CN105176936A - 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用，其亚克隆的序列为SEQ？ID？NO.31所示。复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法包括（1）制备依赖启动子但无需体外转录的高效复制子系统，（2）制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。利用该亚克隆制备出的复制耐受型的病毒样颗粒，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析、病毒抗体药物筛选、疫苗、诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制与致病机制研究。

Description

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用。

背景技术

西门利克森林病毒(Semlikiforestvirus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成5个结构蛋白(C、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。非结构蛋白参与病毒的复制和包装等过程，而结构蛋白参与病毒粒子的组装。西门利克森林病毒具有广泛的宿主范围，且能够感染神经系统。病毒作为一种微生物，一方面对人类的健康和农业生产产生不利的影响，另一方面，病毒的感染特性使得其具有为人类所利用的能力，从而为人类的健康和农业生产服务。因此，必须充分了解病毒的生物学特性，才能够有得放矢去改造病毒。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种具有复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒。将在蛋白表达、基因治疗、疫苗和诊断试剂的研发、神经细胞和非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQIDNO.31所示，该亚克隆可用于西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。

本发明的另一个目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，方法简单。

本发明还有一个目的在乎提供了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，制备出的病毒样颗粒在蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQIDNO.31所示。

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，包括：(1)制备依赖启动子的而无需体外转录的高效复制子系统，(2)制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。

SEQIDNO.31所示的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，包括以下步骤：

1.构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子：

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon(Berglund,Petal.,(1993)Biotechnology11,916-920.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:1，SEQIDNO:4和SEQIDNO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。

2.构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子：

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP。

3.构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:13和SEQIDNO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA。

4.制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHp，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHp，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQIDNO:31所示。

本发明提供的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法也适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus,VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbisvirus,SINV)。

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，包括将Ubc-SFV-FL-EGFP-△C通过脂质体转染进BHK-21细胞制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒，制得的病毒样颗粒利用常规方法，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷的制备复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒的方法，该平台制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有基于该系统的平台，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展SFV的应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、细胞精细结构描绘、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装盒致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明制备出的复制耐受型的病毒样颗粒表明西门利克森林病毒的膜蛋白能够形成病毒样的颗粒，并且该颗粒具有包装病毒核酸的能力，这种包装是通过病毒样颗粒识别位于病毒nsP2基因中的包装序列。

4.野生病毒由于含有病毒衣壳蛋白，因此具有很强的核酸包装能力，病毒的产生的效率高，因此毒性较大。而本发明制备的病毒样颗粒包装核酸的效率低，具有完成病毒生命循环的能力，该病毒样颗粒的毒性小，有利于该系统的应用。

附图说明

图1为一种依赖于Ubc启动子的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图。

pSFV-replicon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-replicon，而制备了Ubc-SFV-replicon。SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。

图2为一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子。

A：一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；

B：一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况；

图3为一种高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子。

A：一种依赖于Ubc启动子的高效表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；

B：表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图4为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。

A：一种缺失病毒衣壳蛋白基因的依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的亚克隆的构建示意图；

B：表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图5为一种复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒通过识别位于nsP2的包装序列而包装核酸。

A：一种包装序列缺失的制备西门利克森林病毒病毒样颗粒的构建示意图；

B：缺失包装序列的表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图6为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的生物学特征的分析。

A：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑形成特征(染色)；

B：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑的荧光成像；

C：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的电镜特征；

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子：

为了将Ubc启动子插入到复制子的3’UTR的上游，需要采用三片段同源重组的方法进行。(1)采用全基因序列合成的方法合成Ubc启动子，其序列为SEQIDNO:1，为了大量获取Ubc启动子的产物，使用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示引物扩增片段SEQIDNO:1；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；(2)以pSFV-replicon为模板，扩增linker1，其序列为SEQIDNO:4，采用引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；(3)以pSFV-replicon为模板，扩增linker2，其序列为SEQIDNO:7，采用引物SEQIDNO:8和SEQIDNO:9；

PCR的反应体系均为50μl：5×ReactionBuffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForwardPrimer：2.5μl，10μMReversePrimer：2.5μl，TemplateDNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-FreeWater：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃90s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon(Berglund,Petal.,(1993)Biotechnology11,916-920.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:1，SEQIDNO:4和SEQIDNO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。

pSFV-replicon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-replicon，而制备了Ubc-SFV-replicon。SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。构建示意图见图1。

实施例2：构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子，其构建方法如下：

以pEGFP-N2(Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQIDNO:10，使用SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物扩增片段SEQIDNO:10；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×ReactionBuffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForwardPrimer：2.5μl，10μMReversePrimer：2.5μl，TemplateDNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-FreeWater：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP。

