CN117083296A - 用于破坏自身耐受的疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,特别是用于破坏针对动物宿主中的内源性细胞因子的自身耐受的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物含有多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA以及一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。多蛋白质包含宿主的至少两个自身蛋白质区段,以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。本发明进一步涉及疫苗组合物用于预防和/或治疗疾病,包括预防和/或治疗瘙痒状况和/或过敏状况的用途。在另一个方面,本发明提供了用于检测针对自身蛋白质的自身抗体的存在的方法,所述自身抗体可以用本发明的疫苗组合物生成。
Description
技术领域
本发明涉及用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,特别是用于破坏针对内源性细胞因子的自身耐受的疫苗组合物,所述内源性细胞因子包括哺乳动物宿主中衍生自IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33和TNF-α蛋白的细胞因子,并且特别是内源性IL-31蛋白。本发明进一步涉及疫苗组合物用于预防和/或治疗疾病,包括预防和/或治疗瘙痒状况和/或过敏状况的用途。本发明进一步涉及多蛋白,其衍生自自身蛋白质并用作疫苗组合物中的免疫原。在另一个方面,本发明提供了用于检测针对自身蛋白质的自身抗体的存在的方法,所述自身抗体可以用本发明的疫苗组合物生成。
背景技术
疫苗对于预防和/或治疗传染病是至关重要的。然而,疫苗技术对于预防和/或治疗非传染性,经常为慢性的疾病,例如过敏、自身免疫性疾病和癌症也变得越来越重要。关于这些疾病的靶一般而言不是外来分子,而是自身蛋白质或其它自身抗原。由于免疫系统已进化为确保对于所有自身蛋白质和自身抗原的耐受,因此针对自身蛋白质的疫苗接种是非常困难的。本发明的基础研究旨在寻找规避或破坏自身耐受的方式。
自身反应性B细胞可能以低水平存在于循环中,但它们并不扩增或造成任何伤害,这主要是由于缺乏T细胞的帮助。相比之下,存在的任何自身反应性T细胞或在胸腺中被克隆删除,或在外周被免疫去势(anergized)。然而,已知的是如果自身抗原与外来(非自身)蛋白质或其部分共价偶联,意味着提供了包含自身和非自身蛋白质或蛋白质部分的融合蛋白,则对于非自身蛋白质(部分)特异性的T细胞被召募并激活。
平行地,自身反应性B细胞可以选择性地摄取含有自身和非自身蛋白质/蛋白质部分的融合蛋白,并且因此将自身肽和外来肽两者均呈递在MHC II类分子上。然后,通过自身反应性B细胞呈递的非自身肽被激活的T细胞识别,所述激活的T细胞刺激自身反应性B细胞扩增并启动针对自身蛋白质/自身抗原的免疫应答。如果免疫应答足够强,则这些自身产生的抗体具有降低靶自身蛋白质的水平的能力。如果选择负责或促成疾病的自身蛋白质作为靶,则体内生成的自身抗体可以通过中和靶自身蛋白质而充当治疗性抗体。然而,此类稳固的免疫应答很难获得。
在包括过敏、自身免疫、癌症和AIDS的各种病理状况中,细胞因子的异常释放促成发病机制和/或疾病进展。
例如,特应性皮炎是一种频繁的过敏性皮肤病症,其特征在于异常和过度的Th2细胞和ILC2激活,伴随2型细胞因子包括白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13和IL-31的稳固表达,以及其它细胞因子特别是IL-22和IL-33,以及IL-17、IL-9和IFN-γ的可变激活(Moyle等人(2019)Experimental Dermatology,28:756-768;Renert-Yuval&Guttman-Yassky(2019)Dermatol Clin 37:205-213)。特应性皮炎是不仅在人中,而且在动物特别是犬中的频繁病症。事实上,特应性皮炎是犬中最常见的过敏,并且影响了大约10%的犬群,导致单独在欧洲和美国1 500万至2000万只犬患有该疾病(Griffin等人(2001),“The ACVD task forceon canine atopic dermatitis(XIV):clinical manifestations of canine atopicdermatitis”,Veterinary immunology and immunopathology,81(3-4),255-269)。由这种过敏性皮肤病引起的发痒或瘙痒通常是复发性或慢性的。它深深地影响了犬及其饲主两者的生活质量。
特别地,内源性致痒原(pruritogen)白细胞介素31(IL-31)似乎在特应性瘙痒中起关键作用。由于IL-31似乎是人和犬中的特应性皮炎中的瘙痒的关键调节因子(Sonkoly等人,″IL-31:a new link between T cells and pruritus in atopic skininflammation″,Journal of Allergy and Clinical Immunology 117.2(2006):411-417;Furue等人,″Emerging role of interleukin-31 and interleukin-31 receptor inpruritus in atopic dermatitis″,Allergy 73.1(2018):29-36;Gonzales等人,″Interleukin-31:its role in canine pruritus and naturally occurring canineatopic dermatitis.″Veterinary dermatology 24.1(2013):48-e12),因此IL-31本身及其受体结合一直是特应性皮炎背景下用于药理学干预发痒的主要焦点。
哮喘是另一种高度流行的状况,其病理生理学与2型以及1型细胞因子两者的异常释放相联系。哮喘有关治疗研究的主要靶包括IL-4、IL-5、IL-13以及IL-33。
已采取了不同的策略来治疗与异常细胞因子产生相联系的状况。例如,在特应性皮炎中,策略之一已集中于使用例如激酶抑制剂来抑制下游信号转导。然而,该策略具有抑制剂必须在短时间间隔内重复给予人或动物患者的缺点。已广泛使用的另一种策略是开发针对特定感兴趣的细胞因子的中和性单克隆抗体,以便降低循环配体水平和/或以其它方式抑制其受体结合且因此抑制生物活性。例如,在特应性皮炎中,已开发了抗4抗体、抗5抗体、抗13抗体、抗17A抗体、抗17C抗体、抗22抗体、抗31抗体和抗33抗体来预防和/或治疗这种状况(Moyle等人(2019)Experimental Dermatology,28:756-768;Renert-Yuval&Guttman-Yassky(2019)Dermatol Clin 37:205-213)。然而,由于昂贵的细胞培养中的抗体生产程序以及在短间隔内重复抗体治疗的需要,因此该策略具有高生产成本的缺点。该策略的另一个缺点在于通常在患者中发生针对单克隆治疗性抗体的渐进性免疫,使得最终,治疗性抗体治疗不再有效。
Bachmann等人2018年尝试通过施用疫苗针对细胞因子IL-31进行疫苗接种,所述疫苗含有与病毒样颗粒(VLP)化学偶联的天然全长IL-31,所述病毒样颗粒衍生自黄瓜花叶病毒并含有通用T细胞表位(Bachmann等人,″Vaccination against IL-31 for thetreatment of atopic dermatitis in dogs″,Journal of Allergy and ClinicalImmunology 142.1(2018):279-281)。天然IL-31与VLP的化学偶联通过使IL-31和VLP外壳蛋白衍生化来实现。IL-31用N-丁二酸S-乙酰基巯基乙二醇酯进行衍生化,随后为脱乙酰化以将反应性SH基团引入IL-31内。VLP外壳蛋白用琥珀酰亚胺基-6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯)进行衍生化,以引入SH反应性化学部分。IL-31和VLP的衍生化制剂彼此反应并纯化。然而,该策略的缺点是IL-31-VLP缀合物的生产是高度复杂且昂贵的,需要纯化的VLP和IL-31,用于衍生化和化学偶联以及后续纯化的多重化学步骤。此外,通过该生产方法无法获得定义明确的化学产物。所获得的IL-31-VLP缀合物还含有非天然组分和化学键合,其生物降解性可能是成问题的。
本发明的基础研究的一个目标是提供以治疗性疫苗形式的人和兽用药物,其可以刺激特别是针对有害细胞因子的免疫应答。
发明内容
针对上述背景,本发明的一个目的是提供与本领域已知的手段相比,抑制或扰乱导致疾病或促成疾病的靶自身蛋白质的功能的有效药理学手段。本发明的另一个目的是提供在宿主中诱导针对靶自身蛋白质的长期效应的药理学手段,使得该药理学手段仅在长时间间隔后才需要重新施用,所述长时间间隔优选在数周的范围内,最优选在数月的范围内。本发明的一个进一步目的是提供可以以经济的方式生产,并且在其组分方面是化学上定义明确的药理学手段。
与上述目的有关,本发明的另一个目的是提供一种简单且有效的方法,以调查本发明的药理学手段抑制或扰乱涉及涉及疾病或导致疾病的靶自身蛋白质的功能的效应。
这些目的通过根据权利要求1的疫苗组合物、根据权利要求18的多蛋白、根据权利要求19和20的用途以及根据权利要求24的方法来实现。
本发明提供了多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA,其用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,其中所述多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。
本发明的基础研究惊讶地发现了,包含自身蛋白质区段以及在这些自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主T细胞表位的多蛋白能够破坏或规避宿主针对多蛋白的自身蛋白质区段的自身耐受。本发明的多蛋白的设计不仅具有免疫学优点,而且允许特别是皮下施用大量本发明的多蛋白,而不产生由多蛋白中发挥其正常的生物学功能和/或致病功能的自身蛋白质区段引起的显著负面效应。这使得根据本发明的多蛋白成为用于疫苗组合物的特别合适的抗原。
本发明的疫苗组合物包含根据本发明的多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA。更准确地,本发明提供了用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的疫苗组合物,其中当将疫苗组合物施用于宿主时,所述疫苗组合物能够产生针对所述自身蛋白质的自身抗体。本发明的疫苗组合物包含:
a)多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA,其中所述多蛋白包含
-宿主的至少两个自身蛋白质区段;和
-在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位;和
b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。
发明人惊讶地发现了,包含与作为佐剂的一种或多种免疫刺激性寡核苷酸组合、含有自身蛋白质区段以及在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主T细胞表位的多蛋白的疫苗,能够在疫苗组合物施用于其的宿主中诱导针对多蛋白的自身蛋白质区段的有效免疫应答。宿主中的这种有效的免疫应答包括针对多蛋白的自身蛋白质区段的自身抗体的产生。发明人的实验显示了,在用根据本发明的疫苗组合物接种疫苗后产生的自身抗体也与自身蛋白质区段衍生自其的天然自身蛋白质结合。发明人进一步观察到所产生的自身抗体存在于宿主的循环系统中数周,并且可以扰乱或甚至中和所结合的自身蛋白质的功能。因此,根据本发明的疫苗组合物允许在体内诱导持久的治疗性自身抗体应答。
本发明还涉及多蛋白破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的用途,其中当将所述多蛋白施用于宿主时,通过自身抗体的产生来破坏自身耐受,并且其中所述多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。这种用途在预防性和治疗性医学应用中特别相关。
进一步地,本发明涉及用于预防或治疗受试者中的疾病的方法中的根据本发明的疫苗组合物,其中所述方法包括向受试者施用疫苗的步骤。
最后,本发明涉及用于检测中和性自身抗体的酶联免疫吸附测定,其包括以下步骤:
a)将抗原吸附到测试表面上;
b)封闭测试表面上的游离结合位点;
c)使由抗原包被并封闭的测试表面与包含针对抗原的标记的中和抗体和针对抗原的待测试的中和性自身抗体的混合物一起温育;和
d)检测标记的中和抗体的结合。
根据本发明的测定允许特别是在用根据本发明的疫苗组合物对宿主接种疫苗后,以稳固且明确的方式确定针对感兴趣抗原的中和性自身抗体的存在。
具体实施方式
多蛋白
本发明的多蛋白、编码该多蛋白的DNA或编码该多蛋白的RNA设计为当例如在本发明的疫苗组合物中施用于所述宿主时,破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受。多蛋白包含宿主的至少两个自身蛋白质区段,以及在宿主的至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。
破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受意味着在宿主中引发免疫应答,其包含针对宿主的自身蛋白质的自身抗体,优选中和性自身抗体的产生。因此,“破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受”意味着“引发针对宿主的自身蛋白质的自身抗体,优选中和性自身抗体的产生”。如本文使用的,术语“自身抗体”指由宿主产生的与该宿主的自身蛋白质结合的抗体。“中和性自身抗体”扰乱并且优选地完全抑制它与之结合的宿主的自身蛋白质的生物学功能。作为实例,针对IL-31的中和性自身抗体扰乱并且优选地基本上完全抑制其在宿主中的生物学功能。特别地,针对IL-31的中和性自身抗体扰乱并且优选地完全抑制IL-31在瘙痒的诱导和发作中的作用。
本发明的多蛋白包含两个关键的结构元件:宿主的自身蛋白质区段和非宿主起源的T细胞表位。
本发明的多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段,优选至少三个自身蛋白质区段。最优选地,根据本发明的多蛋白包含三个自身蛋白质区段。发明人的实验显示了,当施用于宿主时,含有至少三个自身蛋白质区段的多蛋白在宿主中非常有效地引发针对多蛋白的自身蛋白质区段的自身抗体的产生,以及因此针对多蛋白的自身蛋白质区段衍生自其的宿主的天然自身蛋白质的自身抗体的产生。
本发明的多蛋白中包含的自身蛋白质区段可以是相同的或不同的。特别地,自身蛋白质区段可以在长度和/或氨基酸序列方面不同。至少两个自身蛋白质区段衍生自相同的自身蛋白质。当相同的自身蛋白质区段用于构成多蛋白的至少两个自身蛋白质区段时,获得了良好的结果。在这些情况下,当施用于宿主时,多蛋白在宿主中诱导免疫应答,其集中于产生针对一种类型的自身蛋白质或甚至一种类型的自身蛋白质区段的自身抗体,这两者均导致针对蛋白质区段衍生自其的宿主的天然自身蛋白质的自身免疫应答。
根据本发明的多蛋白的自身蛋白质区段包含至少一个B细胞表位。如本文使用的,术语B细胞表位意指自身抗体与之结合的自身蛋白质区段的线性或构象部分。
如本文使用的,“区段”意指可区分且分开的蛋白质实体或结构域。因此,如果在自身蛋白质序列内,区段已通过插入序列(例如,T-细胞表位)分开,则宿主的单个邻接自身蛋白质序列只能被视为构成根据本发明的至少两个自身蛋白质区段。多重相同的蛋白质区段或不同的蛋白质区段也可以彼此直接融合,而不存在任何插入序列。优选地,插入序列包含非宿主起源的一个或多个T细胞表位或由其组成。
宿主的自身蛋白质区段可以是
(i)全长自身蛋白质;或
(ii)含有B细胞表位的截短的自身蛋白质;或
(iii)自身蛋白质的衍生物,其与全长自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%的序列同一性。
根据本发明的多蛋白中含有的自身蛋白质区段可以全部是相同的自身蛋白质区段类型或不同的自身蛋白质区段类型,其中所述自身蛋白质区段类型选自以下:
(i)全长自身蛋白质;或
(ii)含有B细胞表位的截短的自身蛋白质;或
(iii)自身蛋白质的衍生物,其与自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%的序列同一性。
优选地,根据本发明的多蛋白的自身蛋白质区段是全长自身蛋白质,优选是同一全长自身蛋白质例如IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α的多重拷贝。对于其中全长形式不同于成熟形式的自身蛋白质,出于本发明的目的,术语“全长”指所述自身蛋白质的全长成熟形式。
更优选地,根据本发明的多蛋白含有三个自身蛋白质区段,其中所述自身蛋白质区段都是全长自身蛋白质。在根据本发明的多蛋白中使用全长自身蛋白质(选项(i))具有各个自身蛋白质区段原则上可以采取其天然折叠的优点。由于这点,自身蛋白质区段不仅提供了与宿主的自身蛋白质区段衍生自其的天然自身蛋白质相同的线性表位,而且还提供了相同的构象B细胞表位。这使得根据本发明的多蛋白中的这种类型的自身蛋白质区段在破坏宿主针对靶自身蛋白质的自身耐受方面特别有效。
根据本发明的多蛋白中含有的自身蛋白质区段也可以是截短的自身蛋白质。在这种情况下,截短必须以这样的方式执行,使得剩余的蛋白质区段仍含有至少一个功能性B细胞表位。在根据本发明的多蛋白中使用含有B细胞表位的截短的自身蛋白质(选项(ii))具有自身蛋白质区段在其大小方面可以减少至主要含有有关B细胞表位的优点。以这种方式,根据本发明的多蛋白可以在大小方面减少,其可能有助于可克隆性和递送,和/或在根据本发明的多蛋白中添加甚至更多的自身蛋白质区段,同时不超过多蛋白的一定大小限制也变得可能。
根据本发明的多蛋白中含有的自身蛋白质区段可以是自身蛋白质的衍生物,其与全长自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%的序列同一性。甚至更优选地,自身蛋白质的衍生物与全长自身蛋白质具有96%、97%、98%或99%的序列同一性。根据本发明的自身蛋白质区段可以同时满足根据本发明的截短的自身蛋白质和自身蛋白质的衍生物的定义。
优选地,根据本发明的多蛋白仅含有自身蛋白质和/或自身蛋白质的衍生物,其与全长自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%、97%、98%或99%的序列同一性。更优选地,根据本发明的多蛋白含有三个自身蛋白质区段,其中所述自身蛋白质区段是全长自身蛋白质和/或自身蛋白质的衍生物,其与全长自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%、97%、98%或99%的序列同一性。由于多重原因,在根据本发明的多蛋白中使用衍生的自身蛋白质(选项(iii))可以是有利的,例如,它可以允许表达更稳定或更可溶的根据本发明的多蛋白。在根据本发明的多蛋白中使用衍生的自身蛋白质也是有利的,所述衍生的自身蛋白质携带导致这些衍生的自身蛋白质的生物学功能受损或完全抑制的突变。在这方面,可特别设想使用携带导致受体接合和/或信号转导潜力丧失的突变的自身蛋白质。此类衍生的自身蛋白质可以例如通过对于受体结合关键的残基的定点诱变来获得。
在一个实施方案中,根据本发明的多蛋白的至少两个自身蛋白质区段衍生自细胞因子。如本文定义的细胞因子具有其在本领域中的正常含义。细胞因子可以例如按结构分组成家族,例如IL-1家族、生血素超家族、干扰素和肿瘤坏死因子家族。对于IL-1家族,已知的是该家族的大多数成员都作为无活性的前蛋白产生,所述前蛋白被切割(去除氨基末端肽)以产生成熟的细胞因子。在此类情况下,全长蛋白质指所述自身蛋白质的成熟形式。这一规则的例外是IL-1-α,对于其前蛋白及其切割形式两者均具有生物活性。细胞因子的生血素超家族包括非免疫系统生长因子和分化因子,例如促红细胞生成素和生长激素,以及在先天免疫和适应性免疫中具有作用的白细胞介素。由活化的T细胞制备的许多可溶性细胞因子都是生血素家族的成员。其中TNF-α为原型的TNF家族含有在适应性免疫和先天免疫中具有重要功能的多于17种细胞因子。细胞因子还包括集落刺激因子。
在一个实施方案中,根据本发明的多蛋白的至少两个自身蛋白质区段衍生自选自白细胞介素家族成员、肿瘤坏死因子家族成员、干扰素家族成员和/或集落刺激因子家族成员的细胞因子。白细胞介素家族成员的实例是选自IL-1-α,IL-1-β,IL-1RA,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17A-F,IL-18,IL-19,IL-20,IL-21,IL-22,IL-23,IL-24,IL-25,IL-26,IL-27,IL-28A,B,IL-29,IL-30,IL-31,IL-32,IL-33,IL-34,IL-35,IL-36-α、β或γ,IL-36Ra,IL-37,IL-38,IL-39,IL-40,IL-41和IL-42的白细胞介素,TSLP,白血病抑制因子和制瘤素或其家族成员。TNF家族成员自身蛋白质的实例是选自TNF-α、淋巴毒素(LT)-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、APRIL、LIGHT、TWEAK和BAFF的蛋白质。IFN家族成员自身蛋白质的实例是选自IFN-α、IFN-β和IFN-γ的蛋白质。集落刺激因子细胞因子的实例是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。优选地,自身蛋白质区段衍生自其为单体、同二聚体、同三聚体或同四聚体的自身蛋白质,特别是细胞因子。在一个优选实施方案中,根据本发明的多蛋白包含至少两个,特别是两个或三个自身蛋白质区段,其中所述自身蛋白质区段衍生自选自以下的细胞因子:IL-1-α,IL-1-β,IL-1RA,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17A-F,IL-18,IL-19,IL-20,IL-21,IL-22,IL-24,IL-25,IL-26,IL-28A,B,IL-29,IL-30,IL-31,IL-32,IL-33,IL-34,IL-36-α、β或γ,IL-36Ra,IL-37,IL-38,IL-40,IL-41和IL-42,TSLP,白血病抑制因子,制瘤素,TNF-α,IFN-α、IFN-β和IFN-γ,G-CSF和GM-CSF。
在一个特别优选实施方案中,根据本发明的多蛋白的至少两个,且更优选至少三个自身蛋白质区段衍生自IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α,特别是犬IL-4、犬IL-5、犬IL-13、犬IL-31、犬IL-33或犬TNF-α。优选地,根据本发明的多蛋白包含三个相同的自身蛋白质区段,其全部衍生自选自IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33和TNF-α,特别是犬IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33和TNF-α(在所述情况下宿主是犬科物种)的同一自身蛋白质。
在另一个特别优选实施方案中,根据本发明的多蛋白的至少两个自身蛋白质区段衍生自IL31,特别是犬IL31。因此,优选地,自身蛋白质是IL31,特别是犬IL-31,在所述情况下宿主是犬科物种。
与(犬)自身蛋白质(例如IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α)结合的术语“衍生自”意指自身蛋白质区段选自(i)分别的全长(犬)蛋白质,(ii)含有B细胞表位的蛋白质的截短(犬)形式,或(iii)(犬)蛋白质的衍生物,其与分别的全长(犬)自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,优选至少95%的序列同一性。
发明人的实验已显示了,通过向宿主施用具有衍生自IL-31的自身蛋白质区段的根据本发明的多蛋白,特别是向犬宿主施用衍生自犬IL-31的蛋白质区段,可以优选地产生针对(犬)IL-31蛋白的自身抗体。根据本发明的这种多蛋白被证实为能够特别有效地破坏针对(犬)IL-31的自身耐受。
对于衍生自众多其它自身蛋白质的自身蛋白质区段也显示了相同的情况,特别是通过施用具有衍生自犬IL-4、犬IL-5、犬IL-13和犬IL-33的自身蛋白质区段并施用于犬宿主,以及具有衍生自猫IL-31的自身蛋白质区段并施用于猫宿主,以及具有衍生自牛TNF-α-多蛋白的自身蛋白质区段并施用于兔宿主的根据本发明的多蛋白。有效地产生针对分别的(犬/猫/牛)IL蛋白的自身抗体,并且有效地破坏针对其的自身耐受。因此,本发明决不限于本文呈现的实例,而是容易地涵盖在物种内和跨越物种的其它自身蛋白质。
如本文中与氨基酸序列有关使用的,“百分比序列同一性”和类似术语用于描述两个或更多个氨基酸序列之间的序列关系,并且在该术语的上下文中以及结合该术语理解为包括:a)参考序列,b)比较窗口,c)序列同一性和d)序列同一性的百分比。
a)“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体。例如,在本文的情况下,犬IL-31的参考序列是例如SEQ ID NO:3;犬IL-4的参考序列是例如SEQ ID NO:56;犬IL-5的参考序列是例如SEQ ID NO:41;犬IL-13的参考序列是例如SEQ ID NO:46;犬IL-33的参考序列是例如SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51;猫IL-31的参考序列是例如SEQ ID NO:60;并且牛TNF-α的参考序列是例如SEQ ID NO:64。SEQ ID NO:50和51的不同之处仅在于SEQ ID NO:50(“IL-33-WT”)的3个半胱氨酸残基已被SEQ ID NO:51(“IL-33-CS”)中的丝氨酸替换。发明人发现了,以此方式用丝氨酸替换半胱氨酸残基进一步改善基因产物的稳定性。
b)“比较窗口”包括对氨基酸序列的邻接且指定的部分的提及,其中所述氨基酸序列可以与参考序列进行比较,并且其中比较窗口中的氨基酸序列的一部分可以包含与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比的添加、取代或缺失(即,空位),用于两个序列的最佳比对。本领域技术人员应理解,为了避免由于氨基酸序列中包括空位而与参考序列的误导性地高相似性,通常引入空位罚分并将其从匹配数目中减去。
c)用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。已开发了许多成对序列比对(PSA)方法,例如EMBOSS(Rice等人,″EMBOSS:the European molecular biology opensoftware suite″,(2000):276-277),BLAST(Johnson等人,″NCBI BLAST:a better webinterface″,Nucleic acids research 36.suppl_2(2008):W5-W9.),CD-HIT(Li等人,″Cd-hit:a fast program for clustering and comparing large sets of protein ornucleotide sequences″,Bioinformatics 22.13(2006):1658-1659),ESPRIT(Sun等人,″ESPRIT:estimating species richness using large collections of 16S rRNApyrosequences",Nucleic acids research 37.10(2009):e76-e76.),以及UCLUST(Edgar,Robert,″Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST",Bioinformatics 26.19(2010):2460-2461.)等。
