CN113862299B - 一种用于同源重组的载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同源重组载体，所述同源重组载体包括：同源左臂，引物P2，插入片段，引物P3以及同源右臂，其中所述引物P2和P3能够扩增包含基因同源重组位点的序列。本发明进一步提供了基于所述同源重组载体的同源重组PCR鉴定方法。利用该方法，目的片段无论是否整合到了基因组正确位置，引物对均会有PCR产物扩增出，可对结果做出快速判断，有效降低假阴性情况的发生，提高鉴定效率，从而提高了鉴定的准确性。本发明通过对利用同源重组制备的小鼠胚胎干细胞系和基因敲入小鼠模型的鉴定，说明本发明的载体具有高效的鉴定优势，适用于同源重组细胞系和动物模型的建立。

Description

一种用于同源重组的载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同源重组载体及其制备方法和应用。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,缩写：PCR)是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的DNA片段，是一项常规的分子生物学技术。一个PCR反应体系需要包含：DNA聚合酶、引物、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液体系、DNA模板和H2O等，反应需要在热循环设备中进行，尤其是退火温度，每一对引物都有自己特异的退火温度。在PCR反应过程中，反应体系各组分的缺失或者配比错误，以及退火温度不适宜，均会导致PCR失败，无法扩增出目的条带，或者扩增出非特异性产物，造成假阴性或者假阳性的情况。
利用同源重组技术对细胞或者动物进行精确的基因修饰在基础研究和临床应用中具有很大的应用前景和实用性，例如构建基因修饰的动物模型和纠正基因突变的基因治疗。因为PCR技术简单、快速，在制备基因敲入、条件性敲除等同源重组介导的基因修饰细胞系、基因修饰动物模型过程中，通常都会利用PCR方法对是否发生正确的同源重组进行鉴定。在鉴定基因敲入同源重组时，通常的鉴定方法为将一条PCR引物设计在同源臂外基因组上，一条PCR引物设计在基因敲入的DNA片段上，理论上只有发生正确重组的阳性样品才能扩增出目的PCR产物(如图1A及文献：Wenning Qin,et.al,Generating Mouse ModelsUsing CRISPR-Cas9 Mediated Genome Editing,Curr Protoc Mouse Biol.；6(1):39–66.doi:10.1002/9780470942390.mo150178.的图5B所示)。这种方法因为缺乏阳性样品对照，无法对PCR引物对的合适退火温度进行摸索，如果没有扩增出目的大小PCR产物(如图1A’空白泳道所示)，无法判断是PCR反应温度不合适、PCR体系配置错误造成，还是所有的鉴定样品确实均为阴性所致，容易造成假阴性的误判，尤其是当同源臂较长需要进行长片段的PCR产物扩增或者基因敲入片段序列复杂没有合适可用的引物位点时，假阴性的发生概率会大大增加。虽然以CRISPR/Cas9为代表的核酸酶技术通过引发双链DNA断裂，提高了同源重组的效率，但同源重组发生的效率仍然较低，尤其是大片段(超过1000bp的DNA片段)DNA的同源重组。因此，在同源重组阳性比例本身很低的情况下，假阴性情况的发生会给工作带来极大的不确定性。当前常规鉴定策略如要避免假阴性情况的发生，往往需要设计多对PCR引物，摸索不同的退火温度，对样品进行反复鉴定，增加了鉴定工作量，延长了鉴定时间，增加了成本。
因此，迫切需要一种可以提高鉴定同源重组效率的PCR方法，可以快速的对PCR阴性结果做出判断，排除假阴性情况。
发明内容
针对现有PCR鉴定同源重组方法的缺陷和实际需求。
本发明公开了一种同源重组载体，所述同源重组载体包括：同源左臂，引物P2，插入片段，引物P3以及同源右臂，其中所述引物P2和P3能够扩增包含基因同源重组位点的序列。
优选的，所述基因同源重组位点为插入片段在基因组中的插入位点。
优选的，所述同源重组载体顺序包括如下元件：同源左臂，引物P2，插入片段，引物P3以及同源右臂。
优选的，所述同源载体重组载体进一步包括筛选标记。
优选的，所述筛选标记为正筛选标记或负筛选标记。
本发明公开了一种同源重组载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据待插入的基因重组位点，设计引物P2和P3，其中所述引物P2和P3能够扩增包含基因同源重组位点的序列；
(2)构建同源重组载体，将所述引物P2和P3分别与同源左臂和同源右臂连接。
优选的，引物P2插入同源左臂与插入片段之间，引物P3插入同源右臂与插入片段之间。
本发明公开了一种同源重组载体，采用所述的方法制备。
本发明公开了一种基因同源重组方法，采用所述的同源重组载体进行操作。
优选的，所述基因为动物基因、植物基因或微生物基因。
优选的，所述动物基因为小鼠基因。
本发明公开了一种基因同源重组试剂盒，所述试剂盒包括所述的同源重组载体。
本发明公开了所述的同源重组载体在基因同源重组方面的应用。
优选的，所述应用包括基因的突变，基因的插入。
优选的，本发明公开了一种Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型。
优选的，本发明公开了采用所述同源重组载体制备小鼠胚胎干细胞模型。
优选的，本发明公开了采用所述同源重组载体制备小鼠模型。
优选的，本发明公开了建立Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型所涉及的引物序列。
优选的，本发明公开了一种Pax7-IRES-CreERT2小鼠模型。
优选的，本发明公开了建立Pax7-IRES-CreERT2小鼠模型所涉及的引物序列。
进一步的，本发明提供了一种同源重组载体构建方法，所述方法在构建同源重组载体前，先通过预实验针对同源重组发生位点上下游的基因组进行PCR扩增，获得具有良好扩增效果的引物对(如图1B，P1/P2引物对、P3/P4引物对)；构建同源重组载体时，将预实验引物引入构建的同源重组片段内(如图1B在重组片段内放置的P2,P3引物)，作为后续PCR鉴定是否正确重组的引物位点，与预实验的同源臂外引物进行配对扩增，对样品进行鉴定。
所述引物对已经有前期PCR扩增的成熟条件，如样品发生了正确的同源重组，将有目的大小条带出现；如未发生正确的同源重组，无阳性目的大小条带出现，则应该有野生型条带被扩增出，因此可以根据扩增出来的PCR产物大小情况，快速判断样品是否为阴性(如图1B’有条带泳道)；如既无野生型条带被扩增出，也没有目的大小条带被扩增出(如图1B’无条带泳道)，则应该是PCR扩增体系、PCR操作或者PCR反应过程有问题，应进行重复实验，直到有野生型条带或者目的大小条带出现为止，从而避免假阴性情况。
本发明的方法，建立了一个同源重组PCR鉴定验证体系，如实验过程无问题，PCR反应必定会有PCR产物被扩增出，利用产物大小可快速判断样品是否为阳性；如PCR反应无野生型或目的产物被扩增出，则应为实验过程有问题，应对样品进行重复鉴定，从而提高了鉴定的准确性，加快了鉴定效率。本发明通过对利用同源重组制备的小鼠胚胎干细胞系和基因敲入小鼠模型的鉴定，说明本发明具有高效的鉴定优势，适用于同源重组细胞系和动物模型的PCR鉴定。
附图说明
图1为同源重组发生PCR鉴定策略示意。图1A为常规同源重组载体构建、发生和PCR鉴定策略，图1A’为根据图1A策略的电泳结果示意；图1B为本发明同源重组载体构建、发生和PCR鉴定策略，图1B’为根据图1B策略的电泳示意结果。
图2为Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型的构建策略示意、PCR预鉴定策略和电泳结果、同源重组载体结构示意。其中图2A为通过同源重组方式构建Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型的策略示意图；图2B为针对同源重组5’臂和3’臂PCR预鉴定的示意图和引物相对位置及产物大小示意；图2C1-2C4依次为Il1rl1-PreID1、Il1rl1-PreID2、Il1rl1-PreID3、Il1rl1-PreID4引物对梯度PCR PCR扩增电泳结果(M为1kb DNA marker；1-8为对应的8个不同的退火温度)；图2D为最终构建的同源重组载体结构示意，在5’臂和敲入片段之间埋入了Il1rl1-PreID1-Rev(简称：ID1-R)引物，在敲入片段和3’臂之间埋入了Il1rl1-PreID3-For(简称：ID3-F)引物。
图3为Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞抗性克隆PCR鉴定结果。图3A为Il1rl1野生型基因结构和重组后基因结构示意图及各引物对针对不同基因型扩增产物大小示意；图3B为96个抗性克隆3’臂同源重组鉴定结果；图3C为对图3B鉴定阳性克隆的3’臂同源重组重复鉴定结果；图3D为对图3B鉴定阳性克隆的5’臂同源重组鉴定结果。
图4为Pax7-IRES-CreERT2小鼠模型的构建策略示意、PCR预鉴定策略和电泳结果、同源重组载体结构示意。图4A为通过同源重组方式构建Pax7-IRES-CreERT2小鼠模型的策略示意图；图4B为针对同源重组5’臂和3’臂PCR预鉴定的示意图和引物相对位置及产物大小示意；图4C1-4C4依次为Pax7-PreID1、Pax7-PreID2、Pax7-PreID3、Pax7-PreID4引物对梯度PCR PCR扩增电泳结果(M为1kb DNA marker；1-8为对应的8个不同的退火温度)；图4D为最终构建的同源重组载体结构示意，在敲入片段和3’臂之间依次埋入了Pax7-PreID4-For(简称：ID4-F)引物和Pax7-PreID1-Rev(简称：ID1-R)引物。
图5为Pax7-IRES-CreERT2小鼠模型构建F0代基因型鉴定结果。图5A为Pax7野生型基因结构和重组后基因结构示意图及各引物对针对不同基因型扩增产物大小示意；图5B为18只F0代小鼠5’臂同源重组鉴定结果；图5C为对图5B鉴定阳性的小鼠3’臂同源重组鉴定结果(M为1kb DNA marker；数字为小鼠编号；WT为野生型对照)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明方法进行同源重组载体构建的过程和应用分为如下步骤：
1)先根据同源重组要定点整合到基因组上的DNA片段结构决定“预埋引物(如图1B中的引物P2、P3,简称：预埋引物)”在敲入片段上放置的位置，预埋引物位置的选择应以预埋该引物序列后不影响目的基因或者片段发挥功能为原则；同时，因为同等情况下，PCR反应扩增小片段的效率更高，预埋引物在敲入片段上的位置，应以重组后臂外引物(如图1B的P1引物)与预埋引物(如图1B的P2引物)扩增出的阳性目的PCR产物长度小于在野生型中该引物对扩增出的产物大小为最佳；
2)预鉴定引物的设计和筛选原则：
(1)预鉴定引物设计步骤：先根据项目同源重组难度确定预期的同源臂长度，根据该长度确定预鉴定引物的臂外引物设计位置，以5’臂(5’同源重组臂，简称：5’臂)预鉴定引物设计为例：①5’臂鉴定的正向引物(如图1B的P1引物)需位于同源臂之外；②5’臂鉴定的反向引物可位于3’同源臂(简称：3’臂)上或者3’臂外；③因为同等情况下，PCR反应扩增小片段的效率更高，重组后5’臂外引物(如图1B的P1引物)与预埋引物(如图1B的P2引物)扩增出的阳性目的PCR产物大小应小于在野生型中该引物对扩增出的产物大小；
(2)预鉴定引物筛选：以野生型基因组为模板，通过温度梯度PCR对设计的多个预鉴定引物对，进行PCR扩增，通过DNA凝胶电泳对PCR结果进行检测，应选择适宜退火温度区间大、扩增效率高、扩增产物特异性好的引物对作为进行载体构建预埋和后续用于同源重组PCR鉴定的引物对，选择扩增效率高且扩增产物特异性好的退火温度，作为后续用于同源重组PCR鉴定的引物对退火温度。如根据前述原则所设计的预鉴定引物均未能扩增出符合要求的PCR产物，可缩短对同源臂的长度要求，或根据可扩增出的PCR产物长度来确定同源臂长度。
(3)预埋鉴定引物的同源重组载体构建：根据确定的预埋引物在敲入片段的位置，按照常规的载体构建方法，通过PCR扩增或者基因合成的方式将预埋引物整合到敲入片段中，获得最终的同源重组载体。
4)基于本发明方法构建的同源重组载体获得的重组样品PCR鉴定结果判读：如前文所述，利用本发明方法前期预鉴定获得的引物对及PCR扩增条件，如样品发生了正确的同源重组，将有目的大小条带出现；如未发生正确的同源重组，无阳性目的大小条带出现，则应该有野生型条带被扩增出，因此可以根据扩增出来的PCR产物大小情况，快速判断样品是否为阴性；如既无野生型条带被扩增出，也没有目的大小条带被扩增出，则应该是PCR扩增体系、PCR操作或者PCR反应过程有问题，应进行重复实验，直到有野生型条带或者目的大小条带出现为止。以图1B和图1B’的示意为例，对结果判读进行说明：如图1B所示，用于5’臂预鉴定的引物对P1/P2，在野生型基因组上可扩增出zkb大小片段，用于3’臂预鉴定的引物对P3/P4，在野生型基因组上可扩增出wkb大小片段；根据预鉴定结果，将P2引物预埋在敲入片段的5’端，将P3引物预埋在敲入片段的中间区域，利用P1/P2引物对，鉴定5’臂同源重组发生情况(阳性PCR产物大小为xkb)，利用P3/P4引物对，鉴定3’臂同源重组发生情况(阳性PCR产物大小为ykb)。鉴定结果如图1B’所示，共有4个重组样品，分别进行5’臂同源重组鉴定和3’臂同源重组鉴定：1)在5’同源臂重组鉴定中，样品1只扩增出xkb目的大小阳性产物，为5’臂重组阳性；样品2只扩增出zkb大小野生型产物，为5’臂重组阴性；样品3既无阳性产物也无野生型产物扩增出，为实验有误，需要进行重复检测；样品4因为PCR反应扩增效率较高，除xkb目的大小阳性产物外，还有zkb大小野生型产物，为5’臂重组阳性；2)在3’同源臂重组鉴定中，样品1因为扩增效率较高，除ykb目的大小阳性产物外，还有wkb大小野生型产物，为3’臂重组阳性；样品2既无阳性产物也无野生型产物扩增出，为实验有误，需要进行重复检测；样品3只扩增出wkb大小野生型产物，为3’臂重组阴性；样品4只扩增出ykb目的大小阳性产物，为3’臂重组阳性。因此，根据PCR电泳结果，可以快速对各样品情况给出定性结果。
在如下具体实施例中，发明人将就本方法应用于基因敲入小鼠胚胎干细胞系构建、基因敲入小鼠和条件性基因敲除小鼠构建的具体实施过程予以描述。
实施例1Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型的构建
通过同源重组的方式，在小鼠胚胎干细胞中将小鼠Il1rl1基因的内含子1的部分区域、外显子2-7的区域和内含子7的部分区域替换为人源Il1rl1基因对应的区域，对小鼠胚胎干细胞进行人源化改造，重组策略如图2A所示，具体构建过程如下：
1)同源重组载体构建
①预埋引物的筛选：根据项目情况，考虑将两个同源重组臂(5’臂、3臂’)的长度设计为3kb，针对两个同源臂要重组的位置，分别各设计两对PCR引物，进行PCR预鉴定，引物位置示意如图2B所示，引物信息如下表1和表2。
表1：Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型构建涉及的引物信息表
引物对分别以小鼠胚胎干细胞基因组为模板，用可进行长片段PCR扩增的DNA聚合酶，进行PCR产物扩增，反应体系和反应程序如下所示：
PCR反应体系：
PCR反应程序：
*共设置8个温度梯度为：51.5℃,53.4℃,55.7℃,58.3℃,61.0℃,63.7℃,66.1℃,68.0℃(依次对应图2C1-C4中的数字1-8)。
