) para degradar o peróxido de hidrogênio resultante da atividade da CBDA sintase. Em uma modalidade preferencial, os presentes inventores usaram Arabidopsis thaliana ou um gene de E. coli catalase e um fator de transcrição previsto de Cannabis MYB envolvido na elevação de genes envolvidos na biossíntese de canabinoides. Sequências de DNA e proteína para o fator de transcrição MYB previsto pela Cannabis (SEQ ID NOs. 1-12,

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67/114 sequências de DNA e aminoácidos respectivamente), SEQ ID NOs 13-14 da catalidase de Arabidopsis thaliana., sequências de DNA e aminoácidos respectivamente) e/ou E. coli catalase (SEQ ID NO. 15-16, sequências de DNA e aminoácidos).

Exemplo 7: Síntese citossólica e glicosilação in vivo aprimoradas de canabinoides em folhas de tabaco e suspensões de células.

[00193] Os presentes inventores demonstraram o aumento na modificação in vivo de canabinoides em plantas transgênicas coinfectadas com construtos de glicosilação, funcionalização P450-mediada (hidroxilação) e desintoxicação de peróxido de hidrogênio por catalase. Ainda como mostrado na Fig. 1, de funcionalização e de glicosilação, observou-se principalmente do substrato CBGA em plantas transgênicas de tabaco que superexpressam a CBDA sintase, a UDP glicosiltransferase e o transportador ABC, mas aumentaram quando a superexpressão desse construto foi acoplada ao citocromo P450, fator de transcrição MYB e catalase. Como observado anteriormente, a superexpressão de um citocromo P450 aumentou a glicosilação de canabinoides. Como tal, o presente inventor demonstrou a formação e glicosilação de CBDA in vivo em folhas de tabaco transitoriamente transformadas alimentadas com o precursor CBGA.

[00194] Os presentes inventores também compararam as atividades de glicosiltransferase endógena e transgênica no tabaco. Especificamente, como mostrado na Fig. 12, o presente inventor realizou ensaios in vitro de glicosiltransferase UDP e CBDA sintase. Ensaios curtos de 3 horas a 30°C não revelaram diferença na glicosilação do CBGA entre as plantas selvagens e as transgênicas N. benthamiana, sugerindo glicosilação endógena. Em ensaios prolongados (14 horas), houve uma diferença significativa na detecção de CBGA glicosilado em plantas transgênicas em comparação com o tipo selvagem, demonstrando maior atividade de glicosilação em plantas transgênicas.

[00195] Em certa modalidade, glicosiltransferases de tabaco ou outras plantas podem ser usadas como aqui descrito. Em uma modalidade, uma ou mais

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68/114 glicosiltransferases heterólogas ou homólogas podem ser expressas ou superexpressas em uma planta, como tabaco ou Cannabis. Sequências de genes e proteínas para glicosiltransferases exemplares são identificadas abaixo na Tabela

9.

Exemplo 8: Geração de síntese de canabinoides alvo de tricomas e construtos de qlicosilação do ácido canabidiólico (CBDA).

[00196] Como mostrado nas Figs. 14-15, os presentes inventores demonstraram um sistema de síntese, síntese e glicosilação alvo de tricomas, de compostos canabinoides, como CBDA. Ao alvejar CBDA sintase, um transportador de UDP-glucose/UDP-galactose (PM-UTRI) orientada para o plasma, e uma 76G1 Stevia UDP-glicosiltransferase (tsUGT) para os tricomas, estes genes podem produzir e acumular-se, neste caso, CBDA e seus derivados glicosilados (glicosídeo primário e secundário), bem como novos derivados CBDA, nos tricomas.

[00197] SEQ ID NO. 17 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para uma CBDA sintase com uma sequência de alvo de tricoma. SEQ ID NO. 18 é identificada como a sequência de proteína correspondente para uma CBDA sintase com um domínio de alvo de tricoma.

[00198] SEQ ID NO. 19 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para uma sequência de codificação UDP-glicosiltransferase alvotricomas (76G1), neste exemplo ser optimizado para a expressão de Arabidopsis thaliana, embora outras versões de códons optimizados caem dentro do escopo da presente invenção. SEQ ID NO. 20 é identificada como a sequência de proteínas correspondente para uma UDP-glicosiltransferase (76G1) possuindo um domínio de alvo de tricoma.

[00199] SEQ ID NO. 21 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para um transportador de UDP-glicose/galactose (UTR1) possuindo uma sequência de alvo da membrana plasmática.

Exemplo 9: Síntese de alvo de tricoma e qlicosilação do ácido canabidiólico (CBDAPetição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 70/155

69/114 h

[00200] Como mostrado nas Figs. 16-17, a expressão de genes de CBDA sintase, tsUGT e PM-UTRI em folhas infiltradas com N. benthamiana foi confirmada 2DPI (Dias após a infiltração dos construtos do plasmideo Ti de Agrobacterium) via RT-PCR (Figs. 19 e 20). Como esperado, o substrato de CBGA foi detectado em todas as folhas infiltradas e no controle do tipo selvagem (sem infiltração de Agrobacterium). Os glicosídeos primários e secundários de CBGA também foram detectados em todas as folhas infiltradas e controle de tipo selvagem, demonstrando ainda uma atividade glicosiltransferase endógena agindo sobre CBGA. Além disso, o glicosídeo primário acetilado do CBGA foi detectado em todas as amostras, incluindo o controle WT, fornecendo evidências de acetilação endógena. O CBDA foi detectado em níveis marginais em amostras infiltradas com construtos de tricoma e suspensão de células, mas não em plantas do tipo selvagem.

Exemplo 10: Síntese de alvo de Citossólica e glicosilação do ácido canabidiólico (CBDAV) [00201] Os presentes inventores demonstraram um sistema de síntese e glicosilação de canabinoides de alvo de citosol. Ao alvejar ou localizar, CBDA sintase (CBDAs) e UDP-glicosiltransferase 76G1 (UGT) para o citosol, os presentes inventores demonstraram que as plantas que expressam estes genes heterólogos produzirem e acumulam, nesta modalidade, CBDA e os derivados glicosilados dos mesmos (glicosídeo primário, secundário), bem como outros derivados do CBDA, no citosol. Como mostrado na Fig. 18, foi gerado um vetor de expressão de gene para o sistema de produção de canabinoide citossólico. Este construto incluiu um promotor 35S de mosaico de couve-flor; AtADH 5'-UTR, elemento intensificador; cytCBDAs, ácido canabidiolico sintase com a sequência alvo do tricoma removida; Terminador HSP; cytUGT76GI, UDP glicosiltransferase de Stevia rebaudiana.

[00202] SEQ ID NO. 22 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para uma ácido canabidiolico sintase com a sequência alvo do

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70/114 tricoma removida (cytCBDAs). SEQ ID NO. 23 é identificada como a sequência de proteína correspondente dos cytCBDAs.

[00203] SEQ ID NO. 24 é identificada como a sequência do gene de polinucleotídeos para uma sequência de codificação UDP-glicosil transferase (UGT76G1) alvo de citosol (otimizada para a expressão de Arabidopsis thaliana) (cytUGT76GI ou cytUTG). SEQ ID NO. 25 é identificada como a sequência de proteínas correspondente de cytUGT76GI ou cytUTG.

[00204] Como modelo exemplar de planta, as plantas de N. benthamiana foram cultivadas a partir de sementes e, após 4 semanas de crescimento vegetativo, as folhas foram coinfiltradas com Agrobacterium tumefaciens GV3101, com os seguintes construtos: CBDAs citossólicos + UGT citossólico em pRI201-AN ou construto de suspensão de células, Myb/catalase em pRI201-AN e supressor de silenciamento pi 9 em pDGB3alpha2. A densidade de Agrobacterium foi normalizada para 2 na absorbância de 600 nm usando um espectrofotômetro e culturas coinfiltradas na mesma proporção (1: 1: 1). Após 2 e 4 dias após a infiltração de Agrobacterium (DPI), 1 ml de CBGA (2,7 mM) dissolveu-se em 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich) ou 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) foi infiltrado em cada folha. Em uma segunda modalidade utilizando o construto citossólico, 4 mM de UDP-glucose foi adicionado ao meio CBGA antes da alimentação. Foram utilizadas três repetições biológicas. Os iniciadores de RT-PCR estão descritos na Tabela 5 abaixo.

[00205] Como mostrado nas Figs. 19-20, a expressão do gene de cytCBDAs e cytUGT foi confirmada via RT-PCR após 1 e 2DPI. Não foi observada expressão do transportador ABC (ABCt) após o IDPI no construto da suspensão de células infiltradas nas folhas. Isso não afeta esse experimento, pois o papel do ABCt era facilitar o transporte de canabinoides para fora das células em culturas em suspensão. Como mostrado na Fig. 21, CBGA e nos derivados glicosilados e acilados do mesmo foram detectados em concentrações superiores às folhas infiltradas no construto do tricoma, exceto nos glicosídeos secundários. Além disso,

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71/114 o CBDA foi detectado em concentrações mais altas (até 34 ppm) em folhas infiltradas com o construto de suspensão de células, em comparação com os experimentos com tricomas (até 2,6 ppm). Como mostrado na Fig. 22, quando UDP-glicose 4mM (substrato para UGT) foi fornecido junto com CBGA (substrato para CBDAs), os presentes inventores detectaram baixos níveis de CBDA glicosilado e hidroxilado em folhas infiltradas com o construto de suspensão de células e citossólica, mas não no controle WT. Este resultado demonstra a novidade na síntese de plantas, glicosilação e hidroxilação de CBDA na planta substituta N. benthamiana, como demonstrado pelos cromatogramas de íons extraídos mostrados na Fig. 23.

Exemplo 11: Hidroxilação e glicosilação de canabinoides em Cannabis Sativa.

[00206] Os presentes inventores demonstram a glicosilação e hidroxilação de canabinoides em Cannabis sativa. Para confirmar ainda mais nossos achados usando N. benthamiana como modelo de planta, realizamos a infiltração de Agrobacterium dos mesmos construtos de plasmídeo descritas na seção acima em várias cepas de Cannabis sativa (ver Fig. 24 IDs de amostra). Como mostrado nas Figs. 24-26, a expressão dos construtos genéticos selecionados em C. sativa, como em N. benthamiana, demonstram a síntese e acumulação de canabinoides hidroxilados e/ou glicosilados, neste caso CBDA. Uma comparação dos resultados usando diferentes construtos genéticos de Agrobacterium é apresentada na Tabela 8 abaixo.

[00207] Como os presentes inventores demonstraram, em uma modalidade, em que o construto citossólico foi reconvertido com o vetor de expressão Myb/catalase (MYBCAT), produziu a maior detecção de glicosídeo CBDA e CBDA, demonstrando o papel desses genes na mitigação dos efeitos da toxicidade devido ao acúmulo de peróxido de hidrogênio (catalase) e aumento geral na síntese de canabinoides (fator de transcrição Myb).

MATERIAIS E MÉTODOS

Exemplo 12: Uso de um tabaco como um sistema de planta exemplar para a

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72/114 funcionalização in vivo e a glicosilação de canabinoides.

[00208] Os presentes inventores demonstraram a funcionalização in vivo e a glicosilação de canabinoides em um sistema modelo da planta. Especificamente, os presentes inventores utilizaram N. benthamiana (tabaco) como um sistema modelo para demonstrar a funcionalização in vivoe glicosilação dos canabinoides. Nesta modalidade, a transformação transitória através da infiltração de Agrobacterium foi realizada em N. benthamiana. Os presentes inventores demonstraram expressão de genes heterólogos que foram expressos em N. benthamiana transformada usando vários vetores de expressão de genes heterólogos (descritos abaixo). Nesta modalidade exemplar, após confirmação da expressão dos genes heterólogos que funcionariam e moléculas de canabinoides glicosilados, os presentes inventores introduziram nas plantas compostos canabinoides selecionados. Nesta modalidade, os presentes inventores introduziram nas plantas de N. benthamiana transgênicas o ácido canabigerólico (CBGA) e/ou o ácido canabidiolico (CBDA). Os presentes inventores também demonstraram a funcionalização in vivo e a glicosilação de canabinoides numa cultura em suspensão de células. Especificamente, os inventores usaram células exemplares de tabaco amarelo brilhante (BY2) como um sistema de suspensão de células para estudos de produção, funcionalização e/ou glicosilação de canabinoides.

Exemplo 13: Transformação transitória do modelo exemplar de planta Nicotiana benthamiana.

[00209] Os presentes inventores usaram a transformação mediada por plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens com o vetor de expressão da planta pRI201-AN (Takara Bio USA), um vetor binário para expressão de alto nível de um gene estranho em plantas dicotiledôneas portadoras do promotor 35S constitutivo e uma Arabidopsis thaliana Desidrogenase de álcool (AtAdh) como um potenciador da tradução (Matsui et al. 2012). N. benthamiana foi transformada transitoriamente de acordo com o método descrito por Sparkes et al. 2006) As

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73/114 culturas noturnas da cepa Agrobacterium GV3101 foram transferidas para um balão de 250 ml com 50 mL de meio LB suplementado com 50 mg/L de Kanamicina, 50 mg/L de Gentamicina e 10 mg/L de Rifampicina e cresceram por 4-8 horas até a densidade óptica a 600 nm (OD600) atingiu aproximadamente entre 0,75 e 1. As células foram sedimentadas em uma centrífuga à temperatura ambiente e ressuspensas em 45mL de meio de infiltração contendo 5g/L de D-glicose, 10mM MES, 10mM MgC12 e 100 μΜ acetosiringona. 1 ml da solução foi usada para infiltrar nas folhas, utilizando uma seringa de 1ML. A expressão do (s) transgene (s) foi confirmada 2-4 dias após a infiltração por RT-PCR. Para a análise de RTPCR, 100 mg de tecido foliar foram congelados em nitrogênio líquido e triturados em um TissueLyser (QIAGEN Inc, EUA). O RNA foi extraído após o kit de extração de RNA da planta EZNA (Omega Bio-tek Inc, EUA). Utilizou -se até um micrograma de RNA total para sintetizar cDNA usando o kit de síntese de cDNA sobrescrito III (Thermo Fisher Scientific, EUA). O cDNA foi utilizado para verificar a expressão de transgene (s) por RT-PCR.

Exemplo 14: Introdução de substratos canabinoides selecionados para cepa transqênica de N. benthamiana.

[00210] Substratos de enzimas selecionados foram introduzidos na cepa de N. benthamiana transgênica ou geneticamente modificada dois dias após a infiltração de Agrobacterium e após confirmação da expressão do transgene por RT-PCR. Neste exemplo, aproximadamente 277 μΜ de ácido canabigerólico (CBGA) e/ou ácido canabidólico (CBDA) foi dissolvido em 1 ml de tampão contendo 10 mM de MES, MgCI2 10 mM e 0,1% de Triton XI 00 ou 0,1% de Tween 20 e aplicado às folhas transformadas quer por infiltração ou por esfregando com um aplicador de algodão. As plantas foram coletadas após 1 -4 dias, pesadas para peso fresco e congeladas a -80°C antes de realizar análise por LC-MS para a presença de canabinoides modificados.

Exemplo 15: ensaios /7? vitro para CBDA sintase e atividade da qlicosiltransferase. [00211] CBDA sintase é geralmente ativa na faixa de pH 4-6 (Taura et al.

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1996), enquanto as glicosiltransferases são normalmente ativas na faixa de pH 5,0 a 7,0 (Rini e Esko, 2017). Com base nesta diferença no pH ideal para a atividade enzimática, os presentes inventores geraram um único tampão de extração para um ensaio combinado de CBDA sintase e UDP glicosiltransferase a pH 6 e 30°C em ensaios in vitro (Priest et al., 2006). Os presentes inventores moeram o tecido foliar transformado em nitrogênio líquido. Foi adicionado um tampão de moagem consistindo em 50 mM de MES, pH 6, 1 mM de EDTA, 5 mM β-mercaptoetanol e Triton X-100 a 0,1% foram adicionados na proporção de 5:1 de tampão em relação ao peso fresco da planta usando um gral e pilão. O extrato foi filtrado em gelo através de 2 camadas de gaze para remover detritos e centrifugado a 21.000 g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi utilizado em ensaios subsequentes. A concentração de proteína do sobrenadante foi quantificada pelo teste de Bradford, usando albumina de soro bovino como padrão. Para iniciar a reação, 100-200 pg de proteína total bruta foram utilizados. O ensaio foi realizado com e sem UDPglicose para verificar a glicosilação do substrato canabinoide, impedindo reações a jusante ou transporte de CBGA. Plantas do tipo selvagem foram usadas como controle para separar a atividade da UDP glicosiltransferase superexpressa da UDP. A reação foi iniciada adicionando 100 pg de proteína e glicose difosfato de uridina 8 mM (UDPG) como doador de nucleotídeo de açúcar para uma mistura de reação que consiste em aproximadamente 277 pM CBGA, Triton X-100 a 0,1% (p/v), MgCb 3 mM e MES 50 mM (pH 6,0). A reação foi incubada a 30°C por 3 h ou durante a noite por 14 horas. A reação foi terminada por congelamento em nitrogênio líquido e as amostras foram armazenadas a -80°C antes da análise por LC-MS.

Exemplo 16: Síntese e glicosilação de alvo de tricomas.

[00212] Como modelo exemplar de planta, as plantas de N-benhamiana foram cultivadas a partir de sementes e, após 4 semanas de crescimento vegetativo, as folhas foram coinfiltradas com Agrobacterium tumefaciens GV3101, com os seguintes construtos: CBDAs de tricoma + UGT de tricoma em pRI201 -AN

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75/114 (construto de tricoma), PM-UTR1 em pRI201-AN e supressor de silenciamento de p9 em pDGB3alpha2. Em um segundo experimento, as folhas também foram infiltradas com o Agrobacterium expressando um plasmídeo T com os genes Myb/catalase. A densidade de Agrobacterium foi normalizada para 1 ou 2 com absorbância de 600 nm usando um espectrofotômetro e culturas coinfiltradas na mesma proporção (1:1:1). Após 1 e 4 dias após a infiltração por Agrobacterium (DPI), I CBGA (277 μΜ) dissolvido em 0,1% de Tween20 (Sigma-Aldrich) ou 3% de DMSO (Sigma-Aldrich) foi infiltrado em cada folha. Foram utilizadas três repetições biológicas. A experiência foi repetida duas vezes. Após resultados preliminares, densidades de Agrobacterium de 2 a ODeo foram selecionadas para todos os experimentos de infiltração subsequentes. Além disso, 0,1% de Tween20 foi escolhido sobre DMSO 3% devido à melhor solubilização do substrato CBGA.

[00213] Nesta modalidade, amostras de folhas foram coletadas em 2DPI e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. A extração do RNA foi realizada usando o mini-kit da planta de RNA, conforme descrito pelo fabricante (Qiagen). O cDNA foi sintetizado usando RNA para o cDNA Ecodry Premix como descrito pelo fabricante (Takara). O cDNA modelo foi normalizado para 50 ng de RNA total correspondente por reação. Temperatura de recozimento em Celsius: 60. Tempo de extensão: 15s. 35 ciclos. Kit de polimerase de DNA Q5 usado como descrito pelo fabricante (New England Biolabs). Os iniciadores de RT-PCR estão descritos na Tabela 5 abaixo.

Exemplo 17: Transformação transitória de Cannabis sativa.

[00214] Os presentes inventores realizaram a transformação transitória da Cannabis sativa, mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os grupos experimentais consistiram de folhas jovens de alta variedade de CBD (-10% em flores secas) e folhas de tricomas de alta variedade de THC (-20% de flores secas). [00215] Para transformar folhas de variedades com alto teor de CBD, os presentes inventores germinaram 100 sementes três vezes; isso foi feito para garantir que um número suficiente de plantas estivesse disponível para todos os 9

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76/114 eventos de transformação independentes. Para transformar folhas de tricomas, os presentes inventores usaram pequenas folhas contendo tricomas de várias variedades conhecidas por serem variedades de alto THC. A montagem experimental consistiu em 2 cepas diferentes de Agrobacterium tumefaciens. Para a transformação transitória da cepa EHA 105 de Agrobacterium, os presentes inventores cultivaram células em 10 ml de meio LB suplementado com 100 mg/L de rifampicina e 50mg/L de canamicina e para a cepa GV3101 de Agrobacterium : 6000 células foram cultivadas com 50mg/L de Kanamicina, 25 mg/L de gentamicina e 50 mg/L de rifampicina. Uma única colônia de Agrobacterium foi usada para inoculação e cultivada durante a noite. Em seguida, 1 ml desta cultura foi inoculado em 500 ml do meio LB mencionado acima, suplementado com 20 μΜ acetosiringona. Agrobactérias foram cultivadas a ODeo de aproximadamente entre 1 e 1,5. As células foram sedimentadas em uma centrífuga à temperatura ambiente e ressuspensas em meio de infiltração contendo MES 10 mM, MgCb 10 mM e 200 μΜ acetosiringona a um ODeo de 0,5.