d)“百分比同一性”意指通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列而确定的值,其中比较窗口中的氨基酸序列的一部分可以包含与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比的添加、取代或缺失(即,空位),用于两个序列的最佳比对。百分比通过以下进行计算:确定在其处相同氨基酸在两个序列中出现的位置数目,以得到匹配位置数目,将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数目,并且将结果乘以100,以得到序列同一性的百分比。
根据本发明的多蛋白包含非宿主起源的一个或多个T细胞表位作为第二结构组分。如本文使用的,术语“T细胞表位”指可以结合主要组织相容性复合物(MHC)分子并因此由其呈递的短肽。MHC I类分子可以结合长度为8至10个氨基酸的短肽和长度为13至17个氨基酸的MHC II类肽。众所周知的是,T细胞识别已结合衍生自抗原的细胞内加工的肽表位的MHC分子。给定表位的免疫原性取决于三个因素:来自抗原的适当肽片段的生成、结合该片段的MHC分子的存在以及能够识别复合物的T细胞的存在。
与T细胞表位有关的术语“一个或多个”意指相同或不同的T细胞表位可以存在于根据本发明的多蛋白中。因此,本发明的多蛋白中含有的T细胞表位可以在长度和/或序列方面彼此不同。
一个或多个T细胞表位可以选自人工T细胞表位肽序列和衍生自非自身蛋白质,特别是致病性蛋白质的T细胞表位肽序列,其经常包含特别有效的T细胞表位。合适的人工T细胞表位或T细胞表位可以衍生自其的合适的致病性蛋白质是技术人员已知的。此类T细胞表位在施用于宿主后特别具有免疫原性。
优选地,根据本发明的多蛋白包含非宿主起源的一个或多个通用T细胞表位。最优选地,根据本发明的多蛋白包含一个或多个T细胞表位,其中所有T细胞表位都是通用的。如本文使用的,术语“通用T细胞表位”指具有普遍免疫原性并且可以与大量II类MHC分子相关联地被识别的T细胞表位。在根据本发明的多蛋白中使用通用T细胞表位具有T细胞表位特别具有不依赖于所选宿主的免疫原性的优点。
最优选地,在根据本发明的多蛋白中含有的一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,特别是这样的破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:39至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:39。甚至更优选地,一个或多个T细胞表位衍生自或等同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。这些T细胞表位是特别具有免疫原性的通用T细胞表位(Panina-Bordignon等人,″Universally immunogenic T cell epitopes:promiscuous binding to human MHCclass II and promiscuous recognition by T cells″,European journal ofimmunology 19.12(1989):2237-2242)。
甚至更优选地,在根据本发明的多蛋白中含有的T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,特别是这样的破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39或SEQID NO:2至少96,更优选97,且最优选98或99%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:2。
在根据本发明的多蛋白中,非宿主起源的一个或多个T细胞表位定位于至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近。优选地,非宿主起源的一个或多个T细胞表位定位于至少两个自身蛋白质区段之间,并且任选地另外还与其邻近。在该上下文中的术语“邻近”意指“最N末端蛋白质区段的上游和/或最C末端蛋白质区段的下游”。
根据本发明的多蛋白可以另外包含进一步的组分。此类另外的组分的一个实例是在至少两个自身蛋白质区段与非宿主起源的一个或多个T细胞表位之间的一种或多种接头。这些接头的长度可以特别是4至50个氨基酸,优选长度为4至30个氨基酸,且最优选长度为4至20个氨基酸。接头的使用是有利的,因为柔性接头可以促进根据本发明的多蛋白中的各个自身蛋白质区段的独立折叠。
当使用编码多蛋白的DNA和/或RNA代替多蛋白本身时,DNA和/或RNA还可以另外编码一种或多种ER输入信号。人工ER信号的氨基酸序列的实例是SEQ ID NO:67。这确保了在宿主中由DNA或RNA表达多蛋白后,该多蛋白被输入到ER内并且随后被分泌。
优选地,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白包含衍生自细胞因子的宿主的至少两个自身蛋白质区段,优选衍生自选自以下的自身蛋白质:具有SEQ ID NO:3、41、46、50、51、56、60、64或SEQ ID NO:68-201之一的氨基酸序列的自身蛋白质;以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的一个或多个T细胞表位;其中所述一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQID NO:39或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:2。最优选地,一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。
更优选地,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白包含衍生自IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α,最优选衍生自IL-31的宿主的至少两个自身蛋白质区段;以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的一个或多个T细胞表位,其中所述一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:39和SEQ ID NO:2。最优选地,一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
更优选地,用于疫苗组合物中以破坏针对犬宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白包含衍生自犬白细胞介素,特别是衍生自犬IL-4、犬IL-5、犬IL-13、犬IL-31或犬IL-33,最优选衍生自犬IL-31的至少两个自身蛋白质区段;以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的一个或多个T细胞表位,其中所述一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:2。最优选地,一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
发明人的实验已显示了,通过将此类多蛋白施用于犬宿主,可以以特别地B类有效的方式产生针对犬IL-4、IL-5、IL-13、IL-31或IL-33蛋白的自身抗体,特别是中和性自身抗体。发明人的类似实验还已显示了,通过将此类多蛋白施用于猫宿主,还可以以特别地B类有效的方式产生针对猫IL-31的自身抗体,特别是中和性自身抗体。类似地,将TNF-α以根据本发明的多蛋白形式施用于兔,诱导响应TNF-α抗原的有效抗体产生。因此,根据本发明的此类多蛋白在破坏针对自身蛋白质的自身耐受方面非常有效,所述自身蛋白质包括但不限于犬、猫以及牛自身蛋白质。
甚至更优选地,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40至少85%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:40的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:4或SEQID NO:40至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40的序列。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:40仅在其N末端方面不同。与SEQ ID NO:4相比,SEQ ID NO:40具有在N末端处的三个另外的氨基酸(“SHM”)。由SEQID NO:4和SEQ ID NO:40编码的多蛋白的不同N末端起因于N末端ER信号序列的不同切割事件。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于犬宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对细胞因子IL-31的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:61至少85%的序列同一性,或(ii)具有SEQ ID NO:61的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:61至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:61的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:61的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于猫宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对细胞因子IL-31的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:42或43至少85%的序列同一性,或者(ii)具有SEQID NO:42或43的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:42至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:42或43的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:42或43的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于犬宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对细胞因子IL-5的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:57至少85%的序列同一性,或(ii)具有SEQ ID NO:57的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:57至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:57的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:57的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于犬宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对IL-4的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:47至少85%的序列同一性,或(ii)具有SEQ ID NO:47的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:47至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:47的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:47的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于犬宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对IL-13的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:54至少85%的序列同一性,或(ii)具有SEQ ID NO:54的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:54至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:54的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:54的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于犬宿主后能够诱导高度有效的免疫应答,包括针对细胞因子IL-33的自身抗体,特别是中和抗体的产生。
在另一个优选实施方案中,用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:65至少85%的序列同一性,或(ii)具有SEQ ID NO:65的序列。更优选地,根据本发明的多蛋白具有(i)与SEQ ID NO:65至少90%,更优选95%,并且最优选97%、98%或99%的序列同一性,或者(ii)具有SEQ ID NO:65的序列。发明人的实验已显示了,使用编码SEQ ID NO:65的多蛋白或具有上述序列同一性的其衍生物在施用于兔宿主后能够诱导针对细胞因子TNF-α的有效的免疫应答。
技术人员知道如何将编码本发明的多蛋白的DNA或RNA序列克隆到合适的表达载体内,以及如何产生本发明的多蛋白。
在一些实施方案中,本发明的多蛋白通过在培养的细胞中的表达来产生,所述培养的细胞例如HEK293细胞,特别是HEK293细胞系的快速生长变体(HEK293-F),例如Expi293F细胞。在真核细胞中的表达具有所表达的多蛋白配备有与宿主相似或等同的糖基化模式的优点。优选地,使用哺乳动物表达产生包含(犬)IL-4、(犬)IL-5、(犬)IL-13和/或(犬或猫)IL-31的多蛋白。
在一些实施方案中,本发明的多蛋白通过在原核细胞中的表达来产生,所述原核细胞例如细菌细胞,例如大肠杆菌(Escherichia(E.)coli)。可以使用任何合适的细菌菌株。合适的细菌菌株是本领域众所周知的,并且技术人员能够选择与其系统相容的一种菌株。合适的菌株包括但不限于BL21(DE3)、BL21(DE3)-pLysS、BL21-AI、Tuner、Origami、Rosetta、BL21 CodonPlus、BL21trxB、C41(DE3)、JM109、XL1-Blue、NEBexpress和M15。用于表达本发明的多蛋白,特别是本发明的(犬)IL-33和牛TNF-α多蛋白的特别合适的菌株是BL21(DE3)及其变体。细菌细胞中的表达具有由于不太复杂的细菌生理学的简单程序、相对低的成本、短世代时间和高产物产率的优点。
本发明的多蛋白可以由核酸编码。核酸可以是RNA或DNA。核酸还可以包含具有修饰的核碱基的一种或多种核苷酸。这可以例如使得所采用的核酸针对核酸酶的攻击特别稳定。特别是当包含在合适的载体中时,编码多蛋白的DNA或RNA可以直接用于本发明的疫苗组合物中。然后,多蛋白在宿主内部表达,如对于其它DNA和RNA疫苗众所周知的。
编码本发明的多蛋白的核酸可以进行密码子优化,用于多蛋白在感兴趣的真核细胞或宿主中的有效翻译。例如,密码子可以进行优化,用于在人、牛、猪、猫、犬、细菌等等中的表达(参见在www.kazusa.or.jp/codon/处的密码子使用数据库)。用于密码子优化的程序可作为免费软件(例如,在genomes.urv.es/OPTIMIZER处的OPTIMIZER;在www.genscript.com/codon_opt.html处的来自GenScript的OptimumGeneTM)获得。商业密码子优化程序也是可获得的。
编码本发明的多蛋白的DNA可以可操作地连接到至少一种启动子控制序列。DNA编码序列可以可操作地连接到启动子控制序列,用于在感兴趣的真核细胞或宿主中表达。启动子控制序列可以是组成型启动子控制序列。
用于在真核细胞例如HEK293细胞中表达的合适的组成型启动子控制序列包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子(ED1)-α启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其片段或前述中任一种的组合。
用于在细菌细胞例如大肠杆菌细胞中表达的合适的启动子控制序列包括但不限于lac启动子、trc和tac启动子、T7 RNA聚合酶、噬菌体启动子pL、tetA启动子/操纵子、PPBAD启动子、PBAD启动子、其片段或前述中任一种的组合。
编码本发明的多蛋白的DNA还可以连接到多聚腺苷酸化信号(例如,SV40多聚A信号、牛生长激素(BGH)多聚A信号等)和/或至少一种转录终止序列。当使用哺乳动物表达系统时,这是特别有利的。
编码本发明的多蛋白的DNA可以存在于载体中。合适的载体包括质粒载体。合适的质粒载体的非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript、pcDNA、pCI、pCMV及其变体,其中pcDNA型载体是特别合适的。载体可以包含另外的表达控制序列(例如,增强子序列、Kozak序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、可选择标记物序列(例如,抗生素抗性基因)、复制起点等等。另外的信息可以在″Current Protocols in Molecular Biology″Ausubel等人,John Wiley&Sons,New York,2003或″Molecular Cloning:A LaboratoryManual″Sambrook&Russell,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,第3版,2001中找到。
编码本发明的多蛋白的核酸还可以是RNA,特别是mRNA。mRNA可以是5′加帽的和/或3′多聚腺苷酸化的。
进一步地,编码本发明的多蛋白的核酸可以是自我复制型RNA。适合于免疫的自我复制型RNA是RNA疫苗领域众所周知的。当递送至真核细胞时,自我复制型RNA分子可以通过自身的转录导致产生多重子RNA。自我复制型RNA分子通常是+链分子,其可以在其递送至细胞后直接翻译。自我复制型RNA分子的翻译除了本发明的编码多蛋白之外还提供了RNA依赖性RNA聚合酶,其然后从最初递送的RNA产生反义转录物和有义转录物两者。该转录顺序的总体结果是所引入的自我复制型RNA数目的扩增。以这种方式,所编码的多蛋白成为携带所递送的自我复制型RNA的细胞的主要多肽产物。合适的甲病毒自我复制型RNA可以使用例如来自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒或委内瑞拉马脑炎病毒的复制酶。
因此,优选的自我复制型RNA分子编码(i)可以从自我复制型RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)本发明的多蛋白。聚合物可以是甲病毒RNA依赖性RNA聚合酶。尽管天然甲病毒基因组编码病毒体结构蛋白质加上RNA依赖性RNA聚合酶,但对于本发明优选的是自我复制型RNA分子并不编码甲病毒结构蛋白质。因此,用于本发明的优选的自我复制型RNA可以导致其自身的RNA拷贝的细胞产生,但不导致含有RNA的病毒体的产生。如根据RNA疫苗领域已知的,本发明中使用的自我复制型RNA中不存在产生感染性病毒粒子所必需的甲病毒结构蛋白质,并且它们的位置由编码本发明的多蛋白的构建体取代。因此,适合于本发明的自我复制型RNA可以具有两个开放读码框。一个开放读码框编码RNA依赖性RNA聚合酶;另一个开放读码框编码本发明的多蛋白。自我复制型RNA可以具有另外的(例如下游的)开放读码框,例如以编码本发明的一种或多种进一步的多蛋白。
疫苗组合物
本发明进一步提供了用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的疫苗组合物。根据本发明的疫苗组合物包含两种必需组分:
a)多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA,其中所述多蛋白包含
-宿主的至少两个自身蛋白质区段;和
-在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位;和
b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。
当将疫苗组合物施用于宿主时,疫苗组合物能够产生针对自身蛋白质的自身抗体。
多蛋白如上所述。
本发明的疫苗组合物包含作为佐剂的一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。与本发明的免疫刺激性寡核苷酸结合使用的术语“一种或多种”意指化学上不同的寡核苷酸可以是本发明的疫苗组合物的部分。例如,可以使用具有不同长度、碱基序列或糖磷酸酯主链中的差异的寡核苷酸。“一种或多种”中的“一种”并非意指单一寡核苷酸分子。
如本文使用的“免疫刺激性寡核苷酸”是通过被脊椎动物的先天免疫系统检测为外来的并且从而激活先天免疫应答途径,而在脊椎动物中引发免疫应答的寡核苷酸。
通常,本发明的免疫刺激性寡核苷酸是合成起源的。因此,它们可以用任何所需的序列和/或糖磷酸酯主链中的修饰来合成。
一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是线性的、至少部分地单链的DNA分子。然而,单链DNA免疫刺激性寡核苷酸可以尤其通过沃森-克里克碱基配对与其自身或彼此相互作用,以形成二级结构和附聚物。然而,单链段将始终存在于免疫刺激性寡核苷酸中。
优选地,一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。这些是短单链合成DNA分子,其含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(“C”),随后为鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(“G”)。“p”指连续核苷酸之间的磷酸二酯键,尽管根据本发明的ODN可以具有代替的修饰的硫代磷酸酯主链。使用CpG ODN作为免疫刺激性寡核苷酸具有CpG二核苷酸代表由Toll样受体(TLR)9感知的病原体相关分子模式(PAMP)的优点。TLR9的激活导致不同促炎信号传导途径的激活,所述途径依赖于例如激活B细胞的核因子‘κ轻链增强子’(NFKB)。NF-κB的激活通常导致促炎细胞因子的表达。相应地,CpG ODN在根据本发明的疫苗组合物中是特别有效的疫苗佐剂。
优选地,免疫刺激性寡核苷酸选自A类、B类和C类免疫刺激性寡核苷酸。将免疫刺激性寡核苷酸分类成“A类”、“B类”和“C类”是技术人员众所周知的,并且例如在Vollmer,″CpG motifs to modulate innate and adaptive immune responses″,International reviews of immunology 25.3-4(2006):125-134中进行描述。
A类免疫刺激性寡核苷酸的特征通常在于含有中心磷酸二酯CpG的回文基序和部分硫代磷酸酯修饰的主链,特别是硫代磷酸酯3′聚G段。
B类免疫刺激性寡核苷酸的特征通常在于具有一个或多个CpG二核苷酸的完全硫代磷酸酯主链。
C类免疫刺激性寡核苷酸显示出A类和B类免疫刺激性寡核苷酸的特性。它们含有完全的硫代磷酸酯主链和一个或多个含有回文CpG的基序。
根据本发明的免疫刺激性寡核苷酸通常具有14至500个核苷酸,优选14至400个核苷酸,更优选14至300个核苷酸,还更优选14至200个核苷酸,甚至更优选16至40个核苷酸,且最优选18至30个核苷酸的长度。这种大小的免疫刺激性寡核苷酸可以容易地在体外合成,并且发现作为疫苗佐剂是有效的。
优选地,一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自B类免疫刺激性寡核苷酸。本发明的基础研究证实了,根据本发明的疫苗组合物中的B类免疫刺激性寡核苷酸对于增强根据本发明的疫苗组合物中使用的多蛋白的免疫原性是特别有效的。
一种或多种免疫刺激性寡核苷酸还可以优选地包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少75%的序列同一性,更优选至少80%的序列同一性,甚至更优选85%的序列同一性,还更优选90%、95%或97%的序列同一性。
如本文中与核酸序列有关使用的,“百分比序列同一性”和类似术语用于描述两种或更多种核酸之间的序列关系,并且在该术语的上下文中以及结合该术语理解为包括:a)参考序列,b)比较窗口,c)序列同一性和d)序列同一性的百分比。
a)“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体;例如,全长cDNA或基因序列的区段、或者完整的cDNA或基因序列。在本文的情况下,参考序列是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
b)“比较窗口”包括对多核苷酸序列的邻接且指定的区段的提及,其中所述多核苷酸序列可以与参考序列进行比较,并且其中比较窗口中的多核苷酸序列的一部分可以包含与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比的添加、取代或缺失(即,空位),用于两个序列的最佳比对。本领域技术人员应理解,为了避免由于多核苷酸序列中包括空位而与参考序列的误导性地高相似性,通常引入空位罚分并将其从匹配数目中减去。
c)用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以通过以下进行:Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981的局部同源性算法;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970的同源性比对算法;Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:2444,1988的相似性搜索方法;这些算法的计算机化实现,包括但不限于:通过Intelligenetics,Mountain View,Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL,Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),7 ScienceDr.,Madison,Wis.,USA中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA;CLUSTAL程序通过Higgins和Sharp,Gene,73:237-244,1988;Corpet等人,Nucleic Acids Research,16:881-90,1988;Huang等人,Computer Applications in the Biosciences,8:1-6,1992;以及Pearson等人,Methods in Molecular Biology,24:7-331,1994充分描述。可以用于数据库相似性搜索的BLAST系列程序包括:用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN;用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX;用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN;以及用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19,Ausubel等人,编辑,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1995。上述程序的新版本或新程序一起无疑地将在未来变得可获得,并且可以与本公开内容一起使用。