针对两个同源臂分别进行PCR预鉴定的PCR产物电泳结果如下图2C1-C4所示,根据电泳结果，针对5’臂预鉴定的引物对Il1rl1-PreID1-For/Rev具有更强的扩增效率，选择该引物对的Rev引物作为同源重组5’臂鉴定的预埋引物，利用该引物对作为用于后续5’臂同源重组的鉴定引物，选择61.0℃为后续PCR鉴定的退火温度；针对3’臂预鉴定的引物对Il1rl1-PreID3-For/Rev具有更好的扩增效率，选择该引物对的For引物作为同源重组3’臂鉴定的预埋引物，利用该引物对作为用于后续3’臂同源重组的鉴定引物，选择61.0℃为后续PCR鉴定的退火温度。
②同源重组载体构建：分别设计下表所示引物对，以前述Il1rl1-PreID1-For/Rev引物对扩增获得的PCR产物为模板，扩增获得5’臂；以前述Il1rl1-PreID3-For/Rev引物对扩增获得的PCR产物为模板，扩增获得3’臂；以全基因合成获得的敲入片段为模板，扩增获得敲入片段；以PBR322质粒为模板，扩增获得骨架载体。通过In-Fusion的方式，将5’臂、敲入片段、3’臂和骨架载体通过一步重组的方式，构建获得Il1rl1基因人源化同源重组载体(简称：Il1rl1-donor vector)。Il1rl1-donor vector、5’臂、敲入片段、3’臂和骨架载体的序列信息依次为SEQ ID NO:17-21。
表2：Il1rl1基因人源化小鼠胚胎干细胞模型构建涉及的引物信息表
Il1rl1-donor vector载体构建过程中，通过在5’臂反向引物5’端添加前述预鉴定筛选的5’臂预埋引物(Il1rl1-PreID1-Rev)，实现5’臂预埋引物添加到5’臂和敲入片段之间的目的；通过在敲入片段反向引物5’端添加前述预鉴定筛选的3’臂预埋引物(Il1rl1-PreID3-For)，实现3’臂预埋引物添加到3’臂和敲入片段之间的目的，最终重组载体结构如图2D所示。
2)小鼠胚胎干细胞(ES细胞)克隆筛选
Il1rl1-donor vector经测序确认正确后，经大肠杆菌转化，扩增抽提纯化后，进行小鼠胚胎干细胞电转，电转后经Neomycine抗性筛选，共获得96个抗性ES细胞克隆。对抗性ES细胞克隆基因组DNA抽提后，通过长片段PCR的方式利用前期预鉴定获得的PCR扩增条件对抗性克隆进行鉴定，鉴定策略示意如图3A所示。
鉴定过程具体的为：①以Il1rl1-PreID3-For/Rev引物对先对3’臂同源重组情况进行PCR鉴定(PCR反应体系同上；PCR反应程序，除退火温度为61.0℃外，其余同上)，如图3A所示，阳性ES细胞克隆应可扩增出3.2kb大小的PCR产物，阴性ES细胞克隆应只能扩增出6.5kb大小的野生型条带，对96个抗性克隆的鉴定结果显示(如图3B)：24、35、36、50、81、83号克隆扩增出3.2kb大小的阳性PCR产物(因DNA聚合酶扩增效率较高，同时有6.5kb野生型条带扩增出)，37、49、61、73、85、86号克隆未扩增出任何条带，其余克隆均只扩增出6.5kb大小的野生型条带。因此，24、35、36、50、81、83号克隆为3’臂同源重组阳性克隆(对这些克隆的重复确认结果如图3C所示)；37、49、61、73、85、86号克隆为扩增出PCR产物，为实验失误，需要进行二次鉴定；其余克隆为3’臂同源重组阴性克隆。②针对24、35、36、50、81、83号3’臂同源重组阳性克隆，以Il1rl1-PreID1-For/Rev引物对(PCR反应体系同上；PCR反应程序，除退火温度为61.0℃外，其余同上)进行PCR鉴定5’臂是否发生正确的同源重组，结果如图3D所示，24、35、36、50、81、83号克隆均扩增出3.6kb的阳性PCR产物(因DNA聚合酶扩增效率较高，同时有4.9kb野生型条带扩增出)，野生型对照只能扩增出4.9kb的野生型条带。
该实施例表明，通过前期对重组位置进行预鉴定PCR筛选，获得扩增条件好的PCR引物，构建同源重组载体时，将其预埋入重组片段内，在后续同源重组细胞系的鉴定中，根据PCR结果可以快速得出克隆的鉴定结论，提高鉴定效率。
实施例2Pax7-IRES-CreERT2基因敲入小鼠模型的构建
利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，将IRES-CreERT2 DNA片段插入Pax7基因的3’UTR(Untranslated region)位置，重组策略如图4A所示，具体构建过程如下：
1)同源重组载体构建
①预埋引物的筛选：根据项目情况，考虑将两个同源重组臂(5’臂、3臂’)的长度设计约为3kb，针对IRES-CreERT2要插入的3’UTR位置，分别各设计两对PCR引物，进行PCR预鉴定，为了避免预埋引物插入对IRES-CreERT2敲入片段表达的影响，考虑将5’臂和3’臂鉴定的PCR引物均放置在IRES-CreERT2敲入片段后，引物位置示意如图4B所示，引物序列信息如下表3和表4。
表3：Pax7-IRES-CreERT2基因敲入小鼠模型构建的引物信息表
引物对分别以野生型C57BL/6小鼠基因组为模板，用可进行长片段PCR扩增的DNA聚合酶，进行PCR产物扩增，反应体系和反应程序如下所示：
PCR反应体系：
PCR反应组成 体积(μl)
ddH2O 31
PCR Buffer 10
2.5mM dNTP 4
正向引物 1
反向引物 1
DNA Polymerase 2
genomic DNA 1
总计 50
PCR反应程序：
*共设置8个温度梯度为：51.5℃,53.4℃,55.7℃,58.3℃,61.0℃,63.7℃,66.1℃,68.0℃(依次对应图4C1-C4中的数字1-8)。
针对两个同源臂分别进行PCR预鉴定的PCR产物电泳结果如图4C1-C4所示：根据电泳结果，针对5’臂预鉴定的引物对Pax7-PreID1-For/Rev具有更好的特异性和较强的扩增效率，选择该引物对的Rev引物作为同源重组5’臂鉴定的预埋引物，利用该引物对作为用于后续5’臂同源重组的鉴定引物，选择63.7℃为后续PCR鉴定的退火温度；针对3’臂预鉴定的引物对Pax7-PreID4-For/Rev具有更好的扩增效率，选择该引物对的For引物作为同源重组3’臂鉴定的预埋引物，利用该引物对作为用于后续3’臂同源重组的鉴定引物，选择63.7℃为后续PCR鉴定的退火温度。
②同源重组载体构建：分别设计下表所示引物对用于重组载体构建，以前述Pax7-PreID1-For/Rev引物对扩增获得的PCR产物为模板，扩增获得5’臂；以前述Pax7-PreID4-For/Rev引物对扩增获得的PCR产物为模板，扩增获得3’臂；以全基因合成获得的IRES-CreERT2片段为模板，扩增获得敲入片段；以PBR322质粒为模板，扩增获得骨架载体。通过In-Fusion的方式，将5’臂、IRES-CreERT2片段、3’臂和骨架载体通过一步重组的方式，构建获得Pax7-IRES-CreERT2同源重组载体(简称：Pax7-donor vector)。Pax7-donor vector、5’臂、敲入片段、3’臂的序列信息依次为SEQ ID NO:36-39，骨架载体的序列信息为SEQ IDNO:21。
表4：Pax7-IRES-CreERT2基因敲入小鼠模型构建的引物信息表
Pax7-donor vector载体构建过程中，通过在敲入片段反向引物5’端添加前述预鉴定筛选的3’臂预埋引物(Pax7-PreID4-For)，实现3’臂预埋引物添加到敲入片段和3’臂之间的目的；通过在3’臂正向引物中添加前述预鉴定筛选的5’臂预埋引物(Pax7-PreID1-Rev)，实现5’臂预埋引物添加到敲入片段和3’臂之间的目的，最终构建载体的结构示意如图4D所示。
2)F0代小鼠PCR鉴定筛选
Pax7-donor vector经测序确认正确后，经大肠杆菌转化，扩增抽提纯化后，与Cas9、gRNA混合后进行小鼠受精卵显微注射，注射后的受精卵经培养箱短暂培养后，移植至受体母鼠的输卵管，获得基因修饰小鼠F0代小鼠，共计出生18只F0代小鼠。
经小鼠鼠尾基因组抽提后，对F0代小鼠基因型进行鉴定，鉴定策略示意如图5A所示，具体的为：①以Pax7-PreID1-For/Rev引物对先对5’臂同源重组情况进行PCR鉴定(PCR反应体系同上；PCR反应程序，除退火温度为63.7℃外，其余同上)，同源重组阳性F0代小鼠应可扩增出6.3kb大小的PCR产物，阴性小鼠应只能扩增出9.8kb大小的野生型条带，对18只F0代小鼠5’臂的鉴定结果(如图5B所示)：1和6号小鼠扩增出6.3kb大小的阳性PCR产物(因DNA聚合酶扩增效率较高，同时有9.8kb野生型条带扩增出)，其余小鼠均只扩增出9.8kb大小的野生型条带。因此，1和6号小鼠为5’臂同源重组阳性小鼠；其余小鼠为5’臂同源重组阴性小鼠。②针对1和6号3’臂同源重组阳性小鼠，以Pax7-PreID4-For/Rev引物对(PCR反应体系同上；PCR反应程序，除退火温度为63.7℃外，其余同上)进行PCR鉴定3’臂是否发生正确的同源重组，结果如图5C所示，1和6号小鼠均扩增出5.6kb的阳性PCR产物(因DNA聚合酶扩增效率较高，同时有8.7kb野生型条带扩增出)，野生型对照只能扩增出8.7kb的野生型条带。
该实施例表明，通过前期对重组位置进行预鉴定PCR筛选，获得扩增条件好的PCR引物，构建同源重组载体时，将其预埋入重组片段内，在后续同源重组动物模型的鉴定中，根据PCR结果可以快速得出克隆的鉴定结论，提高鉴定效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海南方模式生物科技股份有限公司
上海砥石生物科技有限公司
广东南模生物科技有限公司
<120> 一种用于同源重组的载体及其应用
<130> 2021
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttattgttg gggcagagtg a 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttggcggct ttttatgtat ggtg 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctgccaca tatatggagg agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttcaactg tgaatgatct ggt 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcctctaat cctttctcca c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctttcacc cctctcatac tcta 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctactagat tttattttac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctaaaaccaa gagatatcag 20
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcggtcgac aagctactgt aatcccaaat caggg 35
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttggcggct ttttatgtat ggtgatgttc gtgtactgtg ttaa 44
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taaaaagccg ccaagggatg tttattgact gacac 35
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtggagaaag gattagaggc tacctaggat tttctcactg a 41
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taatcctttc tccactcaat gaagcaaggg aagag 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgactctaga ggatcctatt agtgtctatt atcat 35
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gatcctctag agtcgagcag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcttgtcga ccgcggcctt 20
<210> 17
<211> 19183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctgcggccg caaaggccgc ggtcgacaag 60
ctactgtaat cccaaatcag gggaactggt gcaaaattac gttagatatt tgtaaggttg 120
attttttttt ttttttagaa tgaggtagtt tgaagacata aaagggtatt tttttttttc 180
agaaaagttg gcagatgcta gctggattct gaaggacttg gctactttaa aactcctatt 240
tggttcattg attggaggcc gtccttgctc agatgtgcct cctgagctgt gttctatgta 300
ttctcaaatg gctgcattcc atgtctacaa agcccaaaca gaggctgaga tggcttattg 360
tttcttgaag aacctggtta agggacagat cttactttaa taactcagtc atggtgatca 420
gagaaagggg ttgaccatga cagtttctct ctctcatttt ttagtcgacc tgtggaaaaa 480
gagaagaatg catgtttcct tgcttcaacc acttggtttt aaccccagcc acatctgagt 540
gagcttggtt gaattattta agcattatta ttgctaatga tagtactaaa taacgtagcc 600
ttggattttg ctcaaactca tgctgcatgc aatcctgata ataagagtca agagcagcaa 660
ggaacacact caaggtcaag ctcccagaca gcaaaaggct tgctttttct gccatgtaaa 720
gtgtatcacc agtggctaag agctggctaa gccactgggc agagaagata tatcaggagc 780
attccagccc ctataaggag ctggctcaag ctgtgttctt agctagcaat acttccatgc 840
ttgtctttct atgcctggct cacttggatt cggtggctag cctttagagc cagcctgctt 900
gggttctaat tctcttagct ctgtgttgtg tggatccctt acttaatctc tgtgcctctg 960
ggtcatcatt tggaccatgg agagaacaac agcatggcat tgactgactt ggggaatgaa 1020
gaattgatat gggagtcaca gagagccaca taaagcatag aggagatact gcataaagat 1080
ttcaattata tttttctatt ggtgctgggg tggggatggt ccttcaatcc ttcctatgca 1140
tgaagacata aaaggaagtc tcataataga gttaagacaa ggatgcttgg cacaactcaa 1200
aaccaaccgt taacattgtt tcatttgaag ccccaaaaga tgatggcctc cttggaaagg 1260
cttggttatc ttcatcctag atgagattat agatcaaaat ctgaggtact agactatact 1320