[00216] A cultura bacteriana foi então usada para três tipos diferentes de transformações de Cannabis Sativa. Em todos os casos, a transformação foi realizada na forma de cotransformação, misturando todas as cepas relevantes (plasmídeos) na mesma proporção do número de células. Primeiro, para os presentes inventores infiltraram-se plantas jovens de Cannabis sativa (com duas semanas de idade), totalmente gastas, utilizando uma seringa de 1 ml. Antes da transformação, as plantas eram mantidas sob cobertura plástica, para garantir a máxima maciez das folhas. A infiltração foi realizada pelo lado abaxial, garantindo que toda a superfície da folha seja infiltrada às 12/h/12h dia/noite a 22°C.

[00217] Em segundo lugar, os presentes inventores infiltraram a vácuo, folhas jovens e com duas semanas de idade, totalmente despejadas de Cannabis sativa. Antes da transformação, as plantas eram mantidas sob cobertura plástica, para garantir a máxima maciez das folhas. As folhas foram então colocadas em meio ágar Murashige e Skoog (1962) (½ MS) suplementado com 6 nitrato de

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77/114 amônio 1,8 a 8 mM e incubadas por 5 dias a 12/h/12h dia/noite a 22°C.

[00218] Terceiro, as folhas do tricoma foram destacadas, colocadas em tubos Falcon de 50 ml e infiltradas a vácuo com a solução bacteriana mencionada 2 x por 10 minutos cada. As folhas foram então colocadas em % ágar MS suplementado com 61,8 mM de nitrato de amônio e incubadas por 5 dias.

[00219] Todas as experiências foram realizadas em triplicatas, com a quarta réplica realizada para coleta de DNA/RNA e coloração X-gluc para medir a atividade da beta-glucuronidase (GUS) após coinfiltração com o gene Agrobacterium contendo GUS. Em todos os casos, as folhas foram colhidas após 5 dias de transformação, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.

Exemplo 18: Extração de canabinoides solúveis em água de N. benthamiana [00220] Material de planta transformada fresco foi colhido a partir de experiências em estufa em 15 mL ou 50 tubos de centrífuga de polipropileno e rapidamente congelados em N2 líquido. O material de planta congelado foi extinto enzimaticamente por submersão do material de planta em metanol em ebulição por 2 min. O material extinto com metanol foi homogeneizado usando um homogeneizador P-10-35 (Kinematica, Bohemia NY). O homogenato foi extraído por breve agitação em um volume final de 10 mL ou 30 mL de metanol a 70% (v/v), correspondente ao tamanho do tubo. Os extratos resultantes foram clarificados por centrifugação a 2.500 rpm a 4°C por 15 minutos em uma centrífuga de piso Beckman J-6B (Beckman Coulter, Indianapolis IN). O sobrenadante foi transferido para um tubo de polipropileno e evaporou-se sob uma corrente de N2 a 45°C até seca. Os extratos foram reconstituídos em metanol contendo 20 g/mL do padrão interno 7-hidroxioumarina (Sigma-Aldrich, H24003). Os extratos reconstituídos foram colocados em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e clarificados em microcentrífuga a 10.000 g por 15 min. 500 pL do sobrenadante foi transferido para um frasco de amostrador automático de 2 mL e mantido a 4°C até a análise. Preparação de amostras para ensaios in vitro: as amostras foram filtradas com seringa com 0,45pm Membrana de PVDF em um frasco de amostrador automático

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78/114 de 2 mL.

Exemplo 19: Extração de canabinoides solúveis em água de Cannabis sativa. [00221] O material de planta fresco foi colhido a partir de plantas crescidas na câmara em 1,5 ml de tubos de centrífuga de polipropileno e rapidamente congelados em N2 líquido. O material de planta congelado foi homogeneizado usando pilão e almofariz e temperado enzimaticamente por submersão do material de planta em etanol a 100% em ebulição por 2 min. A solução homogeneizada foi diluída em etanol a 70%. Os extratos resultantes foram clarificados por centrifugação a 2.500 rpm a 4°C por 15 minutos em centrífuga Eppendorf (Centrifugadora 5415 R). O sobrenadante foi transferido para um tubo de polipropileno e concentrado três vezes usando centrífuga a vácuo (Speedvac SCI 10, Savant). 2 μΙ_ de 20 pg/mL do padrão interno Umbelliferona (Sigma-Aldrich, H24003) foi adicionado a 98 μΙ_ de extrato concentrado e levado para análise.

Exemplo 20: Espectrometria de massa por cromatografia líquida usada para confirmar a funcionalização e qlicosilação de canabinoides.

[00222] O presente inventor utilizou espectrometria de massa por cromatografia líquida para confirmar a funcionalização e glicosilação de canabinoides nos sistemas de plantas exemplares aqui descritos. Especificamente, a espectrometria de massa foi realizada em um espectrômetro de massa quadrupolo de tempo de voo (QTOF) (QTOF Micro, Waters, Manchester, Reino Unido) equipado com uma fonte de íons de eletropulverização lockspray ™ acoplada a um sistema UPLC da Waters Acquity (Waters, Manchester, Reino Unido)) Os espectros de massa foram coletados no modo de ionização por eletropulverização negativa (ESI-). O gás de nebulização foi ajustado para 400 L/h a uma temperatura de 350°C, 0 gás cone foi ajustado para 15 L/H e a temperatura da fonte foi ajustada para 1 10°C. A voltagem capilar e voltagem do cone foram ajustadas para 2500 e 35 V, respectivamente. A voltagem do detector MCP foi ajustada para 2500 V. A taxa de aquisição de micro MS Q-TOF foi ajustada para 1,0 s com um atraso entre varreduras de 0,1 s. O intervalo de varredura foi de 100

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79/114 a 1500 m/z. Os dados foram coletados no modo contínuo. Uma solução de lockmass de 50 ppm de rafinose (503,1612 m/z) em água 50:50: o metanol foi entregue a 20 pL/min através de uma bomba auxiliar e adquirida a cada 10 s durante a aquisição do MS. As separações foram realizadas em uma coluna Waters HSS T3 Cl 8 (2,1 x 100 mm, tamanho de partícula 1,8 pm) usando um sistema Waters ACQUITY UPLC, equipado com um gerenciador de solventes binários ACQUITY, um gerenciador de colunas ACQUITY e um gerenciador de amostras ACQUITY (loop de 10 amostras, modo de injeção parcial de loop, 5 pL volume de injeção, 4°C). Os eluentes A e B foram água e acetonitrila, respectivamente, ambos contendo 0,1 % de ácido fórmico. A eluição foi realizada isocraticamente por 0,5 min a 10% de eluente B e depois gradiente linear de 100% de eluente B em 14,5 min e isocraticamente por 3 min a 100% de eluente B. A coluna foi reequilibrada por 6 min. A vazão foi ajustada para 250 pL/min e a temperatura da coluna foi mantida a 30°C.

Exemplo 21: Demonstra materiais e métodos para processamento de dados. [00223] A identificação de análogos individuais de canabinoides foi realizada pelos presentes inventores, por suas correspondentes mudanças de massa precisas por Metabolynx (Waters Corp., Milford, EUA). Os parâmetros do método para processamento de dados foram definidos da seguinte forma: intervalo de tempo de retenção 0,1-18 min, intervalo de massa 100-1500 Da, tolerância de tempo de retenção 0,2 min, tolerância de massa 0,05 Da, limiar de intensidade de pico 14. A medida de massa precisa dos dados foi realizada usando a massa de bloqueio rafinose. Os dados cromatográficos brutos foram adicionalmente processados para a integração da área do pico da areia do cromatograma de íons extraídos usando Masslynx 4.1 (Waters Corp., Milford, EUA). Os canabinoides selecionados, CBGA e CBDA foram identificados e quantificados usando materiais de referência certificados (Cerilliant, Round Rock, TX). Todas as estruturas químicas e propriedades físico-químicas e constitucionais foram geradas usando o ChemDoodle versão 8.1.0 (IChemLabs ™, Chesterfield, VA).

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TABELAS

Tabela 1 Produtos Biotransformados de CBGA

	RRT para	Esperadc	Erro	Erro	Fórmula Molecular [
Produto	Origem	m/z m/z	(niDa)	(ppm)	HI-

Encontrad

R-OH 1 x Glicosídeo	0,58	537,2700 537,2703	-0,30	0,6	C28H41O10
2 x Glicosídeo	0,59	683,3279 683,3258	2,10	-3,1	C34H51014
1 x 0 glicosídeo acetil0,73	563,2856 563,2844	1,20	-2,1	C30H43010
1 x Glicosídeo # 1	0,74	521,2751 521,2734	1,70	-3,3	C28H4109
R-OH # 1	0,80	375,2171 375,2224	-5,30	14,1	C22H3105
1 x Glicosídeo #2	0,81	521,2751 521,2727	2,40	-4,6	C28H4109
R-OH # 2	0,81	375,2171 375,2237	-6,60	17,6	C22H3105
R-OH #3	0,94	375,2171 375,2192	-2,10	5,6	C22H3105
CBGA	1,00	359,2222359,2245	-2,30	6,4	C22H3104

RRT Tempo de Retenção Relativa para Molécula de Origem

ROH Funcionalizado por adição de átomo de O.

Tabela 2. Produtos Biotransformados de CBDA

Produto	RRT pan Origem	a Esperado m/z	EncontradErro	Erro (PPm)	Fórmula Molecular [ H1-
m/z	(mDa)
2 x Glicosídeo	0,56	681,3122	681,3097	2,50	-3,7	C34H49014
R-OH 1 x Glicosídeo	0,61	535,2543	535,2599	-5,60	10,5	C28H39O10
1 x Glicosídeo	0,71	519,2601	519,2594	0,70	1,3	C28H3909
1 x O acetil Glicosídec0,71	561,2700	561,2700	0,00	0	C30H41010
R-OH # I	0,84	373,2015	373,2074	-5,90	15,8	C22H2905

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R-OH # 2	0,87	373,2015	373,2034 -1,90	5,1	C22H2905
R-OH # 3	0,96	373,2015	373,2040 -2,50	-8	C22H2905
CBDA	1,00	357,2066	357,2122 -5,60	15,7	C22H2904

RRT Tempo de retenção relativo para a molécula de origem

R-OH funcionalizado pela adição de átomo de O.

Tabela 3. Iniciadores diretos e reversos para RT-PCR de CYP3A4 e P450 oxidorredutase

Sequência |	CYP3A4	P4S0 oxidoredutase
Iniciadores para i RT-PCR i	Direto TGCCTAATAAAGCTCCTCCTACT I nverso GCTCCTG A AÁCAGTTCCATCTC	Direto GGA AG AGCTTTGGTTCCTATGT Inverso GCTCCCAATTCAGCAACAÁTATC

Tabela 4. Iniciadores direto e reverso para CBDA sintase, UGT76G1 e ABCG2

Sequência	CBDA sintase	UCT%Gi	À8CG2
Iniciadores para RT-PCR	Iniciador Direto: ACATCACAATCACACA AAACTÀACAAAAG Inciador Rêverso: GGCCATAGTTTCTCAT ÇAATGG	Iniciador Direto; gattggaagaacaagctt CAGGATTTCC Inciador Reverso: CCATCCTG AATGAGTCCA AAAAGCTÇ	Iniciador Direto: CCTTCAGGATTGTCAGGA GATG Inciador Reverso: GCAGGTCCATGAAACAT CAATC

Tabela 5. CBDA sintase (CBDAs) alvo de tricoma, UGT alvo de tricoma e UTR1 alvo de PM

Sequência	CBDAs alvos de tricoma	UGT alvo de tricoma	UTRi alvo de membrana plasmática
Iniciadores para RT-PCR	Iniciador Direto; AAAGATCAAAAUCAA GTTCTTCACTGT Inciador Reverso: CCATGCAGTTTGGCTA TGAACATCT	Iniciador Direto: AGTGCTCAACATtCTCCTT TTGGTT Inciador Reverso: TCTGAAGCCAACATCAAC AATTCCA	Iniciador Direto: TTGTTCCTTÀAàCCTCGC CTTTGAC Inciador Reverso: TCATTATGGAGCACTCCA CTCTCTG

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Tabela 6. CBDA sintase alvo citossólico (cytCBDAs), UGT alvo citossólico (cytUGT)

[Sequência	CBDA sintase alvo citossólico	UGT sintase alvo citossólico
Iniciadores 1 para RT-PCR	Iniciador Direto: AÁAGÁTCA.AAAGCAAGTTCTTCACTGT Inciador Reverso: ATAA ACTTCTCCA AGGGTAGCtCCG	Iniciador Direto: AG.AAÇTGQAAGAATCCGÁAÇTGGAA Inciador Reverso; AAATCATCGGGACACCTTCAGAAAC

Tabela 7. Resumo dos resultados dos experimentos de glicosilação e funcionalização em folhas de N-bentamiana.

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CBGA

ÇBGA

Construtos de

Agrobacteriuci citossolica i glicosiltransferase e |_: CBGA transportador ABC de s membrana plasmatic a

CBDA

CBGA

CBGA ritocromo Ρ4:’·0 com P4:’C· isxsdsreih; rase?

TricomaCBDA sintase 4Tricoma glicosiltransferase + PM-UTR1) * ^dVcatalase* * PIS supressor de _Ísüençiamento

CBDA sintase citossolica, glicosiltransferase e transportador ABC de membrana plasmatic a - í

MvLVeat3iase+Pl& supressor de silenciamento__ ____J

2ΰ1-SUS {CBDA sintase I

CBDA sintase citossolicaglicosiltransferase citossolica -r

Mv&cataiase* +' Pl 9 supressor de silenciamento________

P45GCsfYBca&la-se/cito ss ólic a

CBDA sintase; glicosiltransferase e tr ansportador ABC de membrana plasmatic a

Sem agrobacterium (controle negativo)

CBGA . I CBGA <®GA CBDA

Substrate glicosideo ' alimentado kipantidade] (quantidade acetilado | (quantidade

Irelativa) |_ralativa). ^relativa) relativa)

CBD.A glicosideo (quantidade relativa)

ND

ND *Coinfiltração com e sem construto foi testada em diferentes réplicas

Tabela 8. Resumo dos resultados dos experimentos de glicosilação e funcionalização em folhas de Cannabis sativa.

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| CBDA Construtos de L Agrobseteritti» ^quantidade ^relativa) 1	CBDA glicosídeo (quantidade relativa)	CBDA Hidroxil (quantidade relativa)
1 Tricoma CBDA sintase 4 Trie orna glicosiltransferase | + transportador de açúcar alvo í de membrana plasmática } 4· ]	traços	traços
CBDA sintase citossólica c ] glicosiltransferase citossólica 4-L 4*·+ Myb/«at8la$.8	4+4-t-	ΉI-4-44
pObSÜSf CBDA sintase | citossólica,glicosiltransferase e | ; transportador ABC de 1 [membrana plasmática) ]	44·	+4

Tabela 9. Identificação de sequência de glicosiltransferase exemplificadora

SEQ ID NO.	Nome	Organismo	Tipo
SEQ ID NO. 26	NtGT5a	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 27	NtGT5a	Nicotiana tabacum	DNA
SEQ ID NO. 28	NtGT5b	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 29	NtGT5b	Nicotiana tabacum	DNA
SEQ ID NO. 30	NtGT4	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 31	NtGT4	Nicotiana tabacum	DNA
SEQ ID NO. 32	NtGTIb	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 33	NtGTIb	Nicotiana tabacum	DNA
SEQ ID NO. 34	NtGTIa	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 35	NtGTIa	Nicotiana tabacum	DNA

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SEQ ID NO. 36	NtGT3	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 37	NtGT3	Nicotiana tabacum	DNA
SEQ ID NO. 38	NtGT2	Nicotiana tabacum	Aminoácido
SEQ ID NO. 39	NtGT2	Nicotiana tabacum	DNA

Tabela 10. Modelos de compartimentalização celular de produção de canabinoides. Diferentes colunas e linhas sombreadas correspondem a diferentes construtos de expressão exemplificadores usados.

Sistema de acúmulo/ produção de canabinoide

CBDA

Sintase tmp glicosil transferase

Transportador

ABC de canabinoide

Acumulo Çitoplasmático

Menos Sequência alvo de Tricoma

Necessário mas sem alteração de alvo

Nenhum gene necessário

Síntese de tricoma (baixo pH)

Sem alteração

Adição de Sequência alvo de Tricoma

Nenhum gene i Alvopara necessário ; memhrana í plasmática

Nenhum gene necessário í; Transportador de UDP ií glicose

Expresso

Expresso

Fator de Transcrição de Myb para canabinoides [Catalase para £ degradar

ΪΗ2Ο2 de

CBDA sintase

Expresso

Expresso

Culturas de suspensão de células

Menos Sequência alvo de Tricoma

Necessário mas sem alteração de alvo

Alvo para membrana plasmática (FM)

Nenhumgene necessário

Expresso

Expresso

REFERÊNCIAS

As seguintes referências são aqui incorporadas na sua totalidade por referência:

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 87/155

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Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 88/155

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Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 90/155

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Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 91/155

90/114 [27] Matias.-HeiuaEidez_s L. et al. AaMYBl and its rathologste AíMYtídl affect terpene metabolism asd tochsme development in rfefíãsií? am» and

J. 2017; 90: 520-534

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Como mencionado acima, o presente pedido contém uma Listagem de Sequências completa que foi submetida eletronicamente no Formato ASCII e é por este meio incorporada por referência na sua totalidade. As sequências a seguir são fornecidas adicionalmente com e são incorporadas aqui no relatório descritivo no sua totalidade:

SEQ ID NO. 1 DNA

Citocromo P450 (CYP3A4) Humano

ATGGCTTTCArrCCTGATTTGGCTATGGAAAC.TAGATTGTTGTTGGCTGTTTCATTGGTTTTGT TGTATTTGTATGGAACTCATTCACATGGArEGTrrAAAAAATTGGGAATTC/CTGGACGTACTCC TTTGCCTTTrrTGGGAAATATrrTGTCATATCATAAAGGATTrTGCATGTTTGATATGGAATGC: CATAAAAAATATGGAAAAGTTTGGGGATrrTATGATGGACAACAACXTGTTTTGGCTATTACTG ATCCTGATATGATrAAAACTGTnTGGrrAAAGAATGCTATrCAGTTTTTACTAATAGAAGACX: TTrTGGACCTGTTGGATTTATG.AAATCAGCTATTTCAATrGCTGAAGATGAAGAATGGAAAAGA TTGAGATCATTGTTGTCACXTACTrrTACTrCAGGAAAATTGAAAGAAATGGTrCCTATTATTG CTCAATATGGAGATGTTTTGGTTAGAAATTTGAGAAGAGAAGCTGAAACTGGAAAACCTGTrAC •rTTGÀÀAGATGTTTTTGGAGCTrATTCAATGGATGTTATTÀCTTCÀACTTCATTTGGAGTTAAT ATTGATTCATTGAATAATCCTCAAGATCCTrTTGTTGAAAATACTAAAAAATTGTTGAGATTTG ATTTrTTGGATCCTTTTTTrrTGTCAATTACTGTTTTTCCTTTTITGATTCCTATTrrGGAAGT TTTGAATATTTGCGTTTTTCCTAGAGAAGTrACTAATTTTTTGAGAAAATCAGTTAAAAGAATG AAAGAATCAAGATTGGAAGATACTCAAAÀACATAGAGTTGATTITTTGCAATTGATGATrGATT CACAAAATTCAAAAGAAACTGAATC'ACATAAAGCTTTGTCAGATTTGGAATTGGTTGCTCAATC AATTATTITrATTrTrGCTGGATGCGAAACTACTTCATCAGTrrTGTCATTTATrATGTATGAA TrGGCTACTCATCCTGATGrrCAACAAAAATTGC:AAGAAGAAATTGATGC:iGTTTTGCCTXATA AAGCTCCTCCTACTTATGATACTGTTTTGCAAATGGAATATITGGATATGGTFGTTAATGAAAC TTTGAGATTGTTrCCTATTGCTATGAGATTGGAAAGAGTTrGCAlAAAAGÀTGTTGAÁATrAAT GGAATGTTTATTCCTAAAGGAGTTGTTGTTATGATI€X;iTCATATfXTITCCATAGAGATCCTA AATATTGGACTGAACCTGAAAAATrmGCCTGAAAGATnTCAAAAAAAAATAAAGATÁATAT TGATCCTTÀTATTTATACTC-CTTTTGGATCAGGACCTAGAÀATTGCATTGGÀATGAGATTTGCT TTGATGAATATGAAATTGGCTTTGATTAGAGTTTTGCAAAATTTTTCAITTÀAACCTTGCAAAG AAACTCAAATr€'CTTrGAÀATTGTCATTGGGAGGA.rTGTTGCAACCTGAÀÀAACCTGrrGTTTT GAAAGTTGAATCAAGAGATGGAACTGTTTCAGGAGCT