d)“百分比同一性”意指通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列而确定的值,其中比较窗口中的多核苷酸序列的一部分可以包含与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比的添加、取代或缺失(即,空位),用于两个序列的最佳比对。百分比通过以下进行计算:确定在其处相同核酸碱基在两个序列中出现的位置数目,以得到匹配位置数目,将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数目,并且将结果乘以100,以得到序列同一性的百分比。
优选地,一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。实验研究已显示了,编码SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的免疫刺激性寡核苷酸在根据本发明的疫苗组合物中的使用在激活犬细胞中的NF-κB促炎应答途径中是特别有效的,并且因此强烈增强根据本发明的疫苗组合物中的多蛋白的免疫原性。
优选地,一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含在糖-磷酸酯主链中的硫代磷酸酯,即部分硫代磷酸酯修饰的主链。更优选地,一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含完全的硫代磷酸酯主链。硫代磷酸酯修饰具有免疫刺激性寡核苷酸被保护免于通过核酸酶的降解的优点。结果,这些免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性是增加的。
本发明的疫苗组合物可以包含另外的组分。优选地,本发明的疫苗组合物另外包含佐剂c),其赋予关于本发明的疫苗组合物中含有的多蛋白和/或免疫刺激性寡核苷酸的储库效应(depot effect)。术语“储库效应”指多蛋白和/或免疫刺激性寡核苷酸从注射部位的持续释放。在根据本发明的疫苗组合物中使用此类佐剂具有以下优点:疫苗组合物中的多蛋白和免疫刺激性寡核苷酸的免疫原性进一步增加,使得特别有效地破坏针对多蛋白中的自身蛋白质的自身耐受。
最优选地,赋予储库效应的佐剂是能够在溶液中形成交联的高分子量凝胶的共聚物佐剂。此类佐剂的一个实例是PolygenTM。赋予储库效应的合适佐剂也可以是与表面活性剂系统组合的矿物油或可代谢油。发明人的实验已显示了,能够在溶液中形成交联高分子量凝胶的共聚物佐剂与根据本发明的疫苗组合物的其它组分高度相容并且是其的合适载体,并且同时在伴侣动物和农场动物中提供了特别高的安全性程度。
根据本发明的疫苗组合物,特别是当含有编码多蛋白的DNA或RNA时,可以含有脂质体、阳离子蛋白、阳离子聚合物或阳离子细胞穿透肽和/或增强引入核酸的半衰期、细胞摄取和所可翻译性的其它化学手段。
因此,优选地,根据本发明的疫苗组合物用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,其中当将疫苗组合物施用于宿主时,所述疫苗组合物能够产生针对所述自身蛋白质的自身抗体,并且其中所述疫苗组合物包含:
a)多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA,其中所述多蛋白包含
-宿主的至少两个自身蛋白质区段;和
-在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位;
和
b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸
和
c)赋予储库效应的佐剂。
甚至更优选地,根据本发明的疫苗组合物用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,其中当将疫苗组合物施用于宿主时,所述疫苗组合物能够产生针对所述自身蛋白质的自身抗体,并且其中所述疫苗组合物包含:
a)多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA,其中所述多蛋白包含
-衍生自宿主的细胞因子的至少两个自身蛋白质区段,优选衍生自宿主的IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α,最优选衍生自宿主的IL-31;和
-在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位,其中所述一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:39和SEQ ID NO:2;优选地,一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,其(i)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性,或者(ii)选自SEQ ID NO:1和SEQID NO:2;
和
b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸,其中所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少75%的序列同一性,更优选至少80%的序列同一性,甚至更优选85%的序列同一性,还更优选90%、95%或97%的序列同一性,或者选自SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6
和
c)赋予储库效应的佐剂,其中所述赋予储库效应的佐剂是能够在溶液中形成交联的高分子量凝胶的共聚物佐剂。
发明人的实验已显示了,此类疫苗组合物在破坏针对IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-33和TNF-α,特别是犬IL-5、IL-13、IL-31和IL-33,以及猫IL-31和牛TNF-α的自身耐受方面特别有效。这些结果显示了,本发明提供了表达大量自身蛋白质且针对其接种疫苗的灵活平台,并且不仅限于本文描述的那些自身蛋白质。
技术人员知道如何鉴定且分析疫苗组合物的各个组分。为了分析请求保护的疫苗组合物,技术人员通常首先执行提取和/或分离程序,以例如通过使用液相层析,特别是HPLC将各个组分彼此分开。可以例如通过质谱法和/或测序分析来分析所请求保护的疫苗组合物中使用的核酸。还可以例如通过质谱法来分析疫苗组合物中的蛋白质。本发明的疫苗组合物中含有的寡核苷酸的免疫刺激特性可以通过使用报道细胞系例如犬单核细胞系(DH82)进行评价,允许评估这些寡核苷酸的NFkB刺激潜力。
多蛋白的用途
本发明还涉及疫苗组合物中的如本文所述的多蛋白、编码该多蛋白的DNA和/或编码该多蛋白的RNA破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的用途,其中所述多蛋白包含宿主的至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。在导致本发明的研究中,发现了根据本发明的多蛋白的使用使得能够有效地诱导针对多蛋白的自身蛋白质区段,以及因此针对多蛋白的自身蛋白质区段衍生自其的宿主的天然自身蛋白质的自身抗体,特别是中和性自身抗体的产生。
看来根据本发明的多蛋白中的非宿主起源的T细胞表位的存在,特别是破伤风毒素T细胞表位的存在,允许有效地破坏针对宿主的自身蛋白质区段的自身耐受。
在优选的用途中,多蛋白具有对于上文根据本发明的多蛋白定义的一种或多种特性。
疫苗组合物的用途
本文描述的疫苗组合物适用于预防或治疗受试者中的疾病的方法,其中所述方法包括向受试者施用疫苗组合物的步骤。该方法包括向受试者施用有效量的免疫刺激性疫苗,以在受试者中引发免疫应答。免疫应答包括诱导针对受试者的靶向自身蛋白质的自身抗体,优选中和抗体。术语“受试者”和“宿主”在本文中可互换使用。
在使用本文描述的疫苗组合物后,所述疫苗组合物特别地具有含有衍生自(犬)IL-4、L-5、IL-13、IL-31、IL-33或TNF-α的自身蛋白质区段的多蛋白,在感兴趣的受试者中破坏针对分别的自身蛋白质的自身耐受是可能的。
认为受试者针对引起疾病的自身蛋白质的自身耐受的破坏允许预防或治疗由该自身蛋白质引起或影响的疾病,因为自身抗体中和了自身蛋白质的功能和/或帮助降低受试者中的自身蛋白质的可用水平。本发明的多蛋白中的自身蛋白质区段衍生自其的自身蛋白质在本文中也被称为宿主中的靶向自身蛋白质。
如本文使用的受试者可以特别意指哺乳动物物种,例如人和非人动物。因此,受试者是哺乳动物,包括人和非人动物。优选地,受试者是非人动物,特别是选自牛、家禽、猪和伴侣动物例如猫和犬的非人动物。最优选地,受试者是动物,特别是选自牛、家禽、猪和伴侣动物例如猫和犬的动物。甚至更优选地,受试者是犬。
优选地,本文描述的疫苗组合物用于预防或治疗
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
术语“过敏状况”在本文中定义为由免疫系统以及对于机体外来的物质之间的相互作用引起的疾病或病症。
术语“瘙痒状况”在本文中定义为特征在于强烈发痒感的疾病或病症,所述强烈发痒感产生摩擦或抓挠皮肤以获得缓解的冲动。
更优选地,本文描述的疫苗组合物用于预防或治疗
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
最优选地,本文描述的疫苗组合物用于预防或治疗特应性皮炎。
在一个优选实施方案中,包含衍生自犬IL-31的自身蛋白质区段的本文描述的疫苗组合物用于预防或治疗
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
最优选地,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-31的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗特应性皮炎。
在另一个实施方案中,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-5的自身蛋白质区段,并且用于预防和/或治疗
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;和/或
-嗜酸性粒细胞病症,特别是嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜酸性粒细胞性食管炎、高嗜酸性粒细胞综合征和慢性鼻-鼻窦炎,特别是慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉。
更优选地,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-5的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防和/或治疗
-特应性皮炎;或
-嗜酸粒细胞性哮喘或慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉。
在另一个实施方案中,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-4的至少两个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
更优选地,本文描述的包含IL-4的疫苗组合物包含衍生自犬IL-4的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
最优选地,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-4的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗特应性皮炎。
在一个进一步的实施方案中,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-13的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
更优选地,本文描述的包含IL-13的疫苗组合物包含衍生自犬IL-13的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
最优选地,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-13的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗特应性皮炎。
在另一个实施方案中,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-33的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
更优选地,本文描述的包含IL-33的疫苗组合物包含衍生自犬IL-33的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、过敏性哮喘、嗜酸性粒细胞性哮喘和嗜中性粒细胞性哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程。
最优选地,本文描述的疫苗组合物包含衍生自犬IL-33的至少两个自身蛋白质区段,特别是至少三个自身蛋白质区段,并且用于预防或治疗特应性皮炎和/或过敏性鼻炎。
“治疗(Treatment)”、“治疗(treating)”等等指治疗性治疗。术语“预防(prevention)”和“预防(preventing)”指预防性或预防措施。需要治疗或预防的动物包括已经患有病症或疾病状况的那些动物,以及其中待预防病症或疾病状况的那些动物。术语疾病或病症的“治疗”或“预防”包括预防或保护免受疾病或病症(即,导致临床症状不发展)、抑制疾病或病症(即,阻止或压制临床症状的发展),和/或缓解疾病或病症(即,导致临床症状的消退)。由于一个或多个最终诱发事件可能是未知的或潜伏的,因此区分“预防”和“压制”疾病或病症不一定是可能的。相应地,术语“预防”也可以被理解为构成一类“治疗”,其涵盖了“预防”和“压制”两者。因此,术语“治疗”可以包括“预防”。
各种施用途径可用于施用本发明的疫苗组合物。所选择的特定模式将取决于所选择的特定受试者组,受试者的年龄和一般健康状况,待治疗的特定状况以及治疗和/或预防功效所需的剂量。本发明的方法可以使用产生有效水平的免疫应答而不引起临床上无法接受的不良作用的任何施用模式来实践。
治疗包括向有此需要的受试者施用有效量的本文描述的疫苗组合物。有效量足以引发特征在于产生针对接受者受试者的靶向自身蛋白质的自身抗体的免疫应答。此类有效量是引起免疫应答的任何量,所述免疫应答包括在接受者受试者中的自身抗体产生。测量由本发明的疫苗组合物引发的免疫应答的强度和质量(包括自身抗体的产生)的方法也是本发明的部分(参见下文)。技术人员知道,有效量取决于宿主因素,例如动物物种、年龄、重量、疾病阶段以及本领域已知的其它因素。术语“疫苗组合物的合适有效量”指本发明的疫苗组合物中含有的以蛋白质、DNA或RNA形式的多蛋白,免疫刺激性寡核苷酸和任选地赋予储库效应的佐剂以μg计的总和。
合适的有效量范围可以为约0.1μg至5000μg/受试者。在一些实施方案中,有效量范围可以为约0.5μg至约4500μg、约约0.5μg至约4500μg、约0.5μg至约4500μg、约1μg至约4000μg、约1μg至约3500μg、约1μg至约3000μg、约1μg至约2500μg、约1μg至约2000μg、约1μg至约1500μg、约1μg至约1000μg、约1μg至约900μg、约1μg至约800μg、约1μg至约700μg、约1μg至约600μg、约1μg至约500μg、约1μg至约400μg、约1μg至约300μg。
在一些实施方案中,通过向人受试者施用有效量的本文所述的任何疫苗组合物,可以在人中引发免疫应答。有效量足以引发包括在接受者受试者中产生针对靶向自身蛋白质的自身抗体的免疫应答。例如,用于人的疫苗组合物的有效量可以是约0.1μg至约5000μg/受试者、约0.5μg至约5000μg/受试者、约1μg至约4500μg/受试者、约1μg至约4000μg/受试者、或约1μg至约3500μg/受试者。例如,用于人受试者的合适有效量可以是约5000μg、约4750μg、约4500μg、约4250μg、约4000μg、约3750μg、约3500μg、约3250μg、约3000μg、约2750μg、约2500μg、约2250μg、约2000μg、约1750μg、约1500μg、1250μg、约1000μg、约500μg、约100μg、约75μg、约50μg、约25μg、约10μg、约1μg或约0.1μg。
在一些实施方案中,通过向非人受试者施用有效量的本文所述的任何疫苗组合物,可以在非人动物,特别是犬中引发免疫应答。有效量足以引发包括在接受者受试者,特别是犬中产生自身抗体的免疫应答。例如,用于非人动物,特别是犬的疫苗组合物的有效量可以是约0.1μg至约5000μg/受试者、约0.5μg至约5000μg/受试者、约1μg至约4500μg/受试者、约1μg至约4000μg/受试者、或约1μg至约3500μg/受试者。例如,用于非人受试者的合适有效量可以是约5000μg、约4750μg、约4500μg、约4250μg、约4000μg、约3750μg、约3500μg、约3250μg、约3000μg、约2750μg、约2500μg、约2250μg、约2000μg、约1750μg、约1500μg、1250μg、约1000μg、约500μg、约100μg、约75μg、约50μg、约25μg、约10μg、约1μg、0.5μg或约0.1μg。
本文中与数值有关的术语“约”的使用指示数值可能受到测量误差的影响,所述测量误差通常使数值改变不多于±5%。本文连同术语“约”一起公开的数值也意欲如此公开,即不含术语“约”。进一步地,如本文陈述的数值范围意欲包括且公开该范围内的每个和每一个值。关于本文公开的相同参数的范围的所有上端点和下端点可以彼此组合。关于本文公开的不同参数的所有范围可彼此组合。特别地,不同或相同的“优选水平”的范围特别地彼此相容。
疫苗组合物可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过羽毛毛囊方法在卵内、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域已知的其它方法进行施用。疫苗组合物可以是皮下施用的。疫苗组合物也可以是肌内施用的。疫苗组合物也可以是口服施用的。
本发明的方法在受试者中引发免疫应答,使得受试者中的疾病得到预防或治疗。
施用可以以各种方式来实现。例如,可以使用经由针(例如皮下注射针)的注射,特别是用于肌内、皮下、眼内、腹膜内或静脉内施用。无针注射可以用作替代方案。
酶联免疫吸附测定
本发明的疫苗组合物、多蛋白和用途通过发明人开发的测定来补充,该测定用于特异性检测在宿主中使用本发明的多蛋白或疫苗组合物后产生的自身抗体。该测定方法是酶联免疫吸附测定(ELISA),并且包括以下步骤:
a)将抗原吸附到测试表面上;
b)封闭测试表面上的游离结合位点;
c)使由抗原包被并封闭的测试表面与包含针对抗原的标记的抗体和针对抗原的待测试的自身抗体的混合物一起温育;和
d)检测标记的抗体的结合。
自身抗体,特别是针对细胞因子的自身抗体的检测通常充满困难,然而,所述困难通过本发明的测定得到克服。例如,由于完整的IgG分子和附着至塑料或硝化纤维素膜的(重组)抗原之间发生的非特异性和低亲和力结合,现有技术测定经常递送假阳性测试结果。使用糖基化抗原例如真核细胞中产生的细胞因子用于检测也可能由于测试血清中的抗多糖抗体而导致假阳性结果。令人惊讶的是,由于其依赖针对感兴趣的靶向宿主蛋白质的标记的已知抗体与待测试的自身抗体的竞争,本发明的测定似乎克服了这些困难。测定的这种竞争原理使假阳性结果降到最低。
在根据本发明的测定的步骤a)中,将抗原吸附到测试表面上。如本文使用的,术语“吸附”意指“使测试表面与抗原一起温育,使得抗原粘附至测试表面”。在该上下文中,“粘附至”意欲为“结合至”或“附着至”的含义。测试表面可以是通常用于ELISA形式的任何表面,例如孔板的表面,特别是塑料孔板,优选聚苯乙烯孔板的表面。
如本文使用的,“抗原”指能够被抗体结合的分子或分子的一部分,所述抗体另外能够诱导宿主产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一种或多于一种表位。优选地,步骤a)中使用的抗原是或包含本发明的多蛋白、其单一蛋白质区段或本发明的多蛋白中的蛋白质区段衍生自其的靶向自身蛋白质。
在根据本发明的测定的步骤b)中,封闭测试表面上的游离结合位点。这防止了标记的抗体和待测试的自身抗体与测试表面的非特异性结合。实现步骤b)的合适溶液,所谓的封闭溶液,根据其它典型ELISA形式是本领域技术人员已知的。封闭溶液总是含有封闭剂。封闭剂可以是蛋白质或蛋白质的混合物。特别地,封闭剂可以是牛血清白蛋白(BSA)、新生小牛血清(NBCS)、酪蛋白、脱脂奶粉或明胶。优选地,封闭剂是明胶。当在本发明的测定中使用明胶作为封闭剂时,发明人的实验已显示了背景信号是特别低的。
根据本发明的测定的步骤c)反映了测定的竞争原理。步骤c)涉及标记的抗体与待测试的自身抗体竞争结合步骤a)的测试表面吸附的抗原。优选地,标记的抗体是标记的中和抗体。由于对于测定使用针对感兴趣抗原的标记的抗体,因此只有当待测试的自身抗体对所采用的抗原具有与标记的抗体至少类似地高结合亲和力时,该抗体才能被取代或超过。步骤c)中使用的包含标记的抗体和待测试的自身抗体的混合物含有限定量的标记抗体。在该上下文中的术语“限定量”意指技术人员知道测定中采用的标记抗体的量或浓度。优选地,在步骤c)的混合物中使用25至200ng/ml的标记抗体,更优选50至150ng/ml标记抗体,且最优选75至125ng/ml标记抗体。发明人的实验已显示了,在本发明的测定中使用此类浓度的标记抗体后,可以特别良好地检测与待测试的自身抗体的竞争。
优选地,通过提供一系列混合物来测试步骤c)的两种抗体之间的竞争,其中该系列混合物的不同之处在于待测试的自身抗体的稀释度。待测试的自身抗体可以以1∶1至1∶20.000,优选1∶1至1∶15.000,且最优选1∶1至1∶10.000的稀释度使用。
术语“标记的抗体”意欲包括完整的免疫球蛋白分子以及其一部分、片段、肽和衍生物两者,例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fse、CDR区域、互补位、或者能够结合步骤a)的抗原的抗体的任何部分或肽序列。如果标记的抗体能够与抗原分子特异性反应,以从而使抗原分子与抗体结合,则它被说成“能够结合”步骤a)的抗原。
标记的抗体还包括通过任何已知技术提供的嵌合抗体或杂源嵌合(heterochimeric)抗体以及其片段、一部分、区域、肽或衍生物,所述已知技术例如但不限于酶促切割、肽合成或重组技术。
本发明的测定的步骤d)涉及抗原结合的标记抗体的检测。标记抗体的检测基于其标记。抗原结合的标记抗体的量最终取决于待测试的自身抗体在与测试表面结合的抗原的结合方面如何有效地超过标记抗体。
抗体的合适标记是技术人员已知的。例如,技术人员可以使用放射性同位素例如14C或标签例如生物素作为标记。优选地,使用生物素作为标记。作为标记的生物素具有它可以直接附着到现有蛋白质的优点。
放射性标记的抗体可以通过例如用辐射检测器或使用闪烁混合物和闪烁计数器测量放射性来直接检测。
可以用与报道分子偶联的合适的标记结合部分来检测以标签形式的抗体的标记。用于生物素的合适的标记结合部分可以是例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。生物素-链霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素蛋白的匹配系统具有两个匹配配偶体的结合是特别特异性且强烈的优点。
与标记结合部分偶联的合适的报道分子可以是酶例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶或者荧光标签例如GFP。虽然荧光标签可以通过测量其荧光来直接检测,但报道酶可以用于催化导致可测量的有色产物的反应。
关于碱性磷酸酶的合适比色底物是例如4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP)。在pNPP的去磷酸化后,获得水溶性黄色产物,其在405nm处具有强吸收。在405nm处的吸光度可以用ELISA阅读器,例如Epoch Reader(150115E)或Synergy H1 Reder(180427C)测量。关于碱性磷酸酶的其它合适的比色底物是产生紫色沉淀物的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)。
关于辣根过氧化物酶的合适比色底物是例如3,3′,5,5′四甲基联苯胺(TMB)和2,2′-连氮基-二[3-乙基苯并噻唑啉]磺酸酯(ABTS)。
本发明的测定可以含有在步骤a)至d)之间的另外步骤,例如洗涤步骤,以去除并未与测试表面吸附的抗原结合的任何抗体材料。
发明人的实验显示了,本发明的测定特别适合检测针对IL-31,特别是犬IL-31的自身抗体。在这种情况下,如上所述的含有(犬)IL-31的多蛋白或该多蛋白的(犬)IL-31蛋白质区段用作抗原,并且使用干扰或甚至中和(犬)IL-31的功能的标记抗体作为标记抗体。
优选地,包含由以下组成的组中的至少一种的针对犬IL-31的标记抗体用于本发明的测定中:
-具有氨基酸序列YYDIN(SEQ ID NO:8)、SYDMS(SEQ ID NO:9)、或NYGMS(SEQ IDNO:10)的可变重(VH)链互补决定区(CDR)1;
-具有氨基酸序列WIFPGDGGTKYNETFKG(SEQ ID NO:11)、TITSGGGYTYSADSVKG(SEQID NO:12)、或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:13)的可变重链CDR2;和
-具有氨基酸序列ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:14)、ARQNWVVGLAY(SEQ ID NO:15)、或VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO:16)的可变重链CDR3。
还优选地,包含由以下组成的组中的至少一种的针对犬IL-31的标记抗体用于本发明的测定中:
-包含具有氨基酸序列RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:17)、KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:18)、或KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:19)的互补决定区(CDR)1的可变轻(VL)链,
-具有氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:20)、GASTRES(SEQ ID NO:21)、或RASNLEA(SEQ ID NO:22)的可变轻链CDR2;和
-具有氨基酸序列QQSNKDPLT(SEQ ID NO:23)、QNDYSYPYT(SEQ ID NO:24)、或QQSREYPWT(SEQ ID NO:25)的可变轻链CDR3。
更优选地,包含由以下组成的组中的至少一种的针对犬IL-31的标记抗体用于本发明的测定中:
a)包含(SEQ ID NO:26)、(SEQ ID NO:27)、(SEQ ID NO:28)、(SEQ ID NO:29)、(SEQ ID NO:30)、(SEQ ID NO:31)、或(SEQ ID NO:32)的可变轻链;
b)包含(SEQ ID NO:33)、(SEQ ID NO:34)、(SEQ ID NO:35)、(SEQ ID NO:36)、(SEQ ID NO:37)、或(SEQ ID NO:38)的可变重链。
此类标记的中和抗体非常有效地结合犬IL-31(参见WO2013/011407 A1)。商业抗体洛吉维单抗特别适用于根据本发明的测定方法中,以检测针对犬IL-31的中和性自身抗体。
序列表
本申请含有已以电子方式提交,并且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述序列表文件命名为210741WO_ST25_Sequence listing_.txt,并且大小为973KB。
