CN108472279A

CN108472279A - 通过生物合成方法制造辣椒酯类物质的方法

Info

Publication number: CN108472279A
Application number: CN201780005728.5A
Authority: CN
Inventors: 陈辉; 余晓丹
Original assignee: Kenagen Co
Current assignee: Kenagen Co; Conagen Inc
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-08-31
Also published as: CA3010716A1; US20190010522A1; EP3377057A4; EP3377057A1; MX2018008351A; US10655150B2; KR20180101445A; BR112018013539A2; AU2017205501A1; WO2017120473A1; JP2019500877A

Abstract

本文提供制造辣椒酯类物质的方法，其包括在混合物或细胞系统中提供辣椒素酯合成酶；向所述混合物或细胞系统中供应8‑甲基‑6‑壬烯酰基‑CoA、6E‑8‑甲基壬烯酸或8‑甲基壬酸；向所述混合物或细胞系统中供应香草醇；以及从所述混合物或细胞系统收集辣椒酯类物质。

Description

通过生物合成方法制造辣椒酯类物质的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年1月7日申请的美国临时申请第62/276,059号的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及以生物合成方式，主要在细胞系统中制造辣椒酯类物质(包括辣椒素酯、二氢辣椒素酯、去甲二氢辣椒素酯)的方法。

背景技术

辣椒酯类物质，其包括辣椒素酯、二氢辣椒素酯和去甲二氢辣椒素酯，是天然存在于红辣椒(辣椒(Capsicum annuum上.))中的分子。辣椒素酯主要发现于红胡椒的非刺激性栽培品种CH19 Sweet中，并且已知可以提供与辣椒碱类似的作用，包括辣椒碱受体的激活。首先在独特红辣椒品种CH-19 Sweet(其不含辣椒碱)中分离辣椒酯类物质(矢泽(Yazawa)等人，1989)。

辣椒酯类物质是类辣椒素样物质，如上所述，其首先在名为CH-19Sweet的胡椒(辣椒(Capsicum annuum L.))的非刺激性栽培品种的果实中报道(矢泽等人，1989)。随后，鉴别辣椒素酯(((E)-8-甲基-6-壬烯酸4-羟基-3-甲氧基苯甲酯)、二氢辣椒素酯(8-甲基壬酸4-羟基-3-甲氧基苯甲酯)以及去甲二氢辣椒素酯(7-甲基辛酸4-羟基-3-甲氧基苯甲酯)是CH-19 Sweet中三种重要的辣椒酯类物质(小叶田(Kobata)等人，1998；小叶田等人，1999)。在辣椒酯类物质中，辣椒素的芳香族部分，香草胺，由香草醇替代，然而其酰基残基与相应的辣椒素的酰基残基相同。

先前已报道辣椒素可以能量代谢、抑制体脂积累并且具有提供用于肥胖和糖尿病的饮食疗法的潜力。然而，辣椒碱具有强刺激性和神经毒性，很大程度上阻止其被给予人类(增田(Masuda)等人，2003)。相比之下，可以在无痛情况下使用更大量的辣椒素酯，并且其对能量代谢和体重减轻的作用与辣椒碱类似(增田等人，2003；斯尼克(Snitker)等人，2009)。如今，广泛使用辣椒素酯和CH-19甜椒提取物作为膳食补充剂来增强代谢。

尽管辣椒酯类物质在结构上与辣椒碱(引起辣椒中的刺激性的物质)类似，但辣椒酯类物质的刺激性显著较低。已知辣椒酯类物质具有估算的“辛辣味临限值”，其是辣椒碱的约1/1000。辣椒碱与辣椒酯类物质家族成员之间的结构差异显示于图1中。与辣椒碱的酰胺键相比，辣椒酯类物质在其结构中具有酯键。

相信辣椒碱可以激活舌部上用于检测热量的感官受体(斯扎拉斯(Szallasi)等人1999)。这些受体，瞬时受体电位香草素1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1；TRPV1)，也存在于胃和其它器官中(纳吉(Nagy)等人2004)。应理解，激活TRPV1受体可以触发交感神经系统(SNS)(岩井(Iwai)等人，2003)。辣椒碱可以通过激活SNS来介导人体和动物中脂肪燃烧增加。

与辣椒碱相同，辣椒酯类物质激活感官受体，如瞬时受体电位香草素1(TRPV1)受体(饭田(Iida)等人，2003)。辣椒碱和辣椒酯类物质可以通过激活SNS来介导人体和动物中脂肪燃烧增加。然而，与辣椒碱不同，辣椒酯类物质不会引起口腔中的热感，这可能是因为由于与辣椒碱相比的结构差异，辣椒酯类物质无法实体上到达口腔中的TRPV1受体。但是，辣椒酯类物质可以激活胃中的TRPV1受体，已证实其对于辣椒碱和辣椒酯类物质的代谢作用是重要的(大贯(Ohnuki)等人，2001)。