SEQ ID NO. 2

Aminoácido

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 92/155

91/114

Citocromo P450 (CYP3A4) Humano

MAIJP®l.AaiETKLIXAVSLVLLYL¥GTHSHGLFKKLGI PGPTPI^FWNJLSVHKC^CaíFDX-IEC

HKKY<^T¥<^\TX^QPVLAI TDPDMI KTAT.VKECYX¥TTNRRPFGPVGFMKS ftl S JAEDEEWKR

LRSLESPTFESGSLKEMVPÍ LA.QYGm^VR.JSlLRREAETGKFVELKD^TGAYSMimTSESFG^ WSE^PQBPfWXTKKEEREDFLDPEFLS ITVFPELI PILE¥L?ÍI CVFPREVTNFLRKSVKRM KESREE»TQKHRTOFEQEMI»SQNSKETESHKAESBLELVAQS 11 FI FAGCETTSSVLSFIMYE LÁTHP»VQQKLQEEIDAATPNKAPPT'i^rDIA⁷LQAÍE¥EIÍMV⁷NETLRL.FPIAAÍRLEKVCKK»WIN CHF IFKG.WVMI PSYALaRBFKTWTEPEKFLPERFSKKNKDNmPYnTTFGSGPRNCIG&IRrA EXE^¥IKLALIRVTQNFSFKPCKETQI PLKLSLGGLLQPEKPWLI^TSEIlCiTVSGA

SEQ ID NO. 3

DNA

Gene P450 oxidorredutase (oxred)

Humano

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 93/155

92/114

ATGATTAATÀTGGGÀGATTCACATGTTGATACTTeATCAACTGTTTCAGAAGCTGTrGCilGAAG AAGTTTCATTGTTTTCAÀTCACTGATATGATTTTGTTTTCATrGATTGTTGGATTGTTGACTTÁ TTGGTTTTTGTTTÀGAAAAÀÀAAÁAGAAGAAGTTCGTGAATTTACrAAÀATTGÀÀACTrTGÀCT TCATCAGTTÀGAGÀATCATCATrTGTTGAAAAAATGAÀAAÀAACTGGAAGâÀATAITAITGTIT TTTATGGATCAeAAACTGGAAeTGCTGAAGAATrTGCJAÀTAGATTGTCAAAAGÂTGCTCATAG ATATGGAATGACACGAATGTCAGC/rGATCCTGAAGAATATGATTTGGCTGAmGTCATCATTC CCTGxAAATTGATAATGCTTTGGTTGTTTmG€ATGGCTAeTrATGGAGAAGGAGAT€GrACTG ATÀATCXTCAAGATTrTTATGATTGGTTGCAAGAAACTGATGTTGATTTGTCAGGAGTTAAATT· TCCTGTTTTTGGATTGCGAAATAÀÀACTTATGAACATTTTAATGürATGGGAÁAATATGTTGAT AAAAGATTGGAACAATTGGGAGCTCAAAGAATmTGAATTGGGATTGGGAGATGATGATGGAA ATTrGCAAGAAGATirrATTACTTGGAGAG.AAQAATrrTCGTTCGCTGTrTGCGAA€ATTTTGG AGTTGAAGCTACTGGAGAAGÀATCATCAATTAGACAATATGAATTGGTTGTTGATACTGATATr GATGCTGCTAAÁGTrTATATGGGAGAAATGGGxAÀGATTGAAATCLATATGÀÀAATCAAAAAGCTC CTTTTGATGCTAAAÀATCCTTTTnGGCTGCTGTTACTACTAATAGAAAATTGAATCAAGGAAG TGAAAGACATTTCATGCATTTGGAATTGGATATTTGAGATTCAAÁAATTAGATATGAATCAGGA G4TCATGTrGCTGTTTATCCTGCTAATCATTGAG€“nTGGTT.AATCAATTGCGAÀAAATTTTGG GAGGTGATTTGGATGTIGTTATGTCATTGAATAATTTGGATCxAAGAATCAÀATAÀAAAACATCC TTTTCCTTGCCCTÀCTTCATÀTAGAACTGCTTFGACTTATrATrTCGATATTACTAATCCTCCT AGAACTAATGTTTTGTATGÀATTGGCTÜAATATG€TTCÂGA.A<<TrüAGÀACAAG.A4TTGTTGA GAAAAATGGCn€ATCA.TCAGGÀGAÀGGAAAAG.4ATTGTÀTTTGTCATGGGTFGTrGAAGCTAG AÀGACATATTrTGGCTATnTGCAAaATTGCCXTTCATTGAGACCTCCTATTQÀTCATTrGTGC GAATTGTTGCCTÀGATTGGAAGCTAGATATTATTCÀATTGCTTCATGATCAAAAGTrCATCCTA ATTCAGTTCATATTTGCGCTGTTGTTGTTGAATATGAAACTAAAGCTGGxAAGAATTAATAAAGG AGTTGCTACTAATTGGTTGAGAGCTAAAGAACCTGTTGGAGAAAATGGAGCAAGAGCTTTGGTT CCTATGTrTGTTAGAAAATCACÀATTTAGÀTTGGCTTTTAAÀGCTÁCTACTCCTGTTATTATGG TTGGA€€TGGAACTGGAGTTGCTCCTTTTATTGGAniATTCAÁGAÀAGAGC:TTGGTTGAGACA ACAAGGAÁAAGÀAGTTGGAGAAMTTTGTTGTATTATGGATGGAGAAGATCAGATGAAGATTAT TTGTÀTAGAGAAGAATTGGCTCAATTTeATAGAGATCGAGCTTTGACTeAATlGÀÀTGTTGCTT TTTCAAG4GA4CÀATCÀCATAAWTTTATGTTCAA€ATTTGTTGAÀACÀÀGATA;QÀGAA€ATTT &τ€αΑΑΑΤΤί^ΑΤΤΟΑΑ€©Α^ΟΑ€€Τ<<4ΤΑΓΓΤΑτ&'ΓΤΤ&</<ίΟΑ^ΑΤ€€ΤΑ.©ΑΑΑΤΑΤΟ€ΧΤΑ©Α GAIGTTtAAÀATACITTTTATGAIATTGTTGCTGAATTG&GAGCTATCGAACAT&CTCAAGCrTG TTGÀTTATATTAAAAAATTGÀTGACTAAAGGAAGATÀTTCATTGGATGTTTCGTGA

SEQ ID NO. 4

Aminoácido

P450 oxidorredutase

Humano

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 94/155

93/114

MINMGDSm’DTSSTCSEA¥AEEVSLF5MTDX£I LFSUVGLL-TVWEI^RKKKEE^TEFTOQTLT SSVRZSSFVXiaíKSTGRM IVFYGgQTGTÀEEFA^RLSKBÀiffiTG&IRCXISADPEEYDLÀSLSSl. FEmFiAEWFCiiAn^GDFTDXAQESFYSY'LQETBTOESG^FAVFGEG^KTYEHFNAAJGKYYD· KRLEQLGAí^RIFELGLGDESSG^LEESFreWKEQFWLAVCEHFGyEAFGEESS IKQYELWHTDI BÂÃKVY^iGEMGRLK.SWSQKFFWAKNPFLÀAVTlWKLKQGTEKHIAffiEELBISDSKIRYE.SG DHV’A\^:AT.A^D&AL;V?f'QLGKlLGABE©^^:lí-SL?íKLOEES^KKHFFPCT^,T&¥KTALTY¥LDI TNFF RTX^XlTIAQYA^SEQELLRKMASSSGEGKELYLS-^tEARRHILAI LQD<P8LEFFI»HLC EEÍFELíQAEYYS· LASSSKVHPKSVHI CA^YTEyETKAGEl^GYAT^TRÀKEFVGE^GGRALV PW^^rKKSQn^FK4TTP™n’GPGTGVAlTX€^IQERA^líR.QQGKE¥^.TLL¥¥GCRR8BEBY L^KEEEAQ^EBGALTQE-M.'AFSEiEQSHE^'YVQm.LKQDREKL^^L^.CGAHmOGSARM^AR S VQNTFYDIYAELGAMEHÀQ A VWIKKLAÍTKORYS LDWS

SEQ ID NO. 5 DNA ácido canabidiólico (CBDA) sintase

Cannabis sativa

ATGAATCCTCGAGA4AA€7rTCCTTAAATGCTTCTCGCAATATATTCC«AATAATG€.4ACAAATC TÀAAACTCGTATAGACTGÀAàACAACCCATTGTATATGTCTGTCCTAAÀTTCCACAATACAGAA TCTTAGATTCACCTCTGACACAA£C€€AAA4££ACTTGTTATCGTCACTCCTTCACATGTCTCT CATAECCAAGGCACTATTCTAEGCTCCAAGAAAGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCGAAGTGGTG GTCATGATTCTG.AGGGCATGTCCTACATATCTCAAGFCCCATTTGTTATxAGTAGACTTGAGÂAA CATGCGTTCAATC.AAAÁTAGATGTTCATAíXGAAACTGCATGGGTTGAAGCCGGAGCTACCCTT GGAGAAGTTTATTATTGGGTTAATGAGAAAAATGAGAATCTTAGTTEGGCGGCTGGGTATTGCC CTACTGTTTCCGCAGGTGGAC ACTTTGGTG GAGGAGGCTATGGACCATTGATGAGAAACT 4TGG CCTCGGG GCTGATÀATATGATTGÀTGCACACTTAGTC .AACGTTCATGGAAAACTGCTAGATC G A AAATCTATGGGGGAAGAFCT€TTrEGGG€TTTxACGTG€T^TGGAG£ÀGAAAGCTTCGG4ATt· Λ TTGTAGCATGG.AAAATTAGACTGGTTGCTGTCC€AAAGT£TACTATGTETAGTCTTAAAAAGAT CATGGAGATACATGAGCTTGTCAAGTFAGTTAACAAATGCGAAAATATTGCTTACAAGTATOAG A4AGATTTATTACT€ATGA£TCACTF£ATA4CTAGGAACATTACAGÀTAAT£_;4A&GG.AAGAATA AGACAGCAATACACAeTTACTTCTCTTCAGTTTTCCTrGGTGGAGTGGÁTAGTCEÂGTCGÀCTI GATGAA€AAGAGTmceTGAGTTGGGTATTAAÀAA4A€GCATTGeAGACAÁTTGAG€TGGATr GATACTATCATCTTCTATAGTGGTG'TTGTxAAATTACGACACTGATAATTTTAACAAGGAAATTT TGGTrGATAGATCCGCTGGGCAGAACGGTGCTTTCAAGÀTTAAGTTAGAGTACGTTAAGÀÀACC AATTCXAGAATCTGTATTTGTGCAAATTTTGGAAAÂATTATATGAAGÀACATATAGGAGCTGGG ATGTATGCGTTGTACGGTTACGGTGGTATAATGGATGAGATTTCAGAATCAGCAATTCCATTCC CTCATCGAGCTGGAATCTTCTATGAGTrATGGTAGATATGTAGTTGGGAGAACCAAGAAGATAA CGAAAÀG€AT€TA4ACTGGAETAGÀÀÀTATTTATÁACTT€ÂTGACTCCTTATGTGTC<AAAAAT TCAAGÀTTCQeATATCTCAATTATAGACAGGUGATÀEAGGAATAAÀTGATCCCAAGAATCCAA ATAAErACACACAAGCACGTATTTGGGGTGAGAAGTATriTGGTAAAAATTTTGACAGGCTAGT AAÀAGTGAAAACCGTGGTTGATCCCAATAACTmTEAGAAACGAACAAAGGATCCCACCTCAA CCACGGCATCGTCATEAA

SEQ ID NO. 6

Aminoácido

Ácido canabidiólico (CBDA) sintase

Cannabis sativa

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 95/155

94/114 wpri v \ \

GaT <

IVDLRRKRSI KIDVHSQTAKVKAGaTL

OKSYGLAASN I IDAIfííVNVHSKVLDR

KSSO· '< i A \> x WSVKKI.^EIHELWLWOQ^TÂ¥KYD

KDLL; > DSLVDLMÍíXSFPEmiKKTOCK.gLGXI

3TIIS \ ? WKKP^FESywgiLSKLYE^IG&S

MSffi » > EKS}WNKKH?Jí» .1 RR ITOWmSKS

SRLA\xx_WAkx»^..A»~&WDRLVO'KTL VDW?WWIPPS

SEQ ID NO. 7 DNA

UDP glicosiltransferase 76G1

Stevia rebaudiana

^vrrx“ A ‘X^ AA J^TOCO^rCCTCAA-C:

~* „ ^T — “''v A”'”''. ”* x*' ^T AiT^si^Jk^PTC^uA.QT⁵*^’^

'.—j. X .4. .4. ·—· ._, x e-ΐ .< 4. -x j. x .<. S„jr:>.vxè-à.x- .4. x x 'X·:‘.4C4-j x x x .1 .i. '-4>J^'5->4-íL_i

SEQ ID NO. 8

Aminoácido

UPD girosiltransferase 76G1

Stevia rebaudiana í/3 Ui

ΜΕΗΚΤΕΤίνΚδΚΕΙΙΙΙΕΚΡνΡΡ^ΗΣ^ΡΣ^Ι^νΐίΎδΚδ^ΙΤΙΡΉΤ^ΡίίΚΡΟΕΝΪΡΗΡΓ^Κ RXLíUÍí}I}^:.Í?^U'àSíi..X AJ.. A li'' 1 y'·?..‘.. j.. :. 1 £

FAQSVimSÍJSLI®LVlWSSLF^FHAirVSLPQFDSLG¥WPWKTRLEEQaSGFP^LK.VKDIK ΑΥδΝϊί^ΙΙίΚΕΙΙ^ϊ^ΙΚςΤΠΪΑΕΕΟνΣ^ΝδΡΚΕ^ΕΕδΕΣ^Σνί^ΕΙΡΑΡΕΕΙΊΡ^ΡΚΗΙίΤ^δδ

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 96/155

95/114

LU>HBRTVTQWLDQQÍPSSlTinWGSTSE\T>£KBFlFlARGLV©SKQS FLVWIÍPGFVKGSTW ATPL?SGELGESGRB'K^ATQQEA’LASGAIGAIA^^:TSSG^'N&TLES¥C.E.GVE’i£í FSDFGLSQm? ASYXiSDVLK’i^GWLEKG^ERGEIA^AlEEA’MVDEEGEYIEQXAS^TKQKABVSL&IKGGSSEESL E.SLVS11 SSL

SEQ ID NO. 9

DNA

Transportador ABC ABCG2

Humano

ATGTC’ATCATCAAATGTTGAACTTTTTATTCCTGTTTCACAAGGAAATACTAATGGATFTeCTG CTACTGCTTC AAATGA'TTTGAAAGCTITIACTGAAGGAGGTGTTITGTC ATTTCAT AATÂTTTG CTATAGÀGTTAAATTGÀAATGAGGÂTTTTTGeCTTCCAGAAAACCTGTTGAAAAAGÂÀATTTTC TGÀAATÁTTAATCGAATTATCAAAGGTGGATTGAATGCTArrTIGGGACCTACTGGAGGAGGAA XATCATCATrCTTGGATGTTTTGGCTGCTAGAAAAGATCiCTTGAGGATTGTCAGGÀCATGTTTT GÀTrAATGGAGCTüCTACACCTGCTAATmAAATGCAATTCAGGATATGTrGTTCAAGATGAT CTTGTTATGGGAACTTTGACTGTTAGAGAÀAATTTGCAATTrECAGCTGCTTTGAGATTGGCJA CTACTATCACTAATCATQAAAAÂAATGÀAAGAATTAATAGAGTTATTGAAGAATTGGGATTGGA TAAAGTTGCTGATTCAAAAGTTG-GAACTCAATTTArTAGAGGAGTTTCAGGAGGAGAAAGAAAA ACAACTrCAATTGGAATGGÁATTCATTACTGATCGTTCÀATTTTGTTTTTGGATGAACCTAGTA CTGGAETGQATICATCAAeTGCTAATQ£:TGTTTTGTTGTTGTTGAÁAAGAÀTGTeAAAACAACG AAGAACTATTATTTTTTC^ATTCATÜAACCTAGATÀTTCÀATTrTTÀÀATTGTTTGAITCATTG A€TFTGTTGG€TTCAGGAACATTGATGTTTCATGGAC'CT€€TCAAGAAGCTTTGGGATATTTTG ÀATCAGCTGGATATC:ATTG-CGÀAG€'TTATAATAATCC-TGCTQATTTTTTETTGGATA.TTATTAÀ. TGGAGÀFT€ÀA€TGCTGTTGCTTTG4ATAQAGAAGÀÀQATTTTAAACCTACTGÀAATrATTGAA CGTTCAAÀACAAGATAAACCTITQATTGAÀAAAETGGCTGAAATTIATGTTAÁUCAECATTTT ATAAÀGAAA€:TAAAGCTGAATTG€ATCAATTGTCAGGA©GAGAAAÀAAAAÀÀAAAAATTACTGT TmAAÀGÁAATTTCATÀTACTACTTCATnTGCGATCAATTGAGATGGGTTTCÀAÀAAGATCA TTTÂAAÂÁTTTGTTGGGÂAATCCTCAAGCTTCAATTGCTCAAATTATTGTTACTGTTGTTTTGG GATTGGTTATTC^AGCTATITATTTTGGATTGAiÀAATGATTC.AÀCTGGAATTCAÀAÀTAGACC TC^AGTETTGTTITTTrrGACTACTÀATCAATCCTFITCÀTCAGTTTCAGCTGTTGAATTGTrT GTTGTTGAAAAAAAATTGTTrATTCATGAATATATTTCÀGGATATTATAGAGTTTCATCATATT TTTTGGGAAÀATTGTTGTCÀGATTTGTr<XCTATGAGÁATGTTGC-CTTCÂATTATITTTAeiTG CATTGITTAITTTATGTTGGGATTGAAAGCTAAAGCTGATCCTTTTTTTGTTATGATGTTTACT TTGATGATGGTTG€TTATTCAGCTTCATCAATGGCTTTGG€TATTGCTG€TGGA€AATCAG-TTG TirCAGTIGCTACTITGTTGATCÀCTÀTTrGCTrTGTTTTTATCÀTGATTTTTTCAGGATTGTT <X?TTAATTTGACTACTATTG€Tr€ÀIGGTTCTCATGCTTCCAATÀTTrTTCAATTC-CTAGATAT GGATrTACTGCTTTGCAACATAATGAÀTrrTTGGGACAAAATTTTTGCCCTGGATTGAATGCTA CTGGAAATAATCeTTGCAATTATGCTACTTGC-ACTGGAGAAGAATÀTTTGGTTAAACÀÂGGAAT TGATTrGFCAeCTTGGGGÀTTGTGGÀAAAATCÀTGTTGCTTTGGCTTGCATGATTGTTÀTTTrr TTGAGTATrGeTTATFTGAÀATTGTTGTTTTT&AAAAÀATATTCA

SEQ ID NO. 10

Aminoácido

Transportador ABC ABCG2

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 97/155

96/114

Humano

M&SS3SVEVR Ci¥RVKI^SCFLM.'KKPVEKlI L

SKJNGatKFeLWAI LGFTCGGK.$.SLLm^AÂgX»FS.GLSGma*ING.«»LA?ÍTKCNSQTO'Q»D ®?0ΤΣ_ίΤνΚ3Ν12Ρ3ΑΑΙ_}ΧΙΑ.ΤΜΤΜΙΕΟΕΕΙ?^νΐ2ΕΣ.01_!ΠΟΑβ5θαΤ2:ΡΣΡ0Χ’·5α0ΕΚΚ ^Ζ8ΤΟΜΒΙ>ι·ΤΏΡΞΙ^ΡΣ.ΟΕ?ΤΤΟ^58Τ&Ν£ν^ΙΑ_!ΚΚΜδΚ'·;'·'’'··^,···^Γ ’ ”~2HQPOSIFKLFDSL TXJ'A.SGRIJi?FRGPÃQEAX>G¥FES^YHCKAYN??PADFFX_íDI ’ χχ” 'AUHSgSSFOTSIIg PSKQDKPLX EEIAglYWSSFYKS^ASTíR^LSGGEKKKKI. rv TTSFCRQLKWSKSS FOLLG^PQASIAQIlVTWLG^IGÂIYroLKNDSTGXQNRAGVLFFLTT^CFSgVGÃVELF WEKKLF XHE¥I SG¥¥WSS¥ΕΙ^Κ&Ε8ΕΜ.·ΕΜΡ.ΜΙ_ίΡ£ 11 FTC XVTFHLGLOKADAFFVW4FT Χ^ν_ίΑΥ3Α35ΚΑ1Α1».02δ·νν5νΑΤ^1«ΙΟΡνΜ4Ι^5ΟΙίΙ_ίν3ϊΣ>_!ΤΧΙΑ8^1_!5^Χ42'ϊ%··5JPRY GFTALQI® EFLSQ^FCPGLSATGraPC^YATCTGEK'Sb VKQGIDAS WGAWCTHVAL&raiVX F ΙΖΓΙΑΥΑΚΑΙιΈΕΚΟΕ

SEQ ID NO. 11

DNA

Semelhante a MYB12

Cannabis λ -_ '-. -i . ~ u. -_-L·..· x ,-,' j ,.ΐχΑ.; AA j. Α.-4ί4ΆΑΑ.-±Ι1·'..Α^·/χ.31.χ5 : ?<?: x jí<j-l c, ,>ΐ. x ô, ^!...?iJ-\:'-LJ-^k' ./ J

ACÃTOSTÃTCATCATCAT·: x x'x .CAACÃACATCATCAACAA.CTACASCAACATCATÜATT

όΛΑδ&δΛΛ«ν'χ%Α.¥7>Α Ax'*· ΓΤ SAACTTrAÃTAÃTAATAATAATAÂTÃATAAÍ^AÃA ATGGTSM'UAA·' XX ’ ΎΑ Λ ΤΑ ATTATCATCATCA.TAÃAOAAOAGGAÂGAAQAAGAA-Í3A AG.A^^TGAÃQCATCTGCATCAOTAGCAGCTGTTOATGÃA.GGGATGTTOTTOTGCTTTGATGA.C âTAATÃGATAGC^^TG^AAÃTaC&AATG&GGTTTTGàCTTTA^SÃGÂÍ^ATAGGSAiaATG .·.Xa^3$a^yx..A'.J'.. j.xy.A.L'GAt&A.3. .\.ik'¹. .t,' ;.'·.yL Λ/Λ. .<'A'·.. :^:. A.·. ./ A'x. ;.ΑΑ..ΐ'*·όΑ.