使用Lipofectamine2000作为转染试剂将质粒DNA转入BHK-21细胞。具体而言，分为两个步骤：1)取2只1.5ml离心管，分别向其加入250μl的Opti-MEM,向其中一只加入2ug质粒Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，向另一只加入5μl转染试剂，室温放置5min后，将两者混匀，置于室温放置20min；2)吸弃长满单次细胞的6孔板中的培养基，用PBS洗两次，吸弃PBS，然后加入1mlOpti-MEM，将步骤1中的混合液(500μl)立刻加入到孔中，混匀后置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中，4h后吸弃培养基，加入2ml含有2％FBS的DMEM培养基。

Ubc-SFV-replicon-EGFP质粒转染BHK2-21后1天可观察到绿色荧光蛋白(图2B),表明西门利克森林病毒复制子不需要通过体外转录为RNA后再转染BHK-21细胞，简化了实验的操作步骤。

实施例3：构建高效的携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子

将hdvr和BGHpA的序列插入到pUbc-SFV-replicon-EGFP的下游。采用基因合成的方法，合成hdvr-BGHpA的片段，其序列为SEQIDNO:13。为了大量获取hdvr-BGHpA的产物，使用SEQIDNO:14和SEQIDNO:15所示引物扩增片段SEQIDNO:13；以pSFV-replicon为模板，使用SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示引物扩增片段SEQIDNO:18；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×ReactionBuffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForwardPrimer：2.5μl，10μMReversePrimer：2.5μl，TemplateDNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-FreeWater：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:13和SEQIDNO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA。

按照实施例2中的转染方法将质粒Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA转染BHK-21细胞，1天后观察到绿色荧光蛋白(图3B),表达的荧光密度比(图2B)中的亮度高，表明hdvr和BGHpA的加入有利于西门利克森林病毒复制子高效表达外源蛋白。

实施例4：制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

以pSFV-helper2(Berglund,Petal.,(1993)Biotechnology11,916-920.)为模板分别扩增序列SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:28，使用SEQIDNO:22和SEQIDNO:23所示引物扩增片段SEQIDNO:19；使用SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示引物扩增片段SEQIDNO:20；使用SEQIDNO:26和SEQIDNO:27所示引物扩增片段SEQIDNO:21；使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示引物扩增片段SEQIDNO:28；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×ReactionBuffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForwardPrimer：2.5μl，10μMReversePrimer：2.5μl，TemplateDNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-FreeWater：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃20s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQIDNO:31所示。

实施例5：

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用：

按照实施例2中的转染方法，将质粒Ubc-SFV-FL-EGFP-△C转染BHK-21细胞，1天后可观察到绿色荧光蛋白(图4B),可见到成团的绿色荧光蛋白，表明产生了具有感染性的亚病毒颗粒，收集上清加入到新鲜制备的BHK-21细胞，可以见到绿色荧光的表达，表达具有成簇的特点，再次收集上清感染新鲜制备的BHK-21细胞，可以见到绿色荧光的表达(图4B)，由此可见，该方法成功制备出了缺失衣壳后，仍可以包装病毒基因组的病毒样颗粒。

实施例6：

复制耐受型的西门利克森林病毒病的毒样颗粒的特征

为了分析复制耐受型病毒样颗粒的特征，一方面进行电镜分析其病毒的形状和大小，另一方面分析其在BHK-21细胞上产生的空斑的情况。

①吸取病毒液体10μl到干净的封口膜上，将铜网正面向下，置于样品表面孵育3-5min；用干净滤纸吸除多余液体，并将铜网浸入染色液染色3min；用干净滤纸吸除多余液体，将铜网铺在干净的滤纸片上，放入玻璃平皿待干燥后作透射电镜观察。可见到复制耐受型病毒样颗粒的直径较小(图6C)

②取病毒液体15μl置于135μlDMEM(含有2％FBS)的稀释液中，依次10倍比西施。然后分别在每个稀释度取100μl加入到含有BHK-21细胞(汇合度95％)中，置于37℃，CO₂5％的培养箱中1小时，然后加入吸弃病毒液，加入浓度为0.6％的琼脂(含有2％FBS和1X的DMEM)，2天后加入含有中性红且浓度为0.6％的琼脂(含有2％FBS和1X的DMEM，)。24小时后可以看见斑点为针尖状(图6A和B)

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院武汉物理与数学研究所

<120>复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

<130>复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

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Claims (6)

1.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQIDNO:31。

2.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，包括：（1）制备依赖启动子的而无需体外转录的高效复制子系统，（2）制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。

3.权利要求1所述亚克隆的制备方法，包括：

1）构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子：

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:1，SEQIDNO:4和SEQIDNO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon；

2）构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子：

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP；

3）构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQIDNO:13和SEQIDNO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA；

4）制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQIDNO:31所示。

4.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用。

5.利用权利要求1所述的亚克隆制备的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒。

6.权利要求5所述的病毒样颗粒的应用；

所述的应用为蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析、病毒抗体药物筛选、疫苗、诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制与致病机制研究中的应用。