SEQ ID NO:1是破伤风毒素T细胞表位p2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是破伤风毒素T细胞表位p4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是破伤风毒素T细胞表位p30的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是犬IL-31的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是用于实施例13a的疫苗的cIL-31多蛋白的氨基酸序列的一种形式。
SEQ ID NO:40是用于实施例13a的疫苗的cIL-31多蛋白的氨基酸序列的另一种形式。
SEQ ID NO:40仅在其N末端方面不同于SEQ ID NO:4。与SEQ ID NO:4形成对比,SEQ ID NO:40在N末端处具有三个另外的氨基酸(“SHM”)。由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:40编码的多蛋白的不同N末端起因于N末端ER信号序列的不同切割事件。
SEQ ID NO:5是免疫刺激性寡核苷酸1668-PTO的核酸序列。
SEQ ID NO:6是免疫刺激性寡核苷酸2006-PTO的核酸序列:
SEQ ID NO:7是编码实施例1a的cIL-31多蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-cIL31-poly的核酸序列。
下述序列涉及与适合于根据本发明的测定方法的抗犬IL-31标记的中和抗体有关的氨基酸序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。
SEQ ID NO:41是犬IL-5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是用于实施例13b的疫苗构建体的cIL-5多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是可以用于实施例13b的疫苗构建体的cIL-5多蛋白的替代氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是编码实施例1b的cIL-5多蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-cIL-5-poly的核酸序列。
SEQ ID NO:45是编码实施例3b的cIL-5蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-cIL-5的核酸序列。
SEQ ID NO:46是犬IL-13的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是用于实施例13c的疫苗构建体的cIL-13多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是编码实施例1c的cIL-13多蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-cIL-13-poly的核酸序列。
SEQ ID NO:49是编码实施例3c的cIL-13蛋白构建体的细菌表达质粒pET30a-cIL-13的核酸序列。
SEQ ID NO:50是全长犬IL-33蛋白(Uniprot O97863)犬IL-33-WT的氨基酸110-263的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是犬IL-33-CS的改变的氨基酸序列,其是全长犬IL-33蛋白(Uniprot O97863)的氨基酸110-263,其中3个半胱氨酸残基被丝氨酸替换(IL-33-CS),以改善基因产物的稳定性。
SEQ ID NO:52是编码实施例3d的cIL-33_WT蛋白构建体的质粒pET30a(+)-canIL33-WT的核酸序列。
SEQ ID NO:53是编码实施例3e的cIL-33_CS蛋白构建体的质粒pET30a(+)-canIL33-CS的核酸序列。
SEQ ID NO:54是用于实施例13d的疫苗构建体的cIL-33-CS多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是编码实施例1d的cIL-33-CS多蛋白构建体的质粒pET30a-cIL33-(CS-)poly的核酸序列。
SEQ ID NO:56是犬IL-4的氨基酸序列
SEQ ID NO:57是用于实施例13e的疫苗构建体的cIL-4多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是编码实施例1e的cIL-4多蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-cIL-5-poly的核酸序列。
SEQ ID NO:59是编码实施例3f的cIL-4蛋白构建体的细菌表达质粒pET30a-cIL-4的核酸序列。
SEQ ID NO:60是猫IL-31的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是用于实施例13f的疫苗构建体的猫IL-31多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62是编码实施例1g的猫IL-31多蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-felIL31-poly的核酸序列。
SEQ ID NO:63是编码实施例3g的猫IL-31蛋白构建体的质粒pcDNA3.4-fel-IL31的核酸序列。
SEQ ID NO:64是牛TNF-α的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65是用于实施例6f的免疫的牛TNF-α多蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66是编码实施例1h的牛TNF-α多蛋白构建体的细菌表达质粒pET30a-bov-TNF-α-poly的核酸序列。
SEQ ID NO:67是给定实施例中用于哺乳动物表达的人工ER输入信号的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68至201是序列表中描述的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:202至329是特别可用于实施例13g的疫苗构建体的多蛋白实施方案的氨基酸序列。
实施例
实施例1a:根据本发明的IL-31多蛋白的设计
设计了编码包含成熟犬IL-31蛋白的三个拷贝的多蛋白的DNA构建体,其中所述成熟犬IL-31(cIL-31)蛋白通过破伤风毒素T细胞表位彼此分开,并且其中C末端成熟cIL-31随后为两个另外的破伤风毒素T细胞表位(参见图1)。所编码的多蛋白进一步含有在N末端处的人工ER输入信号以及在C末端处的His6标签(参见图1)。该DNA构建体进一步设计为含有在多蛋白的起始密码子上游的Kozak序列,以改善在哺乳动物细胞中的表达,并且含有侧翼独特的限制性酶位点用于直接克隆。在合成该DNA构建体后,将DNA构建体克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致大小为7637bp的载体pcDNA3.4-cIL31-poly(SEQ IDNO:7和图2中的质粒图谱)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
实施例1b:根据本发明的IL-5多蛋白的设计
以与实施例1a中的犬IL-31多蛋白相同的方式,设计了编码包含成熟犬IL-5蛋白的三个拷贝的多蛋白的DNA构建体(参见图39)。将编码cIL-5-多蛋白的DNA构建体亚克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致大小为7430bp的载体pcDNA3.4-cIL-5-poly(SEQ IDNO:43和图40中的质粒图谱)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
实施例1c:根据本发明的IL-13多蛋白的设计
以与实施例1a中的犬IL-31多蛋白相同的方式,设计了编码包含成熟犬IL-13蛋白的三个拷贝的多蛋白的DNA构建体(参见图47)。将编码cIL-13-多蛋白的DNA构建体亚克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致大小为7418bp的载体pcDNA3.4-cIL-13-poly(SEQID NO:48和图48中的质粒图谱)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
实施例1d:根据本发明的IL-33-CS多蛋白的设计
设计了编码包含成熟犬IL-33-CS蛋白的三个拷贝的cIL-33-CS多蛋白(多蛋白-SEQ ID NO:54)的DNA构建体,其中所述成熟犬IL-33-CS(cIL-33)蛋白通过破伤风毒素T细胞表位彼此分开,并且其中C末端成熟cIL-33-CS随后为两个另外的破伤风毒素T细胞表位(参见图63)。该多蛋白进一步含有人工起始甲硫氨酸和His6标签,如图63中所示。
基于该多肽序列,设计并合成了编码Hi6-cIL33-CS-poly(SEQ ID NO:55)的DNA,其包括起始ATG密码子以改善在大肠杆菌中的表达,以及侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII),用于直接亚克隆到细菌表达载体pET30a内。
将DNA构建体亚克隆到pET30a细菌表达载体内,导致大小为6954bp的载体pET30a-cIL-33-poly(即pET30a-cIL-33-CS poly)(图64中的质粒图谱)。
发明人用cIL-33-CS代替cIL-33-WT作为基础蛋白构建了cIL-33poly形式。发明人发现了,虽然已知人IL-33-WT被HEK-BlueTM IL-33细胞灵敏地识别,但犬IL-33-WT仅在游离半胱氨酸突变为丝氨酸后才被灵敏地识别,如cIL-33-CS中(参见下文的实施例12c)。不受理论的束缚,似乎该突变克服了游离半胱氨酸的潜在结构倾向,其在cIL-33-poly构建体中可能是不利的。尽管并非所有IL-33构建体都需要游离半胱氨酸的这种突变,但它是有利的且是本发明的优选实施方案。
实施例1e:根据本发明的IL-4多蛋白的设计
以与实施例1a中的犬IL-31多蛋白相同的方式,设计了编码包含成熟犬IL-4蛋白的三个拷贝的多蛋白的DNA构建体(参见图68)。将编码cIL-4-多蛋白的DNA构建体亚克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致大小为7373bp的载体pcDNA3.4-cIL-4-poly(SEQ IDNO:58和图69中的质粒图谱)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
实施例1f:根据本发明的猫IL-31多蛋白的设计
设计了编码包含成熟猫科(家猫(Felis catus);猫(Felis silvestris catus))IL-31蛋白(SEQ ID NO:60)的三个拷贝的多蛋白(SEQ ID NO:61)的DNA构建体(SEQ ID NO:62),其中所述成熟猫IL-31(fel-IL-31)蛋白通过破伤风毒素T细胞表位彼此分开,并且其中C末端成熟fel-IL-31随后为两个另外的破伤风毒素T细胞表位(参见图74)。所编码的多蛋白进一步含有在N末端处的人工ER输入信号以及在C末端处的His6标签(参见图74)。该DNA构建体进一步设计为含有在多蛋白的起始密码子上游的Kozak序列,以改善在哺乳动物细胞中的表达,并且含有侧翼独特的限制性酶位点用于直接克隆。在合成该DNA构建体后,将DNA构建体亚克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致表达质粒pcDNA3.4-felIL31-poly(7597bp)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
实施例1g:根据本发明的进一步多蛋白实施方案的设计
DNA构建体可以设计为编码其它多蛋白。这可以如下实现:
多蛋白设计为包含具有序列SEQ ID NO:68-201之一的自身蛋白质的三个拷贝,其中所述三个拷贝通过破伤风毒素T细胞表位(例如p2、p4或p30)彼此分开,并且其中C末端成熟蛋白质随后为两个另外的破伤风毒素T细胞表位,其方式与图1)中的实施例1a相同。所编码的多蛋白可以设计为含有在N末端处的人工ER输入信号以及在C末端处的His6标签。
该DNA构建体可以进一步设计为含有在多蛋白的起始密码子上游的Kozak序列,以改善在哺乳动物细胞中的表达,并且含有侧翼独特的限制性酶位点用于直接克隆。在合成该DNA构建体后,可以将DNA构建体亚克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,以制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
可替代地,DNA构建体可以设计为改善在细菌中的表达,例如通过包括起始ATG密码子以改善在大肠杆菌中的表达,以及侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII),用于直接亚克隆到细菌表达载体pET30a内,导致载体pET30a-[poly]-poly。
实施例1h:根据本发明的牛TNF-α多蛋白的设计
设计了编码包含TNF-α(SEQ ID NO:65)蛋白的三个拷贝的牛TNF-α多蛋白(多蛋白-SEQ ID NO:65)的DNA构建体(SEQ ID NO:66),其中所述TNF-α蛋白通过破伤风毒素T细胞表位彼此分开,并且其中C末端TNF-α随后为两个另外的破伤风毒素T细胞表位(参见图77)。该多蛋白进一步含有人工起始甲硫氨酸和His6标签,如图77中所示。六G/S-接头用于该构建体中。
基于该多肽序列,设计并合成了编码Hi6-bov-TNF-α-poly(SEQ ID NO:66)的DNA,其包括起始ATG密码子以改善在大肠杆菌中的表达,以及侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII),用于直接亚克隆到细菌表达载体pET30a内。
将DNA构建体亚克隆到pET30a细菌表达载体内,导致大小为7017bp的载体pET30a(+)-bov-TNF-α-poly(图78中的质粒图谱)。
实施例2a:根据本发明的cIL-31多蛋白在Expi293F细胞中的表达以及所表达的多
蛋白的纯化
Expi293F细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。Expi293F细胞在37℃伴随8%CO2下维持在轨道振荡器(VWR Scientific)上的锥形烧瓶(Corning Inc.)中。在转染前一天,将细胞以适当的密度接种在Corning锥形烧瓶中。在转染当天时,将质粒pcDNA3.4-cIL31-poly和转染试剂以最佳比率混合,然后加入具有准备用于转染的细胞的烧瓶内。在第6天时收集的细胞培养物上清液用于纯化由pcDNA3.4-cIL31-poly(SEQ ID NO:7和图2中的质粒图谱)表达的多蛋白。预计所产生的成熟多蛋白不再包括在N末端处的人工ER输入信号,然后具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40的序列。由于ER输入信号的不同切割事件,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:40在其N末端方面彼此不同。
所表达的多蛋白的纯化和分析如下执行:
将细胞培养肉汤离心。其后,将细胞培养物上清液以适当的流速加载到Ni2+-NTA亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后,合并洗脱的级分并将缓冲液更换为最终制剂缓冲液,其为PBS,pH7.2。
通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析纯化的多蛋白,以确定其分子量和纯度。为此,通过Bradford测定以BSA作为校准曲线的标准来确定所纯化的多蛋白的浓度。从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约16mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性(cIL-31)-p4-(cIL-31)-p30-(cIL-31)-p30-p4-His6多蛋白,在下述实施例中被称为cIL-31多蛋白或cIL-31poly。
对于SDS-PAGE分析,使用下述上样缓冲液:
-还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mMDTT,pH6.8。
-非还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝,pH6.8。
将还原性和非还原性上样缓冲液分别加入多蛋白样品中。具有还原性或非还原性上样缓冲液的多蛋白样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。
在将多蛋白样品与还原性上样缓冲液混合后,执行在100℃下5-10分钟的加热。
将具有还原性或非还原性上样缓冲液的多蛋白样品以10000rpm离心1分钟,然后加载到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)的凝胶室中。如通过制造商概述的,执行用这些凝胶的SDS-PAGE(140V大约60分钟)。其后,凝胶用考马斯蓝进行染色。染色的凝胶显示于图3中。
图3中的考马斯蓝染色的凝胶的泳道1中的占优势条带略大于由蛋白质序列预计的(56865.04Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。这种差异很可能起于广泛的N糖基化,因为cIL-31蛋白序列含有8个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),其中7个很可能是修饰的。
在非还原条件下(图3中的考马斯蓝染色的凝胶的泳道2),只有大约一半的加载蛋白质迁移到指示单体的条带中。很大一部分似乎是二聚体和多聚体形式。
实施例2b:根据本发明的cIL-5多蛋白在Expi293F细胞中的表达以及所表达的多
蛋白的纯化
cIL-5多蛋白的表达与实施例2a的cIL-31多蛋白的表达相同地进行,除了使用质粒pcDNA3.4-cIL-5-poly(SEQ ID NO:44;参见图40中的质粒图谱)代替pcDNA3.4-cIL31-poly(SEQ ID NO:7)之外。
如实施例2a中,预计所产生的成熟多蛋白不再包括在N末端处的人工ER输入信号,然后具有SEQ ID NO:42的序列。
从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约0.23mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性(cIL-5)-p2-(cIL-5)-p30-(cIL-5)-p30-p2-His6多蛋白,在下述实施例中被称为cIL-5多蛋白或cIL-5 poly。
染色的凝胶显示于图41中。
图41中的SDS-PAGE/蛋白质印迹的泳道1中的占优势条带比由蛋白质序列预计的大得多(50477.67Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。这种差异很可能起于广泛的N糖基化,因为蛋白质序列含有8个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),其中5个很可能是修饰的。
在非还原条件下(图41中的SDS-PAGE的泳道2),加载的蛋白质的外观与在还原条件下的外观相比是改变的,其指示了二硫键连接的寡聚体或多聚体形式。
实施例2c:根据本发明的cIL-13多蛋白在Expi293F细胞中的表达以及所表达的多
蛋白的纯化
cIL-13多蛋白的表达与实施例2a的cIL-31多蛋白的表达相同地进行,除了使用质粒pcDNA3.4-cIL-13-poly(SEQ ID NO:48;参见图48中的质粒图谱)代替pcDNA3.4-cIL31-poly(SEQ ID NO:7)之外。
如实施例2a中,预计所产生的成熟多蛋白不再包括在N末端处的人工ER输入信号,然后具有SEQ ID NO:47的序列。
从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约0.6mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性(cIL-13)-p2-(cIL-13)-p30-(cIL-13)-p30-p2-His6多蛋白,在下述实施例中被称为cIL-13多蛋白或cIL-13 poly。
染色的凝胶显示于图49中。
图49中的SDS-PAGE/蛋白质印迹的泳道1中的占优势条带比由蛋白质序列预计的大得多(47496.39Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。这种差异很可能起于广泛的N糖基化,因为蛋白质序列含有14个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),其中13个很可能是修饰的。
在非还原条件下(图49中的SDS-PAGE的泳道2),加载的蛋白质的外观与在还原条件下的外观非常相似,其指示了在很大程度上的体形式。
实施例2d:根据本发明的cIL-33多蛋白在大肠杆菌细胞中的表达以及所表达的多
蛋白的纯化
用重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21 StarTM(DE3)。将单个菌落接种到含有相关抗生素的Lysogeny Broth(LS)培养基内。使培养物在37℃下在200rpm下温育,然后用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。使用SDS-PAGE来监测表达。
表达如下进行按比例扩大:将贮存于甘油中的重组BL21(DE3)接种到含有相关抗生素的Terrific Broth(TB)培养基内,并且在37℃下进行培养。当OD600达到约1.2时,细胞培养物在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心来收获细菌。
所表达的蛋白质的纯化如下执行:细菌团块用裂解缓冲液进行重悬浮,随后为超声处理。离心后的沉淀物使用变性剂进行溶解。通过使用Ni柱的一步纯化获得靶蛋白。靶蛋白通过0.22μm过滤器进行灭菌,然后以等分试样贮存。通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。通过标准SDS-PAGE来确定蛋白质纯度和分子量。
如实施例2a中所述的执行所表达的蛋白质的SDS-PAGE分析。染色的凝胶显示于图65中。
从1L培养物的细菌团块获得大约0.9mg可溶性(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)cIL-13-His6。图65中描绘的SDS-PAGE的泳道2中的占优势条带的大小与由蛋白质序列预计的预测良好一致(63604.11Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。
实施例2e:根据本发明的cIL-4多蛋白在Expi293F细胞中的表达以及所表达的多
蛋白的纯化
cIL-4多蛋白的表达与实施例2a的cIL-31多蛋白的表达相同地进行,除了使用质粒pcDNA3.4-cIL-4-poly(SEQ ID NO:58;参见图69中的质粒图谱)代替pcDNA3.4-cIL31-poly(SEQ ID NO:7)之外。
蛋白质印迹分析揭示了还原样品中作为100kDa至120kDa之间的宽条带的重组产物,而在非还原样品中,可见在100-120kDa和>>120kDa处的两个模糊条带区。
如实施例2a中,预计所产生的成熟多蛋白不再包括在N末端处的人工ER输入信号,然后具有SEQ ID NO:47的序列。
从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约4.5mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性(cIL-4)-p2-(cIL-4)-p30-(cIL-4)-p30-p2-His6多蛋白,在下述实施例中被称为cIL-4多蛋白或cIL-4poly。
染色的凝胶显示于图49中。
在还原条件下的占优势条带比由蛋白质序列预计的大得多(51039.30Da),其使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算。这种差异很可能起于广泛的N糖基化,因为蛋白质序列含有20个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),其中17个很可能是修饰的。
潜在地且很可能是异质的、大量的糖基化可能解释了蛋白质在蛋白质印迹中的宽条带外观、以及比由氨基酸组成预测的更大的大小。
实施例2f:根据本发明的fel-IL-31多蛋白在Expi293F细胞中的表达以及所表达
的多蛋白的纯化
Expi293F细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。Expi293F细胞在37℃伴随8%CO2下维持在轨道振荡器(VWR Scientific)上的锥形烧瓶(Corning Inc.)中。在转染前一天,将细胞以适当的密度接种在Corning锥形烧瓶中。在转染当天时,将质粒pcDNA3.4-fel-IL31-poly和转染试剂以最佳比率混合,然后加入具有准备用于转染的细胞的烧瓶内。在第6天时收集的细胞培养物上清液用于纯化由pcDNA3.4-fel-IL31-poly表达的多蛋白。预计所产生的成熟多蛋白不再包括在N末端处的人工ER输入信号,然后具有SEQ ID NO:61的序列。
所表达的多蛋白的纯化和分析如下执行:
将细胞培养肉汤离心。其后,将细胞培养物上清液以适当的流速加载到Ni2+-NTA亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后,合并洗脱的级分并将缓冲液更换为最终制剂缓冲液,其为PBS,pH 7.2。
通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析纯化的多蛋白,以确定其分子量和纯度。为此,通过Bradford测定以BSA作为校准曲线的标准来确定所纯化的多蛋白的浓度。从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约7.29mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性fel-IL-31-poly-His6多蛋白。
对于SDS-PAGE分析,使用下述上样缓冲液:
-还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mMDTT,pH 6.8。
-非还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝,pH6.8。
将还原性和非还原性上样缓冲液分别加入多蛋白样品中。具有还原性或非还原性上样缓冲液的多蛋白样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。在将多蛋白样品与还原性上样缓冲液混合后,执行在100℃下5-10分钟的加热。将具有还原性或非还原性上样缓冲液的多蛋白样品以10000rpm离心1分钟,然后加载到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)的凝胶室中。如通过制造商概述的,执行用这些凝胶的SDS-PAGE(140V大约60分钟)。其后,凝胶用考马斯蓝进行染色。
在考马斯蓝染色的SDS凝胶中,fel-IL-31-poly在还原凝胶中由80kDa左右的占优势条带表示。这大于预计的(成熟多肽的计算分子量:55615.65Da),其可能由N糖基化引起。基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),高达6个位置很可能是修饰的。