TGA.*3?'XA'i.'AACAA.’iAA’C^ei’T^lGA?^GA^3-'3^TGA.$JOTGí-2-AATAA‘rAAC^33JíAGÂ^,.rT^tA1[‘ü'’i^rrÂT^prAGTGAT^t QÃTCÃTGAIGATCAGTAeTCGATAQA0GACGTa3Tr®lAGTIG.ACTTTTaSÃGTIGGGA^GTT xAíAk. I. .·'//.. à .4-.. i <ic i.;. £s. i j./. x.á-xAt-iAii-s.CA/jTAA./yí/Lí-i TATGTGG^TAATG&GÂÃ&GASAAÃereTTGTCTFTGCTAimSATMTAGTGATAACAGCÃGC AGTTGGSAGTTAOAÃSÃTÂÃAAOCAATAATAATAATAÃTAA.TAÂTGTTCCTAACAÃATG^^AÃ.O AGATTACCTCTSATAAAOÃAAATGCTATG^PTGCATGGCTTCTCTCCTGA

SEQ ID NO. 12

Aminoácido

MYB12

Cannabis

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 98/155

97/114

MONKSTS J®8N8SffiI I ®)I VS SSSSTTTTSSTTTATSSWNSKVTVSTDHI SlifLSDKQKR ξ5ΕΟΕϋδΑΕΚΕΕΕΕΕδ®0α€ΟΕΤ»»Εβ5¥®ΡΑΑΑΖΑΑΑΑΟΏ835σβΕϋΚΕί3βΗΣ1ΟΕΖΑΕΟΟ3Ε KK.TTEISSVWFM^WNKTS-SNGDSVSGPYn^H^EEEEEEEEDEASASVAAVDgGXLLCFDD IlDSBI_iLNF^EVLTLRED5®iECK2AADQIDKTTCIWTTTSÍDDWffiM^L3C^NNGS¥¥ISD SW.DqWIDD^SVDFWS?íE£STrTVITQEQEQgQSQ¥QEqK53WDNEKEKLLSLL5iOíSM£S S WSLQDKS KIMW PWXQE ITS DKEX^MV.WLLS

SEQ ID NO. 13

DNA

Catalase

Arabidopsis thaliana

ATGGATCGTTATAAATATAGAGCTGCTTCATCATATAATIGACCTTTTTTTACTACTAATTCAG

GAGCTC-CTGTTTGGAATAAIAATTCATCAATGAXTGTTGGACCT.AGAGG.ATTGATTTTDTTGGÂ AGATTATCAnTGGTTGAÂAAATTGGCTAATmGATAGAGAAAGAATTtXTGAAAGAGTrGTT CA.TGCTA.GAGGAÍj<'TICAÍj<TAAAGGÁTrTTTIGAÂGTTACTÜATtjATÀTTTeAAÀTrTGACTr GCX^CTGATTTTTTGAGAGCKX'TGGAGTK'AAACTCCTGTTATTGTTAGATITTCAACTGTTAT TCATGCTAGAGfâATCACCTGAAAdTTGAGAGATCCTACi.AGGATTTGCTGTT.AAATTTTATACT AGAGAÁ<K<A4.4TTTTGATTIGGTTGGÀAAIAATTTTCCTGrTTTTTTTAITÁGA.GATGGAATGA AAITTGGTGATATTGTrCATGCTTTGAAACCTAATCCrAAATCACATATTCAAGAAAATTGeAG AAiTTTTGGATTTrTTTrC^:A.CATCATCCTGAATCATrGAATATGTTIA.CTTTTTrGTTTGÂTGÀT ATrGG.AATTCCrCÀA.GATTATÀGÁCATATGGATGGATC^;AGGArTT'AATACTTATATGTTGÀ,TTA ATAAAGCTGGxAAAAGCTCATTATGTTÂAATnüATIGGÂÀA I ^CTTGCGGAGTTA.AATCATT GTTGGAÀGÂAGATGCTATTAGATrGGGAQGAACTAATCATR K *TGCTACTCÀAGATTTGTAT GATT0AÂTTGCTGeTGGAAA-TTATC:'CTGAATGGÁÂA.TTGTTT^77s..AAATTA.TTGATC’CTGCTG

ÀIGÀAGATAA^TTreATmGATCC^^TGGATGTTÂCTAAAACTTGGCCTGÁAGATATTTTGCO

TTTGCAAiXTGTTeGAÂGAATGGTrTTGAATAAAAATATTGATAATTTTTTTGCrGÀAAATÍjAA

CAÁTFGGCITrrrGCCCIGCTATTAITGTTCCTGGAATrCAITATTC^JATGÁTAÀATTGTTGC AAACTAGAGTTmTCATATGCTGATACTCAAÂGACATAGÀTrGGGACCrAATTATTTGCAATT GGCTSTTAATGCiTCeTAAABSCGCTCATCATAAIAÁTCATCATGAAGGATTTATGAATTTTATG CATAGAGATGAAGAAGTTAATTATTITCCTTCAAGÂTATGATCAAGTTAGACATGCTCAAÁAAT ATCCT.ACTCC-TÜCTGCTGTTTGCTCAGGAAAAAGAGAAAGATGU.ATTATTGAAAAAG.AAAATAA TTTTAÀAGAAOCTGGAGAÂAGATATAGAACTTTTACTCGTGAAAGACAAGAAAGATTTATTCAA AGATGG.ATTGATGCTTTGTCÀGATCCTÀGAATTACTCATGÀAÀTTÂGATCAÁTTTGGATTTCAT ATrGGTCACAAGCTGÃTÀAATCATTGGGACAAAAATTGGGTTCAÀGATTGAATGTTAGACCTTC

AATT

SEQ ID NO. 14

Aminoácido Catalase Arabidopsis thaiiana

WPY£YRPASS¥NSFFFTT^GAPVWISr>^SSMTVGPRGLILLED¥HLVEKLÂNFDRERIFERVV

HARGASÁKGFFE¥THD1:^LTCADFIJLAPGVQTPVIVEP5TVIHARGSPETLRDPRGFAV£FYT PEGN1^)LVGJ^^PVFHRDG^^PDIVHALKPI^SHIQENWRILDFFSHHPES:LNMFTFLEDD ICSPQDYRH^lDG^VNTll^INi^GKAHYVS^JKPTCGW^I^DÀIRLGGI^SHATQDLY DSIAAGK¥PEWLFIQS3PADEDKFDFDFLD^TRTWPESILFLQFVGWVLKENmNFFAENE QLAFCPAn\Ti^HySDDKI±QT^WS¥ADTQRHkLGPN\TQIJ^>WÂPKCAHHN^,NHHEGíMNE^í HKDEE\n^?SRYDQWHAEK¥PIPPA¥CSGKREPCIIEKENNFKEPGEE¥RTFTPERQERFlQ O®.ÂI5D?TtnHSRSIV®WSQADKSL<3QKLASI^2WRP^

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 99/155

98/114

SEQ ID NO. 15

DNA

Catalase HPII (KatE)

Escherichia coli

ATGTCGCAA£ATAAC?GAAAAGAA€CCACATCAGCACCAG^;TGACCA£;TACACGATTCCAG€GAAG OGAAACCGGGGATGGACTCACTGGCACXTGAGGACGGCTCICxATCGTÍXAGÜGGCTGAACCAAG ACCGCCAGGIGCACAACCTACCGCÜCCÂGGGAGCCTGAAAGCCCCIGATACGCGTAACGAAAAA <^AATTCTCTGGÁAGACGTACGCAAAGÜCAGIGAAAÁTTAIGCGCTGAC€ACTAAirAGGGCG TGCGCATCGCCGACGÀTCAÀAAÜTCACT<KGIGCÜGGTAG<XGIGGTCCAACGCTG€TGGAAGA TTTTAIT€?KK,GKGAGAAA^TÜA£mACITTGACCATGAGCGCATraXÍGAA?CGTAITGTTCAT GCACGCGGATCAGCTKSIAGGGTTATrrCCAÍKX^TATAAAÁGGTLAA&CGATÁrrAOCAAÁG CGGÃTnCCTGTCÂGAKWAACAAAÁT€ACCCCAGTA.TTTGTÀCGTnCTCTÃ<’CGTTCA.GGG TGGTGCTGGCTCTSTOATACWTGCGlGATATCCGTC^TrTGCCACC.AA&ITCTATÁCGGÁA GAGGGTAIITrTGACCTÜGTFGGCAATAACACGCCAATüTTCTTTA.TCCAGGÀTGCGCÃTAAAT TCCCCGATTTTGTTCATGCGGTAAAACCAGAACCGCACTGGGCAATTCCACAAGGGCAAAGTGC CCACGATAC’TTK’TGGGAITATGTTTC'TCTGCAACCTGA.AACTCTGCACAACGTGATGTGGGCG AWTüGGATCXSCGGCÀTCCCCCGCAGTTACCGCACCATWAAGGCTTCGGTATTCACÀCCTreC GCÜTGATTAAIGCCGAAGGGÀÀGGCAACGTTTGTACXàTTTCCÀCTGGÀAAÜCACTGGÜÂGGrAA AGCCTCACICGTTTGGGATGAAQCAOAAAAÀGTCACüíMACGTGÀCCCGGAeTTOCACCGCCGC GAGTrGTGGGAAGCCATTGÂAGCAGGCGATTTTCCGGAATÀCGAACTOGOCTTCCAGTTGÁTTC CTGAAGAAGATGAATTGAAGTTCGÁÜTTCGATCTrCTCGATCÜAACCAAACTTATCCCGGAAGA ACTGGTGC C < GTTCAGCGIGTCGGCAAAATGGTGCTCAAlGGCAACCOsGATAAGTTCTTTGCT GAAAACGÀACAGtKX^CTITCCAI^CTGíX^ATATeGTGCCGGGACTGGACrirACCAACGATC CGCTGTTGCAGGGÀCGITrGTTCXCCTATACCGATACACAAÁTCAGTCGTCrrGGTGGGCüGAA TTT(XAIGAGATTWGÀ1TA€CGTÍXX1ACCTGCCCTTACCATAATTWCAGCGTGACGGCAIG CATCG£AT©CKX3AKGACACTAACCCGGCGAÂTTA£OAÂCCGAAOCGAITAACGATÂÂCTGGC CGCÈXíGAÂACAaGCCOG^XGAAACGCGGaXSITITGAATCATÁCÜÁGGAGCGCGTGGAÀGG CÂATAAÀGTD:GCGAGCGQAC<mATCGITTGG£GAATATTATTOXATCCGCGTCrGTTCTGG CTAAGTCAGACGC^AmGAGCAGCGCCATATFGTaSAT^iTITCAGTTTTGÀGTTAAGCAAAG TCGTTCGTCCOTATÂTTCGIWlGCGCGTmTTGACCAGCTGGCGCATATTGATCTCACTÜTGGC CCAGC<GGTGGCGAAAAATCT€GGTAT€OAACTGACTGACGACCAGCTGAATATCACCCCACCT CCGGADGTCAACmTCTGAAAAAGGÂTCCATCCTTÀAGTrTGTÁCGCÜÂTTCCIGAC<^rGATG TGAÂAGGTCGCGIGGTAGCGATmA€TTAATOAIGAAGTGAQATCG(XÁGACCTrCTGGCCAT TCTCAAGGCGCTGAÁGGCCAAAGGCGITCATGCCAÀACTGCTCTACTCCCGAATGGGTGAÂGTG ACTGCGGATGÁÜGGTAaKsT&TTGCCTATAGCCG^AC^TTTGCCGGTGCACCTTCGCTGACGG TCGATGCGGT€ATTGHXCnGCGGCAATAiaK<K^TATCGCTGAGAACGC^GATGCCAACTA CTAGCTGATGGAAGCCTAGAAACACCirAAACCGAnGCGÍTGGCGGGTGACGCGCGCiAÂGTrF AAÀGCÀACÁAKíAAGAKÍGC^GACCAGGGTGÁAGAAGGGATrGTGGÀAGCTGACAGCGCTGACG GTAGTmATGGATGAAGTGCXAACGCTGATGGCAGCACACCGCG'TGTGGTCACGCArKiCTAA QAITGÀCAAAATTCCTGCCTCA

SEQ ID NO. 16

Aminoácido

Catalase HPII (KatE)

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 100/155

99/114

Escherichia coli

MSt^^KJTPHQHQSPLHDSSEASOOsLAPEDGSERPAAEPIPPGAQPTAPGSIKAPDIENEK

L^LED\7i:<GSENWlTWG^AADDQNSLFAGSRGFIlAEDFIL^3aTHFDHERI PEFSVH

ARGSAAKGITQP¥KSLSDnÈáDn.SDI^ÍKI TPVFVRS^WQGGAGSÂDTVSDtR^AlKFYTE

BGI EDLVGISkSiTPÍEFIQDAHKFEDP^HAV^SFEPHWAI ^PQGQSÁHDTFWWSLQPEIEHISiVWiA ^3ΒΕΟΣΡΕ8¥ΑΤ?ίΕΟΕδΙΗΤΕΚ^ΣΚΑΕδΚΑΤΕνΕΕΗΚΚΡ1Αί3ΚΆδΕ»βΕΑ^ΚΙ_ίΤ355εΕη5ΉΚΚ EL^AIEAGDFFEYELGFQLjí PEEDEEKTOFDIIDPTKII PEEnWQEVGKWLNENFJWFA E^QAAFHPGH^GinFESDHAQCMLFSTEDTQI SRLGGFNFHEI P^PTCPYHNFQRDGM HWGWTNPANyEPNS INDN^TREIP?O^RG®ES¥QER¥EG^KVRERSPS FGEYY3HFRLFW LSQFPFEQSinVDGFSFELSKWPYIREWDQLAHmmAQAyÀKNLGI ELTDEQLNITPF

PDWGLKKDPSLWFAI FDGDAIÍGR.WAI WWEVRSADÍUU I^LKAKGVHAKLLYS^ÍGEV

ΤΑΒΒΟΤΛ·ΤΡ1Α4ΙΕΛΟΑΡ«ΕΏΤ3ΑΑΏΤ<«Μ4δΕ4ΒΝ€ΦΑ^ΈΜΑνΈ3Ξ..ΚΡΕ41Α£·;&.ΑΒΕΕ

KWKLWQGEEGnT.WS.W€4SI^fflELLTOlA4HRWSRIPKIBKI PA

SEQ ID NO. 17

DNA

CBDA sintase alvo de tricoma

Cannabis

AZGAAGTCXTCA4CATTCT<.GTTrTGCTETrTrEGCAAGATAATATTTTTriTrTTCTCATTCA ATATC€AÁACTT<XAITG£TAAT’ x E< vAl-AAAU.TK:CTTAA4TKTT<T<«AATÀTATTCC C AATAATGCAACAAATCTAAAAf T<' r T IT VJÂCTCAAAAC AACCXLATTGTATATGTCrGTCCTA .A4ITC&À£XATACACX4TClTAGArrCAvLICBMCACAACiCXXÁAÀACCACTTGTTATCGTCA CTCCTTCÀCATGTeTC:TCATATCCA4GGCÀC:TATICTATGC:TCCAí&AAAGTIGGCTTG€AGAT TCCAÂCTCCAAGTCGTGGTCATGATTCTGÁCGGCÂTGTCGTÂCATÀTCTCAÀCTCCCATrrGTT ATACTAGA£TFGACAA^AFG€<?mAAICAAAAIAGATC^CATÀC«CAA^TGCATGGGTrG A^GC€GGAG€TACCCTTGGAGA«;iTTArTATrGGGTTAWG4QAAAAiT€4AGAATCTTAGTTr· C<XWCTGGGTATTÍXCCTA€TGTTT€XC«A<X;T<XACACTITGGTGGAGCAGGCTATGGACCA TTGAT&À<xAAACTATCAX:<TCGC:GGCTGATAATATCATTGATGCA<ACTTAGTCAiCGTTCÁTG GAAAACTGCTÀGATCXÍ^AAAATCTATGGGGGAAGATCTCTTTTGGGCTTTACGTGGTGGTGCAGC AGAAACá. TTCGG AATi-ATTGTA^.A Ai GGAAA\TTAGAC 1 GGTTí.A TGTCC C AAAGT1..TAC T ATG TITAGTGIIAAAAAGATCATG^GAEAGATGACXTTGTCAAGTTAGTTAACAAÂTGGCAÀÂAIA TrGCrTA€AAGTAIGACAA4GATITA‘nACTCATGACI€ACTrCATAACTAGGA4CAITACAGÀ TAATCAAGGGAAGAATAAGALxAGCAATàCãCACTEàCTTCTCTTCàGTTTTCG-TTGGTGGAGEG gatAGECTAgT C GAC11GATGAACAáGAG.1 i i i C C i GAG1 iGGGT Ai ÍÁAAAAAACGGAí ígcà GA€’AATTGAGC:TGGATIGÀTACTATCATCTT€TAEAGTGGTGTEGTAAATEA€’GAeAeTGATAA TTTTAACAAGGAAAITrTG€TTGATA« AK t GCTGGGC AGAaCG€TG£TTTCAAGATTA4GTTA GACTÀCGTTAAG AAACCAATTCGAG LATÍ TCTÀTITGTC C .4.A«TnGGAÀAAATTATATGAAG AAGATATAGGAGCTGGGATGTATGC oTTGT ACCCTTAC GGT<5GTATAAIX^TGAGATrTCAGA AICAGCXATT£rATI£<£T£ATCGAG£TGGAATCTFGTATGAGTTATGGTACATATGTAGTrGG GAGAAGCAAGAAGATAACGAAAAGEAECTÁÀAtTGGATTAGAAAIAETTATA^CTICATGACTC CTIAEGEGTGCÀAAAÀTCCAAGATIGGCAIATCTCAATrATAGAGACCTEGArATAGGAAIAÂA TGATCCC4AGAAI€CAAATAATrAC4C^4A£X?ACGTATn:GGi^a4G4AGTATrTTGGTAAA AATnTGACAGGCEAGTAAAÁGTG.WLiC€XT€«Tm<TCCCAATAA£TnTnAGAAACGA.AC AAA<^ATCWACCrCTACCA<XSGC4TCGT€ÀTrAA