ttggacctga gatgctcttt ccattatcca acacatctaa gcacccaagg aacataaaca 1380
tcgtttgcct ctcagggctc atctccatgc ccctcctgca ctctccctaa catgtgatgg 1440
tttgtgagat tgtccacagc acaggaaaca attgtgcccc ctgacagtat cagcagaggt 1500
catgaacagc ctggaggaca gcctggtgcg tgtgtgtgtt tgagatttgg gaatggacat 1560
tatggtaaac agcattgttt atctcagctt cactgaccca gcaaagacag gggcgggtga 1620
tttaattggt tcccctgagg tggattatga cgttgtgctc atggttaaat atttatgtgg 1680
taagtttagg aatttccagt aagtgagaca gcagcatttt tgaacaagtc atggattttg 1740
gctaaaacta aaattctatg atgggcgggt taaaaaaaaa tgccaagaca tctgtgtatt 1800
taaaaagaaa gagggagcat gcccacgtgg gtcgtctgca gaaatgagac gaaggagcgc 1860
caagtagcct cacggctctg agcttattct ctccagccct tcatctgggg taagaatcaa 1920
tgactgtctg aagcttgtaa aagaaaaaag tgcctgcaaa tcaaagaaac gtgcactctt 1980
gaaactacta aggagttaaa tatttattcc tagctttggg gatgtctgta tccctcctct 2040
gactggtgaa ggggaaagcc acagtaatag attctttaaa agaaaaagga ttatttattg 2100
tgcacagacc tctggcaagc ctccgtggct tttgagaaca agcctaggca gttactattc 2160
tttgaaagtt tgggggaaca gtcttggatg gcctcctggc taatgtttta gttcaaattt 2220
ttccttcctt agttttttat aatgatgcct atctgtgagt actggcatgt tgctctagcc 2280
tgctacacgg ctgtggcttt gattgacact gtgctttcta gtatctactc aattttatgg 2340
ttctaagttt tacaaatgca aaaatttgtt tcctttcctc ttaatttagt ttttttttgt 2400
ttgttttttg ttttttgttt tttatttttt ttgaggaaat gttcaagaga ctggtaaggt 2460
ataatcaatc atggaaaaaa aatctagtca ttgtaaggac tgctgtctgg tttcacgttc 2520
agtagggatg gatgcaatat tgtatacctg aaacctacta ttatccatat gtgaatttaa 2580
taaatacgtg tcaaccgact gtcctgtatg gtaagaacaa atcaaaacaa gtaagtaaaa 2640
agcgatacaa attaattatt ttacatggtt tatttttcag tatctacagt gatttctctt 2700
ctggacccta cctcagagag cacttgtcaa ccgcctagtg aacacaccat tactatcctg 2760
tgccattgcc atagagagac ctcagccatc aatcactagc acatgattga cagacagaga 2820
atgggacttt gggctttggc aattctgaca cttcccatgt atttgacagt tacggagggc 2880
agtaagtacc gattctcaga tgagtggtat ggtttgaact taagtaattc tgggaatatt 2940
tggcctcatt taagctgctt gcttcctgtt gttttgggct gaattttatg ttaggaaact 3000
atttcctctt cattcattct ttatcgtaaa tctctcagaa ggaattctct atagggagta 3060
gatcataatt tttgagttat gtaaattaag acttaacaca gtacacgaac atcaccatac 3120
ataaaaagcc gccaagggat gtttattgac tgacacacag tttgtttaga tagataaggc 3180
tgcttttcca ttggataact gtgggggatt tagctccaaa ttaattcatt aacatttcat 3240
aagagatctt aacagttact tattctttcc caaggtatca cagtatatga ccggcttcta 3300
aatttaatcc tagaagaaaa tattgagagt ataagaatta tgatcttttc atttgatcat 3360
ttcaggattg tctttatatc ttttatttgc aggtaaacaa tcatggggcc tggaaaatga 3420
ggctttaatt gtaagatgtc ctagacaagg aaaacctagt tacaccgtgg attggtatta 3480
ctcacaaaca aacaaaagta ttcccactca ggaaagaaat cgtgtgtttg cctcaggcca 3540
acttctgaag tttctaccag ctgcagttgc tgattctggt atttatacct gtattgtcag 3600
aaggtattat gcagaaggct cccatcttct ttcaccctgc tcccctttct tcagtggttg 3660
attgcctgag ctgcccttgc tttcattcct tccctagtcc tttctggaac agttaaattt 3720
ataaaatgat ttgaataaaa gtgatttgga taaacttcta ggaatactat caggttgagg 3780
tctagctcat tctgagctat ttggatttac agttgcaggg attgatttgt agctgactta 3840
gagaaaaacc tagctttcct agtgaccaag ataactgaga gcaattgctt acttttggct 3900
ggaattaaga acaaactagc acagaaaata gtaatctgga tgttttccat ctcagggggc 3960
ctctagtagg tgaaaagggg cttctaacct tcaagttaag ccacagaagg ctgatgagat 4020
tgtgtgccta aaaattaatt acttttgttc acaaattgtt aaatgttttg attttgtggc 4080
tgtatttggc acacacaaaa tgtcaaatga attaaatcaa aaagcaggat gtattagtta 4140
agggcctagg tctgagacta gacaagtgtc aaattcatgc tctgccacta gttaactgtg 4200
cgatgccagc aagttacttc tctgcccttc agtttccttc tctgtaaaat gcatataatg 4260
taataatata tttcatctca aagcattatt gtgaaaataa actaaggtaa tgtgtgaaaa 4320
gtgctcatca tcatcactgg tacagagtaa actctgaata aatagtaatt atctttatta 4380
cactgggatt acagcattac agcagatgta gtgtatgaat aaatggtgaa gaagtcattg 4440
ttagggctac tatgggggct atgtttttag ctcaagtgta acaaaaaagt atttaaactc 4500
tagattttaa tgtttatttt taaataataa aataaccatt atgtatattg atggttttta 4560
agaagaaaag caatattaag taaaggctga atttagatta agttatttca caatgctaag 4620
tgactctttt aattgtctga cttattttaa cagtcccaca ttcaatagga ctggatatgc 4680
gaatgtcacc atatataaaa aacaatcaga ttgcaatgtt ccagattatt tgatgtattc 4740
aacagtatct ggatcagaaa aaaattccaa aatttattgt cctaccattg acctctacaa 4800
ctggacagca cctcttgagt ggtttaaggt aagaagaaat ttggaaggaa atagatgaaa 4860
attacacaat taaaatagac acaagtggcc gggcacagtg gctcatgcct gtaatcctag 4920
cactttggga ggccaaggca ggcagatcac ttgaggccag gagtttgaga ccagcctggc 4980
caacatgagg aaaccccatc tctactaaaa atataaaaat cagctgggtg tggtggcaca 5040
cacctgtaat cccagcagct tgggaggctg aggtatgaaa atcacttgaa cctagaaggc 5100
agaggttaca gcgagcccag attgcaccac tcactccagc ctaggcaaca aacattctgt 5160
caacagataa ataaataaaa gtgaagaatt actgagaagg aaatggaatt tcttatttca 5220
gaattgtcag gctcttcaag gatcaaggta cagggcgcac aagtcatttt tggtcattga 5280
taatgtgatg actgaggacg caggtgatta cacctgtaaa tttatacaca atgaaaatgg 5340
agccaattat agtgtgacgg cgaccaggtc cttcacggtc aagggtaagc tactgacatt 5400
aatgagatag aatactacgt gaaagaagtc gaagtgggaa cagcggtgcc cttctggttg 5460
ggtttcttgc acttctccct cctcccttta cttcctcctg ctccatctta tcttatacat 5520
tctgaactat gacgcaaaga ggttttctga acacactatc aagatttaag aaatttcagg 5580
gggaaattac attactaatt caaagccaca tctgttcttt attctttttt tgtgacttaa 5640
ttttccaaag ataaagcaat ctgaatgcta acttaactta ctttttttga atggcaatac 5700
aactatttgg agagcaaaac cagctttttt tttttttttc tagtttggtg tcagagtttc 5760
tgcaaattaa aaaagagctt aatctttagt aatactcatt ggattcaaag tctaatgaga 5820
ggctttgtga tggtatacta tggtgtacat aaatgttgtc gagtggtttt taatctttgt 5880
ttgcaatact ttcaacatca tcaatggcct tgagtaagtc acttcattct aaaaatgtgt 5940
tttccaagtt attttaaatt ttataaaagc ttatttaagg gaaagatttc acaatcatag 6000
cttatcaatc tacaaaggat tggggtctcc ttagcacaag tcgatctaca gacgtagatg 6060
taatagcccc tttacgtatg aatcgataag cttgatatcg aattccgaag ttcctattct 6120
ctagaaagta taggaacttc aggtctgaag aggagtttac gtccagccaa gctagcttgg 6180
ctgcaggtcg tcgaaattct accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc 6240
atgcgcttta gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac 6300
acattccaca tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc 6360
accttctact cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag 6420
gacgtgacaa atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga 6480
gcaatggaag cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt 6540
ctgggctcag aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg 6600
cggggcgggc gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac 6660
gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca gcctgttgac 6720
aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc 6780
atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 6840
aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 6900
cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 6960
aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 7020
gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 7080
ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 7140
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aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 7260
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gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 7440
tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 7500
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ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 7740
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 7800
tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa 7860
agaaccagct ggggctcgac tagagcttgc ggaacccttc gaagttccta ttctctagaa 7920
agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggatccac agttttttca gggcaaagca 7980
atattggaga caaatttttg gagtttttca atactccacc gctgtaaaat aagcatcacc 8040
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attattttca tgggtctttt gaaatcttct ctgtagtctt attcttattc tgtagaagag 8340
tagttttcta acaactacta ggtcatgtaa ttagttttat gggttggatc tgcatttgtt 8400
taagtgatat cagagaataa tgatattaaa gagcatcata ggtaataaaa gaaagtttta 8460
tttaagtgcc tttctgtttc gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 8520
gtttgtcatt atgggttatt gtcagaagaa cttgaaaaac attgctatga aatagaatag 8580
aaacatgaaa atacaagctt tatattgact agcattcaat gctctcctaa tatttatatt 8640
tctttttgtc tttaagatga gcaaggcttt tctctgtttc cagtaatcgg agcccctgca 8700
caaaatgaaa taaaggaagt ggaaattggt aagaaaattt atcagaatgc tgtaaatatt 8760
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ttagcataag gaaccttgag gagtaagtga ggtgacatcc ctgaaagcac ctgccccaag 8880
catttgctaa tattgggaac agggacacag caattgcagt gtttacattt gtttattgta 8940
ctttgtaatt catgatgctt tcatgtatgc atctaatttc atcttcatct ctatcccaga 9000
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catgtttatc ttcaaagtag cttatggaga gatgaagaga gttctgtaga aagatgtgga 9120
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ctttgtaatg tggggttggt gaaggcagaa tcattggcct tgttagtttc ccatgcagat 9240
gagaatatag tgggagctga gcttcaaacc cagctgggtg aatgaaggta atggaagcag 9300
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ggtggggtgc atactaagtg ttcagtaagg tttttttttt acattaaatg ggataaaatg 9420
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cagcttaatg gaacaaaaat tacagacttt ggtgaaccaa gaattcaaca agaggaaggg 9600
caaaatcaaa ggtattttta tattgaagag aaccatcctc ttccccttgc acatggtttg 9660
cacctgcaaa gtaggcatta aaagtaacag gttgctttct tagtttcagc aatgggctgg 9720
cttgtctaga catggtttta agaatagctg acgtgaagga agaggattta ttgctgcagt 9780
acgactgtct ggccctgaat ttgcatggct tgagaaggca caccgtaaga ctaagtagga 9840
aaaatccaag taaggagtgt ttctgagact ttgatcacct gaactttctc tagcaagtgt 9900
aagcagaatg gagtgtggtt ccaagagatc catcaagaca atgggaatgg cctgtgccat 9960
aaaatgtgct tctcttcttc gggatgttgt ttgctgtctg atctttgtag actgttcctg 10020
tttgctggga gcttctctgc tgcttaaatt gttcgtcctc ccccactccc tcctatcgtt 10080
ggtttgtcta gaacactcag ctgcttcttt ggtcatcctt gttttctaac tttatgaact 10140
ccctctgtgt cactgtatgt gaaaggaaat gcaccaacaa ccgtaaactg aacgtgttct 10200
tttgtgctct tttataactt gcattacatg ttgtaagcat ggtccgttct ataccttttt 10260
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caatgaagca agggaagagt gggcctaagg ccttgccaag aactgtaatt ctagacccag 10440
gatgcaacac agacaacatt ttcctgttta taaacactgc caagaagcat ttgcgtctgg 10500
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cacacaggta cttcacccac agcagttcct ataagaagtc tatcttccat accctctgta 10680
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ccaacaggca agcagaccag gaatggtagc agttcctgtg tccaacctgt acatgtgtct 11100
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catgaactca gcattctctc tggagagggg agtgttcttt ttttttttcc tagaccgttc 11700
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atagagcagt ttctgtttaa gatggctgtc agctgaaatc ccttttgcct cctatcttag 11820
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ttaagacttg tgccgagtat gtgctaagaa aattgatttg ttgattttga aagtattgtt 11940
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gagttcatgc aaccatccat tctgtctcat tttgctatta ctaatgcccg tttcccccat 12060
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ctctgttctg gagagatata gtgacacctt acaaaacccg gaacggtgag tatctgtttt 12240
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tgctcctaaa cccaatctcc gtttcctttt aacctcatct gtgagatttt ggagtctaca 12360
cggatcattt tccatgcctc tgtgtcactg cttatacttc tgacattcag acattcatct 12420
ccaagattct ccttgccgag attgctattc ctagtgagcc cccataactc tgcctgagac 12480
ccgaacaggt tctgctgttt tgaaaaatgc atgttaataa cattttacaa caggacaata 12540
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ttttaagttg agcatgagtc tgagatatgt gattgtcctg cctgggatgt gaattgtctg 12960
tttgttcagt gtatctatgt tgtataatgt ataataacct agcactaatc agttacccta 13020
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atgttgacgt cactgccttc actgctggag tagtgatgcc atggattttg ttgtagtcca 13140
ttgtcctatg tttattacta gctatggttg ttaaactctt actgtgacaa gtgtattagg 13200
tctgtgtgtg cagaagtaag tgttgaatgg agggcacagt attatctgtg gcttcaggta 13260
ctcactggat gtctttgaac ctgtgctctg tggctaaatg aggaatgttg tgtgggaaaa 13320
ctgtaacagt caatagacag agaagaccct tccccaccca tgataataga cactaatagg 13380
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cgatacctta tgggcagcat gaccccccag gccgtgctgg cgttcgtggc cctcatcccg 14340
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gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 17280
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cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 17400
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ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaa 19183
<210> 18
<211> 3050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actgtaatcc caaatcaggg gaactggtgc aaaattacgt tagatatttg taaggttgat 60
tttttttttt ttttagaatg aggtagtttg aagacataaa agggtatttt tttttttcag 120
aaaagttggc agatgctagc tggattctga aggacttggc tactttaaaa ctcctatttg 180
gttcattgat tggaggccgt ccttgctcag atgtgcctcc tgagctgtgt tctatgtatt 240
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ggattttgct caaactcatg ctgcatgcaa tcctgataat aagagtcaag agcagcaagg 600
aacacactca aggtcaagct cccagacagc aaaaggcttg ctttttctgc catgtaaagt 660
gtatcaccag tggctaagag ctggctaagc cactgggcag agaagatata tcaggagcat 720
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ccaaccgtta acattgtttc atttgaagcc ccaaaagatg atggcctcct tggaaaggct 1200
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gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 2340
caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 2400
cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 2460
ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 2520
ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 2580
accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 2640
gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 2700
ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 2760
agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag 2820
aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt 2880
gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 2940
cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 3000
tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 3060
tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 3120
gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 3180
tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 3240
caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 3300
cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg 3360
accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 3420
cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 3480
cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 3540
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 3600
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 3660
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 3720
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 3780
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3840
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3900
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3960
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 4020
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 4080
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 4140
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 4200
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4260
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 4320
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 4380
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 4440
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4500
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4560
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4620
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 4680
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 4740
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 4800
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 4860
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 4920
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 4980
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 5040
ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 5100
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 5160
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 5220
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 5280
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 5340
gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 5400
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 5460
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 5520
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5580
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 5640
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 5700
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 5760
cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattctca tgtttgacag 5820
cttatcatcg ataagctgcg gccgcaaagg ccgcggtcga caagct 5866
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
accagcaggc atgttgtcta tt 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctaagggct tgcagtggtt tgaa 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgcctcgggt tttatttttc tcaa 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cccccaaccc cactcgctca g 21
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cggaataact gtagtggtcg tgtc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttggtcttgg cttggtgctt ttat 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attgccaaga tgctgatacc aca 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgctacgat gcacacctga c 21
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgcggtcgac aagctagttc tacatttcac caaac 35
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggaccctagt aggcttgtcc cg 22
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agcctactag ggtccgcccc tctccctccc ccccccct 38
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgtggtatca gcatcttggc aattcatcaa gctgtggcag ggaaac 46
<210> 34
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gatgctgata ccacattcaa accactgcaa gcccttagcg gtccctgggg caacttgccc 60
catccagtgg 70
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cgactctaga ggatcttcct aatttctgtt tcctg 35
<210> 36
<211> 14498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctgcggccg caaaggccgc ggtcgacaag 60
ctagttctac atttcaccaa acagggacag gggacagtcc cactatctgg cttatatgac 120
tggaaaaata cctaaaagta ccctgagtac agcattggga gcaggatagc acagggctaa 180
atctctgggg tttctgtttc tatcccttca gccctctaag agggtggctt actgatccat 240
ggaccctgac acccaaggag aaatgacagt gtgaccagag ctttaaagtt ttccttcagc 300
aagagttggc aactccccac tccccattca cagccaggca agggtggcca tagctgcctc 360
tgctctgcta ccttggagcc tgaggctgag tgagtgacgt caccagccca ggaactcagc 420
atagatcttc ccctccactc acccactatg agcctggctg gagaggcaca cacacgattc 480
aaagacaccc caggacattt tcatagcctt taggagtggg gaggcttgtc ctgagccttc 540
tatgacagcg tgttttaaaa cagtgtctgt accccagctt tcaagtagat aaactaacat 600
aaaggaagac cagtttgctc aaaaccatat gactgggaat gtacccagga atggccaccc 660
ttttctccat gccaccgcta aaggtcacat ttcttctagg cctgcgctca caagcaccac 720
actctacctt cacactatgt gtgtggattc tttgcctgca gttctttggt tcatatgctc 780
catcccatga tatagacaag gaaactgagg ctgaaatgct atggcccagg tcacactcaa 840
ggttgggagg caactattga gattgtccct ttggactccc tggtctcacc atcaagctgt 900
gtcccctgcc tcctggctct acctccccct gccctgcttt aagcagaaga tgccacgctt 960
ggggaagcac agagatagtc tacagggagc cctgaaaggc gggtaacaga gggagccttg 1020
tgactctccg tgcccagctt tcacctctct atgcatgggg gttctgtggg ggcacactgg 1080
ttatagtcac aagacctaaa ggccctggga ggccctggac ctttgcctgt ccagtgcctt 1140
agtcaggaaa gatgtctgct agagcttcaa ttaggacaga tccacatgct tcgcaggcca 1200
gccattgtag ttgcacatga cagacatctg tgtcttcctc aggtgagctc ttatgcttgc 1260
aggacctgtg tgtgcatagg tatctgttta caaggagcaa ggggctcaca caggtgtgtg 1320
tgtctgtatg tgtgtgtgtc tcaaatgggc atgggtaggt attgttatgt atgaatattc 1380
atgctatgct cagcattgcc ttgtgaagac actcctttcc cctacacaca gacacacaca 1440
cacacacaca cacacataca cacacacaca catacacacc actcattttc acacgcatcc 1500
ccaccaatgc tcacaggact tctctggagc tggcaggctg tgggtttcag ctctcatgtt 1560
ttctctcaaa ggccctcttg gctcacttgc aaaagccact ttggctcttg tgcaaggacc 1620
ctgttgtgcc tcatgcatac ctgcactcag ggtccagaaa aggtagagag ccttcatcct 1680
cagtgttaac ctggactcac tcagccgggt tcactggcca ggatatgcaa atggactgag 1740
ggagggaagc ttaattctct actgaaatct gggatgtgta cgtgtacttc cctttagagc 1800
cagaaaaaga gcagacaaat aataaacact gaggaaatat ttgctgagag ggtgggaaag 1860
agatttataa gggaactatg ggtggaagaa ggatggaggg tgttctcatt ttatttctgt 1920
tactgtgcca aataccctga ccaaaagtaa cttagggaag gaatgggttc attttactta 1980
caatgacatg tgttacagtt catgataaca ggaagtcaag gcaggaactt gaattggtca 2040
catcaaaccc acactgaaaa gcagagagaa acaatgtatc catgctgtct acttacttgc 2100
ctttggctgg cttcattctt aatacacctt agggttccct gcctagggaa tggtgtcacc 2160
cacagtgggc tgtgtctctt aataaccaat tagcagtcaa gacagttccc ccacagacat 2220
gtccacaagc caacctgatc tagacaattc ttcaactgat gctcacctcc caggtcattt 2280
taggctgtgt gaagttgaca ataaaaatta gccaacaaag gaaagaggga ctgatggata 2340
gatggtcaga aggatggaca tatagacaga agattaatga acagaagaat gggtagatga 2400
atagtgtggg tggaagaaca gatgagaaga ttggcaggtg tgtaaaggga agacattgta 2460
tgtggatgat tgtgaagaag aatggatggt ggaaatggat ggatagatca taaggtttga 2520
tgggtaatta gacagaaatg gatggatgga tggatggatg gatggatgga tggatgggtg 2580