在非还原凝胶泳道中,fel-IL-31-poly条带的迁移率稍快于还原凝胶泳道中,这对于导致更紧凑结构的链内二硫键是典型的。在占优势条带顶部的一些污点指示了聚集的材料。然而,总体而言,SDS-PAGE分析提示了fel-IL-31-poly在很大程度上是单体的。
实施例2g:根据本发明的进一步多蛋白的表达和纯化
实施例1g中设计的多蛋白的表达可以与实施例2a或实施例2d的cIL-31多蛋白的表达相同地进行。如果包括在构建体中,则所产生的成熟多蛋白预计不再包括在N末端处的人工ER输入信号,并且预计具有相应的氨基酸序列SEQ ID NO:202至329。
实施例2h:根据本发明的牛TNF-α多蛋白的表达和纯化
pET30a-bov-TNF-α-poly在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的表达和重组蛋白质的纯化基本上如关于其它大肠杆菌表达描述的完成(参见例如cIL-33-CS、cIL-13、cIL-33-CS-poly)。
简言之,将包涵体溶解于变性溶液中并经受Ni2+-NTA亲和层析。然后使来自该柱的洗脱物经受Superdex G200尺寸排阻层析,并将洗脱物贮存于PBS、10%甘油、1M L-精氨酸,pH 7.4中。1L培养物得到5.82mg的重组蛋白质,并且SDS PAGE分析显示牛TNF-α多蛋白的纯度超过90%。
实施例3a:正确折叠的天然cIL-31在哺乳动物细胞中的表达
设计了编码cIL-31的DNA构建体,其具有在N末端处的人工ER输入信号以及在C末端处的His6标签。该cIL-31-DNA构建体进一步设计为含有在蛋白质的起始密码子上游的Kozak序列,以改善在哺乳动物细胞中的表达,并且含有侧翼独特的限制性酶位点用于直接克隆。在合成该DNA构建体后,将DNA构建体克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致大小为6521bp的载体pcDNA3.4-cIL31。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
来自pcDNA3.4-cIL31的cIL-31构建体的表达如下实现:
Expi293F细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。细胞在37℃伴随8%CO2下维持在轨道振荡器(VWR Scientific)上的锥形烧瓶(CorningInc.)中。在转染前一天,将细胞以适当的密度接种在Corning锥形烧瓶中。在转染当天时,将质粒pcDNA3.4-cIL31和转染试剂以最佳比率混合,然后加入具有准备用于转染的细胞的烧瓶内。在第6天时收集的细胞培养物上清液用于纯化。
所表达的蛋白质的纯化和分析如下执行:
将细胞培养肉汤离心。将细胞培养物上清液以适当的流速加载到Ni2+-NTA亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后,合并洗脱的级分并将缓冲液更换为最终制剂缓冲液,其为PBS pH 7.2。
通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析纯化的蛋白质,以确定其分子量和纯度。为此,通过Bradford测定以BSA作为校准曲线的标准来确定所纯化的多蛋白的浓度。从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约2.61mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性cIL31-His6,在下述实施例中被称为cIL-31。
对于SDS-PAGE分析,使用下述上样缓冲液:
-还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mMDTT,pH 6.8。
-非还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝,pH6.8。
将还原性和非还原性上样缓冲液分别加入蛋白质样品中。具有还原性或非还原性上样缓冲液的蛋白质样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。
在将蛋白质样品与还原性上样缓冲液混合后,执行在100℃下5-10分钟的加热。
将具有还原性或非还原性上样缓冲液的蛋白质样品以10000rpm离心1分钟,然后加载到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)的凝胶室中。如通过制造商概述的,执行用这些凝胶的SDS-PAGE(140V大约60分钟)。其后,凝胶用考马斯蓝进行染色。染色的凝胶显示于图4中。
SDS-PAGE的泳道1中的占优势条带比由蛋白质序列预计的大得多(16196.54Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。很可能差异是由广泛的N糖基化造成的,因为蛋白质序列含有两个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),所述两个位点很可能是修饰的。
在非还原条件下(SDS-PAGE中的泳道2),大部分加载的蛋白质迁移到指示单体的条带中。只有一小部分似乎以二聚体和多聚体形式存在。
实施例3b:正确折叠的天然cIL-5在哺乳动物细胞中的表达
如实施例3a中关于cIL-31所述的,执行编码cIL-5的DNA构建体的设计、合成和亚克隆。在图42中描绘了大小为6452bp的载体pcDNA3.4-cIL-5(SEQ ID NO:45)。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
如对于实施例3a中的cIL-31构建体,实现了来自pcDNA3.4-cIL-5的cIL-5构建体的表达以及所表达的蛋白质的纯化和分析。
从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约7.28mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性cIL-5-His6,在下述实施例中被称为cIL-5。
在还原性SDS-PAGE(图43,泳道“1”)中观察到的表观分子大小略高于由预测预计的(13921.91Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算),这可能由在一个位置处的N糖基化造成。非还原性SDS-PAGE(图43的泳道“2”)提示了该蛋白质作为二聚体表达,这与关于来自其它物种的IL-5的文献知识一致。
实施例3c:正确折叠的天然cIL-13在细菌(大肠杆菌)细胞中的表达
设计了编码SEQ ID NO:46的cIL-13的DNA构建体,其具有在N末端处的起始甲硫氨酸(M)以及在C末端处的His6标签。该cIL-13-DNA构建体进一步设计为含有人工起始密码子ATG,侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII)用于直接亚克隆,以及终止密码子TGA。
在合成该DNA构建体后,DNA构建体经由限制性位点NdeI和HindIII亚克隆到pET30(+)大肠杆菌表达载体内,导致大小为5619bp的载体pET30a-cIL-13(SEQ ID NO:49);图50中所示的质粒图谱)。制备转染级质粒用于大肠杆菌表达。
如下实现来自pET30a-cIL-13的cIL-13构建体的表达:用重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21 StarTM(DE3)。将单个菌落接种到含有相关抗生素的Lysogeny Broth(LS)培养基内。使培养物在37℃下在200rpm下温育,然后用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。使用SDS-PAGE来监测表达。
表达如下进行按比例扩大:将贮存于甘油中的重组BL21(DE3)接种到含有相关抗生素的Terrific Broth(TB)培养基内,并且在37℃下进行培养。当OD600达到约1.2时,细胞培养物在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心来收获细菌。
所表达的蛋白质的纯化如下执行:细菌团块用裂解缓冲液进行重悬浮,随后为超声处理。离心后的沉淀物使用变性剂进行溶解。通过使用Ni柱的一步纯化获得靶蛋白。靶蛋白通过0.22μm过滤器进行灭菌,然后以等分试样贮存。
通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。从1L大肠杆菌培养物的细菌团块获得大约10.5mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性cIL-13-His6,在下述实施例中被称为cIL-13。
使用还原性上样缓冲液,通过标准SDS-PAGE来确定所表达的蛋白质的蛋白质纯度和分子量。BSA用作对照。向蛋白质样品中添加还原性上样缓冲液(300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mM DTT,pH 6.8),使得蛋白质样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。
在将蛋白质样品与还原性上样缓冲液混合后,它们在100℃下加热5-10分钟,以10000rpm离心1分钟,然后加载(BSA 2μg;cIL-131.86μg)到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)的凝胶室中。如通过制造商概述的,执行用这些凝胶的SDS-PAGE(140V大约60分钟)。其后,凝胶用考马斯蓝进行染色。
染色的凝胶显示于图51中。泳道1描绘了BSA的大小。泳道2描绘了cIL-13蛋白的大小。
图51的SDS-PAGE的泳道1中的条带与BSA的预计的66kDa分子量良好一致。图51的SDS-PAGE的泳道2中的占优势条带的大小与由蛋白质序列预计的预测良好一致(13394.39Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。
实施例3d:正确折叠的天然cIL-33-WT在细菌(大肠杆菌)细胞中的表达
cIL-33-WT蛋白序列(SEQ ID NO:50)对应于全长犬IL-33蛋白(Uniprot O97863)的氨基酸110-263,类似于充分描述的小鼠IL-33的氨基酸109-266形式(Uniprot Q8BVZ5)。
设计了编码cIL-33-WT(SEQ ID NO:50)的DNA构建体(SEQ ID NO:52),其还编码在N末端处的起始甲硫氨酸(M)和His6标签。该构建体设计为含有人工起始密码子ATG,侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII)用于直接亚克隆,以及终止密码子TGA。
在合成该DNA构建体后,它经由限制性位点NdeI和HindIII亚克隆到pET30(+)大肠杆菌表达载体内,导致大小为5742bp的载体pET30a-canIL33-CS(图57中所示的质粒图谱)。
来自pET30a(+)-canIL33-WT的His6-cIL-33-WT构建体的表达如下实现:将pET30a(+)-canIL-33-WT转化的BL21(DE3)大肠杆菌接种到含有卡那霉素的Terrific Broth(TB)培养基内,并且在37℃下进行培养。当OD600达到约1.2时,细胞培养物在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心来收获细胞。
cIL-33-WT蛋白的纯化遵循使用Ni2+柱的典型His标签蛋白纯化方案。细胞团块用裂解缓冲液进行重悬浮,随后为超声处理。离心后的上清液(可溶性表达)用于柱层析。靶蛋白进行透析并且通过0.22μm过滤器进行灭菌,然后以等分试样贮存。通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。
通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。从1L培养物的细菌团块获得大约10.01mg可溶性(在50mM Tris-HCl、10%甘油、150mM NaCl,pH 8.0中)His6-cIL-33-WT,在下述实施例中被称为cIL-33-WT。
如实施例3c中关于cIL-13描述的(各2.00μg加载到凝胶室内),使用还原性上样缓冲液和作为对照的BSA,通过标准SDS-PAGE来确定所表达的蛋白质的蛋白质纯度和分子量。染色的凝胶显示于图58中。泳道1描绘了BSA的大小,并且与其预计的66kDa分子量良好一致。泳道2描绘了cIL-33-WT蛋白的大小,并且与由蛋白质序列预计的预测艮好一致(18578.54Da,使用https://web.expasy,org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。
实施例3e:正确折叠的天然cIL-33-CS在细菌(大肠杆菌)细胞中的表达
从cIL-33-WT开始设计编码cIL-33-CS的DNA构建体。IL-33-WT(SEQ ID NO:50)中存在的三个半胱氨酸残基各自替换为丝氨酸残基,以改善基因产物的稳定性,导致IL-33-CS(SEQ ID NO:51)。
设计了编码cIL-33-CS的DNA构建体(SEQ ID NO:53),其具有在N末端处的起始甲硫氨酸(M)和His6标签。该构建体设计为含有人工起始密码子ATG,侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII)用于直接亚克隆,以及终止密码子TGA。
在合成该DNA构建体后,它经由限制性位点NdeI和HindIII亚克隆到pET30(+)大肠杆菌表达载体内,导致大小为5742bp的载体pET30a-canIL33-CS(图60中所示的质粒图谱)。
来自pET30a-cIL33-CS的cIL-33-CS构建体的表达如下实现:将pET30a(+)-canIL-33-CS转化的BL21(DE3)(大肠杆菌)接种到含有卡那霉素的Terrific Broth(TB)培养基内,并且在37℃下进行培养。当OD600达到约1.2时,细胞培养物在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心来收获细胞。His6-canIL33-CS蛋白的纯化遵循使用Ni2+柱的典型His标签蛋白纯化方案。细胞团块用裂解缓冲液进行重悬浮,随后为超声处理。离心后的沉淀物(包涵体)使用变性剂进行溶解,然后经受柱层析。靶蛋白通过0.22μm过滤器进行灭菌,然后以等分试样贮存。
通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。通过上述程序,从1L培养物的细菌团块获得大约10.4mg可溶性(在磷酸盐缓冲盐水『PBS]、10%甘油、0.5M L-精氨酸,pH 7.4中)His6-cIL-33-CS。
如实施例3c中关于cIL-13描述的(各2.00μg加载到凝胶室内),使用还原性上样缓冲液和作为对照的BSA,通过标准SDS-PAGE来确定所表达的蛋白质的蛋白质纯度和分子量。染色的凝胶显示于图61中。泳道1描绘了BSA的大小,并且与其预计的66kDa分子量良好一致。泳道2描绘了cIL-33-CS蛋白的大小,其中占优势条带与由cIL-33-CS的蛋白质序列预计的预测良好一致(18530.36Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。
实施例3f:正确折叠的天然cIL-4在细菌(大肠杆菌)细胞中的表达
设计了编码cIL-4(SEQ ID NO:56)的DNA构建体(SEQ ID NO:59),其还编码在N末端处的起始甲硫氨酸(M)和His6标签。该构建体设计为含有人工起始密码子ATG,侧翼独特的限制性酶位点(NdeI和HindIII)用于直接亚克隆,以及终止密码子TGA。
在合成该DNA构建体后,它经由限制性位点NdeI和HindIII亚克隆到pET30(+)大肠杆菌表达载体内,导致大小为5601bp的载体pET30a-cIL-4(图70中所示的质粒图谱)。
来自pET30a-cIL-4的cIL-4构建体的表达如下实现:用重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21 StarTM(DE3)。将单个菌落接种到含有相关抗生素的Lysogeny Broth(LS)培养基内。使培养物在37℃下在200rpm下温育,然后用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。使用SDS-PAGE来监测表达。
表达如下进行按比例扩大:将贮存于甘油中的重组BL21(DE3)接种到含有相关抗生素的Terrific Broth(TB)培养基内,并且在37℃下进行培养。当OD600达到约1.2时,细胞培养物在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心来收获细菌。
所表达的蛋白质的纯化如下执行:细菌团块用裂解缓冲液进行重悬浮,随后为超声处理。离心后的沉淀物使用变性剂进行溶解。通过使用Ni柱的一步纯化获得靶蛋白。靶蛋白通过0.22μm过滤器进行灭菌,然后以等分试样贮存。
通过以BSA作为标准的Bradford蛋白测定来确定浓度。从1L大肠杆菌培养物的细菌团块获得大约10.78mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性cIL-4-His6,在下述实施例中被称为cIL-4。
使用还原性上样缓冲液,通过标准SDS-PAGE来确定所表达的蛋白质的蛋白质纯度和分子量。BSA用作对照。分别向蛋白质样品中添加还原性上样缓冲液(300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mM DTT,pH 6.8)、以及非还原性上样缓冲液(300mMTris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝,pH 6.8),使得蛋白质样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。
在混合后,具有还原性上样缓冲液的蛋白质样品在100℃下加热5-10分钟。将蛋白质样品以10000rpm离心1分钟,然后加载(BSA 2μg;cIL-42μg)到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)和适当的电泳缓冲液的凝胶室中。电泳在140V下执行大约60分钟。考马斯蓝染色的凝胶显示了在泳道1中的条带,其与BSA的预计的66kDa分子量良好一致。SDS-PAGE的泳道2中的占优势条带的大小与由cIL-4蛋白序列预计的预测良好一致(13585.88Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。
实施例3g:正确折叠的天然fel-IL-31在哺乳动物细胞中的表达
设计了编码fel-IL-31的DNA构建体(SEQ ID NO:63),其具有在N末端处的人工ER输入信号以及在C末端处的His6标签。该fel-IL-31-DNA构建体进一步设计为含有在蛋白质的起始密码子上游的Kozak序列,以改善在哺乳动物细胞中的表达,并且含有侧翼独特的限制性酶位点用于直接克隆。在合成该DNA构建体后,将DNA构建体克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体内,导致载体pcDNA3.4-fel-IL31。制备大量转染级质粒用于Expi293F细胞表达。
来自pcDNA3.4-fel-IL31的cIL-31构建体的表达如下实现:
Expi293F细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。细胞在37℃伴随8%CO2下维持在轨道振荡器(VWR Scientific)上的锥形烧瓶(CorningInc.)中。在转染前一天,将细胞以适当的密度接种在Corning锥形烧瓶中。在转染当天时,将质粒pcDNA3.4-fel-IL31和转染试剂以最佳比率混合,然后加入具有准备用于转染的细胞的烧瓶内。在第6天时收集的细胞培养物上清液用于纯化。
所表达的蛋白质的纯化和分析如下执行:
将细胞培养肉汤离心。将细胞培养物上清液以适当的流速加载到Ni2+-NTA亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后,合并洗脱的级分并将缓冲液更换为最终制剂缓冲液,其为PBS,pH 7.2。
通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析纯化的蛋白质,以确定其分子量和纯度。为此,通过Bradford测定以BSA作为校准曲线的标准来确定所纯化的多蛋白的浓度。从100ml粗制细胞培养物上清液获得大约7.29mg(在磷酸盐缓冲盐水,PBS中)可溶性fel-IL31-His6,在下述实施例中被称为fIL-31。
对于SDS-PAGE分析,使用下述上样缓冲液:
-还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝、250mMDTT,pH 6.8。
-非还原性上样缓冲液:300mM Tris-HCl、10%SDS、30%甘油、0.5%溴酚蓝,pH6.8。
将还原性和非还原性上样缓冲液分别加入蛋白质样品中。具有还原性或非还原性上样缓冲液的蛋白质样品具有接近于0.5mg/ml的浓度。在将蛋白质样品与还原性上样缓冲液混合后,执行在100℃下5-10分钟的加热。将具有还原性或非还原性上样缓冲液的蛋白质样品以10000rpm离心1分钟,然后加载到预制凝胶(Genscript,目录号M42012)的凝胶室中。如通过制造商概述的,执行用这些凝胶的SDS-PAGE(140V大约60分钟)。其后,凝胶用考马斯蓝进行染色。
考马斯蓝染色的泳道1中的占优势条带比由蛋白质序列预计的大得多(16196.54Da,使用https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam根据成熟序列进行计算)。这种差异很可能起于广泛的N糖基化,因为fel-IL-31蛋白序列含有2个N糖基化位点,基于NetNGlyc分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),所述两个位点很可能是修饰的。
在非还原条件下,大部分加载的蛋白质迁移到指示单体的条带中。只有一小部分似乎是二聚体和多聚体或聚集形式。
实施例4:体内cIL-31活性测试的执行(犬中的瘙痒/发痒诱导)
以1.75μg/kg体重的单剂量,向16只犬静脉内施用如上文实施例3中所述的纯化的cIL-31。为此,将cIL-31制备为无菌NaCl溶液中的液体制剂。所施用的剂量体积为1ml/犬。
在施用cIL-31液体制剂120分钟后,视频记录瘙痒行为大约20-40分钟。
120分钟的整个观察期拆分成1分钟的间隔(120个间隔)。如下通过观察者做出明确的是/否(“I/0”)决定:对于其通过犬展示至少一种瘙痒行为的所有间隔都计数为“1”。无瘙痒行为的所有间隔都计数为“0”。
瘙痒行为的类型由每个间隔中发生的第一个行为定义。120分钟的每个观察期内的累积计数提供了瘙痒评分。如果犬显示了在多于60个间隔过程中的瘙痒行为,则瘙痒诱导被视为成功的。
在施用cIL-31液体制剂后,在所有犬中都观察到瘙痒。按照上文定义的标准,在16只犬中的13只中成功诱导了瘙痒。在本研究过程中并未观察到不良事件。总之,本研究因此提供了所表达的cIL-31构建体具有生物活性的证据。
实施例5:测试cIL-31多蛋白是否也在犬中引发瘙痒
以200μg的单剂量,向三只犬皮下施用如上文实施例2中所述的纯化的cIL-31多蛋白。为此,将cIL-31多蛋白制备为具有Polygen作为佐剂,在PBS中的液体制剂。剂量体积为1mL/犬。
为了评估犬针对所注射的多蛋白的局部和全身耐受性,测量直肠温度,就肿胀、疼痛、发红和发热增加的临床体征,执行注射部位的观察(adspection)和触诊。如果发现了临床症状,则每周完成一次上述局部和全身耐受性评价,直到临床发现消失或直到研究结束。
没有一只犬显示了瘙痒的任何体征。在注射部位处观察到轻微的临床体征如发红和表皮脱落,并且在第一次施用后在所有犬中以及在第二次施用后在两只犬中观察到体温升高,指示了针对多蛋白的免疫应答诱导。
实施例6a:针对cIL-31的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg cIL-31用作新西兰白兔中的下述63天免疫方案(DavidsBiotechnology,Regensburg/FRG)的抗原:
第1天:免疫前血清的收集,第一次免疫
第14天:第二次免疫
第28天:第三次免疫
第35天:就中间ELISA滴度测试血清
第42天:第四次免疫
第56天:第五次免疫
第63天:抗血清的收获
实施例6b:针对cIL-5的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg cIL-5用作上文实施例6a中描述的63天免疫方案中的抗原。
实施例6c:针对cIL-13的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg cIL-13用作上文实施例6a中描述的63天免疫方案中的抗原。
实施例6d:针对cIL-33-WT的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg cIL-13-WT用作上文实施例6a中描述的63天免疫方案中的抗原。
实施例6e:针对cIL-4的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg cIL-4用作上文实施例6a中描述的63天免疫方案中的抗原。
实施例6f:针对bov-TNF-α-poly的多克隆兔抗血清的生成和表征
大约500μg bov-TNF-α多蛋白(SEQ ID NO:65)用作上文实施例6a中描述的63天免疫方案中的抗原。
实施例7:由蛋黄生成针对cIL-31的鸡IgY制剂
大约500μg cIL-31用作鸡中的下述63天免疫方案(Davids Biotechnology,Regensburg/FRG)的抗原:
第1天:免疫前蛋黄IgG/IgY的收集,大约90%纯
第1天:第一次免疫
第14天:第二次免疫
第28天:第三次免疫
第35天:第四次免疫
第45-55天:蛋的收集
第63天:通过专有技术(Davids Biotechnology,Regensburg;Prep I)制备蛋,IgY制剂产生可与来自兔的抗血清相比的纯度和质量
实施例8a:抗cIL-31和抗cIL-31多蛋白的设置,用于兔血清抗体和鸡蛋黄IgY滴度
确定的ELISA形式,与天然cIL-31和cIL-31多蛋白的结合研究
聚苯乙烯ELISA板(384孔:Thermo Maxisorp,目录号464718)用溶解于包被缓冲液(50mM NaHCO3 pH 9.6)中的1μg/ml cIL-31或cIL-31多蛋白(cIL-31:0,29mg/ml,或cIL-31多蛋白:0,4mg/ml)进行包被。每孔使用体积为10μl的包被溶液。然后使聚苯乙烯ELISA板在4℃下伴随关闭的盖温育过夜(O/N)。在去除包被溶液后,执行用PBS(ThermoFisher磷酸盐缓冲盐水,pH 7.2,目录号20012-019)、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,用每孔50μl的PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(来自冷水鱼皮,40-50%的H2O溶液,Sigma C7765)执行非特异性结合位点的封闭。该封闭步骤在室温(RT)下执行至少1小时。在去除封闭溶液后,添加(每孔20μl)兔抗血清或鸡蛋黄制剂在PBS、0.05%(v/v)Tween20、3%(v/v)明胶中的系列稀释物(来自非吸附性复制板)。与系列稀释物一起的温育在RT下执行至少1小时。其后,去除兔抗血清或鸡蛋黄制剂的系列稀释物,并且执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。接下来,添加在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(每孔20μl)中的抗兔IgG(整个分子)的1∶15,000稀释物、在山羊中产生的F(ab′)2片段-碱性磷酸酶(AP)抗体(Sigma A3937或等价物)、或在兔中产生的抗鸡IgY(IgG)(整个分子)-AP抗体(Sigma A9171或等价物)的1∶5000稀释物,并且在RT下温育至少1小时。在去除这些抗体溶液后,再次执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,孔用AP缓冲液(50mM NaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH 9.6,每孔50μl)洗涤一次。最后,添加在AP缓冲液(每孔90μl)中的5mM 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP,Applichem,经由Sigma,A1442,0050或等价物)。在ELISA阅读器例如Epoch Reader(150115E)或Synergy H1Reder(180427C)中,在RT下记录每分钟在405nm处的光密度(OD)(mOD/分钟)增加,并且由线性增加范围确定曲线斜率。