SEQ ID NO. 18

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 101/155

100/114

Aminoácido

CBDA sintase alvo de tricoma

Cannabis

MKCSTFSWFVCKH HTFSFMQTS IAIWENFLKCFSQY1Í ^sn^TRFIBSTI?KP»T^TPSm^HIQCÍTIL<^KkTGLQníIIÍS-GCvHBSEGMm SQVPFV

U DL W1RS liSDVHSQTAm-’EAGATLGEVn T\T>EK^^lJEAAGYCFn’CAGGSFGGGGl’GP

LM^YC^A^iroAHL.Vm’SGSCV’lDKKSStiGEDLnVAI^OGGAE^GlIvAwKlSLVAX.’l^lM ^ΈΚίΆΜΗΕΕΛΊα:Λ?ΰ£^?^Ί^)ΚΒΕΕΕΧίΤΗΗ:Τ^ΙΤΏ^0ΟΚΝΚΓΑΒΤΐΡ^ΎΈΙΧΧ^· D^IODÈKSimO KKTDOQLSWIDIII FSSC^TWDIIWNKH UDRSACQNGÁFSKL

DYVK13»!.SESVEVQl EEEZYEEIMGAGM^'AIYPY-GGBWEI. SESAl PTTEKAGI LYEOfYlCSW

EKQED^lOlI^lE^TCÍFMIPlYSK^lU_íAlXNY^DLDT<^l>l^f^lTQAI3WGEK.¥EGl£

NFDRL’fc’KVKTLWFJiNFfE^QS Ϊ FHPRHRH

SEQ ID NO. 19

DNA

Glicosiltransterase 76G1 de UDP alvo de tricoma

Stevia rebaudiana

ATGAÂGTGGTCAACATTCTCCTTTFGGTTTGTTrGCAA.&ATAATAFTrTFCTFTTTCTCA.TTCA ATAKCAAACTTCCATTGCTAÍTCGTCGAGAAAATAAAACTGAÀACTACTGETAGAáGAAGAáG AAGAÂITATrriGTTTGCTGTTCCTTTTCAAGGACATATTAATCriÀTTTTGCAATTCGCTAAT GTTTTCTATTC:AAAAGGÀTTTTCAATTACTÁTTTTTCATA€TAArrTTAATAAACCTAAÀ£:TT CAÀATTATCGTCATTTTACTrFIÀGATTIATTrrGGATAATGATCCTCAAGATGÀÂAGAÀTTTC AAATTPGCCTACTCATGGACGTFTGGCTGQAATGAGAATTCCTATTATrAATGAACATGGAGCT GATGAATTGAGAAC^GAATTGGÂÀTTGTTGATGrTGGCTTCAGAAGAAGATGAAGAAGT-rTCAT GCTTGATTAC'TGATGC'TTTGTGGTATTTTGCTCAATCAGTTGCTGATTCAnGAATTTGAGAAG ATTGGTTrTGATGACTTC.:ÀTCA.TTGTTTAATTTTCAT&CTOATGTTT£ATTGCCTCAATTTGAT GAATTGGGATATTTGGATCCTGATGATAAAACTAGATTGCLAAGAACAAGCTTCAGGATTTCCTA TGTTGAÀAGTT.4AAGATATTAÀÀTCAGClTATTeAAATrGGCÀÀATTTTGlÀ.AGAAATTTrGGG .AAAAATCxATTAAACAAACTAGACXTTCATCAGGAGTTATTTGGAATTCATTTAAAGAATTGGAA GxAATCAGAÂTTGGAAACTGTTATTxAGAGÂÂÂTTCCTGCTCCTTCArTTETGATTCCTTTGCCTxA ÀÂCATTTGACTGCTTCATCATCATCATTGTTGGATCATGATAGAACTGTTrTTCAATCGTTQGA TCAACAACCTGCTTCATCAGTm’GTATGTTTCATTTCGATCAACTTCAGAAGTTGATGAAAAA GATTTTTTGGAAATrGCTACAGGATTGGTTGATTCAAAACAATCATTTTTCTGGGTTGTrAGAC CTGGATTTGTTÀAAGGATCAACTIGOGTTGAACCTrTGCCTGATGGATTTTTGGGAGAAÂGAGG AAGAATTGTTAAAT<X^TrCCTCAACAAGAAGTTTTGGOTCATGGAGOTATTCGÀGCTrTTTG€ ACTCATT€AGGÀTGGAATrCAACTTTGGÀATCAGTTTGCGAA€GAGTTC€TATGATinTrCAG ATTTlWATTC^ATCAAC^lTTGAÁTGCTAGÀTATÀTGTCAGATGTTTTGAAAGTTGGAGTrTA TTTGGAAAATGGATCGGAÀAGAGGAGA4ATTGCTÀATGCTATTAGAÀGAGTTATGGTTGATGAA GÀÀ<X^GAATÀEÀ1TAGÀCAAAATCCTAGÂGTrTTGAAÀCAAÁÁAG€TGÀTGTTTCAITC.ÀTCA AAGGAGGATCATCATATGAATCATTGGAATCATFGGnTCATATATTTCATCATTGTÀA

SEQ ID NO. 20

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 102/155

101/114

Aminoácido

Glicosiltransferase 76G1 de UDP alvo de tricoma

Stevia rebaudiana ataCCSrF&nrn’CKl I FFFF&FNI QTS LV^I^NKTETTt^ERRRI IISSVFFQGHEOTLQLAX VL.YS3Í.GFS ΪΓΙ ΓΗΤ5Ϊ?5Κ5ΚΤ§?Π·>ΗΤΓΙ3ΪΚ LDND'P'QDEEI SM^THGJLAGa.fRl PII2ÍEHG4 DELKFELE^MLASEEBEEVSCIJ TBÁLWlTÂQSV.W^SsllH&yiàn^LlSíyHAHV.SLÍQFI» ELGyLDPSDKTELEEQASGFPMLKVXDI KSAYSWQl LKEXLGKàSKQFRASSCTI WsFKELE ESELEIV3RS. FÀFSFLI FLPKHLTASgSSLWHDE’nTQV.T.BQQPPS&^TA^'SFGSTSEWEK DfLE XÀKGLVSS l^TLWyn®GFVKSSTm-Z PO&GFLGEEGRI naVVS^EWiBGAlGAW TH^GW^TLESVCEGWMI FSDFGLBQFLNARy^XSmyK^XíVVTE^CTORGEIASAERR^^Iffi ECSYW^ÀSVLKQSG^ySlAiKGC^SYESLE.gLVSYI ísSL

SEQ ID NO. 21

DNA

PM-UTR1

Arabidopsis thaliana

AT<^GGTCCATG<^COGGáTIC'CGT€GÂÃTrCKiTT&TIWCGTrGTGTAICTCCGGG^TCT CtGTQGGC-CTACA λ C TA..CCAAGCtL GTTC T ^CAAgAGACTÜTGjTÜGACájAáCAGâTTTGGTCXAGà TGAGAAGACrGT.S.CGAGC..ATC. TTGC-.ATTCTTGAAL-TTaGC-TLjAAAGTljTAGTL.TGC- ZTGAZCTGCf TCTTÂTATÀATGAJTCAAGC^CTOGTCAÂAI^T<KyTAAC'<XjTGGA<^A€'CÂTGGTGGACGTATT G*jAL? TGl ACCX. ATTACT A AT ALAATTGGTCCTGCCATí^GGAATTGAâGLCTTGAAGTATà à LAG TTATC CAGCTC AGGTTTí^jGCAàAATCGTCAAAAt.TGâTílA AGT í. ATGCTA4TGGGAAC TTTA GTTTÂCGí^ÁATA4GÀTÀCACTirTCCCTGAAT.Á-CATGTG€AC'C'TTTCTrGTCGCTGíGÀGGAGTAT CLATLTTTCSL-TCTTVTTàAGALAâGL -^CTÀAGÂC-AATà AGC.AA.GCrr.AGC-ALArL<GAAATGGTW C -CTL GGTTÀCGG ACTTTG TTCCTTAÀAC L TCGC -OTTTG AÜGGATTC .ÀCAAÀTGCCAC AC. AAG AC TCiCATTCA GTCâAGG^:T.áCCCAAAuAàLCGAà.CX GTGi^G.AC’ATAATCA '1 LjGiAAATGAALTZ’ATCXrG GC âL-AATATACAALvATTATCTAC.aA.í.GTTTGGC?TTGC.Cà,CAÂ'GGGATGGAT^:TOGAãGCAâ.TTÜAG TiCTCAAAGXTAC,4GcCGGAAGCGGCATgC-OAC ATTCTAAAGTATTGTàTATGCájGTGCCgTC-G GALjAàAAGTTCATC· TTCATG. AC AÀ.TAAGT AALT’TCGGGS CACTAGCTAAC ACGAC C ATAAL C AC: GÂCCAGGAAGTTTGITÀGCATrGTreTATCATÜAGTAAIGAGGGGAAATGCATrGTCGTTGAAG CAATGGGCCATGTGTTTCGAICTGTGTlTC^TGGTrrGGC'ATAIX'AAATTTATCTTAAATGGAACvA AATTGCA&AG.ÁGTGG.ÁGTGCTCCÀ.TAArG.AACTTAATGTGTGGGTLTACCTGCGCLGJT.$ CA.

SEQ ID NO. 22

DNA

CBDA citostólico sintase (cytCBDAs)

Cannabis sativa

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 103/155

102/114

ATGÀATWICGAGÂAÃÂCTTWTTÂÂÁIGCTTCTCGCAATATATTGCCAÁTAÂTGCÂACAAATC

TÂÁÂÂCTaJTATÂCárTCÂÂÂÂCÂACCrATIGTATATGTCTGTCGTÂÂÂTrCGACÀÂTâCACAA TCTTAGÁTTCAttTCTGACÁÜAACCCCAAAACCACFrGTTATCGTCACTWriCACATGT£TCT CATAKC^AGGEACTÂTTCTATGCTGCAÁGÀAÁGTTGGCTTGCAGATrCGAÂCrCGAAGTGGTG GTCÀTGATTCTGAGGGCATGTCCTÂCATATCrCAAGTCCCATTTGTTATÂGTAGACTrGÃGAAÃ CÀTGvGITCÂAIÇAââATAGAT&TKATAGCCâáACTGCATGGGTTGAAGGCGGAGCTÂCCCTT GGAGAAGTnATTATTGGGTTAATGAGAAAAATGAGAATCTTAGTTrG^GCOGGGTATTGGC:

CTACTGTTTGCGCAGGTGGACACTFTSGTGGÂGGAGGCTATGGACCATTGÂTGAGÂÀACTATGG CE^SGGeiSATAÀTATCÁTrGATGCÀCAGTTÂGTCiÀACGTTGÃTGGAÂAAGTGCTAGATCGÀ AÂATCFAlGGGGG-AAGÂTCrCTTTTGGGCTTTACGTGGTGGTGGAGCAGÂÀAGCITCGGÂATCÀ HGTAGCATGG^AAATTAGACTGGTTGCTGTCCCAAAGI€TACTATGTTTAGTGTTAAAAAGAT CATGGAGATÂCÂTGAGCnGTCAÂGTTAGTTÀACAÂATGGGAÂAÂTATTGCTTÂCAÂGTATGAC .AAAGATTTATTÀCTCATGACTCâCrTGATÃACTAGGAACÁTTACAGATAATCAAGGGAAGAATA AGÃCAGCÃÃTACACAClTACTFCrClTCAGTTTrcCTTGGTGGAGlGGATAGTCTÃGTCGACrr GATOAACAAGAGTTrTCCTGAGTTGGGFATrAAAAAAACGGATTGCAGACAATTGAGCTGGATT GATÀCEÀTCATCTTCTATÂGTGGTGTTGTAAATTACGACACTGATAATnTÂACÂAGGÂAATTT· TGCTTGATÂGATCC^TG^XAGAACGGTCXmTCÂÁGÂTTAAGTTÂGACTACGTTAÂGAAÂCC AAT^CAGÂATCTGTATTrGTCCAAAITTTGGAAAAATTATATGÁAGAAGATATAGGÂGCTGGG ATGTATGCGTT&TACCCTTACGGIGGTÂTAATGGÁTGAGATTTCAGÂATCAGCAÂTTCCATTCC

CICAIGGMKTOGÃATCTTGTATGAGTTATGGrÁCATATGTAGITGGGAGÁAGCAAGÀAGATAÀ CGAAAAGCATCTÀAAÍ^GÍ^TTA^AATAITrATAACTrCATGAGTCCTrÂTGimCCÂAAAAT CCAAGÂTTGGGATATCTCAÁTGATAGÂGACCTTGATATAGGAATAAATGATCCCAÂGAATCCÀÂ ATAATTACACACAAGCACGTATTTKAAÜTGAGAAGTArmWTAÂAAATATTGACA&ACTAGT AA4ÀGTGÁAÀACCCTGGTrGÂTCWAÀTÀÁCTITTTTAGÂÀACGÀÀCÁAAGCATCCCÁCCIürA CCACGGCATCGTCÁTTAÁ

SEQ ID NO. 23

Aminoácido

CBDA sintase citostólica (cytCBDAs) Cannabis sativa

HK^mLCSKKVC^Qa^SGGHDSEGMSY^QWFVITOI^^íSSaaDVHSQTAWVEÂGATL GEVTYWVNEKJSSNLSLAAGTCHVCAeGHFGGGGTGPLMSNyGLAADNI I dAHLVNVHGKVLDR KA^EDLFWALSGGGAESFGIIVÂWKISLVAYTXST^ffSVKKIMEIHELVKLVNK^QNIÁAXYD KmiMrHFn^^N^®^AJEm^^LGG\®aWU^SE^GIKKI3X?35QLSWI

DTS J ΡΑΈ-GWYDIDNFNKE xliDRSAGQNGAFXI KLDYVKKPI PESWVQS LEKL'¥m>lGAG

MTALlT¥G<HMEEISESAIPFPHR4GiL^WYICSU^QED?O2niTOIRNn?N^fIP¥VSKN

FWLlTNYFJ>mO^I>?KNTNN¥IK}ARWQ^T<^2rôm^’Kn.X^Sa®FHySsEQSim.

PRHRH

SEQ ID NO. 24 DNA

Glicosiltransferase 76G1 de UDP com alvo citostólico (cytUTG)

Stevia rebaudiana

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 104/155

103/114

ATGGAAAAT^AMXGAÀACGWCGTCCG^

I££AGGGCC£AI€ÂA€GWATI£TGCAACTG(X2GAA€GIGCTGTÀIITOAAÂGGTrTCAGCAT CAC£ATCTIWATAQjâACTI£AACAAGC€GÀAGACCAGCAATTACCCGCACTTTACGTTCCGT TTTATTCIWATAACGA£ro£CAGGAIGAACGQAI£I£TAATCIGCCGA£££ACGGCCCGCTGG GCKKHATGCGTATTWGATFÂTCAACXLAÀCACGGCGCAGÁIGAACTGCGTCGCGAACTGGAACT GCÍGÁTGCTGGCCAGCGAAGAAGATGAÀGAAGITTCnGCCTGATCACCaACGCACTGIGGTAT ITFGOXAGTCTGTIX^AGATAGKTGÀACGTGCGiaKXnGGTCGTGAIGAíXAGCAGWIGT TCAATTITCATGCCGACGrTAGTCrGCCGCAGITCGATGAACrGGGTTATCTGGACCCGGATGA CAAAACCCGCC5GGAAGÁACAGGCX^GCGGCTnGCGATGCT(^AAGTCAAGGxATATTAAGTCA GCGTACTCGAACTGGCAGÂTTCTGAÀAGÀAÂTCCTGGGTÀAAAIGÂTTAAGCAAACCAAAGCAA GTTGCGGCGTCATCTGGAATAGTTTCAAAGAACIGGAAGAAI£CGAACTGGAAACGGTGATTCG TGAAATCCCGGC^CCGAGTTrTCTGATICCGCTGCCGAAGCATmGACCGOGAGCAGCAGCAGC CTGGTC^ATCAWACWCACGGTGTTIÜAGTGGCTGGATCAWAÀCCGCCQAGrrarGTGCIGT ATGTFAWTI£GGTAGTACCT£GGAAGIGGATGAAAAGGÁCTn€IGGAAATCGCTCGIGGCCT GGTTGATAGCAAAGÂATümCCTGTQ^TGGTrCGCCCGGGTniGTGAAGGGÜTCTACGTGG GTIGÀAC£Q£TGCCGQACGGC^€OGGGIGAACXHWCCGCArrGTCAAÀTGGGTGC£GCAGC AAGAAGTGCTGQ'GCAT<XKWGATrGGCXK;GTmGGACCCAETCC£KJT1XX}AACICAACCK:T QGAÁiaKmTGTGAA<K^I£CCGATOAITnriCAGATmGGCCTGG^CAGCCGCTGAAT GCACGTFATATGTCWATGTI£TGAAAGTtWTGTGTAC£TGGAAAACGGTrGGGAACG€GGCX3 AAATTGCGAATGCCATWGTOGCXnTATGGIGGATGAAGAAGGCGAATACATTGGTCAGAATGC

SEQ ID NO. 25

Aminoácido

Glicosiltransferase 76G1 de UDP com alvo citostólico (cytUTG)

Stevia rebaudiana

MENETETTVRRlíSKSILFFWFQSHISPIigLSWLYSEGFSXTIFgTSFNOETSNYPgFTFE ΡΣ1ΏΪΠ)Ρβ333Σ3ϊί1?ΣΉ®Ρ1Α<^®:ΣΡΣ INEESADSISSSIELLMLA^SSDSSVSCIXTSALWY FA.03VADãlJs’’LSSLATL5ÍTSSLWFSASVSlPQFDE38YLDPDSKTRS33Q^3GFPSHKWDIKS .ΑΣ·3™^Ι1ΕΕ:Ι13ΚΜΣΚςΤΚΑ338¥Σξ^33ΕΕ13:Ε3Ε13Τνΐ33ΣΡΑΡ331ΙΡ1ΡΕ31ΤΑ8383 ΙΙϋΗδΚΤνΡα^Σ^βΡΡβδνΐΥνΒΡδ^ΤδΒνΠΕΚΒίΙΕΣΑΕδΙΥΒδΚςδΡΙΚΚΊΪΜΡνΚΘδΤ® ν3:Ρ1Ρϋ®31δ3333ΣνΚ5ϊνΡ®_;3νΐΑΗ8ΑΣδΑΓη·33δΜ8^:Τ1Ε3νΰ3«ΥΡΚΙΕ®Ώ3δ1Β^Ρ1Κ ΑΡ:Υ5ί3ΣινΐΚναν¥1ΕΚ<^33^ΕΣΑΜΑΣΡΡν^1Ε3δΕΣ^ΓΣΚ^^Α®Λ^13:.’3ΚΑϋν81ΜΕΟΟ33¥Ε®1 SSIVSTISSL

SEQ ID NO. 26

Glicosiltransferase de Aminoácido (NtGT5a) Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 105/155

104/114

ΜΟΡΒΡΕΤΙΡΒ^^ΡΡΟΕ&Π&^βΙΡΟΙίσΕ^ΤΤΪΕΡΟΣ^ΡΚΒΟΛΧΙ^ΕίΤΚΤδΚνΡΡνοαίνδΒα

V^FTLAAAQELeVPEVLFKTTSAeGFLGYWTCE^^EKGTAPLEDAEDLTNGyiiErTtDFIPG Μ^¥ΕΣ_ίΕβ&^8Ρ^ΕΤΤ®Ρ3ΕΕΜΣΚΕ¥Ε^ΕΤΕΕΑΕΕΑΕΑΙΙΣ_ί^ΤΡΕΤΕΕΑΕνΐ_ίΕ§ΣίΕ^Σ_ίΕΡΡνΎΡ IGPLHFL VKEVBDEJTLK.GIiE.SS LWKEEPECIQWLDTKEFKS WWFGG ITWTP^QLTEFAKG LANSQ^TFL^I ΣΕ.Ρ0 IVSGDAE i:LPPEFVEETraEGMLdASWC®QEEVLEHPaiVGFLTHSGWS

TLBSIESGVPKIíWíFFAEgQT^a^FSVTKWWGaffiinSDVXSZÍWgSLWSXiMVWKGKKMRi: Κ»Μ^Κ2Χ*Ε»^&1^8α30ΥΧΪΕΣΒ81_ίνΗϋΙΣ_ίΙ_ι85ΚΗ

SEQ ID NO. 27 DNA

Glicosiltransferase (NtGT5a)