相信这些代谢作用有助于辣椒碱和辣椒酯类物质的许多健康有益性质，包括抗癌性、抗炎性和镇痛活性，以及体重管理(马乔(Macho)等人，2003；桑乔(Sancho)等人，2002；何(He)等人，2009；川端(Kawabata)等人，2006；汉德勒(Handler)等人，2008)。研究表明在给予辣椒酯类物质或CH-19 Sweet的提取物之后，人体中出现能量代谢(斯尼克等人，2009；井上(Inoue)等人，2007)和体温(大贯等人，2001；哈基亚(Hachiya)等人，2007)升高。此外，在摄入辣椒酯类物质之后抑制体脂积累(大贯等人，2001)。

然而，甜椒中的辣椒酯类物质含量极低。举例来说，仅可以从10,000磅CH-19甜椒中提取一磅辣椒酯类物质，其是昂贵的，推动辣椒素酯的市场价格，引起从甜椒提取的辣椒素酯的价格极其昂贵(例如40％到98％纯度的辣椒素酯的价格是US$600-25,000；www.alibaba.com/product-detail/High-quality-Capsiate-40-to-98_344832645.html？spm＝a2700.7724838.35.1.J77Yht)。因此，需要更有效的可以大量产生辣椒酯类物质的方法。

发明内容

本公开涉及制造辣椒酯类物质的方法，例如使用如本文中所描述的混合物或细胞系统。

在一些方面中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)；向细胞系统中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒酯类物质。在其它方面中，提供一种制备二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向细胞系统中添加8-甲基壬酸和香草醇；以及培育细胞系统足够的时间以产生二氢辣椒素酯。在其它方面中，提供一种制备辣椒素酯的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶；向细胞系统中添加6E-8-甲基壬烯酸和香草醇；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒素酯。在另一方面中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向细胞系统中添加中链脂肪酸和香草醇；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒酯类物质。

在任一种以上方法的一些实施例中，CS氨基酸序列是来源于辣椒属(Capsicumgenus)的植物。在一些实施例中，辣椒属植物是魔鬼辣椒(ghost chili)植物。在一些实施例中，CS包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，CS包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在任一种以上方法的一些实施例中，ACS氨基酸序列是来源于辣椒属的植物。在一些实施例中，辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。在一些实施例中，ACS包含与SEQ ID NO：2具有至少90％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，ACS包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在任一种以上方法的一些实施例中，细胞系统使选自包括以下各项的群组：酵母菌、非辣椒酯类物质产生植物、海藻和细菌。在一些实施例中，细胞系统是细菌。在一些实施例中，细胞系统是大肠杆菌(E.Coli)。

在任一种以上方法的一些实施例中，所述方法进一步包含收集所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯。在一些实施例中，所述方法进一步包含将所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯纯化到大于70％的纯度。在一些实施例中，纯化步骤包含酸-碱提取。在一些实施例中，纯化步骤包含真空蒸馏。在一些实施例中，纯化步骤包含半制备型HPLC。

在其它方面中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；向反应混合物中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇；以及培育反应混合物足够的时间以产生辣椒酯类物质。在一些方面中，提供一种产生二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向反应混合物中添加8-甲基壬酸和香草醇；以及培育反应混合物足够的时间以产生二氢辣椒素酯。在另一方面中，提供一种制备辣椒素酯的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶；向反应混合物中添加6E-8-甲基壬烯酸和香草醇；以及培育反应混合物足够的时间以产生辣椒素酯。在另一方面中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向反应混合物中添加中链脂肪酸和香草醇；以及培育反应混合物足够的时间以产生由此制备的辣椒酯类物质。

在任一种以上方法的一些实施例中，CS氨基酸序列是来源于辣椒属的植物。在一些实施例中，辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。在一些实施例中，CS包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，CS包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在任一种以上方法的一些实施例中，在选自包括以下各项的群组的细胞系统中产生CS和/或ACS：酵母菌、非辣椒酯类物质产生植物、海藻以及细菌。在一些实施例中，细胞系统是细菌。在一些实施例中，细胞系统是大肠杆菌。

在任一种以上方法的一些实施例中，所述方法进一步包含从反应混合物收集所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯。在一些实施例中，所述方法进一步包含将所产生的辣椒素酯、辣椒素酯或二氢辣椒素酯纯化到大于70％的纯度。在一些实施例中，纯化步骤包含酸-碱提取。在一些实施例中，纯化步骤包含真空蒸馏。在一些实施例中，纯化步骤包含半制备型HPLC。