在图5中描绘了使用cIL-31或cIL-31多蛋白作为兔免疫前血清和抗血清的抗原的ELISA结果。该图显示了兔抗血清识别cIL-31和cIL-31多蛋白构建体两者,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。对于两种抗原直到1∶160的抗血清稀释度,观察到线性信号阶段,随后为典型的ELISA滴定曲线。终点滴度(其信号高于背景信号加上两个标准差的最后一个稀释度)对于cIL-31为>1∶40,000且对于cIL-31多蛋白为>1∶80,000。这些数据提示了本研究中生成的兔抗cIL-31血清具有良好质量。
cIL-31多蛋白与cIL-31同样良好地被针对后一种蛋白产生的抗血清识别的事实,提示了尽管人工重复结构域结构和破伤风毒素间隔物序列,多蛋白中的cIL-31拷贝仍是正确折叠的。这个结果是令人惊讶的,并且是出乎意料的。
在图6中描绘了使用cIL-31或cIL-31多蛋白作为鸡免疫前血清和蛋黄制剂的抗原的ELISA结果。如该图中可以看出的,鸡蛋黄制剂识别了cIL-31和cIL-31多蛋白,而当1∶250稀释时,鸡免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号(数据未显示)。对于降至62.5μg/ml的蛋黄制剂稀释度的cIL-31多蛋白,观察到线性信号阶段,随后为典型的ELISA滴定曲线。对于cIL-31,线性阶段在125μg/ml蛋黄蛋白时结束。蛋黄蛋白制剂的终点滴度(其信号高于背景信号加上两个标准差的最后一个稀释度)对于cIL-31为122ng/ml且对于cIL-31多蛋白为61ng/ml。这些数据提示了本研究中生成的鸡蛋黄制剂具有良好质量。
cIL-31多蛋白与cIL-31大致同样良好地被针对后一种蛋白产生的鸡蛋黄抗体识别的事实,再次支持了尽管人工重复结构域结构和破伤风毒素间隔物序列,多蛋白中的cIL-31拷贝仍是正确折叠的。这个结果是令人惊讶的,并且是出乎意料的。
实施例8b:用于兔血清抗体滴度确定的抗cIL-5和抗cIL-5多蛋白ELISA形式的设
置、与天然cIL-5和cIL-5多蛋白的结合研究
以与实施例8a中关于cIL-31相同的方式,设置了ELISA以测试针对cIL-5生成的抗血清。然而,如实施例8a中所述的,用溶解于包被缓冲液中的1-5μg/ml cIL-5或0.5μg/mlcIL-31-poly包被384孔聚苯乙烯ELISA板。
在图44中显示了兔抗cIL-5抗血清与其相应的免疫前血清相比的滴度确定结果。兔抗血清识别cIL-5,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。线性信号阶段直到约1∶500的抗血清稀释度可见,随后为典型的ELISA滴定曲线。终点滴度(其信号>背景+2个标准差的最后一个稀释度)接近于1∶200,000。这些数据提示了本研究中生成的兔抗cIL-5血清具有良好质量。
在图45中描绘了使用cIL-5或cIL-5多蛋白作为兔免疫前血清和抗血清的抗原的ELISA结果。该图显示了兔抗血清识别cIL-5和cIL-5多蛋白构建体两者,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。虽然与cIL-5相比,绝对信号强度在cIL-5-poly的情况下更低,但图45中的曲线形状非常相似。这提示了尽管人工重复结构域结构和破伤风毒素间隔物序列,cIL-5-poly中的至少一部分cIL-5多肽仍处于天然样构象。这个结果是令人惊讶的,并且是出乎意料的。
实施例8c:用于兔血清抗体滴度确定的抗cIL-13和抗cIL-13多蛋白ELISA形式的
设置、与天然cIL-13和cIL-13多蛋白的结合研究
以与实施例8a中关于cIL-31相同的方式,设置了ELISA以测试针对cIL-13生成的抗血清。然而,如实施例8a中所述的,用溶解于包被缓冲液中的5μg/ml cIL-13或5μg/mlcIL-13-poly包被384孔聚苯乙烯ELISA板。
在图53A中显示了兔抗cIL-13抗血清与其相应的免疫前血清相比的滴度确定结果。兔抗血清识别cIL-13,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。线性信号阶段直到约1∶5000的抗血清稀释度可见,随后为典型的ELISA滴定曲线。终点滴度(其信号>背景+2个标准差的最后一个稀释度)超过1∶500,000。这些数据提示了本研究中生成的兔抗cIL-13血清具有良好质量。
在cIL-13-poly作为包被抗原的情况下,终点滴度接近于1∶100,000(图53B),其确认了在疫苗抗原构建体上的抗cIL-13抗体结合位点的丰富存在。
实施例8d:用于兔血清抗体滴度确定的抗cIL-33-WT和抗cIL-33-CS多蛋白ELISA
形式的设置、与天然cIL-33和cIL-33-CS多蛋白的结合研究
以与实施例8a中关于cIL-31相同的方式,设置了ELISA以测试针对cIL-33-WT生成的抗血清。然而,如实施例8a中所述的,用溶解于包被缓冲液中的5μg/ml cIL-33-WT或cIL-33-CS-poly包被384孔聚苯乙烯ELISA板。
在图59中显示了兔抗cIL-13-WT抗血清与其相应的免疫前血清相比的滴度确定结果。兔抗血清识别cIL-33-WT,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。终点滴度(其信号>背景+2个标准差的最后一个稀释度)超过1∶10,000。这些数据提示了本研究中生成的兔抗cIL-33-WT血清具有尚好的质量。
在图66中显示了兔抗cIL-13-CS-poly抗血清与其相应的免疫前血清相比的滴度确定结果。针对cIL-33-WT产生的兔抗血清识别cIL-33-CS-poly,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。线性信号阶段直到约1∶320的抗血清稀释度可见,随后为典型的ELISA滴定曲线。终点滴度(其信号>背景+2个标准差的最后一个稀释度)超过1∶100,000。这些数据提示了cIL-33-CS-poly实际上是比亲本抗原更好的抗cIL-33-WT血清的结合配偶体。很可能cIL-33-CS-poly的聚合性质促成了这一特性。另外,结果提示了,与cIL-33-WT相比,C→S突变并未在很大程度上改变cIL-33-CS的抗原性。
实施例8e:用于兔血清抗体滴度确定的抗cIL-4和抗cIL-4多蛋白ELISA形式的设
置,与天然cIL-4、cIL-4多蛋白和cIL-13的结合研究
以与实施例8a中关于cIL-31相同的方式,设置了ELISA以测试针对cIL-4生成的抗血清。然而,如实施例8a中所述的,用溶解于包被缓冲液中的1μg/ml cIL-4(图71A)或2.5μg/ml cIL-4-poly(图71B)包被384孔聚苯乙烯ELISA板。
在图71A中描绘了使用cIL-4或cIL-4多蛋白作为兔免疫前血清和抗血清的抗原的ELISA结果。
兔抗血清识别cIL-4,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。线性信号阶段直到~1∶80的抗血清稀释度可见,随后为典型的ELISA滴定曲线。终点滴度(其信号>背景+2个标准差的最后一个稀释度)超过1∶150,000。这些数据提示了本研究中生成的兔抗cIL-4血清具有良好质量。
在cIL-4-poly作为包被抗原的情况下,终点滴度接近于1∶50,000(图71B),其确认了在疫苗抗原构建体上的抗cIL-4抗体结合位点的丰富存在。
另外,测试了针对cIL-13的兔血清。这种血清仅在比特异性抗cIL-4抗血清低几个数量级的低稀释度下产生较小的信号(图71B)。这些数据证实了cIL-4-poly构建体含有犬IL-4的抗原决定簇。
实施例8f:用于兔血清抗体滴度确定的抗bov-TNF-α多蛋白ELISA形式的设置
以与实施例8a中关于cIL-31相同的方式,设置了ELISA以测试针对牛TNF-α多蛋白生成的抗血清。然而,如实施例8a中所述的,用溶解于包被缓冲液中的1μg/ml bov-TNF-α(R&D Systems)包被384孔聚苯乙烯ELISA板。
在图79中显示了兔抗bov-TNF-α-poly抗血清与其相应的免疫前血清相比的滴度确定结果。兔抗血清识别牛TNF-α,而免疫前血清在所应用的ELISA形式中仅产生可忽略不计的信号。因此,用bov-TNFa-poly免疫兔导致高滴度的抗牛-TNF-a抗血清。该抗血清的终点超过1∶40,000稀释度,并且可见直到1∶200稀释度的饱和。这证实了使用本发明的多蛋白构建体已实现了bov-TNFa-poly的预期免疫原性。
实施例9:关于cIL-31中和性犬单克隆抗体(mAb)洛吉维单抗与天然cIL-31和cIL-
31多蛋白结合的ELISA形式的设置
洛吉维单抗是一种针对犬IL-31的犬化单克隆抗体(Michels等人,″A blinded,randomized,placebo-controlled,dose determination trial of lokivetmab(ZTS-00103289),a caninized,anti-canine IL-31 monoclonal antibody in client owneddogs with atopic dermatitis″,Veterinary dermatology 27.6(2016):478-e129),并且形成兽药的活性物。
开发了下述ELISA形式来测试洛吉维单抗与cIL-31或cIL-31多蛋白的结合:
聚苯乙烯ELISA板(384孔:Thermo Maxisorp,目录号464718)用溶解于包被缓冲液(50mM NaHCO3 pH 9.6)中的1μg/ml cIL-31或cIL-31多蛋白(cIL-31:0,29mg/ml,或cIL-31多蛋白:0,4mg/ml)进行包被。每孔使用体积为10μl的包被溶液。然后使聚苯乙烯ELISA板在4℃下伴随关闭的盖温育过夜(O/N)。在去除包被溶液后,执行用PBS(ThermoFisher磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.2,目录号20012-019)、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,用每孔50μl的PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(来自冷水鱼皮,40-50%的H2O溶液,Sigma C 7765)执行非特异性结合位点的封闭。该封闭步骤在RT下进行至少1小时。在去除封闭溶液后,添加(每孔20μl)洛吉维单抗在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶中的系列稀释物(来自非吸附性复制板)。与洛吉维单抗的系列稀释物一起的温育在RT下执行至少1小时。其后,去除洛吉维单抗的系列稀释物,并且执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。接下来,添加在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(每孔20μl)中的蛋白A-AP(P7488 Sigma)的1∶15,000稀释物、或抗犬IgG-AP(Sigma LotRI6082 0,61mg/ml)的1∶2000稀释物,并且在RT下温育至少1小时。在去除这些溶液后,再次执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,孔用AP缓冲液(50mMNaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH 9.6,每孔50μl)洗涤一次。最后,添加在AP缓冲液(每孔90μl)中的5mM 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP,Applichem,经由Sigma,A1442,0050或等价物)。在ELISA阅读器中,在RT下记录每分钟在405nm处的光密度(OD)(mOD/分钟)增加,并且由线性增加范围确定曲线斜率。
在图7中描绘了使用cIL-31作为洛吉维单抗的抗原的ELISA结果。这些结果提示了洛吉维单抗与cIL-31结合,并且它可以通过抗犬IgG试剂进行检测。然而,与cIL-31结合的洛吉维单抗被蛋白A弱识别。
在图8中描绘了使用cIL-31和cIL-31多蛋白作为洛吉维单抗的抗原的ELISA结果。这些结果证实了洛吉维单抗与cIL-31和cIL-31多蛋白结合。这提示了多蛋白中的cIL-31拷贝具有天然折叠。
实施例10:生物素化的洛吉维单抗的生成和表征
对于生物素化的洛吉维单抗,首先用50mM NaHCO3、150mM NaCl,pH 8.5来平衡Zeba 0.5ml Spin脱盐柱(40K)。接下来,使100μl洛吉维单抗(10mg/ml)两次通过平衡的柱。其后,将20μl 10mM EZ-LinkTM sulfon-NHS-LC-LC-Biotin(Thermo Scientific 21338)加入含有洛吉维单抗的溶液中,并且在37℃下温育4小时。在温育后,添加1μl 1M Tris pH8.0。在用PBS pH 7.2进一步平衡Zeba 0.5ml Spin脱盐柱后,使含有洛吉维单抗的反应混合物通过PBS平衡的柱,并且用PBS填充至200μl的最终体积,并且假定浓度为5mg/ml的生物素化的洛吉维单抗。
接下来,开发了一种ELISA形式来测试生物素化的洛吉维单抗的cIL-31结合:
聚苯乙烯ELISA板(384孔:Thermo Maxisorp,目录号464718)用溶解于包被缓冲液(50mM NaHCO3 pH 9.6)中的1μg/ml cIL-31或cIL-31多蛋白(c1L-31:0,29mg/ml,或cIL-31多蛋白:0,4mg/ml)进行包被。每孔使用体积为10μl的包被溶液。然后使聚苯乙烯ELISA板在4℃下伴随关闭的盖温育过夜(O/N)。在去除包被溶液后,执行用PBS(ThermoFisher磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.2,目录号20012-019)、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,用每孔50μl的PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(来自冷水鱼皮,40-50%的H2O溶液,Sigma C 7765)执行非特异性结合位点的封闭。该封闭步骤在RT下进行至少1小时。在去除封闭溶液后,添加(每孔20μl)洛吉维单抗在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶中的系列稀释物(来自非吸附性复制板)。与生物素化的洛吉维单抗的系列稀释物一起的温育在RT下执行至少1小时。其后,去除生物素化的洛吉维单抗的系列稀释物,并且执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。接下来,添加在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(每孔20μl)中的-AP(Sigma E2636)的1∶17.000稀释物,并且在RT下温育至少1小时。在去除这种溶液后,再次执行用PBS、0.05%(v/v)Tween20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,孔用AP缓冲液(50mM NaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH 9.6,每孔50μl)洗涤一次。最后,添加在AP缓冲液(每孔90μl)中的5mM 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP,Applichem,经由Sigma,A1442,0050或等价物)。在ELISA阅读器中,在RT下记录每分钟在405nm处的光密度(OD)(mOD/分钟)增加,并且由线性增加范围确定曲线斜率。
在图9中描绘了使用cIL-31作为生物素化的洛吉维单抗的抗原的ELISA结果。这些结果提示了洛吉维单抗的生物素化是成功的,因为在所采用的ELISA设置中观察到很强的可滴定信号。
实施例11:生物素化的洛吉维单抗竞争测定形式的设置。
兔免疫前血清、兔抗cIL-31抗血清(参见实施例6)、cIL-31多蛋白0,4mg/ml(Genscript)、cIL-31 0,29mg/ml(Genscript)和洛吉维单抗-生物素(参见实施例10)用于设置洛吉维单抗竞争测定。
生物素化的洛吉维单抗竞争测定形式如下进行设计:
聚苯乙烯ELISA板(384孔:Thermo Maxisorp,目录号10192781)用溶解于包被缓冲液(50mM NaHCO3 pH 9.6)中的1μg/ml cIL-31或cIL-31多蛋白(PBS中的储备溶液:cIL-31:0,29mg/ml,或cIL-31多蛋白:0,4mg/ml)进行包被。每孔使用体积为10μl的包被溶液。然后使聚苯乙烯ELISA板在4℃下伴随关闭的盖温育过夜(O/N)。在去除包被溶液后,执行用PBS(ThermoFisher磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.2,目录号20012-019)、0.05%(v/v)Tween 20(每孔35μl)的3次洗涤。随后,用每孔35μl的PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(来自冷水鱼皮,40-50%的H2O溶液,Sigma C 7765)执行非特异性结合位点的封闭。该封闭步骤在RT下伴随关闭的盖进行至少1小时。在分开的非吸附性ELISA板中制备兔免疫前、兔抗cIL-31免疫血清或鸡蛋黄IgY制剂在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶中的100ng/ml生物素化的洛吉维单抗中的系列稀释物,并且在RT下温育约1小时。在从cIL-31或cIL-31多蛋白包被的ELISA板中去除封闭溶液后,添加预温育的系列抗体稀释物(每孔20μl)。与系列抗体稀释物一起的温育在RT下执行约1小时。其后,去除系列抗体稀释物,并且执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔35μl)的3次洗涤。接下来,添加在PBS、0.05%(v/v)Tween20、3%(v/v)明胶(每孔20μl)中的-AP(Sigma E2636)的1∶17.000稀释物,并且在RT下伴随关闭的盖温育至少1小时。在去除这种溶液后,再次执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔35μl)的2次洗涤。随后,孔用AP缓冲液(50 mM NaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH9.6,每孔50μl)洗涤一次。最后,添加在AP缓冲液(每孔90μl)中的5mM 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP,Applichem,经由Sigma,A1442,0050或等价物)。在ELISA阅读器中,在RT下记录每分钟在405nm处的光密度(OD)(mOD/分钟)增加,并且由线性增加范围确定曲线斜率。
使用兔免疫前血清+生物素化的洛吉维单抗的混合物或兔免疫血清+生物素化的洛吉维单抗探针的混合物的ELISA设置,用于作为cIL-31中和抗体的生物素化的洛吉维单抗与固定在ELISA板上的cIL-31或cIL-31多蛋白之间的相互作用。图10和11的结果显示了兔免疫前血清并不干扰洛吉维单抗与cIL-31或cIL-31多蛋白的结合。然而,抗cIL-31兔免疫血清显示出在1∶128至1∶64的稀释度下起始的对于这种相互作用的抑制活性,并且在1∶2的稀释度下导致洛吉维单抗结合的完全抑制。
使用鸡蛋黄IgY制剂+生物素化的洛吉维单抗探针的混合物的ELISA设置,用于作为cIL-31中和抗体的生物素化的洛吉维单抗与固定在ELISA板上的cIL-31之间的相互作用。图12的结果显示了,抗cIL-31鸡蛋黄IgY制剂显示出在122至244μg/ml之间起始的对于这种相互作用的抑制活性,并且在15.6mg/ml下导致生物素化的洛吉维单抗结合的完全抑制。
实施例12a:犬单核细胞系(DH82)的生成,允许评估寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)的
NFkB刺激潜力
用pcDNA3.1(+)-bsd-NFkB-SEAP(如图13包括的质粒图谱)转染犬单核细胞系DH82(Wellman等人1988)。这导致杀稻瘟菌素S选择的细胞系,其可以通过许多NFkB途径激活配体(例如LPS或TNF-α)进行刺激,以分泌分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。执行单细胞克隆以获得克隆细胞系。
该克隆细胞系(DH82-bsd-NFSEAP)暴露于不同的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(PTO-ODN)。对于三种不同的PTO-ODN观察到强烈的浓度依赖性SEAP信号,其效力的次序为1668-PTO>>2006-PTO>2007-PTO(参见图14)。
图14的结果提示了DH82表达功能性toll样受体9(TLR9),因为它是识别PTO-ODN并导致NFkB信号传导的唯一已知受体。此外,图14的结果令人惊讶地显示了,特别地1668-PTO(SEQ ID NO:A)是犬TLR9的有力激活剂。
实施例12b:cIL-13在HEK-BlueTM IL-13细胞中的刺激潜力
HEK-BlueTM IL-4/IL-13细胞(Invivogen,hkb-i1413)用人STAT6基因进行稳定转染,以获得完全活性的STAT6途径。此外,细胞用STAT6诱导型SEAP报道基因进行转染。受体亚基IL4Rα和IL-13Rα1以及信号传导途径的其它基因以足够的量天然表达。
这些细胞响应人IL-4和人Il-13(https://www.invivogen.com/hek-blue-il4- il13,数据未显示)。
用cIL-13对这些细胞的测试揭示了,这种细胞因子被HEK-BlueTM IL-4/IL-13细胞灵敏地识别,并且导致具有~2ng/ml(2000pg/ml)EC50的SEAP报道酶读出(参见图52)。
实施例12c:cIL-33-WT和cIL-33-CS在HEK-BlueTM IL-33细胞中的刺激潜力
HEK-BlueTM IL-33细胞(Invivogen,hkb-hiL33)用于评估cIL-33-WT和cIL-33-CS蛋白的刺激潜力。细胞已通过用人IL1RLl基因稳定转染人胚肾HEK293衍生细胞而生成。另外,TNF-α和IL-1β应答被阻断。因此,HEK-BlueTM IL-33细胞特异性地响应IL-33。这些细胞表达NF-KB/AP-1诱导型SEAP报道基因。已知人IL-33与这些细胞的表面上的异二聚体IL-1RL1/IL-1RAcP的结合触发信号传导级联,导致NF-KB的激活以及SEAP的后续产生。
这些细胞响应人IL-33(https://www.invivogen.com/hek-blue-i133)。用犬IL-33对这些细胞的测试揭示了,来自不同来源的cIL-33-WT被可变地识别(图62,具有实心三角形的“cIL-33-WT分批1”和具有实心正方形的“cIL-33-WT分批2”),并且随着时间过去似乎丧失刺激活性(发明人自己的观察,数据未显示),很可能是由于含硫醇的半胱氨酸残基的氧化。
然而,cIL-33-CS被HEK-BlueTM IL-33细胞灵敏地识别,并且在cIL-33-WT中的三个半胱氨酸突变为丝氨酸(clL-33-CS)后,导致具有~10ng/ml EC50的SEAP报道酶读出(图62,实心圆圈)。
实施例13a:cIL-31多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
cIL-31多蛋白疫苗定义为含有:
在900μl PBS中的200μg cIL-31-poly(SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:40)
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100μl Polygen
犬的免疫如下通过皮下注射执行:
第0天:用如上文定义的cIL-31多蛋白疫苗的初次免疫和血液样品(免疫前样品)的收集
第7天:血液样品的收集
第14天:血液样品的收集
第21天:血液样品的收集
第28天:用如上文定义的cIL-31多蛋白疫苗的二次免疫和血液样品的收集
第35天:血液样品的收集
第42天:血液样品的收集
第49天:血液样品的收集
第56天:血液样品的收集
第63天:血液样品的收集
第70天:血液样品的收集
实施例13b:cIL-5多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
cIL-5多蛋白疫苗定义为含有:
在1000μl PBS中的23μg cIL-5-poly(SEQ ID NO:42)
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+110μl Polygen
如关于实施例13a所述的执行三只犬(犬1(0368)、犬2(9641)、犬3(0852))的免疫和血液取样方案,除了取样并不包括第70天之外。
实施例13c:cIL-13多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
cIL-5多蛋白疫苗的一个注射剂量定义为含有:
在900μl PBS中的50μg cIL-13-poly(SEQ ID NO:47)
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100μl Polygen
如关于实施例13a所述的执行三只犬(犬cIL-13-1(0521)、犬cIL-13-2(2579)、犬cIL-13-3(6048))的免疫和血液取样方案,除了取样并不包括第70天之外。
实施例13d:cIL-33多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
cIL-33-CS多蛋白疫苗定义为含有:
在900μl PBS中的100μg cIL-33-CS-poly(SEQ ID NO:54)
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100 μl Polygen
如关于实施例13a所述的执行一只犬(犬402)的免疫和血液取样方案,除了取样并不包括第70天之外。在经典的板结合的抗原ELISA设置中评价了特异性抗cIL-33抗体的存在。该分析中使用了野生型形式的cIL-33,以排除对于C→S突变特异性的任何效应。
实施例13e:cIL-4多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
cIL-4多蛋白疫苗的一个注射剂量定义为含有:
在900μl PBS中的200μg cIL-4-poly(SEQ ID NO:57)
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100 μl Polygen
如关于实施例13a所述的执行三只犬(犬5365、犬6523、犬7104)的免疫和血液取样方案,除了取样并不包括第70天之外。
实施例13f:fel-IL-31-多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫研究