ggtgggtggg tgggtgggtg ggtggatgga tggatggatg gatggataga tggatggatg 2640
gatggatgga tgagtagata gaaggagaga aggatacatg gctggaagaa gggatggagt 2700
agaagatgga taaatagatt tgtgaatgtg cagaagaatg gaagaaaagg aggctggatg 2760
gatagattag taagatgcat gggtaaacag atgaatagat ggatgttata ggtggatggg 2820
tggatggaca agagctggtt aggatggatg gaacggtggt tggatggaca gatggacaga 2880
tggatgaagg ttaagtggaa ggatgtatga aaagaacctc agtttctaga agcttctctc 2940
tctttccagc tgctgttgat tacctggcca aaaacgtgag cctgtccaca cagcgccgta 3000
tgaagcttgg ggaacactcc gctgtgctgg gacttcttcc tgtggaaacg ggacaagcct 3060
actagggtcc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 3120
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 3180
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 3240
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 3300
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 3360
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 3420
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 3480
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3540
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 3600
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat 3660
gggctccaat ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca ttaccggtcg atgcaacgag 3720
tgatgaggtt cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat cgccaggcgt tttctgagca 3780
tacctggaaa atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg gcatggtgca agttgaataa 3840
ccggaaatgg tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat tatcttctat atcttcaggc 3900
gcgcggtctg gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc cagctaaaca tgcttcatcg 3960
tcggtccggg ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt tcactggtta tgcggcggat 4020
ccgaaaagaa aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag gctctagcgt tcgaacgcac 4080
tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat cgctgccagg atatacgtaa 4140
tctggcattt ctggggattg cttataacac cctgttacgt atagccgaaa ttgccaggat 4200
cagggttaaa gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg ttaatccata ttggcagaac 4260
gaaaacgctg gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt agcctggggg taactaaact 4320
ggtcgagcga tggatttccg tctctggtgt agctgatgat ccgaataact acctgttttg 4380
ccgggtcaga aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc agccagctat caactcgcgc 4440
cctggaaggg atttttgaag caactcatcg attgatttac ggcgctaagg atgactctgg 4500
tcagagatac ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc ggagccgcgc gagatatggc 4560
ccgcgctgga gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt ggctggacca atgtaaatat 4620
tgtcatgaac tatatccgta acctggatag tgaaacaggg gcaatggtgc gcctgctgga 4680
agatggcgat ctcgagccat ctgctggaga catgagagct gccaaccttt ggccaagccc 4740
gctcatgatc aaacgctcta agaagaacag cctggccttg tccctgacgg ccgaccagat 4800
ggtcagtgcc ttgttggatg ctgagccccc catactctat tccgagtatg atcctaccag 4860
acccttcagt gaagcttcga tgatgggctt actgaccaac ctggcagaca gggagctggt 4920
tcacatgatc aactgggcga agagggtgcc aggctttgtg gatttgaccc tccatgatca 4980
ggtccacctt ctagaatgtg cctggctaga gatcctgatg attggtctcg tctggcgctc 5040
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ccgcatgatg aatctgcagg gagaggagtt tgtgtgcctc aaatctatta ttttgcttaa 5220
ttctggagtg tacacatttc tgtccagcac cctgaagtct ctggaagaga aggaccatat 5280
ccaccgagtc ctggacaaga tcacagacac tttgatccac ctgatggcca aggcaggcct 5340
gaccctgcag cagcagcacc agcggctggc ccagctcctc ctcatcctct cccacatcag 5400
gcacatgagt aacaaaggca tggagcatct gtacagcatg aagtgcaaga acgtggtgcc 5460
cctctatgac ctgctgctgg aggcggcgga cgcccaccgc ctacatgcgc ccactagccg 5520
tggaggggca tccgtggagg agacggacca aagccacttg gccactgcgg gctctacttc 5580
atcgcattcc ttgcaaaagt attacatcac gggggaggca gagggtttcc ctgccacagc 5640
ttgatgaatt gccaagatgc tgataccaca ttcaaaccac tgcaagccct tagcggtccc 5700
tggggcaact tgccccatcc agtggcccag ccaacccttc ccaagccctg agtctcctca 5760
cctcagtccc cttatccccc tggggttgca ggagaccaag ggaaaaaaac cctttccctt 5820
cctacaggaa accctctgga gacggaaaac cagtgtgcca tctacccatg cttagtgacc 5880
cagagtggcc ccttgccttc ccctctttct tcagaggggt tcctaggcat cctgcagtga 5940
cctccagctc acatccacct tctctgtatc gtggcctcgg tcctgtctca gtgcagagat 6000
tgaggctcaa tttgaaccaa gcacctagtt atcagaagaa aatggtgcca aagacaaggc 6060
cctggagtcc ttgacctctg agtcgtgggt gccctggcta tgggtgtagg tggagcccat 6120
gggtgtcctc agtcacagag ctgggagctc tctctcgctc gcttggcatc aggactgcag 6180
cctctttcac tggacactga gatgagtccc cagggtgttc ccaggggaga aagcaggtaa 6240
catcccagct ttacctagga atccagagga ctttaggact gtccctatgc accctgcagg 6300
gcatcaggag accaggaagg gattctagca gagggtaggg ggcacagagg cagagctgat 6360
tgcccatggg ctatcccaga atgcctggtc ctgaatctag catcaggagg tgcaggattc 6420
ctaggctgca atctgacaga ggcttgccca ctgtgtcagg cctgggcagc ccacagaacc 6480
tgtcactctc ctcaattggt aggagaagag gtcttgaggt gacaggaggc agaaggcagg 6540
ctcagacagt cagagagcac caagctttca agtccgcacc cctggggttc ggcataccat 6600
cttgctggca gctggaaacc tggttccctg aaagggggcc tccatcctcc agaatgtaag 6660
gctcttgatg ccaccggatg cagagagcct tctcgggcca gacaaaattg ctgctccacc 6720
ccagagaaga tgttccagcc ttcttggcat cttagaggaa ggccatgtcg ctgtcctttt 6780
cagagtagca tatttttcag tgatggctgc tcagtcagga ggcttctgtc gccttacaaa 6840
gcacagtgcg ctctgggcac tgtttctaag ccaccccatc ccacccccac ccccgccacc 6900
ccggggacag aggaagatgc taaaagtccc agcaaagagg acaaagcacc tttcttaagc 6960
actccagagt cttccttgta ccccgccctc tcttagagct gggtcttttg agggaaacgg 7020
attgctgagc cctccccccc ccccaatcct ctcctctgtg gagctgttta tcatcctcta 7080
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ctcatccagt gctggtaccc cacagcacta aatccaggaa ccctgggctt gatcacctgt 7200
tgccacctgt acacatgaaa ccacctgctg gcccggccca tgtctcctgc cctcagccag 7260
caagacattc ctagagagag gaactatggg cttaaaagcc ccaactgact tccttttgcc 7320
tggggacctg aaccgacaag acaccaggga cacttgtcta catgaacatg tgaccaatgt 7380
acaccgattt ctcatctcta gacctattat ctgaagcctg tcccgggcca tgactagaat 7440
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agcatggagc accaggcgga tggagctcac cagctctgtc caggtttcaa aggaggagac 7560
tgttgggctc ttcaaggtct ggacaagagg aaagccacat tgcccccttg ggaacccagg 7620
ttctcctttt gaacttctca cagctgcaag cacccctttc aaagaccaaa tgcatcctcc 7680
tccacattcc ttgctccctg gaggcctggc tctggataca cctgagtctt cgttcaccta 7740
ctacacttta ggagcaggaa cttcaagcag gtgacatcca cagggcccag tcccagccaa 7800
gggagcaaca ttccaacgct tggaccaatc ataatgatct gcccgtgagg gtaaccgcaa 7860
ctagagacct gcttgggaga aaacaaaatg acttctcatt ccatgccatg cctctgaatg 7920
ctcccccaag ctgccatctt ggtataaaat gggacttgtg ttgtggggaa ccccttgacc 7980
ccaacaggtt ttcccaactg tctcatgctt ttgtgaatct gtctgctttg atctgtaaaa 8040
ctcagccttg tttgggcagc ttgtaatttc aacagtgagg cgacatcgat tagatgagag 8100
gcaccaggcc tctccgccgc cgtccctctg tggccgtccc tctggggttg agcagaacct 8160
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aaaaacaaaa aaaatggaaa gaaaccccca cagtttgtgt cgtgctagtg ccggggacca 8460
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aaatgaaaga gatggcttga agagccaagc tcctactcct ttactttata ggcgaattaa 8640
ctttgccctt cttttagggg accaggaaca agcacaggaa acagaaatta ggaagatcct 8700
ctagagtcga gcagtgtggt tttcaagagg aagcaaaaag cctctccacc caggcctgga 8760