本公开还提供以下额外实施例。在一些实施例中，提供用于制造辣椒酯类物质的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；向混合物中供应8-甲基壬酰基-CoA；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒酯类物质。在一些实施例中，提供用于制造辣椒素酯的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；在混合物中提供酰基转移酶；供应6E-8-甲基壬烯酸；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒素酯。在一些实施例中，提供用于制造二氢辣椒素酯的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；在混合物中提供酰基转移酶；供应8-甲基壬酸；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒素酯。在一些实施例中，提供用于制造辣椒酯类物质的生物转化方法，其包含在细胞系统中表达CS基因；在细胞系统中表达ACS1基因；向细胞系统中供应中链脂肪酸；向细胞系统中供应香草醇；收集辣椒酯类物质。

附图说明

图1显示辣椒素酯、二氢辣椒素酯和去甲二氢辣椒素酯的分子结构。

图2显示辣椒素酯合成酶(CS)催化的辣椒素酯生物合成图。

图3显示分别由6E-8-甲基壬烯酸(6E)和8-甲基壬酸(8M)进行的假定的辣椒素酯(CQ)和二氢辣椒素酯(DHCQ)产生的HPLC分布图。VA(香草醇)、6E和8M浓度是500mg/L。如图3中所示，分别由6E和8M形成不同产物。

图4显示分别由VA+6E(VE)和VA+8M(VM)进行的CQ和DHCQ产生。实验是一式三份地进行。

图5显示进行GC/MS以确认培养物中CQ和DHCQ的一致性。

图6显示GC/MS库中DHCP(二氢辣椒素)谱图与从诱导样品获得的CQ和DHCQ谱图的比较，因为GC/MS库中不存在CQ和DHCQ谱图并且最接近的匹配是DHCP(二氢辣椒素)。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。虽然可以在本公开的实践或测试中使用任何类似于或等效于本文中所述的那些方法和材料的方法和材料，但选择的材料和方法描述如下。

关于本发明技术的变异型多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”是指在比对序列且引入间隙(视需要)以实现最大序列一致性百分比之后，候选序列中与参考多肽的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列一致性的一部分。

为了确定氨基酸序列一致性百分比而进行的比对可以按所属领域技能内的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列全长内实现最大比对所需的任何算法。举例来说，可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2测定氨基酸序列一致性％。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从ncbi.nlm.nih.gov下载。NCBIBLAST2使用若干搜索参数，其中所有这些搜索参数将设置成默认值，包含例如无屏蔽＝是，链＝所有，预期出现＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多程e值＝0.01，多程常数＝25，最终间隙比对衰减＝25并且评分矩阵＝BLOSUM62。在其中使用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较的情况中，既定氨基酸序列A与、和或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(其可替代地表述成具有或包含与、和或针对既定氨基酸序列B的某一氨基酸序列一致性％的既定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的序列比对程序NCBI-BLAST2比对中，通过序列比对程序NCBI-BLAST2以相同匹配形式进行评分的氨基酸残基数，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应了解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。

在此意义上，用于测定氨基酸序列“相似性”的技术在所属领域中是众所周知的。一般来说，“相似性”是指在适当位置处，两个或更多个多肽的精确氨基酸与氨基酸比较，其中氨基酸是一致的或具有类似的化学和/或物理性质，如电荷或疏水性。随后，可以测定所比较的多肽序列之间的所谓的“相似性百分比”。用于测定核酸和氨基酸序列一致性的技术在所属领域中也是众所周知的，并且包括测定所述基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过cDNA中间物)，并且测定其中编码的氨基酸序列，并且将此与第二氨基酸序列进行比较。一般来说，“一致性”分别是指两个聚核苷酸或多肽序列的精确核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应关系。可以通过测定“一致性百分比”来比较两个或更多个聚核苷酸序列以及两个或更多个氨基酸序列。可以在威斯康星序列分析软件包(Wisconsin Sequence AnalysisPackage)，第8版(可以从威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup，Madison，Wis.)获得)获得的程序，例如GAP程序，能够分别计算两个聚核苷酸之间的一致性以及两个多肽序列之间的一致性和相似性。其它用于计算序列之间的一致性或相似性的程序是所属领域的技术人员已知的。

除非另外规定，否则两个多肽或聚核苷酸序列的一致性百分比是指跨越两个序列中的较短一个的整个长度的一致氨基酸残基或核苷酸的百分比。

“转化”是根据其由所属领域的技术人员理解的一般和惯用含义使用，并且用于指(但不限于)将聚核苷酸转移到目标细胞中。可以将被转移的聚核苷酸并入目标细胞的基因组或染色体DNA中，引起遗传学上稳定的继承，或其可以独立于宿主染色体来复制。含有被转化的核酸片段的宿主生物被称为“转殖基因”或“重组”或“转化”生物。