在900μl PBS中的100μgfel-IL-31-poly(SEQ ID NO:61)
25μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
25μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100 μl Polygen
如关于实施例13a所述的执行三只猫(猫3132、猫0487、猫5674)的免疫和血液取样方案,除了二次免疫在第35天时进行,并且还在第77、84、91、98、105、112、119和126天时抽取血液样品之外。
实施例13g:进一步多蛋白/PTO-ODN/Polygen疫苗制剂的设计和免疫
进一步的多蛋白疫苗可以定义为含有以下:
在900μl PBS中的200μg SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:202至329之一
50μg 1668-PTO(SEQ ID NO:5)
50μg 2006-PTO(SEQ ID NO:6)
+100μl Polygen
可以如关于实施例13a所述的执行免疫和血液取样。
实施例14a:免疫的犬中的抗cIL-31滴度的确定
基于下述ELISA形式,就抗cIL-31抗体的存在测试从免疫的犬(参见实施例13a)中获得的犬血清:
聚苯乙烯ELISA板(384孔:Thermo Maxisorp,目录号464718)用溶解于包被缓冲液(50mM NaHCO3 pH 9.6)中的1μg/ml cIL-31或cIL-31多蛋白(cIL-31:0,29mg/ml,或cIL-31多蛋白:0,4mg/ml)进行包被。每孔使用体积为10μl的包被溶液。然后使聚苯乙烯ELISA板在4℃下伴随关闭的盖温育过夜(O/N)。在去除包被溶液后,执行用PBS(ThermoFisher磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.2,目录号20012-019)、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,用每孔50μl的PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(来自冷水鱼皮,40-50%的H2O溶液,Sigma C 7765)执行非特异性结合位点的封闭。该封闭步骤在RT下进行至少1小时。在去除封闭溶液后,添加(每孔20μl)犬血清在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶中的系列稀释物(来自非吸附性复制板)。与犬血清的系列稀释物一起的温育在RT下执行至少1小时。其后,去除犬血清的系列稀释物,并且执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。
接下来,添加在PBS、0.05%(v/v)Tween 20、3%(v/v)明胶(每孔20μl)中的兔IgG抗犬IgG(Fc)-Alk.Phos.,MinX none(Dianova GmbH,SKU 304-055-008,或等价物)的1∶2,000稀释物,并且在RT下温育至少1小时。在去除这种溶液后,再次执行用PBS、0.05%(v/v)Tween 20(每孔50μl)的3次洗涤。随后,孔用AP缓冲液(50mMNaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH9.6,每孔50μl)洗涤一次。最后,添加在AP缓冲液(每孔90μl)中的5mM 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pNPP,Applichem,经由Sigma,A1442,0050或等价物)。在ELISA阅读器中,在RT下记录每分钟在405nm处的光密度(OD)(mOD/分钟)增加,并且由线性增加范围确定曲线斜率。
图15a-c至17a-c描绘了这些ELISA的结果,其显示了在免疫后14天,免疫的犬已经产生了以相当量的抗cIL-31抗体。在初次免疫后的第112天时,在所有三只犬中一致地仍然还可以观察到高抗cIL-31滴度。
实施例14b:免疫的犬中的抗cIL-5滴度的确定
基于与实施例14a中关于抗cIL-31抗体所述相同的ELISA形式,就抗cIL-5抗体的存在测试从免疫的犬(参见实施例13b)中获得的犬血清。384孔聚苯乙烯ELISA板用溶解于包被缓冲液中的1-5μg/ml cIL-5进行包被。
图46(A-F)描绘了这些ELISA的结果,其显示了在免疫后28天,两只cIL-5-poly免疫的犬已经产生了以相当量的抗cIL-5抗体(图46A和46E)。在第28天的加强免疫导致这两只犬中进一步大量的抗cIL-5抗体滴度增加,其在第42天达到峰值(图46B和46F)。滴度在最后一个取样点(第63天)时保持很高,并且很可能持续更久。一只犬显示了对cIL-5-poly疫苗接种的总体较弱的应答(图46C-D),但在第28天的加强免疫的效应是可见的(图46D)。
实施例14c:免疫的犬中的抗cIL-13滴度的确定
基于与实施例14a中关于抗cIL-31抗体所述相同的ELISA形式,就抗cIL-13抗体的存在测试从免疫的犬(参见实施例13c)中获得的犬血清。384孔聚苯乙烯ELISA板用溶解于包被缓冲液中的1-5μg/ml cIL-13(储备溶液:cIL-13:0,15mg/mL)进行包被。
图54描绘了这些ELISA的结果。cIL-13-poly免疫的犬显示了在直至第28天的初次免疫中的仅少量的抗cIL-13抗体发展(图54A-C)。然而,在第28天的加强免疫导致所有三只犬中的大量抗cIL-13抗体滴度增加,其在第35天-第42天左右达到峰值,并且持续到第63天且很可能更久(图54A-C)。
实施例14d:免疫的犬中的抗cIL-33-CS滴度的确定
基于与实施例14c中关于抗cIL-33抗体所述相同的ELISA形式,就抗cIL-33抗体的存在测试从免疫的犬(参见实施例13d)中获得的犬血清。384孔聚苯乙烯ELISA板用溶解于包被缓冲液中的1-5μg/ml cIL-33-WT(以排除任何C→S异常)进行包被。
图67描绘了这些ELISA的结果。cIL-33-CS-poly免疫的犬并未显示在直至第28天的初次免疫中的抗cIL-33-WT抗体发展(图67,空心符号)。然而,在第28天的加强免疫导致抗cIL-33-WT抗体滴度的增加,其在第42天达到峰值,并且持续到第63天,伴随随着时间过去的轻微减少(图67,实心符号)。
这些结果显示了,所设计的cIL-33-CS-poly抗原导致对cIL-33-WT的自身耐受的破坏。
实施例14e:免疫的犬中的抗cIL-4滴度的确定
基于与实施例14a中关于抗cIL-31抗体所述相同的ELISA形式,就抗cIL-4抗体的存在测试从免疫的犬(参见实施例13e)中获得的犬血清。唯一的例外是384孔聚苯乙烯ELISA板用溶解于包被缓冲液中的1μg/ml cIL-4(例如Genscript cIL-4,0.84mg/ml)进行包被。
图72描绘了这些ELISA的结果。cIL-4-poly免疫的犬显示了在直至第35天的初次免疫中的仅少量的抗cIL-4抗体发展(图72A-C)。然而,在第35天的加强免疫导致一只犬(犬5365;图72A)中的大量抗cIL-4抗体滴度增加,其在第42天左右达到峰值,并且持续直到第63天且很可能更久。两只犬(犬6523,图72B和犬7104,图72C)显示了基本相同的情况,但具有在加强后比犬5365弱的滴度。该实验显示了,所选制剂中设计的cIL-4-poly抗原导致对cIL-4的自身耐受的破坏。
实施例14f:免疫的猫中的抗fel-IL-31滴度的确定
基于与实施例14a中关于抗cIL-31抗体所述相同的ELISA形式,在犬中就抗cIL-31抗体的存在测试从免疫的猫(参见实施例13e)中获得的猫血清。唯一的例外是384孔聚苯乙烯ELISA板用溶解于包被缓冲液中的1μg/mlfel-IL-4(例如Genscript U6344FL160-4,fel-IL-31,0.54mg/ml)进行包被。
图75和76描绘了这些ELISA的结果。三只fel-IL-31-poly免疫的猫中的两只(猫3132和猫5674)显示了在直至第27天的初次免疫中的仅少量或无抗fel-IL-31抗体发展(图75A-C)。然而,在第27天的加强免疫导致所有三只猫中的大量抗fel-IL-31抗体滴度增加,其从第35天到第63天保持很高(图75A-C)。直到第126天的血液样品的进一步ELISA分析(图76)显示了特异性抗体滴度仅非常缓慢地下降,其中在初次免疫后4个月和二次免疫后3个月仍存在显著的滴度(图76A-C)。
该实验显示了,所设计的fel-IL-31-poly抗原导致猫中的对fel-IL-31的自身耐受的破坏,伴随持久的抗fel-IL-31抗体滴度。
实施例15:测试多克隆犬抗体与生物素化的洛吉维单抗的竞争,以分析犬血清中
的cIL-31中和抗体的存在
ELISA测定如实施例11中所述的执行,但使用犬血清在100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的PBS溶液中的混合物。
图18至23描绘了对于包含来自免疫后第42天的犬血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为抗原的ELISA结果。虽然在图18、20和22中,应答的单位是“mOD405/分钟”,并且因此是来自报道者应答的直接读出,但图19、21和23使用“%洛吉维单抗结合”作为应答的单位,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。
图24至29描绘了对于包含来自免疫后第42天的犬血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为抗原的ELISA结果。虽然在图24、26和28中,应答的单位是“mOD405/分钟”,并且因此是来自报道者应答的直接读出,但图25、27和29使用“%洛吉维单抗结合”作为应答的单位,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。
犬的免疫前血清显示了针对洛吉维单抗与cIL-31的结合的一定抑制活性,但这种效应与免疫后42天获得的犬血清的抑制活性相比弱得多,并且在1∶2稀释度下限制为40-70%。似乎很可能的是这反映了犬中的cIL-31细胞因子自身抗体的存在,如先前在人中关于各种细胞因子描述的,所述细胞因子例如干扰素α和γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和10及其它(Bendtzen等人,″High-avidity autoantibodies to cytokines″,Immunologytoday 19.5(1998):209-211)。
然而,中和活性通过用cIL-31多蛋白的免疫得到极大地增加。来自根据实施例13中所述方案免疫的所有三只犬的第42天的血清样品含有当1∶2稀释时,将洛吉维单抗与cIL-31的结合压制95%的抗体(参见图21至26)。当血清样品进一步稀释(滴定)时,这种抑制变得较不明显,但在1∶16稀释度下,在所有三只犬中仍可见部分效应。
当使用cIL-31Poly作为洛吉维单抗结合剂时,获得了类似的结果(图24至29)。
因为洛吉维单抗是cIL-31中和抗体,所以用所述cIL-31多蛋白免疫方案成功诱导洛吉维单抗竞争性自身抗体,指示了自身抗体可以中和犬中的cIL-31功能的明确潜力。
由于洛吉维单抗的治疗作用是充分确立的,因此可以预计根据本发明在宿主中诱导的洛吉维单抗竞争性自身抗体将显示类似的治疗功效。
实施例16:使用实施例13的疫苗制剂的二次免疫研究
在二次免疫研究中,患有瘙痒的犬如下通过用根据实施例13的疫苗制剂的皮下注射进行免疫:
第-7天:用cIL-31的攻击(1.75μg/kg bw静脉内注射用于基线评估)
第0天:用如实施例13中定义的cIL-31多蛋白疫苗的初次皮下免疫。在初次免疫前,从所有测试的犬中获取免疫前血液样品。
第6天:血液样品的收集
第14天:血液样品的收集
第21天:血液样品的收集以及用cIL-31的攻击(1.75μg/kg静脉内注射的cIL-31)
第28天:用cIL-31多蛋白疫苗的第一次皮下加强免疫和血液样品的收集
第35天:血液样品的收集
第42天:用cIL-31的攻击(1.75μg/kg静脉内注射的cIL-31)和血液样品的收集
第49天:血液样品的收集
第56天:血液样品的收集
第63天:用cIL-31的攻击(0.85μg/kg静脉内注射的cIL-31)和血液样品的收集
第70天:血液样品的收集
第77天:血液样品的收集
第84天:用cIL-31多蛋白疫苗的第二次皮下加强免疫和血液样品的收集
第91天:血液样品的收集
第98天:用cIL-31的攻击(0.85μg/kg静脉内注射的cIL-31)和血液样品的收集
第105天:血液样品的收集
第112天:血液样品的收集
第119天:血液样品的收集
第126天:血液样品的收集
在第28天和第84天时的加强免疫期间,测试的犬再次接受了根据实施例13的疫苗制剂。
使用cIL-31作为包被抗原,如实施例14中所述的用ELISA测定来分析血清样品。使用从1∶20到1∶20480的犬血清的系列稀释物。图30a-b至37a-b描绘了这些ELISA的结果,并且显示了免疫的犬产生以相当量的抗cIL-31抗体。在第28天的加强免疫导致测试的犬中的抗cIL-31抗体滴度的增加。在42天后仍观察到高抗cIL-31抗体滴度。直到第二次加强免疫,测试的犬中仅发生了抗cIL-31抗体滴度的部分损失。总的来说,这些结果显示了测试的犬中针对cIL-31的自身耐受的成功破坏。
经受上述免疫方案的犬在免疫方案的不同时间点,如实施例4中所述的分析任何瘙痒行为的存在:在免疫研究开始前(第-7天)、在第一次免疫后三周(第21天)、在第一次加强后两周(第42天)、在第一次加强后五周(第63天)以及在第二次加强后两周(第98天)。在图38中描绘了来自三只测试犬的瘙痒行为分析的示例性结果。图38的结果证实了,通过所应用的免疫方案可以减少瘙痒评分,并且因此使用根据本发明的疫苗组合物,提供了关于成功的预防性/治疗性疫苗治疗的概念验证。
实施例17:使用编码根据本发明的多蛋白的mRNA的疫苗制剂
近年来,由于mRNA疫苗的生产相当简单的事实,用mRNA的疫苗接种越来越受到关注。对于此类疫苗,表达且纯化蛋白质抗原的步骤不再是必要的,所述步骤经常是疫苗生产的成本和速度方面的瓶颈(参见Zhang C,Maruggi G,Shan H,Li J.Advances in mRNAVaccines for Infectious Diseases.Front Immunol.2019年3月27日;10:594.doi:10.3389/hmmu.2019.00594.eCollection 2019.)。mRNA疫苗依赖基于所引入的mRNA通过宿主的自身细胞的抗原产生。
可设想的是,犬针对其自身的IL-31的疫苗接种也可以用含有编码本发明的多蛋白的mRNA的疫苗来实现。这可以如下实现:
将实施例1中描述的cIL-31-poly构建体转移到体外转录载体内。为此,使用限制性酶EcoRI和HindIII,将编码cIL-31-poly的插入片段从pcDNA3.4克隆到pcDNA3.1(+)内。pcDNA3.1(+)具有在EcoRI克隆位点上游的T7 RNA聚合酶启动子。为了使来自该载体的加帽失控(run-off)RNA转录物产生成为可能,pcDNA3.1(+)-cIL-31-poly载体在插入片段的3′处进行线性化。然后在cap核苷酸、四种规范dNTP和/或非规范dNTP的存在下,使用T7-RNA聚合酶执行体外转录,以修饰转录物特性。在下一步中,通过使用多聚A聚合酶对所获得的失控转录物进行多聚腺苷酸化。可替代地,在cIL-31-poly构建体的终止密码子的3′中包括多聚dT尾也是可能的。
加帽且多聚腺苷酸化的mRNA然后可以用于疫苗接种。例如通过肌内、皮下或皮内(interadermally)或用基因枪注射裸露的mRNA连同请求保护的疫苗组合物的剩余组分,犬可以接受1μg至1mg,更优选10μg至300μg的mRNA量。将编码多蛋白的mRNA连同请求保护的疫苗组合物的剩余组分一起以脂质体制剂的形式,以包含具有阳离子蛋白质、阳离子聚合物或阳离子细胞穿透肽的复合物的制剂的形式,或者以增强所引入的mRNA的半衰期、细胞摄取和可翻译性的其它形式注射也是可能的。
然后以2-6周的间隔重复mRNA注射。可以如实施例14中所述的评价抗cIL-31抗体的存在。
一般地,通过自我复制型mRNA,例如通过甲病毒衍生的自我复制型mRNA来编码cIL-31-poly构建体也是可能的。自我复制型mRNA的使用可以具有以下优点:在施用于宿主后从RNA构建体实现更长的蛋白质生产,使得还可以获得更高的抗cIL-31抗体滴度。
实施例18:使用编码根据本发明的多蛋白的DNA的疫苗制剂
DNA疫苗含有DNA,通常是质粒DNA。质粒DNA经常经由注射或基因枪以裸露的形式施用于宿主。然而,将质粒DNA作为例如具有阳离子脂质的脂质复合物、脂质体制剂或具有阳离子聚合物的复合物递送至宿主也是可能的。有时,DNA也封装在类似于病毒的蛋白质外壳中,其确保了通过细胞的有效摄取。(关于综述:Ghaffarifar F.Plasmid DNA vaccines:where are we now?Drugs Today(Barc).2018年5月;54(5):315-333.doi:10.1358/dot.2018.54.5.2807864)。
可设想的是,针对其自己的自身蛋白质之一,例如针对细胞因子,特别是优选衍生自IL-31的白细胞介素,对犬的疫苗接种还可以用含有编码本发明的多蛋白的DNA的疫苗来实现。
作为实例,可设想的是,针对其自己的IL-31对犬的疫苗接种还可以用含有编码本发明的多蛋白的DNA的疫苗来实现。这可以如下实现:
将实施例1a中描述的cIL-31-poly构建体转移到哺乳动物表达载体内。为此,使用限制性酶EcoRI和HindIII,将编码cIL-31-poly的插入片段从pcDNA3.4克隆到pcDNA3.1(+)内。pcDNA3.1(+)具有对于cIL-31-poly在宿主细胞中的表达必需的所有元件:以人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子的形式的强哺乳动物启动子、以及以牛生长激素BGH基因的形式的强多聚腺苷酸化/终止信号。
例如通过肌内、皮下或皮内或用基因枪注射裸露的mRNA连同请求保护的疫苗组合物的剩余组分,犬可以接受以10μg至3mg,更优选50μg至1000μg的量的高度纯化的pcDNA3.1(+)-cIL-31-poly(不含LPS)。将编码多蛋白的质粒DNA连同请求保护的疫苗组合物的剩余组分一起以脂质体制剂的形式,以包含具有阳离子蛋白质、阳离子聚合物或阳离子细胞穿透肽的复合物的制剂的形式,或者以增强所引入的mRNA的半衰期、细胞摄取和可翻译性的其它形式注射也是可能的。
然后以2-6周的间隔重复质粒DNA注射。可以如实施例14a中所述的评价抗cIL-31抗体的存在。
对于其它白细胞介素,特别是对于本文例举的那些白细胞介素(例如IL-4、IL-5、IL-13、IL-33-CS和TNF-α),设想了类似的方案。
实施例19a:使用特异性兔抗cIL-13血清的cIL-13信号转导的中和测定
HEKBlue IL4/IL13(Invivogen,hek-il413)在DMEM(Thermo Fisher,616965-026)、10%iFCS中,在37℃、5%CO2下生长。为了选择目的,培养基补充有10μg/ml杀稻瘟菌素(Invivogen,ant-bl-5b)和100μg/ml博来霉素(zeocin)(Invivogen,ant-zn-5)。
在补充有10ng/ml cIL-13的384孔细胞培养板中的40μl完全生长培养基中,执行兔抗cIL-13血清(实施例6a)的稀释并温育1小时。收获HEKβlue IL4/IL13细胞,在完全生长培养基中调整至2.2x105个细胞/mL,并且向每种血清稀释物中添加40μl细胞悬浮液。使细胞在370℃、5%(v/v)CO2下温育96小时。对于384孔板90μl/孔,通过将细胞培养物上清液样品加入AP缓冲液(50mM NaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2,pH 9.6)中的5mM对硝基苯磷酸酯(pNPP)中,它们用于碱性磷酸酶(SEAP)活性的测量。通过确定线性区域(=mOD405nm/分钟)中的曲线斜率以动力学模式(mOD/分钟),或通过确定在固定时间点的光密度以终点模式(OD),在ELISA阅读器中测量在RT下在405nm处的光密度(OD)。
在图55中描绘了兔cIL-13抗血清对HEKBlue IL4/IL13细胞的中和作用的ELISA结果。兔cIL-13抗血清已经在1∶320的稀释度下起始抑制HEKBlue IL-4/IL-13细胞的cIL-13刺激。在1∶20的稀释度下实现了完全抑制。本实验建立了cIL-13的生物学效应的抗体中和测定。
实施例19b:使用免疫前和抗cIL-13犬血清的cIL-13信号转导的中和测定
对在实施例14c的cIL-13-poly疫苗接种研究的第0天(免疫前,SD-1)和第42天时收集的来自三只犬(犬0521、2579和6048)的血清,执行实施例19a的相同中和测定。在图56A-C中描绘了ELISA结果。
虽然免疫前血清(“SD-1”)的稀释并不导致HEKBlue IL-4/IL-13细胞中的cIL-13信号强度的减少,但第42天,来自所有三只犬的cIL-13-poly抗血清分别在1∶320、1∶20和1∶40稀释度下导致信号的完全压制,以及在这些稀释度之后的抑制滴定曲线(参见图56A-C)。
实施例19c:使用免疫前和抗cIL-4犬血清的cIL-4信号转导的中和测定
已知IL-4在mRNA和蛋白质水平下诱导胸腺和活化调控的趋化因子(TARC或CCL17)的表达,并且在犬中,已记录了特应性皮炎中的TARC上调。因此,TARC用作暴露于IL-4的犬血液的阳性标记物(强mRNA上调)。
如下评价TARC mRNA上调的抑制,以探测在cIL-4-poly疫苗接种之后的中和抗体的存在:在第49天(加强免疫后2周)时,从IL-4-poly免疫的动物(犬5365、犬6523和犬7104)中获取EDTA稳定的血液样品,并且合并来自对照动物的血液样品。500μl血液补充有cIL-4(R&D systems,754-CL-025/CF)至1ng/ml,然后使血液在35℃、5%CO2和96%相对湿度下温育6小时。血液裂解和RNA稳定用RNAprotect Animal Blood Tubes 500μl(Qiagen 76554)完成,并且在室温下温育2小时。
然后使用RNeasy Protect Animal Blood Kit(Qiagen 73224)分离RNA。使用Implen类型NP80,对分离的RNA进行分析且定量。用具有关于犬CCL-17(TARC)的探针和引物的/>Assay Cf02622128_m1(Thermo)和QuantiNova ProbeRT-PCR Kit(Qiagen 208354),来执行定量RT-PCR(qPCR),其中引物、反应混合物和条件通过制造商概述。使用自制的犬β-肌动蛋白TaqMan探针和PCR引物作为管家基因对照。通常使用25ng总RNA作为模板。使用CFX96Real-Time System(BioRad)执行qPCR。/>
在图73中描绘了实验的结果。
就TARC/CCL-17 mRNA诱导而言,对照犬的合并血液高度响应与1ng/ml cIL-4一起的温育(参见图73A中的ΔΔCq)。相比之下,用cIL-4-poly接种疫苗的所有三只犬在cIL-4温育中具有强烈压制的TARC/CCL-17 mRNA诱导,在线性标度图中,抑制对于所有三只犬显然是完全的(图73A)。在对数标度图中,cIL-4诱导的TARC mRNA产生的抑制对于犬5365和7104超过99.99%,并且对于犬6523超过99%(图73B)。在cIL-4刺激的不存在下,在所有犬中都检测到TARC的一些较少的背景mRNA表达(图73B,条件“w/o”)。
总的来说,数据证实了,在用cIL-4-poly疫苗免疫的所有三只犬中,破坏了对cIL-4的自身耐受,并且存在针对天然cIL-4的抗体滴度。这些抗体在细胞培养测定系统中具有关于cIL-4作用的中和潜力,并且中和在免疫的犬的离体血液测定中添加的cIL-4。
附图说明
图1描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以用于ER输入的人工信号序列开始,以允许在HEK 293细胞中的表达。这随后为成熟犬IL-31(SEQ ID NO:3)的第一个拷贝。在成熟犬IL-31的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟犬IL-31的第二个拷贝。在成熟犬IL-31的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟犬IL-31的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。这两个破伤风毒素T细胞表位随后为用于蛋白质纯化的His标签。
图2描绘了载体pcDNA3.4-cIL31-poly的质粒图谱,所述载体编码根据图1的cIL-31多蛋白。
图3描绘了关于cIL-31-poly的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例2中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了在还原条件下的cIL-31多蛋白的大小,并且泳道2描绘了在非还原条件下的cIL-31多蛋白的大小。
图4描绘了关于cIL-31的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例3中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了在还原条件下的cIL-31蛋白质的大小,并且泳道2描绘了在非还原条件下的cIL-31蛋白质的大小。
图5描绘了对于兔免疫前血清和针对cIL-31产生的抗血清,使用cIL-31或cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8中进一步说明。
图6描绘了对于针对cIL-31产生的鸡蛋黄制剂,使用cIL-31或cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8中进一步说明。
图7描绘了对于洛吉维单抗,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果,其在实施例9中进一步说明。
图8描绘了对于洛吉维单抗,使用cIL-31和cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例9中进一步说明。
图9描绘了对于生物素化的洛吉维单抗,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例10中进一步说明。
图10描绘了对于兔免疫前血清+生物素化的洛吉维单抗的混合物或兔免疫血清+生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果,以探测作为cIL-31中和抗体的生物素化的洛吉维单抗和固定在ELISA板上的cIL-31之间的相互作用。这些结果在实施例11中进一步说明。
图11描绘了对于兔免疫前血清+生物素化的洛吉维单抗的混合物或兔免疫血清+生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果,以探测作为cIL-31中和抗体的生物素化的洛吉维单抗和固定在ELISA板上的cIL-31多蛋白之间的相互作用。这些结果在实施例11中进一步说明。
图12描绘了对于鸡蛋黄IgY制剂+生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果,以探测作为cIL-31中和抗体的洛吉维单抗和固定在ELISA板上的cIL-31之间的相互作用。这些结果在实施例11中进一步说明。
图13描绘了构建体pcDNA3.1(+)-bsd-NFkB-SEAP的质粒图谱,其中
-181bp-448bp编码五个NFkB结合位点,随后为最低限度的ELAM启动子(NFkB-5-ELAM)
-454bp-2022bp编码作为NFkB报道基因的SEAP基因
-3214bp-3613bp编码杀稻瘟菌素抗性基因(bsd-R),以允许真核细胞选择
-5961bp-5100bp编码氨苄青霉素抗性基因(amp-R),以允许大肠杆菌选择
图14描绘了在用PTO-ODN处理克隆细胞系DH82-bsd-NFSEAP后,NFkB信号激活的结果。这些结果在实施例12中进一步描述。