Nicotiana tabacum

ATGGGTTCCATTGGTGCTGAATTAACSAASCCACÀTSCAGTTTSCATACCATATCCCGCCCAAS GeeATATTAACCCCATSTTAAAGCTA.GCaAMA.TCCTTCA.TCACAAAGGCTTTeAQATCAeTTT TGTCAATACTÍ^ATTTAACCACCGACGTCTCCTTAAATCTCsSTGGCCCTGATTCTfTTCAAGGGT CTTTCTTCTrTCC®TTTTGAGA.CCATTGCTGATGGAeTTee®CCATGTGAGGCAGATGCeACA.C MSA.TATACCTTCTTTGTGrGAATOTACAACeAATACTTGe'TTGGCTCCTTTTAGGGATCTTCT TGQGAAÀCTCAATGATAGTMCA.GATCTAASGTGCGA«:C'GTTT©GTG^;CA.TCGTCTCGGATSGT GTeATGAGCTTCACCTTA.GCCGCTGCACAAGAA.TTGQGAGTCCCTGAAGTTCTGTTTTGGACeA CTA@TGCTTGTQ®PTTCTTAGGTTA.CATGCATTACTSCAAGGTTATTGAAAAAGGATATgCTCC ACTTAAASSATQCGA.GTGACTTGACAAATs3<3ATA€CTAGAGACAACATTíSSATTTTATACCAGGC ATSAAAGACSTACGTTTAAGG^TCTTCCAAGTTTCTTGAGAACTAQAAATCCAGATSAATTCA TGA.TÜAÃATTTGTCCTCCAAGAAACAGAGAÍ3AGCÃA.GAAAQGCTTCTGCAA.TTATCCTCAACAC

ATTTGAAACACTAGAGGCTGAAiHTGTrGAATCGCTCCGAAATCITCTrCCTCCAGTCTACCCC ATAC^GWCTTGCATTrTCTAGTGAAACATGTTGATGAIGÀGAATTTGlAGGGACTTAGATCeA GCCirrGG^4ÁGÀ^AACCAGAGTCTATACAAT<^TTGATACCAAAGAACCAAATTCTGTTGT TrATGTTAACTTTGGAAC«ATTACTGTTATGA€TCCTAATCAGCTTATTGAGTTrGeTTGGCGA GTTCCAAAGAGCCAGCAAACATTCTTATGGATGATAAGAGGTGATATTGTTTCAGGTGATGCAT GGATTCTrCCACCCGAATTCGTGG.AAGAÀACGAAGA.ACAGAGGTATGCITGeTAGTTGGTGrrC ACAAGAAGAAGTACTrâGTCACCCTGCAATAGTAGGATTCTTGAC-TCACAGTGGATGGAATTCG A€ACTCXÍAÀAGTATAAÍ^AGTGGGCTG€CrATGATrTGCTGGÜCATTrTTCGCTGÀACAGCAÀA GAAATTGTrGGTTTTCCGTCACTAAATGGGATGTTGGAATGGAGATTGACAGTGATGTGAAGAG AGATGAAGTGGAAAGCCTTGTAAGGGAATTGATGGTrGGGGGAAAÀGGCAAíAAG4TGxAAGAAÀ A^GGCAATGCAATGGAÁGGAATTGGCTGAAGCÀTCTGCTxWlGAACATTCAGGGTCATCTTATG TCÀA€ATTGÂÀAAGTTGGTCAATGATATTCTr€TTT€ÍATC£AAACATTAA

SEQ ID NO. 28

Glicosiltransferase de Aminoácido (NtGT5b)

Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 106/155

105/114

MGS IGAEFTOBAVCI Pl^AQG^DSFMLKLAEILHHKGFai TR^'TFFKSKKLAKSRGPB.SLKG LSAFRIETI ?DC£FPCBABATQ&I TSlXSSTTCTCTGPFRD’LIAKXJt’BTN’TSM^WSGI ISDC

VMS FTL.VV4QEL-GyPE^TJWTTSACGFLGYX:ffiYT£^,sTEKG¥AP'IJ£DA§BLTNGYLT.TTLDFl PC ^ÍKDyRMSI^SFLRTINFaEnS. KnTQETERAEKMAI SJm^TLIAE^lZSLKKIXPmT IGfLHn.^ianWEJi^GLRSSX^'KEE^C^RilJJTKEThWTSWGS ITVMWfQLffiFAWG LANSQQSH.-W1 XRTDIVSGOAS EJTEnTEIKKRGAH.ASWSQEE^SHFAIGGfL.THSG^S TLES I SSGVPMI €%TFFÀEQQTT<C^TSSTKRí®V’GW3I3CBVKl®ES’ESIA^TREIA£VGGlíG13a-HÍK KAMEWKSLAEÀS AKESS GS STVMIEKW j®I LL.S SKH

SEQ ID NO. 29 DNA

Glicosiltransferase (NtGT5b)

Nicotiana tabacum

ATGGCTTCCATTGGTGCTGÀATTTACAAAGCXACATGCÀGTrrGCÀTACCATATCCCGCCCAAG GGCATATTAÀCCCCATGTTAAAGGTAGCCAAAATCCTTÜATGACAAAGGCTrTCACATCACTTT TGTCáATACTGÀATTTAACCACAGAGGTCTGCTTÂÀATCTCGTCGCCCTGATTCTCTCAAGGGT CTTTCTTCTrTCCGTTrTGAGACX^TTC^^TGGACTTCCGCCATGTGATGCAGATGCCAGAC AAGATATACGTTCTTTC^GTGAATCTACAACCAATAGTrCXTTGGGTCCTrTTAGGGATCTTCT TG€«ÂAACTÜAATGATACTÀACA€ATCTAA€GTG€GACC€GTTTCGTGCATC'AT€TCAGATGGT GTCATGÀGCTTGAGCTTAQCCGCTGCACAAGAATTGCGAGTCCCTGAAGTIGTGTTTTGGACeA GTAGTGCTrGTGGTTTCrTTAGGTTACATGCATTATTACAAGGTTATTGAAAAAGGATACGCTCC ACTTAAAGATGCGAGTGACTTGACAAATGGATACCTÀGAGÀCAACAITGGAnTrATACGATGC ATGÀÀÀGAGGTACGTTrAAGGGÁTCTICCAAGTTTCTrGAGÀACTACAÀATCCAGÀTGAATTCA TGATCAÀATTTGTUCTCCAAfâAÁCAGAGÀGAGC: 'AWAAAGGCTTCTGCAATTATC GTCAACAC ATATGAAACACTÀGAGGCTGAAGTTCTTGAATCGCTCCGAAATCTTCTTCCTCCAGTCTACCCC ATTGGGCCCTT€XATTTrCTACTG4ÀACATCTTGATGÀTGACAATTTC;AAGGGACTTAGATCC,A GCUTTTGGAAAGÀGGÀA«AGAGTCTATACAÀTGGCTTGATACCÀAAGAACC:AAÀ.TTCTGTTeT TTATGTTAACTTTQ<^AACXATTAeTGTTATGACTCCT.AATCAACTTÀTTGAATTTGC:TTGGGGA €TrGCA^À€AGC€AAÜAATCÀTTCTTÀTGGAT€ATAAGA€CTGATATTGTTT€AGCTGATGCAT CGATTCTTCCCCCCGAATTCGTGGAAGAAACGÀAGAAGAGAGGTATGCTTGCTAGTTGGTGTTC ACAACAA&AAGTACTTÂGTCAGGCTGCAATÂGG4CGATTCTTGACTCACÂGTGGATGG.AATTCG ACACTCGAAAGTATAÁGCAGTGGGCTQOCTATCATrTGCTGGCCATTTrTCGCTGAACAGCAAÀ CAAATTGTTGGTTTTCCGTCACTAAATGGGiTGTTGGÀATGGAGATTGACTGTGATGTGAAGAG CGATGAÀGTGGAAAGCrCTTGTAAGGGÀATTGATGGTrGGGGCAAAÀGGCAAÀAAGAIGXAGÀÀA AAGGCÀATGGAATGGÀAGGÀATTGGCTGAÀGCATÜTGCTAAAGAACATTCAGGGTCATCTFATG TGAACATTGÀGAAGGTGGTCAATGATATTCTTCTrrCGTCXAAACATTAA

SEQ ID NO. 30

Aminoácido

UDP-glicosiltransferase 73C3 (NtGT4)

Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 107/155

106/114

MATQVHKLIHflL^LMATGHMI ΡΜΙΏΙΑΚΕΕΑΝΕ.ΕΛΤΤΏ ΠΤΒΤΜΚ STI TRAI KSCLRI QILlIJi^SWA’GIiEGCEKIBXS^SLBLASKFFAAI SML£QQ¥E?ÍLLEGWS ESCVI SDMGT PWETQIAQNFNI PRBTHGTCCTSLLCSYKI lASNTLOS TSDSEYFWDI^BRI’ELTKAQVS GSTKNTTSVSAS^TJ^VTEQnaAEESSVGVIVNSEEIXE^’YEKEySKAROKSCVWCVGPVS^ .NKEIEBLVTRGÍíKTAIBNQBeLKWLSNEETES^TASLGSLSRLTELQAnELGLGLEESNREn/ mT.GCGma^&LEKWHZNG^£QRIKERGV£J RGWARQVLILSIffAlGGVLTHCC-WSTLEGI S AGLPIWT^TirAEQrCNEKL^TQTXKIG^LGI’K^’T^'KWCTEEJ^'G^XVKKDBVKKALDKLWE CEEGQTREEKAKELGE1 AKKAFGEGGSSWNLTSOE»! IEQQNHKEK

SEQ ID NO. 31

DNA

UDP-glicosiltransferase 73C3 (NtGT4)

Nicotiana tabacum

ATGCCA4CTCAACTGCACÀÀAGTTCATTTCATACTATTCCCTTT.AATGGCTCCAGGCCACATGA TTCETATGATAGACATAGCTAAACTTCTAGCAAATCGCGGTGTCATTAGCACTATCATCACCAC TCCAGTAA4CGCCAATCGTTTCAGTTCAACA,4TTACTCGTGCCATAAAATCCGGT€TA4GAATC CAAATTCTTACACTCAAATTTCeAAGTGTAGAAGTAGGATTACCAGAAGCTTGCGAAAATATTC ACATGGTTCCTTCTCTTGACTTGGCTTCAAAGTTTnTGCTGCAATTAGTATGCTGAAACAACA AGTTGAAAATCTCITAGAAGGAATAAATCCAAGTCCAACTTGTGTTATTTCAGATATGGGATTT CCTTGGÀCTACTCAAATTGCACAAAATmAATATÜCCAAGAATTCITTTTCATGGTACTTGTT GTTT-CTCACTTTTATGTTCCTAT.4AAATACTTrCXTCCAACATT€TTGAAAATATAACCTCACA TTCxAGAGTATTTTGTTGTTCCTGATFrACCCGATAGAGTTCAACTAACGAAAGeTCAGGTTTCA GGATCGACGAAAAATACTACTTCTGTTAGTTCTTCTGTATTGAAAGAAGTEACTGAGCAAATCA GATTAGCCGAQGAATCATeATATGGTCTAATTGTTAATAGTmGAGGAGTTGGAGCAAGTGTA TCAGAAAGAATATACaAAAGCTAGAGGGAAAAAAGTTTGGTGTGTrGGTCCTGTTTCTTTGTGT AATAAGGAA4TTGÀAGATTTGGTTÀCÀAGGGGTÂATAAAACTGCAATTGATAÀTCAAGATTGCT TGAÀATGGTTAGATÀATTrTGxAAACÀGAATCTGTGGTTTATGCAAGTCTTGGAAGTTTATÜTCG TTTGACATTATrGCAAATGGTGGAACTTGG-TCTTGGTTTAGAAQAGTCAAATAGGCCTTTTCTA TGGGTATTAGGAGGAGGTGATAÀÀTTÀÀATGATTTAGAGAAATGGATTCTTGACAATGGÀTrTG AGC AAAG^TTAtóaAAAGAG-GÀGTTTTGATTAGA-GGATGGGCTCCTCAAGTGCTTATACTTTC ACACCCTGCAATTGGTGGAGTATTGACTCATTGCGGATGGAATTCTACATTGGAAGGTATTTCA GCAGCATTACCAATGCTAACATGGGCACTATTTGCTQAGCAATTFTGCAATGAGAAGTTAGTAG

TCGAAGTGCTAAAAATTGGAGTGAGCCTAGGTGTGAAGGTGCCTGTCAAATGGGGAGATGAGGA AAATCTTGGAGTTTEGGTAAAiAAGGATGATGTTAAGAAAGCATTAGACAAACTAATGGATGAA GGAGAAGAAGGACAAGTAAGAAGAACAAAAGCAAAAGAGTTAGGAGAATTGGOTAAAAAGGCAT

TTGGAGAAGGTGGTTCTTGTTATGTTAACTTAACATCTCTGATTGAAGACATCATTGAGCAACA AAATCAC AAGGAAAAÀTAG

SEQ ID NO. 32

Glicosiltransferase de aminoácido (NtGTIb) Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 108/155

107/114

MOAEl^TiyAI^MGSLWn^VAlLQLV'BKHEQLSrn^WaTi ΡΕΕΤΑΙ PSYTKSLSSDTSSRI TLLPLSQFETSVTMSSFNAIííFEEYI SSTKCSEKDAYSETS ESSgXSVKLÂGF^TISSSFCTAMm VA^EFGl PS¥lT¥T.SSAASaGLQLlS^rQSl^ ΙΕ€δΡΚΑΉΝΤΛΈΡΕ8Ε\ΊΑ bTY5f>P\ P\ KCLPGE I LA^DESSTMn-WÀKSFSElKGimTaTTELESHÀLKALSBOEKl ΪΤΓΏΛ GPIL.YLENGNED WQElTJÀanaRXBEKF^&SWFLCTGSKGSFEEDQllíESÀNALESSGYHH.^ iLKRPPPKSKLQ :rT:8EFEisFEEVLFE®FTQKTKGKG£F3GWAPQ£AIL:SKF§VGGFVSaCG1S^:NSFl.E5yKSGW3A TK7L¥A£QQS^AFQL11O>LGMA^TIKMI>¥K^>f??TRWI<LVKAEEIEI>GIRKLMI>SENKIKAKV TEMia>K^AAE£ECC§SWALGHFVETVMKN

SEQ ID NO. 33

DNA

Glicosiltransferase (NtGTIb)

Nicotiana tabacum

ATCAAGACAGCAGAGTTAGTATTCATTCCTGCTCCTGGGATGGGTCACGTEGTACCAACTGTGG AGGTGGCAAAGCAAC/TAGTCGACAGACACGAGCAGCMTTCGATCACAGTieTAATCATGACAAT T€€TrTGGAAACAAATATTCCATCATATACTAAATCA€TGTC€TCAGACTACAGTTCTCGTATA ACGeTGCTTCCACTCTCTCAACCTGAGACCTCrCTrACTATCAGCAGTTTrAATGCCATeAATr TTTTTGAGTACATCTOCAGCTACAAGGGTCGTGTCAAAGATGCTGTTAGTCAAACCTCCTTTAG TTCGTCAAATTCTGTGAAACTTGCÁGGATTTGTAATAGACATGTTCTGCACTGCGATGÁTTGÁT GTÁGCGÀÀCGAGTrTGGAATGGGÀAGTTATGTGTrCTACAGTTCTAGTGCAGCTATGCTTGGÀC TACAACTGCATTrTCAAAGTCTTÀGCATTGAATGCAGTCeGAAAGTTCATAACrACGTFGAACC TGAATCAGAAGTTGTGATGTCAAGTIACATGAATCXGGTTCCAGTCAAATGTTTGCCCGGAATT ATACTAGTAAATGATGÀÀAGTAGCACCATGTTTGTCÁATCATGCACGxAAGATTGAGGGAGACGA AAGGAATrATGCTCÀAQACGTTQACTGAGGTrGAÀTCACAGGCTTTGAAAGCCCTTTCCGATGA TGA4AÀAAFCCCACCAATCTACCCAGTTGGÀCCTATAC:TTAACCTTGAAAATGGGAAFGAAGAT CACAATCAAGAATATGAT&l^GATTAFGAÀGTGGCTTGACGAGAÀGCCTAATTCATCAGTGGTGT TCTTAIGCTTTGGAAGCAAGGGGTCTTTCGAAGAAGATCAGGTCÀAGGAAÁTAGCAAATGCTCT AC^GAGCAGTGGCTACCACTrCTTGTGGTCGeTAAGCCGACCGCGACCAAAAGACAAGCTÀGAA TTCGCAAGCGAATTeGAGAATCGAGAGGAAGTCTTACCAQAGGGATTCTTTCAAAGGACTÀAAG GÀAGAGGAAAGGTGATAGGATGGGCÀCCCCAGTTGGCTATTTTGTCTCATCCTTCAGTAGGAGG ATTCGTCTCGCÀTTCTGGGTGGAATTCAACTCTGGAGAGCGTTCGAAGTGGAGTGCCGATAGCA ACATGGCCATTGTÁTCCAGAGCAACAGAG€AATGCATTTCÀA€TGGTG4AGGATTTGGGTATGG GAGTAGAGATrAAGATGGATTÀGÀGGGAÀGATTTrAATACGACAAATCQACCACTGGTTAAAGC TGAGGAGATAGAAGATGGAATTAGGAÀGCTGATGGATTCAGAGAATÀÂÀATCÀGCGCTAAGGTG

ACGGAGÁTGAAGGACAAAAGTÁGA<^:AGCAOTGeTGOAGGG€GGATCAICATATGTAGCTCTrG GGCATTTTGTTGACACTGTCATGAAAAACTAG

SEQ ID NO. 34

Glicosiltransferase de aminoácido (NtGTIa) Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 109/155

108/114

ΜΚΠΕΙΛΤΓ PAPCMGHLATTl^AKQL^DRDEQLSmOMTLFLETNI PSVIKSLSSBYSS®!