当在本文中结合宿主细胞使用时，术语“转化”、“转殖基因”和“重组”是根据其由所属领域的技术人员所理解的一般和惯用含义使用，并且用于指(但不限于)宿主生物的细胞，如植物或微生物细胞，其中已引入异源核酸分子。可以将核酸分子稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或核酸分子可以染色体外分子形式存在。

当在本文中结合聚核苷酸使用时，术语“重组”、“异源”和“非原生”是根据其由所属领域的技术人员所理解的一般和惯用含义使用，并且用于指(但不限于)满足以下条件的聚核苷酸(例如DNA序列或基因)：其来源于对具体宿主细胞来说是外来的来源，或(如果来自相同来源)由其原始形式被修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对具体宿主细胞来说是内源性，但已经通过例如使用定点突变诱发或其它重组技术修饰的基因。所述术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个复本。因此，所述术语指满足以下条件的DNA片段：对于细胞来说是外来或异源的，或与细胞同源，但在通常未发现所述元件的宿主细胞内的位置或形式。

类似地，当在本文中结合多肽或氨基酸序列使用时，术语“重组”、“异源”和“外源性”意指满足以下条件的多肽或氨基酸序列：其来源于对于具体宿主细胞来说是外来的来源，或(如果来自相同来源)由其原始形式被修饰。因此，可以在宿主细胞中表达重组型DNA以产生重组型多肽。

如本文中所使用，术语“细胞系统”是指任何提供异位蛋白质的表达的细胞。其包括细菌、酵母菌、植物细胞和动物细胞。其包括原核和真核细胞。其还包括利用细胞组分(如核糖体)进行的活体外蛋白质表达。

如本文中所使用，术语“使细胞系统生长”包括提供可实现细胞倍增和分裂的培养基。其还包括提供资源，使得细胞或细胞组分可以翻译和制造重组型蛋白质。

如本文中所使用，术语“蛋白质表达”是指作为基因表达的一部分的蛋白质产生。其由在DNA被翻译成信使RNA(mRNA)之后的阶段组成。接着，将mRNA翻译成多肽链，是最终折叠成蛋白质。DNA通过转染而存在于细胞中，转染是一种故意将核酸引入细胞的过程。所述术语通常用于真核细胞中的非病毒性方法。其还可以指其它方法和细胞类型，但其它术语是优选的：“转化”更通常用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒性DNA转移。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。对于本申请案，转化、转导和病毒感染包括于转染的定义中。此外，蛋白质表达包括活体外翻译，其中利用位于细胞外的细胞器表达蛋白质。

如本文中所使用的术语“生物变换”，也称为“生物转化”，是指使用活的生物(通常微生物，例如细菌和酵母菌)进行化学反应，所述反应在以非生物学方式进行时可能成本更高或不可行。这些生物将物质转化成被化学修饰的形式。

如本文中所使用的术语“反应混合物”和“混合物”是指两个或更多种物质的物理组合，所述物质可以溶液、悬浮液或胶体形式混合，具有所属领域中已知的多种变化。反应混合物可以包含重组型蛋白质(例如本文中所描述的ACS和CS)与一种或多种活体外反应系统组分(如基质(例如本文中所描述的香草醇(VA)、6E-8-甲基壬烯酸(6E)和/或8-甲基壬酸(8M))、缓冲液(例如磷酸钾缓冲液)和盐(例如MgCl₂))的混合物。举例来说，申请人使用以HPLC为基础的方法测量辣椒ACS1的活性(陈(Chen)等人，2011)。在这类系统中，反应混合物(400μE)含有0.1M Tris-HCl，pH 7.5；2mM DTT；5mM ATP；10mM MgCl₂；0.5mM CoA；0.1％曲拉通(Triton)和200μM羧酸。通过添加20μm被纯化的酶来开始反应，并且在30分钟之后通过添加20微摩尔乙酸来停止。使用120 CI 8反相柱(赛默科技公司(ThermoScientific)；3μ，120A，150×3mm)，用3000 LC系统(赛默科技公司)进行HPLC。流动相由溶剂A(0.1％三氟乙酸)和溶剂B(乙腈)组成。梯度溶离程序如下：0到5min，5％B；5到9min，从5到80％B的线性梯度；9到11min，80％B；11到12min，5％B。流动速率使0.6ml/min。二极管阵列检测器在200到400nm范围内收集数据。对于基质和产物的检测和量化，在257nm下测量峰面积。

当在本文中结合术语“包含”使用时，字词“一(a/an)”的使用可以指“一个”，但是其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义相符。