atgtttccac ccaatgtcga gcagtgtggt tttgcaagag gaagcaaaaa gcctctccac 8820
ccaggcctgg aatgtttcca cccaatgtcg agcaaacccc gcccagcgtc ttgtcattgg 8880
cgaattcgaa cacgcagatg cagtcggggc ggcgcggtcc caggtccact tcgcatatta 8940
aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag cgacccgctt aacagcgtca 9000
acagcgtgcc gcagatcttg gtggcgtgaa actcccgcac ctcttcggcc agcgccttgt 9060
agaagcgcgt atggcttcgt accccggcca tcagcacgcg tctgcgttcg accaggctgc 9120
gcgttctcgc ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc 9180
cacggaagtc cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc 9240
ccacgggatg gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga 9300
tatcgtctac gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat 9360
cgcgaacatc tacaccacac aacaccgcct tgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc 9420
ggcggtggta atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc 9480
cgttctggct cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct 9540
caccctcatc ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata 9600
ccttatgggc agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac 9660
cttgcccggc acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct 9720
ggccaaacgc cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg 9780
cgtttacggg ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga 9840
ggattgggga cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa 9900
cgcgggccca cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt 9960
gctggccccc aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa 10020
acgcctccgt cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg 10080
ggacgccctg ctgcaactta cctccgggat gatccagacc cacgtcacca ccccaggctc 10140
cataccgacg atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg 10200
aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat gacggcaata aaaagacaga 10260
ataaaacgca cgggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc ccagggctgg 10320
cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt ttcttccttt 10380
tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa cgtcggggcg 10440
gcaggccctg ccatagccac gggccccgtg ggttagggac ggggtccccc atggggaatg 10500
gtttatggtt cgtgggggtt attattttgg gcgttgcgtg gggtcagtcc acgactggac 10560
tgagcagaca gacccatggt ttttggatgg cctgggcatg gaccgcatgt actggcgcga 10620
cacgaacacc gggcgtctgt ggctgccaaa cacccccgac ccccaaaaac caccgcgcgg 10680
atttctggcg ccgccggacg aactaaacct gactacggca tctctgcccc ttcttcgctg 10740
gtacgaggag cgcttttgtt ttgtattggt caccacggcc gagtttcctc gaccgatgcc 10800
cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 10860
cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 10920
ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 10980
ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 11040
tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 11100
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cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 11220
gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 11280
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cacctcgacc tgaatggaag ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt 11460
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tggccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt 11640
tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc 11700
tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa 11760
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tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc 11880
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tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc 12000
atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa 12060
caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg 12120
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cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 12240
tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 12300
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 12360
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 12420
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 12480
tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 12540
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 12600
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 12660
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 12720
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 12780
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 12840
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 12900
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 12960
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 13020
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agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 13200
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 13260
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 13320
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 13380
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 13440
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cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 13860
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agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 14040
cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 14100
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gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 14280
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 14340
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 14400
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 14460
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaa 14498
<210> 37
<211> 3008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agttctacat ttcaccaaac agggacaggg gacagtccca ctatctggct tatatgactg 60
gaaaaatacc taaaagtacc ctgagtacag cattgggagc aggatagcac agggctaaat 120
ctctggggtt tctgtttcta tcccttcagc cctctaagag ggtggcttac tgatccatgg 180
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ctctgctacc ttggagcctg aggctgagtg agtgacgtca ccagcccagg aactcagcat 360
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agacacccca ggacattttc atagccttta ggagtgggga ggcttgtcct gagccttcta 480
tgacagcgtg ttttaaaaca gtgtctgtac cccagctttc aagtagataa actaacataa 540
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tctaccttca cactatgtgt gtggattctt tgcctgcagt tctttggttc atatgctcca 720
tcccatgata tagacaagga aactgaggct gaaatgctat ggcccaggtc acactcaagg 780
ttgggaggca actattgaga ttgtcccttt ggactccctg gtctcaccat caagctgtgt 840
cccctgcctc ctggctctac ctccccctgc cctgctttaa gcagaagatg ccacgcttgg 900
ggaagcacag agatagtcta cagggagccc tgaaaggcgg gtaacagagg gagccttgtg 960
actctccgtg cccagctttc acctctctat gcatgggggt tctgtggggg cacactggtt 1020
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tcaggaaaga tgtctgctag agcttcaatt aggacagatc cacatgcttc gcaggccagc 1140
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tctgtatgtg tgtgtgtctc aaatgggcat gggtaggtat tgttatgtat gaatattcat 1320
gctatgctca gcattgcctt gtgaagacac tcctttcccc tacacacaga cacacacaca 1380