'TLLQEAQPETSVSXISSF^AINFFEEI S8¥K&ri⁷K»À^^TFSSgSSVKLKGFVSaiF€TÁR£ffiV ANEFGI PSWF^SNAÀMLGLQLHFQSO lETSFKVEEíYLDFEKEVAI STV1KEI FVKCLPCI X LD^K§GTMF¥7®AKRFKET^mn^TFAELESHALKALS&SEKI PPHWGPUJaGDG^ESH SQEYSMlMKWLSE^iHSS^TLCFGSKGSFEESQ^’KE L^UZESCNSTLWSLRRPPPKBILQF ,FSElTOTEE¥XWGEFQRTKGgGA^GA¥APQLAI L8HFAA’GGn.^?S.HCG^STLE8¥’R8GVHAT WPEVAEQQSW.O'QL^lOiLGMAXTIOffilliiESFNKEhTSLAlL^EEEEaQIRKLMBgENKIEAK^’Ai EXEKBKSRAÂEEEGG8 ALGHEVETVMKN

SEQ ID NO. 35

DNA

Glicosiltransferase (NtGTIa)

Nicotiana tabacum

ATGAAGACAACAGAGTTAGTATTCATTCCTGCECCTGGCATGGGTCAGCTTGIAC-CCACTGTGG ÀGGEGGCAAAGCAACTAGTCGACA£yiGACGAACAGC:TTT€?AAT€ACAGTTCTCÀTCÀTGACGCT TCemGGAAACAAATÀTTGCÀTCATATACTAAATCACTGTCCTCAGACTACAGTTCTCGTATA ACGCTGCTTCAACTrTCTCÁAC«TGAGA€'CTCTGTrAGTATGÀGC.'AGTTTTAATCCCATCAATT TrmGAGTACATCTeCAGCTACAAGGATCGTGTCAAAGAEGCTGTTAATGAAAECTTTAGTTe GTCAAGTTGTCTGAAACTCAAAGGATTTCTAÀTAGACATGTTCTGCACXGCGATGATTCATGTG GCGAACCiAGTTTGGAATCCCAAGTTATGTC/ETC.TACACTTCTAATGCAGCTATGCTEGGAeTCC AACTCCATTTTQAAAGTCTrACTÀTTGAATACAGTCCGÁAAGTTCATAATTACCTAGÀCCCTGA ATCAGAACTÀGCGATGTCAACTTACAETAATCCGATTCCAGTCAAATGTTTGCCCGGGATTATA CTAGACAATGÀTAAAACTGGCACCÀTGTTCGTCAATCATCXACGAAGATTCAGG

GAGACGxAAAGGAATTATGGTCAÀCACATTCGCTGACCXrTGAATCÀCACGCTTTGAAAGCCCTTr CCGATGÀTGAGAAAATCCGAC CAATCTAC CCAGTTGGGCCTÀTACTTAAC CTTGGAGATGGGAA. TGAAGATCACAATCAAGAATATGATATGATTATGAAGTGCCTCGACGAGCACCCTCATTCATCA GEGGTGTTCCTATGCTTTGGAAGCAAGGGATCTTTCGÀAGAAGAECAAGTGAÀGGAÀATAQCAA ATGCT€^:TAGAGAGAAGTGG¥AACGGGTTE3TCTGGTCGC;TAAGACGACCGCCÂC€AAAAGACAe GCTACAATTC<<AAGCGAATT€GAGAATC€AGACGAAGTCTTGCCGGTGGGAITCTTTCAÀAGG ACTÀAAGCAÀGACGAAACGTGÀTAGGATGGCCACCCCÁGTTGQCTÁTTTTGTeTCÁTCÜTGCAG TAGGAGGÀTE€GTGTCGCATTGTQGGTGGAArrCAACTTTGG.AGAG.TGTT€GTAGTGGAGTACC GATAGCAA€’ATGGCCATTGTATG€ACAGCAACAGACCAATGCATrTCAACTCGTGAAGGATTTG GGGATGGCAGTQGAGATTXAGATCGATTAGAGGGAA.GATTTTAATAAGAC.AÀATCCACCACTGG Tr.AAAGCTGAGGAGATAGAAGATGGÂATrAGGÀAGCTGATGGATTC^:AGAGAATAAAATCAGGGC^: TÀÀGGTGATGGÀGÀTGÀAGGACAAÂAGTÀGAGCAGCGTTAITAGAAGGCGGATCATCATATGTÂ GCECTCGGGCATTTTGTTGAGACTGECATGÁAÀÀACTAA

SEQ ID NO. 36

Glicosiltransferase de aminoácido (NtGT3) Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 110/155

109/114

MKEIKKSELVTI K PGSOELVST^TMAKLLIAREEQIA ITVLI IQ^^l>OXBSllQSV.tòTS& RLSJ3KLFQI®·» HÍQLLKS^I FITHASHSSAVRSÁVÀBI LKSES^TLAGJVTOIi'CTSStHBV .Α^ΕΓΕ»ΤΎ^’ΓνΤ8βΑ7ΜΧίΕΗΪΉΙΟ^^ΣΤΝ1ΦΙΤΚΏίΙΪΣΤΈΕΏχ5 lATVUSITPAKCLFSV AU>KEGG&WnJ^KRfKETK^n^^LEÍZS¥ALNSI^KB13aJf I1TVG>VO?LN^TGB »€«^0ΚΤΜ,»1.ΒΒ0ΡΑϊ5·νθΈ€Ε«§€Ο®ΙΈΚΗί2ΐ'ΚΣΙΑ¥ΑΕΕ§ SG€®JXW:£Lí®PPTEDÀK

FPSNYZXLEEILJEGri.ERIKGÍGKVtGWAPQLAIL5HKgTGGFA’SHCGW?<STLESTYFGVFIÁ

T%l^\AE<^ÀNAFQL¥Kl»^£GVSKMm’EKBMKn_:iGKEA^;n^:KÀEEiEKA£lEaíBSESEÍRl'K VKEi£KSKSSÂA^fEGGSS¥T®IGGF£Ql B£ENSQ

SEQ ID NO. 37

DNA

Glicosiltransferase (NtGT3)

Nicotiana tabacum

ATGAAÁGAAACCÀÀGÀÀÀÀTAGAGTTAGTCTTCATTCGTTCACCAGGAATTGGCCATTTAGTÀT CCACAGTTGAAATGGCAAAGCTTCTTATAGCTAGÀGAAGAGCAGCTATCTATCACAGTCÍCTCAT CATCCAATGGCCTAACGAClAAGAAGCTCGATTCTTATATCCAATCAGTCGCCAATTTCAGCTCG CGTnG.AAATTCATTGGACTCCCTCAGGATGATrCCATTÀTGCAGCTAGTCAAÁÀGCÀÀCÀTTT TCACCACGTTTATTGCCAGTGATAAGCCTGCAGTrAGÀGATGCTGTTGCTGATATFeTCAAGTO AGAATCAÀATAATACGCTIAGCAGGTATTGTTATCGACTTGTTCTGCACCTCÀATGATAGACGTG GCCAATGA€TTC'CAGCTACCAACCTATCTTTTCTACACGTCTGGTGCAG€AACCÜTTGCTCTTC ATTATCATAT A» Ac ÀATCTCAGGGÀTGAATTTÀACAAAGATATTACCAAGTACAAÁGÀC GAACC TGÃÁGAAÁ A AC TCTCTATÀCCAACATATCTCA4TCCATrT€€AGCAAÀATGTTTG€ C GTCTGTÁ GCCTTAGÀv.A4Av.AAGGTGCFreÁACÂATGTTTC:TTGATCTCG€AAÀÀÀGGTTTCGAGÀAACCA AAGGTATTÀTGATAAACACATrTCTAGAGCTCGAATeeTATGGATTAAACTCCCTCTCAeGAGA CAAGAATCTTCCACeTATATACCCTGTCGGACeAGTATTGAACCTTAACAATGTTGAAGGTGAC AACTTAGGTTCÁTCTGÀCCAGAATACTATGAAATGGTTAGATGATCAGCCCGCTTCÁTCTGTAG TGTTCCTTTGTrTTGGTAGTGGTGGAAGCTITGAAAAACATCAAGTTAAGGAAATAGCCTATGC TCTGGAGAGCAGTGGGTGTCGGTTTTTGTGGTCGITAAGGCGACCACCÁACCGAAGATGCAAGA TTTCCAAGeAACTATGAAAATCTTGAAGAAATrTTGeeACAAGGATTCTTGGAAAGAAeAAAAG GGATTGGAAAAGTGATAGGATCGGOÁeGTCAGTTGGCGATTrrGTGACATÀAÀTCGACGOGGGG ATTTGTGTCGCACIGTGGATGGÁATTCGACTTIGGAAAGTAGATATTWGGÀGTGCGAATAGCA AeeTGGCCAATGTAeGCGGAGCAACÂÂGCGAATGCATrrCÂÂTTGGTTAAGGATTTGAGAATGG GAGTrGAGATrAAGATGGATTATAGGAAGGATATGAAAGTGATGGGGAAAGAAGTTÁTAGTGAA AGCTGAGGÁGATTGAGAAÀGCÀÀTÀÂGAGAÁATTATGGATTCGGAGAGTGAAATTCGGGTGAAG GTaAAAGACATGAÀGGAGÀÀGAGOAGAGCAGCACAAATGGÀAGGTGGOTCTTCrTACACTTCTÀ TTGGAGGTTTCATCCAÁÁTTATCATGGAGAATECTGAÀTAA

SEQ ID NO. 38

Glicosiltransferase de aminoácido (NtGT2) Nicotiana tabacum

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 111/155

110/114 .m’QEm^LYTETAQGH&TCLQFAKRLISSiGI EVTFATSTyAHRRJkiAKTTTSTLSKGLíSrÀAFS SC¥D©€TSABEHDSQHYMSEÍ KSKGSKTLKSI 'II^S&S^GRFiTSLA^IXI^AAK^’AKEfHl ?CALLWlQFATVLfíiy¥¥WNG¥£»Àl KCSl^BF^VCIQLEBLfLIJCSQBLPSFLLSSSNE^y SFALÍITKEQIJilWVEE^SXX^TFBAIZPKELKAI EKl^XIGiGFU PSTTLBGKBPLSSS FGGS1FQKSXSYI EWLNSEAKSS^^ SFGSLEÍ^SKNQEEEÍAKGLI E1 KOFLST.TR&QENC KGBEKEEKISC^SIEKQGKRTWCSQLEVLIHPS ÍG€:n’8HCGWNSTLESESSGySWÀFPSW TDi^TXAKLXEDVWKTG^'RLKKSEDG^SSEE JERCI EIA-IÜDGCOlC^EMRRK^QKWKELAREA ^XEGGSSE^SÍLEAFVQEVGSGC

SEQ ID NO. 39

DNA

Glicosiltransferase (NtGT2)

Nicotiana tabacum

ATGGTGCAACCCCATGTCCTeTTGGTGACTrTTCGAGCACAAGGCCATATTAATCCATGTCTCC AATTTGCXAAGAGGCTAATTAGAATGGGCATTGAGGTAACTTTT'GCCACGAGCGTTTTCCCCCA TCGTCXjTATGG£:AAAAACTAEGÁ£TTOOACTCTATC£AÀGGG€TTAAATTTTGOGGCÀTTCTüT GATGGGTAGGACCÁTGCTTTCAAGGCCCATGÁGCAECATTGTCAACATTACATGTCGGAGATAA AAAGTCGCGGTTCTAAAACCX^ÀAÀÀGATATCATrTTGAAGAGCTGAGACGAGCGACGTCC/EGT GACATCCCTCCTCTATTCTCTTTTGCTTCCATGGG€TGC.4ÀAGGTAGCGCGTCAATTTCACA.TA CCGTGCGCiGTTACTÀTGGATTCÀÀCeiGCAACTGTGCTAGÀCATÀTÀTTATTATTAGTTCJLATG GCTATGAGGATGCCATAAiAGGTAGCACCAATGATCCAiATTGGTGTATTeAATTGCCTAGGCT TCCACTACT.4.4AAAGCXAAGATCTT©CTrCTTTTTTACTTTC/TTCTAGTAATGAACAÀAAATAT ÂGCTITGCTCTACGAAGArrTAAAGÂGCÀÀCTTGÀCACATTAGATGTTGAAGÀÀÀATCCTAAAG TACTTGTQAACÂGATTrGATGOATTAGAGCGAAAGQÁÀGTCAAAGCTATTGAAÀAGTACXATTT AATrGGGATTGGAeCATTGATTCCTTCAACATTTTTGGAeGGAAAAGACCCTTTGGATTCTTCC TTTGGTGGTGATCTTTrTCAAAAGTCTAATGACTATÁTTGAATGGTTGAACTCAÀAGGCTAACT CATCTGTGGTTTATATCTGArETGCGAGTCTCTTGAATTTGTCÀÀÀÀÀATCÀAÀAGGAGGAGÁT TCCAAA.4GGGTTGATAGÀGATTA.4AA4GC:CATTCErGTGGGTAATAAGAGATeAAGAAAATGGT AAGGGAGATGA.AAÂAGA^GAGAAATTA4GTTGTATGATGGAGTTGGAAAAGCAAGGGAAAATAG TACCATGGTGTTCÁCAACTTCAAGT€TrAACACATCCATCT.4TAGGATGTITCGTGTCACATTG IGGATGGAATTCCaCTC TGGAAAGTTTÀE€GTCAGGCGTGTCÀCTÀGTGGCÀTTTCCTCA-n?GG ACGGATCÀÂGGOAlAAATGCTAÀACTÀÂTTGXAGÀTGTTTGGAACÍACAGGTGTAAGGTTGAAÀÂ AGAAIGAAGATGGTGTGGTTGAaAGTGAAGAGATAAAAAGGTGCATAGAAATGGTAAEGGATGG TGGÂGAGÀA4GGAGAAG.A4ÂTGÀGAAGÀAATGCEG.A4ÂÂÂTGGAAAGAATTGGCAWGGAÂGCT GTAAAAGAAGGCGGATCTTCGG.A4ATGAATCTAAA4GCTrFTGTTCÂAGAAGTTCG€AAAGGTT G£TGA

SEQ ID NO. 40

Aminoácido

Domínio alvo de Tricoma de THCA Sintase

Cannabis

NÍNCSÀFSFWWCKI I FFFLSFHI QI $ I. A

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 112/155

111/114

SEQ ID NO. 41

Aminoácido

Domínio alvo de Tricoma de CBDA Sintase

Cannabis

WCCSTFS WFVCK1IFFFFS FNIQTSIA

SEQ ID NO. 42

Cannabis de THCA Sintase de Aminoácido

SSTIC^RPISGTXProitVIVTPSWSKI^TILCSKKVG-LQIRTRSG » ' i 7 „ ?V l^RNYGLÃADSÍ IDARLWVSGKVT-DRKS^OSSLWAIRGCXsGRWGI IA&OTKLTOWEEST

IFgVEW^SIHGLVKLFfJKKQK ΙΑ¥Κ5®Κ2Ε.ν»ΓΗΕ ITOITDRHGKNOTVRGYFSgX PEGG VDSLVDEiynSTKSFPELGIO'riXORS^IIFFriRFSGVXRPlS'TANFKra.I^DRSAGOl'APSTK I.DVVKKPIFSTMVKILEKE^VEEIjVQAG^ryLVpyGaiKggTgE.gAXPFPHgAGTMYEl^YZAS ^E^EDJfEFHXWVRSVYWTTFWSgKPRLAYLRYRDW-LGCTâRÃSPMYT-Q&RIWEKYPG OFTOEVOKTKTOP^PPEEEQS Σ PPLPPERR

SEQ ID NO. 43

Aminoácido

MYB8 - ortólogo para CAN738

Humulus lupulus

MGR&PCGEOGUGCGRm?G'””'I ”⁵'¥I QSNGBSCWESLE35HÃGLLR CGKECRLEW I EYlsRMJ LKROTISSEREDIlXOsHS ♦ kW XASHLFGRTSNEIKSTWSiiLSRSSIHTFSPCFKTTTH WHS.FELVTVTKWL PlPKh RLÃMKKSKS STSi^SSVXKNDVGSSSSTTTTSVHQRT

TTTTPT^TDQQÍSQLSRCRi^tte^.^nQ&gTGTÍ^KLGQ^^.VGSgCDSiD^n^ICÍQLSFLCCg E^TTEES^rmj^EGDKEVSGPYXJTDHEYEKETSySE^R.CPEGIIDSKLLEPEEVLTLSEE SLNLGGÁLAíDTTTSTTTXSS^STYaSYiSíssNGDCVlSDDHDCpVaiJDVyGyDFWSWESSTrVTaEQ

SEQ ID NO. 44

Aminoácido atMYB12 - ortólogo para CAN739 Arabidopsis thaliana

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 113/155

112/114

.iDíjíjLíJ^SíJI-OIíLí 17'0'1.'4 UjG-IJG

ΒΙ^ΝΧΚδ8Ε®ΜίβΒδΙ5Τ«®^®Ι©ϋΣ₁>Ι^8ΟΡ8νΕ8ΪΙ₁ΗΧΒ·^3νϊ©1^Ώ58Ρ333«η€ν»^Ε®8Σ^

EtWHBEENPDSMVSMIJiDGnSSATXSWNCENFíSEP&SHDDESALVÃÍÍIiIiE

SEQ ID NO. 45

Aminoácido

MYB112 - ortólogo para CAN833

Arabidopsis thaliana miSRTEFJtíiCKTLXl®l£EEV^VEia^IEIRRSPWTVEEDMKLVSYXSIá®SES8H»Sí₁SRSJl

03Ν8Χ0£:8ϋ81Ε?&ΚΤ&ΕΡΟΙ520ΕΪ812Ε2ΕΣΣ3Ε3Ή38»335Μ8ΚΧΑ2Ε3Ρ05Τ3ΚΕΧ2Ν™

8Τ5να£ΗΑΚ.11<εϋνΚ·ΒΚ28Κ3ΤΣΚΗ.ΙΛΡδ.1ΙΕ8ΙΑΑΤ2δ¥32Τ8ΝΗΥ8ΡΕΚ88νΑΤΑΤ88Τ8

88ΕΑ^.838Τ003α^ΡδΓ3Ο»ΊΝ<ϊ3Μ!23©33Τδ’ΕΤ108Ε3Β2Ν57?113

SEQ ID NO. 46

Aminoácido

THCA sintase alvo citossólico (ctTHCAs)

Cannabis

HP»®^2>XCFSKSIP»SVaMPKLVTS^®QI_ITÍ®XI«^TXSSl®FXEDTTPlLPL¥IVTP^®SK IgATlLCSKO’SLQIBTRSiSiSgDAEMSTISQVPFWiDLSMHSSXIBVSSOTAmfSfeSATLG ®mw 8$ SHWBS FPGGyCFTVSVSGS FSOSSYOALMSS WIMEI XDl^VKVDGKVIi©S3E Ε!^ΕΟΙ^ΑΣΚΟ®3^»ΡσΐΙΑΑ»ΕΣΕ&5ΠΜΓΡδ^ΤΙ?8νΚΧ^®Σ®δΣ.νΕΙ₁Β8Κ»Ι2ΝΕ&ΥΚΧδ ΧΧ>Σ.νΐ_ί«ΪΉΡΧ^ΗΧΤΕ®ΒΙ3®^Τ™3¥Ρ33ΣΡΒδδνΒ3Σ_>νΣ>Ι3®Εδ»3Ι>ΟΙΚΕΣΒΟΕΕΡ8ΚΙ DTTIFYSSWSFNTMÍFEKS ILLDE8 AGKK.TAES IKWÍVXXS¹ IPETMWKX 8EE1TEEDV0AS Μϊν3ϊ'Ρϊ00ΙΜΕΕΙ3Ε3ΑΙΡ88Η8.ΑδΙΜΪΒ1»ΥΤΑ8^ΈΕαΕ33522ΗΙϊ0Κ?Β.8¥¥»ΤΤΡ¥¥82.Ν PRÍAYSKY^IiDSíSamSH&SPKim^AEXWSBKXFGSKFSR&VKVXTKVDP^lWFKK^S IPPL FFHEK

SEQ ID NO. 47

Aminoácido

Catalase alvo de Tricoma com Domínio alvo de Tricoma de THCA Sintase

Arabidopsis thaliana

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 114/155

113/114

WCSAFSWFVCKIIFFFLDFaZ^IEXAWPYKYP.FASS^SPFFTTS'SGAPWWNDSKTVSP

S.OÍ.ZLl>®5ÍHI«VBKSASFSR2SZF^.WK&RSasaKSFF8VTSDISSÍi:TCM^LRXPGygTFFX VPFS TVXS&FSS SET J3® FRSFAVRF YTREGSFDL V9HF PVFFISEGSKF PD IVHALXPl® K8 ΒΐαΕ8»«ΣΙ®^δ^Ρ^Ι^®ΤΡΣ^δδΙ®ΙΡ§δΥΒΗ®68δΠ®ΤΧΜΧ»ΣΗΟ.0Ο2Τ«ΧΡ®ίΚΡ TSGVKSLLEEn&ZRLGGTW.SSÃTQDLZDSIAAGtTXPE^D.FZQXXDPADEDKFDFDPLDYTKT ^ΕΕΙΙίΡΙ^Ρν^ΚΜνΕ^ΝΙΒΪΐΡΡΑΕΒΕδΣΛΡ^ΡΑΙΣνΡσΣΗΥδδ^ΣίΣίδΤΚνϊ'δΥΑϋΤδΚ^Ι· G?m'DgLPV®A-PKCAS^NKSEGPMNFIáKPSE:E:VN¥WSR¥DQWHÃEKyPTPPA¥CSGOSSC ΙΙΕΚΒ»ΡΚΕ?®ΕβΥβΤΈΤΡ®Κ0ΕΡΡΣ0Ρ»ΙϋΑΕ_ί§ΞΡΡΙΤΙ®:ΣΡ§ϊ«!Ι8™8>3Α33Κ8Σ_!®·2ΧΈΑΒ S&WRPSI

SEQ ID NO. 48

Aminoácido

Catalase Alvo de tricoma com domínio alvo de tricoma de CBDA Sintase

Arabidopsis thaliana

MCCSTFSFSFVCSlIXFFFFSFKZaTSIMaDPYKTRFASSXKSPFFTX^ÍSGaPVSKSBÍS^fWSP RSfcSZ&BDXHLVSKLaSFDSEaiPERWSM^SASSFFSVTWXS^TCroFLSU^gVQTPVI VRFSTVZH&»^PSTIi8DFPGFAVXFyTSS®SFD&^SSSFPWFXJS3®!®FPDZFMMXPSPES

HIQSS5®XSDFFSH^SSS^FTFLFE©ISXP®PX8ffiS3GSSWTXMI>X^»GiaHXVKFS5®P

ΧΟ^νΧδΖ.ΏΚΕΠΑΙΡΖβδΤΝδ^Ε&.Τ^ΖΪΒδΣδΛαΝΪΡΣΜ.ΏΡΙβΙΣϋΡΆ^ΜϋΚΡϋΡΩΡΜίνΤΚΤ «ΡΚ33ΧΧΡΕ_ί2Ρ?<ΪΕΜΏ3ΪΚΪ?ΣΪ^ΡΡΑΕΚΕ^Ι₁ΑΡαΡΑΙΣ¥Ρ®ΧΗΤ5&Ι0Κ_ίΣ_ίΟΤΚνΡ§'Σ3«>Τ2ΕΚΚΣ₁

GPK’fXQLPraÃ.FXCAHBKNHHE®FmMgPDSSV^rN¥EPSaZBgZTO6.EKTPTPPAZ^SGKRE8C

II^EWFS^t^YETFTPERSSR^ISWXDÃLSSFEITSSISSIWISWSQÃDíKS&G^KLaS

RítôVPPSl

SEQ ID NO. 49

Aminoácido

Catalase HPII (KatE) com domínio alvo de Tricoma de THCA Sintase

Escherichia coli

Petição 870190120782, de 21/11/2019, pág. 115/155

114/114

WCSAFS IWTCH IFFFLg PEI£ IS

SPAAEPTPPtSAQFTAFQSLKAPDTRKEKIjNSLEDYEKGSWEAXTT^QGVKIÃDD^SLSAGSE ®ΡΤ'ΧΧΕΕΕΣΣ_ί®ΕΚΙΤΗΡΏΗΕβΣΡΕΕΣνΗΑΕΘ8ΑΑ2σΥΡ0ΡΪΚ®Ε§βΙΤΚΑβΡΙ₁8ΒΡδΚΙΤΡνΕ7

ΕΕ3ΤναΘ®Α©®ΑΓΤνΡ»ΣΡαΡΑΤΕΕΥΤΕΕ8ΧΕϋΕνδΜΤΡΙΕΕΙΏ·0.ΑΗ^ΡΡΠΡνΉΑνΕΡΕΡΙ«Α

ISÍMlSA^WmyySLíSFXTI^VMWMfâSRGXF^YRraBSFGIHTFSIi^a^KATSWFH EEPXtAGKA8&V$E^AQ3^tT@RDPDF8RR£LWEAXSAQK>FPEYEZtC^^LXPE^EPKPDFDLLX^ ISaiP^iVP^WSKMVXJmtPDSFFASÍgÇl&aS^^JVPGlSFTSDSLl^RÍ.FSYTDTSI S®&GGFKFMEXPIHRPTCF¥HNFaSS5GMH5aegim^PMnrSP»SXfiB3SWPRSTPPGFO.GG»8S

ΥαΕΕνΕΏΚΚνΕΕΕΕΕ^ΕδΕΥΥδΕΡΡΧΡ^ΕδδΤΪΤΕδΧΗΐνΒΏΕΡΡΕΧΕΟ^ΡΥΤΕΕΡΜί^ΕΑ HWLTI_tÃ^VM!SLGI^TDD2I^T>PI^nnSGLJ[KD?SLS£TAXPDS5¥KGRWÍKXLMroiEVR.