如上文所描述，辣椒酯类物质，如以CH-19甜椒提取物形式存在的辣椒素酯和辣椒酯类物质，广泛用于多种目的，但目前生产成本过于昂贵。相信辣椒素酯是在辣椒中由辣椒素酯合成酶(CS，也称为辣椒碱合成酶)天然合成，辣椒素酯合成酶是一种酰基转移酶，其将8-甲基-6-壬烯酰基部分从8-甲基-6-壬烯酰基-CoA转移到香草醇以形成酯结合物(图2)并且在遗传学上，其生物合成由辣椒中的Pun1基因座控制(汉(Han)等人，2013)。

如本文中所描述，已发现利用酰基-CoA合成酶(ACS，如魔鬼辣椒ACS1)和辣椒素酯/辣椒碱合成酶(CS，如魔鬼辣椒AT3/PUN1)的表达系统在被供应适当起始物质(如香草醇(VA)和6E-8-甲基壬烯酸(6E)或8-甲基壬酸(8M))时可以用于产生辣椒酯类物质。

细胞系统

在一些方面中，本公开涉及在细胞系统中，如在细菌或真菌细胞中产生辣椒酯类物质。在一些实施例中，细胞系统使过表达魔鬼辣椒ACS1和AT3/PUN1基因的大肠杆菌培养物。先前已经描述使用魔鬼辣椒ACS1和AT3/PUN1产生辣椒素(参见例如PCT/US2015/011729，以PCT申请公开案第WO2015109168号公开，其以全文引用的方式并入本文中)。如上文所描述，可以在结构上和功能上区分辣椒素与辣椒酯类物质。如图3中所示，通过引入6E-8-甲基壬烯酸(6E)和香草醇(VA)或8M和VA来形成不同的辣椒酯类物质产物。更多的定量数据表明这种ACS1-PUN1系统优选8M作为基质(图3)。

在一些实施例中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)；向细胞系统中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇(共同或分开地)；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒酯类物质。在一些实施例中，提供一种制备二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向细胞系统中添加8-甲基壬酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育细胞系统足够的时间以产生二氢辣椒素酯。在一些实施例中，提供一种制备辣椒素酯的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶；向细胞系统中添加6E-8-甲基壬烯酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒素酯。在一些实施例中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向细胞系统中添加中链脂肪酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育细胞系统足够的时间以产生辣椒酯类物质。

例示性细胞系统包括酵母细胞(甲醇酵母(Pichia Pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、植物或植物细胞(例如非辣椒酯类物质产生植物或植物细胞，如阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza Sativa)或玉米(Zea mays))、海藻细胞以及细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli))。

足以产生相关辣椒酯类物质的时间量视所制备的辣椒酯类物质、所使用的细胞系统的类型以及用于维持细胞系统的条件而不同。实例中提供用于在细菌中产生辣椒酯类物质的例示性条件。类似条件可以适用于酵母，如酿酒酵母，已证实其能够以生物合成方式产生许多分子(参见例如PCT申请公开案第WO2014086842号)。本文中所描述的条件也可以适用于植物细胞，已证实其也能够以生物合成方式产生许多分子(参见例如PCT申请公开案第WO2010124324号)。

本公开的另一实施例是用于制造辣椒酯类物质的生物转化方法，其包含在细胞系统中表达CS基因；在细胞系统中表达ACS1基因；向细胞系统中供应中链脂肪酸；向细胞系统中供应香草醇；以及收集辣椒酯类物质。

在任一种本文中提供的细胞系统的一些实施例中，可以使用辣椒素酯合成酶(CS)。在一些实施例中，CS核酸和/或氨基酸序列是来源于辣椒属植物(例如魔鬼辣椒植物或CH19 Sweet植物)。在一些实施例中，CS包含与SEQ ID NO：1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，CS由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。在一些实施例中，CS由与SEQ ID NO：3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的核酸序列编码。

魔鬼辣椒Pun1/AT3的例示性氨基酸序列

在任一种本文中提供的细胞系统的一些实施例中，可以使用酰基转移酶(ACS)。在一些实施例中，ACS核酸和/或氨基酸序列是来源于辣椒属植物(例如魔鬼辣椒植物或CH19Sweet植物)。在一些实施例中，ACS包含与SEQ ID NO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，ACS由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在一些实施例中，ACS由与SEQID NO：4具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的核酸序列编码。

魔鬼辣椒ACS的例示性氨基酸序列

反应混合物

本公开也涉及使用反应混合物(例如活体外反应混合物)制备辣椒酯类物质，所述反应混合物包含ACS(如魔鬼辣椒ACS1)和/或CS(如魔鬼辣椒AT3/PUN1)，向所述反应混合物中添加合适的起始物质(例如VA和6E或VA和8M)。