图15a-c描绘了对于动物4315在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例14中进一步说明。
图16a-c描绘了对于动物6962在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例14中进一步说明。
图17a-c描绘了对于动物8523在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例14中进一步说明。
图18描绘了对于包含来自犬4315的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图19描绘了对于包含来自犬4315的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图20描绘了对于包含来自犬6962的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-3l作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图21描绘了对于包含来自犬6962的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图22描绘了对于包含来自犬8523的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图23描绘了对于包含来自犬8523的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图24描绘了对于包含来自犬4315的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图25描绘了对于包含来自犬4315的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图26描绘了对于包含来自犬6962的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图27描绘了对于包含来自犬6962的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图28描绘了对于包含来自犬8523的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“mOD405/分钟”,以及因此来自报道者应答的直接读出。这些结果在实施例15中进一步说明。
图29描绘了对于包含来自犬8523的免疫后第42天的血清和100ng/ml生物素化的洛吉维单抗的混合物,使用cIL-31多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。应答的单位指示为“%洛吉维单抗结合”,其基于第0天的免疫前血清的“mOD405/分钟”的最高读出进行计算。这些结果在实施例15中进一步说明。
图30a-b描绘了对于动物1672在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图31a-b描绘了对于动物5096在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图32a-b描绘了对于动物5583在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图33a-b描绘了对于动物7918在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图34a-b描绘了对于动物9351在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图35a-b描绘了对于动物8779在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图36a-b描绘了对于动物1368在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图37a-b描绘了对于动物3432在不同取样时间点的犬血清,使用cIL-31作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例16中进一步说明。
图38描绘了三只测试的犬的瘙痒行为分析的示例性结果,所述犬经受实施例16中描述的免疫方案。结果在实施例16中进一步说明。
图39描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以用于ER输入的人工信号序列开始,以允许在HEK 293细胞中的表达。这随后为成熟犬IL-5(SEQ ID NO:41)的第一个拷贝。在成熟犬IL-5的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟犬IL-5的第二个拷贝。在成熟犬IL-5的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟犬IL-5的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。这两个破伤风毒素T细胞表位随后为用于蛋白质纯化的His6标签。
图40描绘了载体pcDNA3.4-cIL-5-poly的质粒图谱,所述载体编码根据图39的cIL-5多蛋白。
图41描绘了关于cIL-5-poly的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例2b中进一步说明。泳道“M2”描绘了蛋白质标记物(GenScript,目录号M00521)。泳道“R”描绘了在还原条件下的cIL-5多蛋白的大小,并且泳道“NR”描绘了在非还原条件下的cIL-5多蛋白的大小。泳道“P”描绘了作为阳性对照的多标签蛋白(GenScript,目录号M0101)。一抗是小鼠抗His6 mAb(GenScript,目录号A00186)。
图42描绘了编码cIL-5蛋白的载体pcDNA3.4-cIL-5的质粒图谱。
图43描绘了关于cIL-5的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例3b中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了在还原条件下的cIL-5蛋白的大小,并且泳道2描绘了在非还原条件下的cIL-5蛋白的大小。
图44描绘了对于兔免疫前血清和针对cIL-5产生的抗血清,使用cIL-5作为ELISA板包被抗原的ELISA滴度确定结果。这些结果在实施例8b中进一步说明。
图45描绘了对于兔免疫前血清和针对cIL-5产生的抗血清,使用cIL-5或cIL-5多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8b中进一步说明。
图46A-F描绘了对于图46A和46B中的动物“犬1”、图46C和46D中的动物“犬2”、以及图46E和46F中的动物“犬3”的犬血清,使用cIL-5作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。这些结果在实施例14b中进一步说明。
图47描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以用于ER输入的人工信号序列开始,以允许在HEK 293细胞中的表达。这随后为成熟犬IL-13(SEQ ID NO:46)的第一个拷贝。在成熟犬IL-13的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟犬IL-13的第二个拷贝。在成熟犬IL-13的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟犬IL-13的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。这两个破伤风毒素T细胞表位随后为用于蛋白质纯化的His6标签。
图48描绘了编码cIL-13蛋白的载体pcDNA3.4-cIL-13的质粒图谱。
图49描绘了关于cIL-13-poly的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例2b中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了在还原条件下的cIL-13多蛋白的大小,并且泳道2描绘了在非还原条件下的cIL-13多蛋白的大小。
图50描绘了编码cIL-13蛋白的载体pET30a-cIL-13的质粒图谱。
图51描绘了关于cIL-13的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例3c中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了牛血清白蛋白(BSA,2μg)的大小。泳道2描绘了cIL-13蛋白(1.86μg)的大小。
图52描绘了基于SEAP报道基因读出,通过cIL-13的HEKBlue IL-4/IL-13细胞刺激的结果。这些结果在实施例12b中进一步描述。
图53描绘了对于兔免疫前血清(空心符号)和针对cIL-13产生的抗血清(实心符号),使用cIL-13蛋白(A)或cIL-13多蛋白(B)作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8c中进一步说明。
图54A-C描绘了对于动物“犬0521”(A)、动物“犬2579”(B)和动物“犬6048”(C)的犬血清,使用cIL-13作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。这些结果在实施例14c中进一步说明。
图55描绘了用兔抗cIL-13血清处理的HEKBlue IL-4/IL-13细胞的cIL-13刺激结果。这些结果在实施例19a中进一步描述。
图56A-C描绘了在用cIL-13-poly免疫之后的第0天(免疫前,空心符号,“SD-1”)或第42天(实心符号,“SD42”),用从犬0521(A)、犬3579(B)和犬6048(C)收集的犬血清处理的HEKBlue IL-4/IL-13细胞的cIL-13刺激结果。这些结果在实施例19b中进一步描述。
图57描绘了载体pET30a(+)-canIL33-WT的质粒图谱,所述载体编码cIL-33-WT蛋白。
图58描绘了关于cIL-33-WT的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例3d中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了牛血清白蛋白(BSA)的大小。泳道2描绘了在还原条件下的cIL-33-WT蛋白的大小。
图59描绘了对于兔免疫前血清(空心符号)和针对cIL-33-WT产生的抗血清(实心符号),使用cIL-33-WT蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8d中进一步说明。
图60描绘了载体pET30a-canIL33-CS的质粒图谱,所述载体编码cIL-33-CS蛋白。
图61描绘了关于cIL-33-CS的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例3e中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了牛血清白蛋白(BSA)的大小。泳道2描绘了在还原条件下的cIL-33-CS蛋白的大小。
图62描绘了基于SEAP报道基因读出,通过不同形式的cIL-33的HEKBlue IL-4/IL-13细胞刺激结果。使用的不同形式是IL-33-WT-NovoPro(https://novoprolabs.com/p/human-i133-c9orf26-il1f11-nfhev-519146.html;空心圆圈)、cIL-33-WT分批1(实心三角形)、cIL-33-WT分批2(实心正方形)和cIL-33-CS(实心圆圈)。这些结果在实施例12c中进一步描述。
图63描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以起始甲硫氨酸和His6标签开始,以允许在大肠杆菌细胞中的表达。这随后为成熟犬IL-33(意指cIL-33-CS,SEQ ID NO:51)的第一个拷贝。在成熟犬IL-33-CS的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟犬IL-33-CS的第二个拷贝。在成熟犬IL-33-CS的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟犬IL-33-CS的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。
图64描绘了载体pET30a-cIL33-poly的质粒图谱,所述载体编码cIL-33-CS蛋白。
图65描绘了关于cIL-33-CS-poly(此处也被称为cIL-33-poly)的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析结果,其在实施例2d中进一步说明。泳道M1描绘了蛋白质标记物(TaKaRa,目录号3452)。泳道1描绘了在还原条件下的cIL-33-CS多蛋白的大小,并且泳道2描绘了在非还原条件下的cIL-33-CS多蛋白的大小。
图66描绘了对于兔免疫前血清(空心符号)和针对cIL-33-WT产生的抗血清(实心符号),使用cIL-33-CS多蛋白作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。这些结果在实施例8d中进一步说明。
图67描绘了对于使用cIL-33-CS多蛋白进行免疫的动物“犬402”的犬血清,使用cIL-33-WT作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。时间点是免疫前血清(空心圆圈)、免疫后的第28天(空心正方形)、免疫后的第35天(实心圆圈)、免疫后的第42天(实心正方形);免疫后的第49天(实心三角形);免疫后的第56天(实心菱形);免疫后的第63天(空心三角形)。这些结果在实施例14d中进一步说明。
图68描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案(SEQ ID NO:57)。多蛋白的N末端以用于ER输入的人工信号序列开始,以允许在HEK 293细胞中的表达。这随后为成熟犬IL-4(SEQ ID NO:56)的第一个拷贝。在成熟犬IL-4的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟犬IL-4的第二个拷贝。在成熟犬IL-4的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟犬IL-4的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。这两个破伤风毒素T细胞表位随后为用于蛋白质纯化的His6标签。
图69描绘了编码cIL-4蛋白的载体pcDNA3.4-cIL-4的质粒图谱。
图70描绘了编码cIL-4蛋白的载体pET30a-cIL-4的质粒图谱。
图71描绘了对于兔免疫前血清(圆圈)和针对cIL-4产生的抗血清(三角形),使用cIL-4蛋白(A)或cIL-4多蛋白(B)作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。还显示了对于针对cIL-13(正方形)产生的兔抗血清,使用cIL-4-多蛋白作为包被抗原的结果。这些结果在实施例8e中进一步说明。
图72A-C描绘了对于动物“犬5365”(A)、动物“犬6523”(B)和动物“犬7104”(C)的犬血清,使用cIL-4作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。这些结果在实施例14e中进一步说明。
图73描绘了在第49天取自三只IL-4-poly免疫的犬(如图72中的犬5365、犬6523和犬7104)的EDTA稳定化血液、或取自无疫苗暴露的对照犬的合并血液样品(“合并初始血液”)的cIL-4刺激(“+IL4”)之后,关于TARC mRNA表达的qPCR结果。ΔΔCq值在线性(A)或log10标度(B)上给出,用于较低值的更好可视化。“w/o”指示了以相同方式温育且处理,但并未接受cIL-4的血液样品)。结果在实施例19c中进一步描述。
图74描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以用于ER输入的人工信号序列开始,以允许在HEK 293细胞中的表达。这随后为成熟猫IL-31(意指fel-IL-31;SEQ ID NO:61)的第一个拷贝。在成熟猫IL-31(SEQ ID NO:60)的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟猫IL-31的第二个拷贝。在成熟猫IL-31的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟猫IL-31的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。这两个破伤风毒素T细胞表位随后为用于蛋白质纯化的His6标签。
图75A-C描绘了对于使用fel-IL-31多蛋白进行免疫的动物“猫3132”、“猫0487”和“猫5674”的猫血清,使用fel-IL-31作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。时间点是第2天的血清(空心圆圈)、免疫后的第7天(空心菱形)、免疫后的第14天(空心三角形)、免疫后的第21天(“x”)、免疫后的第27天(星号)、免疫后的第35天免疫(实心圆圈);免疫后的第42天(实心菱形)、免疫后的第49天(实心三角形)、免疫后的第56天(粗体“x”)和免疫后的第63天(实心正方形)。这些结果在实施例14f中进一步说明。
图76A-C描绘了对于使用fel-IL-31多蛋白进行免疫的动物“猫3132”、“猫0487”和“猫5674”的猫血清,使用fel-IL-31作为ELISA板包被抗原,在不同取样时间点的ELISA结果。时间点是免疫后的第63、70、77、84、91、98、105、112、119和126天的血清(关于符号参见图例)。这些结果在实施例14f中进一步说明。
图77描绘了根据本发明的多蛋白的一个实施方案。多蛋白的N末端以起始甲硫氨酸和His6标签开始,以允许在大肠杆菌细胞中的表达。这随后为成熟牛TNF-α(意指SEQ IDNO:64)的第一个拷贝。在成熟牛TNF-α的该第一个拷贝后,包括了破伤风毒素p30 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸947-968,SEQ ID NO:2),随后为成熟牛TNF-α的第二个拷贝。在成熟牛TNF-α的该第二个拷贝后,附着了破伤风毒素p2 T细胞表位(破伤风毒素的氨基酸1273-1284,SEQ ID NO:1),随后为成熟牛TNF-α的第三个拷贝。其后,包括两个破伤风毒素T细胞表位(p30和p2)。
图78描绘了编码牛TNF-α多蛋白的载体pET30a-bov-TNF-α-poly的质粒图谱。
图79描绘了对于兔免疫前血清(“x”)和针对牛-TNF-α-多蛋白产生的抗血清(圆圈),使用牛-TNF-α作为ELISA板包被抗原的ELISA结果。
Claims (25)
1.一种用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的疫苗组合物,其中当将所述疫苗组合物施用于宿主时,所述疫苗组合物能够产生针对所述自身蛋白质的自身抗体,并且其中所述疫苗组合物包含:
a)多蛋白、编码所述多蛋白的DNA和/或编码所述多蛋白的RNA,其中所述多蛋白包含
-宿主的至少两个自身蛋白质区段;和
-在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位;和
b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。
2.根据权利要求1的疫苗组合物,其中所述一个或多个T细胞表位选自人工T细胞表位肽序列和衍生自非自身蛋白质,特别是衍生自致病性蛋白质的T细胞表位肽序列。
3.根据权利要求1或2的疫苗组合物,其中所述一个或多个T细胞表位是破伤风毒素T细胞表位,特别是这样的破伤风毒素T细胞表位,其
(i)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:2至少95%的序列同一性
或
(ii)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:2。
4.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述多蛋白包含至少三个且特别是三个自身蛋白质区段。
5.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述自身蛋白质区段是
(i)全长自身蛋白质;或
(ii)含有B细胞表位的截短的自身蛋白质;或
(iii)自身蛋白质的衍生物,其与全长自身蛋白质具有至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,且最优选至少95%的序列同一性。
6.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自细胞因子;特别是选自IL-31、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33和TNF-α蛋白的细胞因子。
7.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自IL-31蛋白,特别是犬IL-31(SEQ ID NO:3)、猫IL-31(SEQ ID NO:60)、猪IL-31(SEQ IDNO:68)、鸡IL-31、牛IL-31或人IL-31(SEQ ID NO:69)。
8.根据权利要求1至6中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自IL-5蛋白,特别是犬IL5(SEQ ID NO:41)、猫IL-5(SEQ ID NO:76)、猪IL-5(SEQ ID NO:77)、鸡IL-5(SEQ ID NO:78或79)、牛IL-5(SEQ ID NO:80)或人IL-5(SEQ ID NO:81)。
9.根据权利要求1至6中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自IL-4蛋白,特别是犬IL-4(SEQ ID NO:56)、猫IL-4(SEQ ID NO:70)、猪IL-4(SEQ ID NO:71)、鸡IL-4(SEQ ID NO:72)、牛IL-4(SEQ ID NO:73)或人IL-4(SEQ ID NO:74或75)。
10.根据权利要求1至6中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自IL-13蛋白,特别是犬IL-13(SEQ ID NO:46)、猫IL-13(SEQ ID NO:82)、猪IL-13(SEQID NO:83)、鸡IL-13(SEQ ID NO:84)、牛IL-13(SEQ ID NO:85)或人IL-13(SEQ ID NO:86)。
11.根据权利要求1至6中任一项的疫苗组合物,其中所述至少两个自身蛋白质区段衍生自IL-33蛋白,特别是犬IL-33(SEQ ID NO:50或51)、猫IL-33(SEQ ID NO:87、88、89或90)、猪IL-33(SEQ ID NO:91、92、93或94)、牛IL-33(SEQ ID NO:95或96)或人IL-33(SEQ IDNO:97、98、99或100)。
12.根据权利要求1至6中任一项的疫苗组合物,其中所述多蛋白具有
(i)与SEQ ID NO:4、40、42、43、47、54、57、61或65至少85%的序列同一性;
或
(ii)SEQ ID NO:4、40、42、43、47、54、57、61或65的序列。
13.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述多蛋白具有
(i)与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40至少85%的序列同一性;
或
(ii)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40的序列。
14.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自A类、B类和C类免疫刺激性寡核苷酸及其混合物,并且其中优选地,所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自B类免疫刺激性寡核苷酸。
15.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸中的至少一种或每种
(i)包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少75%的序列同一性;或
(ii)选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
16.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸中的至少一些磷酸二酯部分已进行化学修饰,以增加核酸酶抗性,特别是已被硫代磷酸酯部分替换。
17.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物进一步包含赋予储库效应的佐剂。
18.多蛋白、编码所述多蛋白的DNA和/或编码所述多蛋白的RNA,其用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受,其中所述多蛋白包含宿主的至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。
19.多蛋白破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的用途,其中当将所述多蛋白施用于宿主时,通过自身抗体的产生来破坏自身耐受,并且其中所述多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个T细胞表位。
20.根据权利要求1至17中任一项的疫苗组合物或根据权利要求18的多蛋白,其用于预防或治疗受试者中的疾病的方法中,其中所述方法包括向所述受试者施用所述疫苗组合物或多蛋白的步骤。
21.用于根据权利要求20使用的疫苗组合物或多蛋白,其中所述受试者是哺乳动物,包括人和非人动物。
22.用于根据权利要求21使用的疫苗组合物或多蛋白,其中所述受试者是选自牛、家禽、猪和伴侣动物例如猫和犬的动物。
23.用于根据权利要求20至22中任一项使用的疫苗组合物或多蛋白,其中所述疾病是
-选自自身免疫性疾病、AIDS和癌症的慢性疾病;或
-瘙痒状况,特别地选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒症;或
-过敏状况,特别地选自过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、炎症性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺部疾病以及起因于自身免疫的炎症性过程,
其中优选地所述疾病是瘙痒状况或过敏状况,特别是特应性皮炎。
24.一种酶联免疫吸附测定方法,其用于检测自身抗体,特别是针对权利要求1至17中任一项的疫苗组合物中包含的多蛋白获得的自身抗体,其中所述方法包括以下步骤:
a)将抗原吸附到测试表面上;
b)封闭所述测试表面上的游离结合位点;
c)使由抗原包被并封闭的测试表面与包含针对抗原的标记的抗体和针对抗原的待测试的自身抗体的混合物一起温育;和
d)检测所述标记的抗体的结合。
25.根据权利要求24的酶联免疫吸附测定方法,其中所述抗原包含或者是权利要求18的多蛋白或权利要求1至13中任一项所定义的多蛋白或其单个蛋白质区段或携带表位的肽。
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