SWLIAXLgALKAKS¥KAKLL¥S5aSKSVTMS3CTVI₁PSAA.TFAGftS'SLT¥DAVXVPCSKXÀDIA ΕΕΘΟΜηΠΓΣ38Ι»1ΚΗΣ^ΧΜΑαΐ»^ΚΡ8»ΤΣΚΣΑΒ0αΕΒδΧνΕΑ»3Ι^8ΡΙΦΕ&&Τί«ΑΑΗΒ

WSSIPEIDKXFA

SEQ ID NO. 50

Aminoácido

Catalase HPII (KatE) com domínio alvo de Tricoma de CBDA Sintase

Escherichia coli

Ι^ΧΡΤΡΕΕΪ^ΓϋΚΧΧΡΡΕΕΕΕϊη^δΣΑίΚςϊΒ^ΚΡΗΜδΡΧάϊΠδΕΒΜΕΡδϊΕίδΧΛΡΕββδϊϊ

ΕΡ^:ΑΑΕΡΤΡΡβΑ^Ρ^ΑΡβΕβΚΑΡΠΤΚΪ?ΕΚΕϊ?ΕΕ®^Κ3®Ε^'ΑΕΤΤΝς«νΕΣΜ>·δ^ίϊ®Ι_££ΑδΡ® «ΡΤΖΖΕΒΕΙΣΕΕΕΣΤΚ^βΗΕΡΙΪΈΕΙΥΪ^ΕΐΕΕΑΑΗδΥ^ΡΥΚΕΕΕϋΣΤΚΑϋΡΕΕΕΡΝΕΣΤΡνΕν ΡΕ8Τνςΐ®®Αδ®ΑβΤΛ?ΕβΧΕ®ΡΆΤΚΕ¥ΤΕΕ3:ΣΕΕΕ_ίν®ϊ3®Τ'ΡΣΕΕΣ2ΠΑΪ3:ΡΡβΕνΉΑ¥Κ:ΡΕΡΗ·».

I Re^SD®DTR®¥VSXígPETSS8Vl®®a^DRGI PES ¥ΕΤΜΕ@ΕΏΙΗΤΡΡΕΣΙ·?ΑΕβΕ&ΤΕνΡΕΕ

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ΕΕΕΟ©Ρ8Ρ®ΕΣΡΙΝΕ.ΡΤ£!Ρ'Ώ0ίΡαΕΕ·>8®ΕΕΜΘΣβΤΪ®^!ΑΜΕΡ»ΕΙϊ®Ν5ίΡΕΕΤΡΡ’3βΚΕί3<3ΕΕΕ

Y^EP.VES^VSERSPSFGEyySHPREWL.SgTPFSQEHXWQESFELSKWSPYZKEP^SgLA

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SADLLAXLKM,KAKG^rEAEX<LYS:R^GEVTÃDE>GTVLPIAÂTFAGA.PSLTVI3A¥XVFe®riADIÃ

Σ2ί^3ΑΗΥΧΣ^Α.ΥΚ»Σ«ΡΧΑΙΑ®ϊ&ΚΧΕΚΑΤΧΚΧΛΒ®®ΕΕ3Σν^Β3ΑΙΚ3δ^®2Χ>Χ>Τ^ϊΑ«Η8 VSÍEKXPKXDKXPA

Claims (160)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método in vivo intensificado para a produção de alto nível de canabinoides solúveis em água em uma cultura de células de suspensão de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase P450 heteróloga;

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase;

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada unia sequência de nucleotídeo codificando um transportador ABC heterólogo;

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb; e

   - expressar numa célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cultura de células de suspensão de Cannabis compreende uma cultura de células de suspensão de Cannabis sativa.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida oxidoredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de

   Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 7/196

   2/27 elétrons de uma nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) para o referido citocromo P450.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida oxidoredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo feto de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase heteróloga.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é identificada como SEQ ID NO. 7, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas ou uma sequência homóloga em Nicotiana benthamiana.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo feto de que o referido transportador ABC heterólogo é identificado como SEQ ID NO. 9, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 9.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb é um fator de transcrição myb12 endógeno da Cannabis ou um ortólogo do mesmo.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb endógeno de Cannabis é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 8/196

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    ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma de canabinoide de O acetil glicosida.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água são isolados.
19. 19. Método in vivo de produção de canabinoides solúveis em água em uma cultura de células de suspensão de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    - expressar em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima de citocromo P450 heterólogo;

    - expressar em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo; e

    - expressar em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida cultura de células de suspensão de Cannabis compreende uma cultura de células de suspensão de Cannabis sativa.

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21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila uni canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílíco canabinoide.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons de uma nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) para o referido citocromo P450.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase heteróloga.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é identificada como SEQ ID NO. 7, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.
27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana.
28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas ou uma sequência homóloga em Nicotiana benthamiana.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 10/196

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29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que expressa ainda em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador ABC identificado como SEQ ID NO. 9, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO.

    9.
30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que expressa ainda em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80%> idêntica a qualquer das sequências listadas.
31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que expressa ainda em uma célula de Cannabis geneticamente modificada uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.
35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água são isolados.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 11/196

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36. 36. Método in vivo de produção de canabinoides hidroxilados e glicosilados em uma cultura de células de suspensão de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima de citocromo heterólogo P450:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo; e

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase heteróloga; e · expressar em uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador ABC heterólogo.
37. 37. Método in vivo intensificado para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em um tricoma de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende:

    - uma planta de Cannabis:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase tendo uma sequência alvo de tricoma;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador de UDP-galactose/UDP-glícose heterólogo tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb; e

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 12/196

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38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a referida planta Cannabis compreende Cannabis sativa.
39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hídroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a referida oxidoredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons de um NADPH para o referido citocromo P450.
42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
43. 43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase tendo uma sequência de alvo de tricoma é uma glicosiltransferase heteróloga tendo unia sequência de alvo de tricoma.
44. 44. étodo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é identificada como SEQ ID NO. 19, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 19.
45. 45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é unia glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana tendo uma sequência de alvo de tricoma.
46. 46. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb é um fator de transcrição myb 12 endógeno de Cannabis, ou um ortólogo do mesmo.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 13/196

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47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb endógeno de Cannabis é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou unia sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga compreende uma catalase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma.
50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
52. 52. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.
54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água são isolados.

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55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de UDP-galactose/UDP-gücose tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática transporta substrato de açúcar para a referida glicosiltransferase tendo uma sequência de alvo de tricoma no referido tricoma de Cannabis.
56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de UDP-galactose/UDP-glicose tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática é identificado como SEQ ID NO. 21, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 21.
57. 57. Método in vivo de produção de canabinoides hidroxilados e glicosilados em uma cultura de células de suspensão de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima de citocromo heterólogo P450:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo; e

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase heteróloga.
58. 58. Método in vivo de produção de canabinoides hidroxilados em uma planta Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    - uma planta Cannabis geneticamente modificada expressando:

    - uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima de citocromo P450 heterólogo; e

    - uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo.
59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 15/196

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60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons de um NADPH para o referido citocromo P450.
62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
63. 63. Método in vivo para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em um tricoma de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase tendo uma sequência alvo de tricoma; e · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador de UDP-galactose/UDP-glicose tendo uma sequência de alto de membrana plasmática.
64. 64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo feto de que a referida Cannabis compreende Cannabis sativa.
65. 65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila uni canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílíco canabinoide.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 16/196

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66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons do NADPH para o citocromo P450.
68. 68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase tendo uma sequência de alvo de tricoma é uma glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma.
70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é identificada como SEQ ID NO. 19, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.
71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana tendo uma sequência de alvo de tricoma.
72. 72. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotideo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotideo codificando uma catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 17/196

    12/27

    NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
74. 74. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
75. 75. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
76. 76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.
77. 77. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água são isolados.
78. 78. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de UDP-galactose/UDP-glicose tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática é identificado como SEQ ID NO. 21, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 21.
79. 79. Método in vivo intensificado para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em um citosol de célula de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende:

    - gerar uma cepa de cannabis em que um ou mais genes da canabinoide sintase foram interrompido e/ou eliminados;

    - expressar na referida cepa de cannabis uma ou mais canabinoide sintases que correspondem ao gene eliminado e em que as referidas uma ou mais canabinoides sintases que têm seu sinal de alvo de tricoma interrompido e/ou removido;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 18/196

    13/27 · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase; e

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb; e

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga.
80. 80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais genes da canabinoide sintase compreendem um gene da canabinoide sintase selecionado do grupo que consiste em: um gene da CBG sintase, um gene da THCA sintase, um gene da CBDA sintase ou um gene da CBCA sintase.
81. 81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais canabinoide sintases tendo seu sinal de alvo de tricoma interrompido e/ou removido são selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 22 ou SEQ ID NO. 46, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer sequência.
82. 82. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hídroxila uni canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
83. 83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
84. 84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons de NADPH para o citocromo P450.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 19/196

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85. 85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
86. 86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase heteróloga.
87. 87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é identificada como SEQ ID NO. 7, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.
88. 88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana.
89. 89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou uma sequência de pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas de uma sequência homóloga de Nicotiana benthamiana.
90. 90. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador ABC identificado como SEQ ID NO. 9, ou uma sequência pelo menos 80%> idêntica à SEQ ID NO. 9.
91. 91. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
92. 92. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 20/196

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    NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80%> idêntica a qualquer das sequências listadas.
93. 93. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
94. 94. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
95. 95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma de canabinoide O acetil glicosida.
96. 99. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides hidroxilados.
97. 100. Método in vivo para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em um citosol de célula de Cannabis, caracterizado pelo fato de que compreende:

    - gerar uma cepa de cannabis em que um ou mais genes da canabinoide sintase foram interrompidos e/ou eliminados;

    - expressar na referida cepa de cannabis uma ou mais canabinoide sintases que correspondem ao gene eliminado e em que as referidas uma ou mais canabinoide sintases têm seu sinal de alvo de tricoma interrompido e/ou eliminado:

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

    - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo; e · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase.

    Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 21/196

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98. 101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais genes de canabinoide sintase compreendem um gene da canabinoide sintase selecionado do grupo que consiste em: um gene da CBG sintase, um gene da THCA sintase, um gene da CBDA sintase ou um gene da CBCA sintase.
99. 102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais canabinoide sintases que têm seu sinal de alvo de tricoma interrompido e/ou eliminado compreendem SEQ ID NO. 22 ou SEQ ID NO. 46, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer sequência.
100. 103. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
101. 104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
102. 105. Método, de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons de NADPH para o citocromo P450.
103. 106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
104. 107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosíltransferase heteróloga.
105. 108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é identificada como SEQ ID NO. 7, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.

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106. 109. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana.
107. 110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas ou uma sequência homóloga de Nicotiana benthamiana.

     110. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
108. 111. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas acima.
109. 112. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
110. 113. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
111. 114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.

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112. 115. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides hidroxilados.
113. 116. Método in vivo intensificado para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em uma célula de citosol de uma planta não produtora de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida;

     · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga; e

     - introduzir unia quantidade de canabinoides na referida planta não produtora de canabinoide.
114. 117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a referida planta não produtora de canabinoide é Nicotiana benthamiana.
115. 118. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo foto de que as referidas uma ou mais enzimas da canabinoide sintase heteróloga, em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida compreende um gene da canabinoide sintase selecionado do grupo que consiste em: um gene da CBG sintase, um gene da THCA sintase, um gene da CBDA sintase ou um gene CBCA sintase.
116. 119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 24/196

     19/27 canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida compreende uma enzima da canabinoide síntase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida identificada como SEQ ID NO. 46, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 46, ou SEQ ID NO. 22, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica àSEQ ID NO. 22.
117. 120. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
118. 121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
119. 122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons do NADPH para o citocromo P450.
120. 123. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.
121. 124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase heteróloga.
122. 125. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga é identificada como SEQ ID NO. 7, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 7.
123. 126. Método, de acordo com a reivindicação VCIOO, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum Nicotiana benthamiana.
124. 127. Método, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 25/196

     20/27 que consiste em: SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou unia sequência de pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das seqüências listadas ou uma sequência homóloga de Nicotiana benthamiana.
125. 128. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
126. 129. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando unia catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80%> idêntica a qualquer das sequências listadas.
127. 130. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
128. 131. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
129. 132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.
130. 133. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides hidroxilados.
131. 134. Método in vivo para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água em um citosol de célula de uma planta não produtora de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende:

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 26/196

     21/27 · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

     - expressar uma glicosiltransferase tendo uma sequência alvo de tricoma; e · introduzir uma quantidade de canabinoides na referida planta não produtora de canabinoide.
132. 135. Método in vivo para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água no tricoma de uma planta não produtora de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma ou mais enzimas da cababinoide sintase heteróloga;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorreudtase de P450 heterólogo;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma;

     - expressae uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador de UDP-galactose/UDP-glicose tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga; e · introduzir uma quantidade de canabinoides na referida não produtora de canabinoide.

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133. 136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a referida planta não produtora de canabinoide é Nicotiana benthamiana.
134. 137. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que as referidas unia ou mais enzimas da canabinoide sintase heteróloga, em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida compreende um gene da canabinoide sintase selecionado do grupo que consiste em: um gene da CBG sintase, um gene da THCA sintase, um gene da CBDA sintase ou um gene da CBCA sintase.
135. 138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotideo codificando uma enzima da canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida compreende uma enzima da canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida identificada como SEQ ID NO. 46, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 46, ou SEQ ID NO. 22, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica àSEQ ID NO. 22.
136. 139. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 heterólogo hidroxila um canabinoide para formar um canabinoide hidroxilado e/ou oxida um canabinoide hidroxilado para formar um ácido carboxílico canabinoide.
137. 140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo heterólogo P450 é identificado como SEQ ID NO. 1, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 1.
138. 141. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo facilita a transferência de elétrons do NADPH para o citocromo P450.
139. 142. Método, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que a referida oxidorredutase de P450 heterólogo é identificada como SEQ ID NO. 3, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 3.

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140. 143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma é identificada como SEQ ID NO. 19. ou uma sequência pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO. 19.
141. 144. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase é uma glicosiltransferase de Nicotiana tabacum Nicotiana benthamiana.
142. 145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que a referida glicosiltransferase de Nicotiana tabacum é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, ou uma sequência de pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas, cada uma tendo uma sequência alvo de tricoma ou uma sequência homóloga de Nicotiana benthamiana, cada uma tendo uma sequência de alvo de tricoma.
143. 146. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb de Cannabis selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
144. 147. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 13, ou SEQ ID NO. 15, ou uma sequência pelo menos 80%> idêntica a qualquer das sequências listadas.
145. 148. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que expressa ainda uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga tendo um domínio de alvo de tricoma selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 47, ou SEQ ID NO. 48, ou SEQ ID NO. 49, ou SEQ ID

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     NO. 50, ou uma sequência peto menos 80% idêntica a qualquer uma das sequências listadas.
146. 149. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado peto fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides glicosilados tendo uma ou mais frações glicosidas.
147. 150. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides acetilados.
148. 151. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que os referidos canabinoides acetilados compreendem uma forma canabinoide de O acetil glicosida.
149. 152. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado peto fato de que os referidos canabinoides solúveis em água compreendem canabinoides hidroxilados.
150. 153. Método in vivo intensificado para produção de alto nível e acumulação de canabinoides solúveis em água no tricoma de uma planta não produtora de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da canabinoide sintase;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma glicosiltransferase heteróloga tendo uma sequência de alvo de tricoma;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador de UDP-galactose/UDP-glicose tendo uma sequência de alvo de membrana plasmática;

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 30/196

     25/27 · introduzir uma quantidade de canabinoides na referida planta não produtora de canabinoide.
151. 154. Método in vivo intensificado de produção de canabinoides solúveis em água em uma cultura de suspensão de células de Nicotiana benthamiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

     - gerar uma cultura de células de suspensão de Nicotiana benthamiana;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da canabinoide sintase heteróloga em que a sequência de alvo de tricoma foi inativada e/ou removida;

     · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

     - expressar uma glicosiltransferase endógena;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um transportador ABC heterólogo;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga; e · introduzir uma quantidade de canabinoides na referida planta não produtora de canabinoide.
152. 155. Método in vivo intensificado de glicosilar canabinoides em Nicotiana benthamiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima da canabinoide sintase heteróloga;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um citocromo heterólogo P450;

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma oxidorredutase de P450 heterólogo;

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 31/196

     26/27 · introduzir uma quantidade de canabinoides na referida planta não produtora de canabinoide.
153. 156. Método para aumentar a produção de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga em que a referida catalase tem uma sequência de alvo de tricoma em uma planta produtora d canabinoide.
154. 157. Método, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que a referida planta produtora de canabinoide é Cannabis Sativa.
155. 158. Método, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga em que a referida catalase tem uma sequência de alvo de tricoma selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 47, ou SEQ ID NO. 48, ou SEQ ID NO. 49, ou SEQ ID NO. 50, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.
156. 159. Método para aumentar a produção de canabinoide, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

     - expressar uma sequência de nucleotídeo codificando uma catalase heteróloga em que a referida catalase tem uma sequência alvo de tricoma; e · expressar uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição myb.
157. 160. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que a referida planta produtora de canabinoide é Cannabis Sativa.
158. 161. Método, de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo fato de que a referida catalase heteróloga em que a referida catalase tem uma sequência de alvo de tricoma selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 47, ou SEQ ID NO. 48, ou SEQ ID NO. 49, ou SEQ ID NO. 50, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listadas.

     Petição 870190095591, de 24/09/2019, pág. 32/196

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159. 162. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb é um fator de transcrição myb12 endógeno de Cannabis ou um ortólogo do mesmo.
160. 163. Método, de acordo com a reivindicação 162, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição myb endógeno de Cannabis é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, ou uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer das sequências listada.