在一些实施例中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；向反应混合物中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇(共同或分开地)；以及培育反应混合物足够的时间以产生辣椒酯类物质。在一些实施例中，提供一种制备二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向反应混合物中添加8-甲基壬酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育反应混合物足够的时间以产生二氢辣椒素酯。在一些实施例中，提供一种制备辣椒素酯的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向反应混合物中添加6E-8-甲基壬酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育反应混合物足够的时间以产生辣椒素酯。在一些实施例中，提供一种制备辣椒酯类物质的方法，所述方法包含在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；向反应混合物中添加中链脂肪酸和香草醇(共同或分开地)；以及培育反应混合物足够的时间以产生由此制备的辣椒酯类物质。应理解，可按任何顺序添加反应混合物的组分(共同或分开地)，只要所得反应混合物能够在培育后产生所需辣椒酯类物质即可。

用于反应混合物的酶可以由任何来源产生，优选以重组方式，例如在大肠杆菌或另一种合适的能够产生酶的宿主细胞中，或以合成方式产生。反应混合物可以是缓冲溶液，其含有酶和其它组分，如起始物质(例如VA和6E或VA和8M)和盐，其可以适合于产生所需辣椒酯类物质。反应混合物还可以含有细胞裂解物(例如大肠杆菌或酵母细胞裂解物)或由其组成，其中可以向所述细胞裂解物中添加其它组分，如起始物质(例如VA和6E或VA和8M)。

在任一种本文中提供的细胞系统的一些实施例中，可以使用辣椒素酯合成酶(CS)。在一些实施例中，CS核酸和/或氨基酸序列是来源于辣椒属植物(例如魔鬼辣椒植物或CH19 Sweet植物)。在一些实施例中，CS包含与SEQ ID NO：1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，CS由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

在任一种本文中提供的反应混合物的一些实施例中，可以使用酰基转移酶(ACS)。在一些实施例中，ACS核酸和/或氨基酸序列是来源于辣椒属植物(例如魔鬼辣椒植物或CH19 Sweet植物)。在一些实施例中，ACS包含与SEQ ID NO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，ACS由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

足以产生相关辣椒酯类物质的时间量视所制备的辣椒酯类物质、所使用的反应混合物的类型以及用于培育反应混合物的条件而不同。用于使用反应混合物进行生物合成产生分子的例示性条件是所属领域中已知的(参见例如PCT申请公开案第WO2016/054534号，其以全文引用的方式并入本文中)。

本公开的一个实施例是用于制造辣椒酯类物质的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；向混合物中供应8-甲基-6-壬烯酰基-CoA；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒酯类物质。

本公开的另一实施例是用于制造辣椒素酯的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；在混合物中提供酰基转移酶；供应6E-8-甲基壬烯酸；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒素酯。

本公开的另一实施例是用于制造二氢辣椒素酯的生物转化方法，其包含在混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；在混合物中提供酰基转移酶；供应8-甲基壬酸；向混合物中供应香草醇；以及收集辣椒素酯。

纯化

在任一种本文中所提供的方法的一些实施例中，所述方法可以进一步包含纯化辣椒酯类物质(例如辣椒素酯或二氢辣椒素酯)。在一些实施例中，将辣椒酯类物质纯化到50％与100重量％之间的纯度。在一些实施例中，将辣椒酯类物质纯化到大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99重量纯度％的纯度。相关辣椒酯类物质可以通过所属领域中已知或本文中所描述的任何方法纯化。例示性方法包括酸-碱提取、真空蒸馏和半制备型HPLC(参见例如李(Li H.X.)等人，食品科学技术(Food Science Technology)，57：446(2014)；和安德雷德-艾罗拉(Andrade-EiroaA.)等人，固相萃取中试错法的替代性方法：用于分析烟灰中PAH和PAH衍生物的初始自动化固相萃取程序(An alternative to trial and error methodology in solid phaseextraction：an original automated solid phase extraction procedure foranalysing PAHs and PAH-derivatives in soot)，RSC发展(RSC Advances)4：第33636-44页(2014))。

组合物

组合物中可以包括任一种通过本文中所描述的方法制备的辣椒酯类物质。在一些实施例中，组合物使口服消费产品(如饮料、食品、膳食补充剂、保健食品、医药组合物、口腔卫生组合物或化妆品)，其与人类或动物的口腔接触，包括进入并且随后从口腔排出的物质以及饮用、食用、吞咽或以其它方式摄入的物质；并且在以一般可接受的浓度范围使用时，对与人类或动物使用来说是安全的。