cacacacaca cacatacaca cacacacaca tacacaccac tcattttcac acgcatcccc 1440
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gttgtgcctc atgcatacct gcactcaggg tccagaaaag gtagagagcc ttcatcctca 1620
gtgttaacct ggactcactc agccgggttc actggccagg atatgcaaat ggactgaggg 1680
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gaaaaagagc agacaaataa taaacactga ggaaatattt gctgagaggg tgggaaagag 1800
atttataagg gaactatggg tggaagaagg atggagggtg ttctcatttt atttctgtta 1860
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atgacatgtg ttacagttca tgataacagg aagtcaaggc aggaacttga attggtcaca 1980
tcaaacccac actgaaaagc agagagaaac aatgtatcca tgctgtctac ttacttgcct 2040
ttggctggct tcattcttaa tacaccttag ggttccctgc ctagggaatg gtgtcaccca 2100
cagtgggctg tgtctcttaa taaccaatta gcagtcaaga cagttccccc acagacatgt 2160
ccacaagcca acctgatcta gacaattctt caactgatgc tcacctccca ggtcatttta 2220
ggctgtgtga agttgacaat aaaaattagc caacaaagga aagagggact gatggataga 2280
tggtcagaag gatggacata tagacagaag attaatgaac agaagaatgg gtagatgaat 2340
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tggatgattg tgaagaagaa tggatggtgg aaatggatgg atagatcata aggtttgatg 2460
ggtaattaga cagaaatgga tggatggatg gatggatgga tggatggatg gatgggtggg 2520
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tggatggatg agtagataga aggagagaag gatacatggc tggaagaagg gatggagtag 2640
aagatggata aatagatttg tgaatgtgca gaagaatgga agaaaaggag gctggatgga 2700
tagattagta agatgcatgg gtaaacagat gaatagatgg atgttatagg tggatgggtg 2760
gatggacaag agctggttag gatggatgga acggtggttg gatggacaga tggacagatg 2820
gatgaaggtt aagtggaagg atgtatgaaa agaacctcag tttctagaag cttctctctc 2880
tttccagctg ctgttgatta cctggccaaa aacgtgagcc tgtccacaca gcgccgtatg 2940
aagcttgggg aacactccgc tgtgctggga cttcttcctg tggaaacggg acaagcctac 3000
tagggtcc 3008
<210> 38
<211> 2577
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
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aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggctccaat 600
ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt 660
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atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg 780
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gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg 900
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caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt 1080
ctggggattg cttataacac cctgttacgt atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa 1140
gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg 1200
gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt agcctggggg taactaaact ggtcgagcga 1260
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gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac 1560
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tacacatttc tgtccagcac cctgaagtct ctggaagaga aggaccatat ccaccgagtc 2220
ctggacaaga tcacagacac tttgatccac ctgatggcca aggcaggcct gaccctgcag 2280
cagcagcacc agcggctggc ccagctcctc ctcatcctct cccacatcag gcacatgagt 2340
aacaaaggca tggagcatct gtacagcatg aagtgcaaga acgtggtgcc cctctatgac 2400
ctgctgctgg aggcggcgga cgcccaccgc ctacatgcgc ccactagccg tggaggggca 2460
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ttgcaaaagt attacatcac gggggaggca gagggtttcc ctgccacagc ttgatga 2577
<210> 39
<211> 2995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctggggcaac ttgccccatc cagtggccca gccaaccctt cccaagccct gagtctcctc 60
acctcagtcc ccttatcccc ctggggttgc aggagaccaa gggaaaaaaa ccctttccct 120
tcctacagga aaccctctgg agacggaaaa ccagtgtgcc atctacccat gcttagtgac 180
ccagagtggc cccttgcctt cccctctttc ttcagagggg ttcctaggca tcctgcagtg 240
acctccagct cacatccacc ttctctgtat cgtggcctcg gtcctgtctc agtgcagaga 300
ttgaggctca atttgaacca agcacctagt tatcagaaga aaatggtgcc aaagacaagg 360
ccctggagtc cttgacctct gagtcgtggg tgccctggct atgggtgtag gtggagccca 420
tgggtgtcct cagtcacaga gctgggagct ctctctcgct cgcttggcat caggactgca 480
gcctctttca ctggacactg agatgagtcc ccagggtgtt cccaggggag aaagcaggta 540
acatcccagc tttacctagg aatccagagg actttaggac tgtccctatg caccctgcag 600
ggcatcagga gaccaggaag ggattctagc agagggtagg gggcacagag gcagagctga 660
ttgcccatgg gctatcccag aatgcctggt cctgaatcta gcatcaggag gtgcaggatt 720
cctaggctgc aatctgacag aggcttgccc actgtgtcag gcctgggcag cccacagaac 780
ctgtcactct cctcaattgg taggagaaga ggtcttgagg tgacaggagg cagaaggcag 840
gctcagacag tcagagagca ccaagctttc aagtccgcac ccctggggtt cggcatacca 900
tcttgctggc agctggaaac ctggttccct gaaagggggc ctccatcctc cagaatgtaa 960
ggctcttgat gccaccggat gcagagagcc ttctcgggcc agacaaaatt gctgctccac 1020
cccagagaag atgttccagc cttcttggca tcttagagga aggccatgtc gctgtccttt 1080
tcagagtagc atatttttca gtgatggctg ctcagtcagg aggcttctgt cgccttacaa 1140
agcacagtgc gctctgggca ctgtttctaa gccaccccat cccaccccca cccccgccac 1200
cccggggaca gaggaagatg ctaaaagtcc cagcaaagag gacaaagcac ctttcttaag 1260
cactccagag tcttccttgt accccgccct ctcttagagc tgggtctttt gagggaaacg 1320
gattgctgag ccctcccccc cccccaatcc tctcctctgt ggagctgttt atcatcctct 1380
atttatcaaa atcgcatcca tctttaccct ctccttcgct atagcctact tctggatcac 1440
cctcatccag tgctggtacc ccacagcact aaatccagga accctgggct tgatcacctg 1500
ttgccacctg tacacatgaa accacctgct ggcccggccc atgtctcctg ccctcagcca 1560
gcaagacatt cctagagaga ggaactatgg gcttaaaagc cccaactgac ttccttttgc 1620
ctggggacct gaaccgacaa gacaccaggg acacttgtct acatgaacat gtgaccaatg 1680
tacaccgatt tctcatctct agacctatta tctgaagcct gtcccgggcc atgactagaa 1740
tggcttgtat ctgtggttta gagaagtcta ataataactg agggcaaact gactctctgg 1800
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actcagcctt gtttgggcag cttgtaattt caacagtgag gcgacatcga ttagatgaga 2400
ggcaccaggc ctctccgccg ccgtccctct gtggccgtcc ctctggggtt gagcagaacc 2460
tagaagaagg ccgatttcca gtggccagac tggaccagaa acagccccca ccccaatccc 2520
tgtaaataga gtcaatagca aaataagagg ggcgccctcc atgtcacctc aagtagctac 2580
tggttcttct gtggaggccc ctctgaactc attgtctggt agttgaaaat gtgatgttgt 2640
gctgtttgtt tatagaacat tggcttttta tatataaatc tatatactta aaaacaaaaa 2700
caaaaacaaa aaaaatggaa agaaaccccc acagtttgtg tcgtgctagt gccggggacc 2760
atctgtaggg atctcattgt gtgtttggat tatgtatgcc agcctttctc gggttcctcc 2820
ttcttttttt ttttctttgt catttcccta ctcccgattt ggtttttctc tctcgctctg 2880
aaaatgaaag agatggcttg aagagccaag ctcctactcc tttactttat aggcgaatta 2940
actttgccct tcttttaggg gaccaggaac aagcacagga aacagaaatt aggaa 2995

Claims (4)

1.一种同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体包括：同源左臂，引物P2，插入片段，引物P3以及同源右臂，其中所述引物P2和P3能够扩增包含基因同源重组位点的序列；
所述同源重组载体为Pax7-IRES-CreERT2，其序列如SEQ ID NO: 36所示；
所述同源重组载体Pax7-IRES-CreERT2的具体制备过程包括：通过In-Fusion的方式，将5’臂、IRES-CreERT2片段、3’臂和骨架载体通过一步重组的方式，构建获得Pax7-IRES-CreERT2同源重组载体，其中，所述5’臂、IRES-CreERT2片段、3’臂的序列分别如SEQ ID NO:37-39所示，所述骨架载体的序列如SEQ IDNO:21所示。
2.一种引物组，包括5’臂预鉴定的引物对和3’臂预鉴定的引物对，其特征在于，所述5’臂预鉴定的引物对的序列分别如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示，所述3’臂预鉴定的引物对的序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示。
3.一种基因同源重组试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的同源重组载体。
4.权利要求1所述的同源重组载体在基因同源重组方面的应用。
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