如本文中所使用，“膳食补充剂”是指意图补充饮食和提供可能在饮食中缺失或未能摄取足够量的营养物(如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、氨基酸等)的化合物。可以使用所属领域中已知的任何合适的膳食补充剂。合适的膳食补充剂的实例可以是例如营养物、维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、草本植物、植物性药材、氨基酸和代谢物。

如本文中所使用，“保健食品”是指一种化合物，其包括可以提供医药或健康益处的任何食物或一部分食物，包括预防和/或治疗疾病或病症(例如疲劳、失眠、老化作用、记忆力丧失、情绪障碍、心血管疾病和血液中胆固醇含量过高、糖尿病、骨质疏松、发炎、自身免疫病症等)。可以使用所属领域中已知的任何合适的保健食品。在一些实施例中，可以使用营养药剂作为食物和饮料的补充剂，以及作为用于经肠或非经肠应用的医药配制物，其可以是固体配制物，如胶囊或片剂，或液体配制物，如溶液或悬浮液。

在一些实施例中，膳食补充剂和营养药剂可以进一步含有保护性亲水胶体(如胶状物、蛋白质、被改性的淀粉)、结合剂、成膜剂、囊封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、涂料、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载剂、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、味道掩蔽剂、增重剂、啫喱化剂、成胶剂、抗氧化剂以及抗菌剂。

可以使用所属领域中已知的任何合适的医药组合物。在某些实施例中，本公开的医药组合物可以含有辣椒酯类物质和一种或多种药学上可接受的赋形剂。这类组合物可以根据所属领域中众所周知的程序制备，例如雷明顿药学科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，美国宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，USA.)中所描述。

实例

在大肠杆菌中产生辣椒酯类物质

如先前描述，来自魔鬼辣椒的ACS1和AT3/Pun1基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中共同过表达(参见例如PCT申请公开案第WO2015/066615号，其全部内容以引用的方式并入本文中)。使用质体pCDFDuet-ACS1转化胜任型大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在含有100mg/L大观霉素(spectinomycin)的LB盘上选择被转化的细胞。所得含有pCDFDuet-ACS1的BL21(DE3)细胞用于用pETite N-His SUMO-魔鬼Pun1载体的第二转化。在含有50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L大观霉素的LB盘上选择转化体。用于在转化体中共同过表达ACS1和Pun1的ACS1和AT3/Pun1编码序列显示如下：

Pun1/AT3编码序列的序列(来自魔鬼辣椒)

ACS1编码序列的序列(来自魔鬼辣椒)

接着，在转化体中诱导ACS1和PUN1的产生。简单来说，使转化体的过夜培养物在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L大观霉素的TB培养基(2％)中生长。接着，稀释过夜培养物并且在37℃下生长到OD600达到0.6，并且冷却到16℃。接着，添加1mM IPTG以诱导ACS1和Pun1的表达。在16℃下培育1小时之后，向培养物中添加以下基质：(a)500mg/L的香草醇(VA)和500mg/L的6E-8-甲基壬烯酸(6E)或(b)500mg/L的VA和500mg/L的8-甲基壬酸(8M)。香草醇的化学结构提供于图2中。6E和8M的化学结构提供于下文中。

8-甲基壬酸

(6E)-8-甲基-6-壬烯酸酯

在供应基质之后16小时采集样品，用乙酸乙酯提取假定的辣椒素酯(CQ)和二氢辣椒素酯(DHCQ)，并且分别由6E或8M培养物测量假定的CQ和DHCQ产量(图3)。更多的定量数据表明这种ACS1-Pun1系统优选8M作为基质。在一式三份实验中证实在分别用6E+VA或8M+VA诱导之后16小时的CQ和DHCQ产量(图4)。

随后，进行GC/MS分析以确认所诱导的培养物中CQ与DHCQ的一致性。用耦合有GC/MS-QP2010S检测器的Shimadzu GC-2010系统进行GC/MS分析。使用柱Rtx-5MS(厚度0.25μ；长度30m；直径0.25mm)进行分离。注射温度是265℃，注射模式是分开型，并且烘箱温度是140℃。温度梯度如下：0-1min，140℃；1-11.25min，140℃到263℃，速率12；11.25-21.25min，263℃。所获得的来自被诱导的培养物的CQ和DHCQ的GC/MS谱图显示于图5中。接着，比较这些谱图与来自GC/MS机器中MS库的DHCP(二氢辣椒素)的标准谱图。DHCP与CQ和DHCQ最匹配，因为MS库不含用于CQ或DHCQ的标准。由于DHCQ比DHCP重一道尔顿(Dalton)并且CQ比DHCP小一道尔顿，样品中CQ和DHCQ的一致性由GC/MS分布图稳定确立(图6)。这些结果表明ACS1和CS/AT3/Pun1基因可以用于通过使用VA和6E或8M作为起始物质的生物合成来产生辣椒酯类物质。

参考文献

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序列表

<110> 科纳根公司

<120> 利用生物合成途径制备辣椒酯类物质的方法

<130> C1497.70003WO00

<150> US 62/276059

<151> 2016-01-07

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 甜椒 L

<400> 1

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gctctgagct ctaccccgcg tggtgaagtt tgtgtccgcg gcgatgttct gttttccggt 1440

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ccggtgccgt ttgatatgga acgtgacctg ctgaccccga cgttcaagaa aaaacgtccg 1920

caactgctga aatactataa agatgtgatc gactcaatgt ataaaggcac gaaataa 1977

Claims

1.一种产生辣椒酯类物质的方法，所述方法包含：

(a)在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)；

(b)向所述细胞系统中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇；以及

(c)培育所述细胞系统足够的时间以产生所述辣椒酯类物质。

2.一种产生二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含：

(a)在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；

(b)向所述细胞系统中添加8-甲基壬酸和香草醇；以及

(c)培育所述细胞系统足够的时间以产生所述二氢辣椒素酯。

3.一种产生辣椒素酯的方法，所述方法包含：

(a)在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；

(b)向所述细胞系统中添加6E-8-甲基壬烯酸和香草醇；以及

(c)培育所述细胞系统足够的时间以产生所述辣椒素酯。

4.一种产生辣椒酯类物质的方法，所述方法包含：

(a)在细胞系统中表达辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；

(b)向所述细胞系统中添加中链脂肪酸和香草醇；以及

(c)培育所述细胞系统足够的时间以产生所述辣椒酯类物质。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述CS氨基酸序列是来源于辣椒属(Capsicum genus)植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述CS包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CS包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

9.根据权利要求2到8中任一项所述的方法，其中所述ACS氨基酸序列是来源于辣椒属植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。

11.根据权利要求2到10中任一项所述的方法，其中所述ACS包含与SEQ ID NO：2具有至少90％一致性的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述ACS包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述细胞系统是选自包括酵母菌、非辣椒酯类物质产生植物、海藻和细菌的群组。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞系统是细菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞系统是大肠杆菌(E.Coli)。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含收集所述所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包含将所述所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯纯化到大于70％的纯度。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述纯化步骤包含酸-碱提取。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述纯化步骤包含真空蒸馏。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述纯化步骤包含半制备型HPLC。

21.一种产生辣椒酯类物质的方法，所述方法包含：

(a)在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)；

(b)向所述反应混合物中添加8-甲基-6-壬烯酰基-CoA和香草醇；以及

(c)培育所述反应混合物足够的时间以产生所述辣椒酯类物质。

22.一种产生二氢辣椒素酯的方法，所述方法包含：

(a)在反应混合物中提供辣椒素酯合成酶(CS)和酰基转移酶(ACS)；

(b)向所述反应混合物中添加8-甲基壬酸和香草醇；以及

(c)培育所述反应混合物足够的时间以产生所述二氢辣椒素酯。

23.一种产生辣椒素酯的方法，所述方法包含：

(b)向所述反应混合物中添加6E-8-甲基壬烯酸和香草醇，以及

(c)培育所述反应混合物足够的时间以产生所述辣椒素酯。

24.一种产生辣椒酯类物质的方法，所述方法包含：

(b)向所述反应混合物中添加中链脂肪酸和香草醇；以及

(c)培育所述反应混合物足够的时间以产生由此产生的所述辣椒酯类物质。

25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法，其中所述CS氨基酸序列是来源于辣椒属植物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。

27.根据权利要求21到26中任一项所述的方法，其中所述CS包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的氨基酸序列。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述CS包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

29.根据权利要求22到28中任一项所述的方法，其中所述ACS氨基酸序列是来源于辣椒属植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述辣椒属植物是魔鬼辣椒植物。

31.根据权利要求22到30中任一项所述的方法，其中所述ACS包含与SEQ ID NO：2具有至少90％一致性的氨基酸序列。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述ACS包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

33.根据权利要求21到32中任一项所述的方法，其中所述CS和/或ACS是在选自包括以下各者的群组的细胞系统中产生：酵母菌、非辣椒酯类物质产生植物、海藻以及细菌。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞系统是细菌。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述细胞系统是大肠杆菌。

36.根据权利要求21到35中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含从所述反应混合物收集所述所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述方法进一步包含将所述所产生的辣椒酯类物质、辣椒素酯或二氢辣椒素酯纯化到大于70％的纯度。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述纯化步骤包含酸-碱提取。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述纯化步骤包含真空蒸馏。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述纯化步骤包含半制备型HPLC。