CN113061588B - 缺失i226r基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗 - Google Patents

缺失i226r基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，为一类新的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒；通过对I226R部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和厌食、精神沉郁未出现，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感染或人为攻击，可用于非洲猪瘟的预防。

Description

缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗
发明领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失减毒株及由该毒株制备的活疫苗，尤其是公开了一种缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，缺失I226R部分或全部基因功能的非洲猪瘟病毒减毒株，本发明还进一步提供了利用该减毒株联合佐剂制备的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染引起的猪的一种热性、高度接触传染性致死性疾病，强毒株感染引起的死亡率接近100％，是养猪业的重大威胁，并在流行地区造成重大损失。针对非洲猪瘟的防控，一直以来主要采取扑杀和尸体清除的方法，并采取严格的生物安全措施进行防范。迄今为止，全球尚无疫苗应用。非洲猪瘟病毒基因组全长170-193kb,含有150~180个ORFs,推测可编码约165种蛋白。其中已发现包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制凋亡等相关的基因。毒力因子包括9GL、UK、I177L等(Lewis et al.,2000；Zsak etal., 1998；O'Donnell et al., 2015；Borca et al., 2020)，免疫抑制因子包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360以及MGF505等(Afonso etal., 2004；Li et al., 2021；Reis etal., 2016)，血吸附因子如CD2v、EP153R等(Rodriguez et al., 1993)。
近年来针对ASFV MGF505/360、CD2v、UK、A238L等基因进行缺失的减毒疫苗株，以及在家猪或野猪群中分离的自然弱毒株，在猪体内证实有一定的免疫保护效果，但有些毒株在田间试验中证明可产生慢性病变，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀、僵猪、母猪流产和育肥期出现临床异常症状等不良反应（King et al.，2011；Leitao et al.，2001；Revilla etal.，1992，个人通讯）。因此，阐明更多未知基因功能，进而探索利用其作为更为安全有效的新疫苗，一直是养猪业中非洲猪瘟防控面临的重要且现实的课题。
发明内容：
本发明提供了一种缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，即缺失了I226R部分或全部基因功能的非洲猪瘟活病毒，I226R基因单独部分或全部缺失后即表现良好的免疫保护作用，可保护易感猪免受ASFV强毒自然感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。在此基础上再联合缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其使用的安全性。
本发明公开的一种缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株，基因序列如：SEQ No.1所示，缺失以下基因的功能：基因组右端可变区I226R。
其中，基因组右端的I226R基因的完全缺失或基因序列的部分缺失或单个核苷酸的突变。
本发明所示的一种基因缺失的减毒的非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的I226R单基因缺失或联合ASFV其他致病基因如CD2v、MGF505/360、I177L等缺失的重组病毒。
本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒（不同基因型）的毒力分离株。
本发明所述的一种缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）I226R基因缺失病毒的构建
以pUC-EGFP质粒或类似质粒为载体，以I226R基因为目标，构建含该目的基因左右同源臂的重组质粒，与ASFV亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到目的基因缺失的重组病毒△I226R；
2）I226R基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，构建含其他毒力相关目的基因X左右同源臂的重组质粒，与ΔI226R共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到同时缺失I226R基因与ASFV其他毒力相关基因X的联合缺失病毒。
3) 疫苗的制备
将步骤1）或2）中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以103TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗。
本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗，可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用；也可与其他猪用疫苗联合制备使用。
本发明所述的上述非洲猪瘟基因缺失病毒制备的疫苗免疫试验猪后，未出现发热、厌食、精神沉郁等任何异常临床症状；并在攻毒后28天100%健活，且无病毒血症、发热、厌食等症状。证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减毒活疫苗。
本发明的积极效果在于：
公开了一类新的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒；通过对I226R部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后未引起发热、厌食和精神沉郁等症状，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感染或人为攻击，可用于非洲猪瘟的预防。
附图说明
图1为本发明I226R基因在SY-18全基因组中的位置示意图；
图2为本发明pΔI226R-EGFP质粒构建示意图；
图3为本发明pΔCD2v-mCherry质粒构建示意图；
图4为本发明pΔMGF505/360-mCherry质粒构建示意图；
具体实施方式：
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不得以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。同时本发明所用实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
细胞、毒株和质粒的制备
1、猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml GM-CSF和10%FBS的1640完全培养基中诱导培养；
2、非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894，由军事兽医研究所流行病学研究室于2018年分离，本研究所使用毒株为该分离株在PAM细胞上的第四代扩繁毒，于-80℃分装保存；
3、pUC-EGFP和pUC-mCherry分别为携带有绿色荧光EGFP基因和红色荧光mCherry基因的质粒，其荧光基因均在p72启动子的控制下表达。
实施例2
缺失I226R基因毒株ASFVΔI226R的构建
1、同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即I226R基因的左同源臂（I226R基因左侧约1200bp，I226R Left Arm）和I226R的右同源臂（I226R基因右侧约1200bp,I226R Right Arm），依次克隆至EGFP基因两侧，如图2所示；获得重组质粒pΔI226R-EGFP；
2、重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 pΔI226R-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮以上有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存；提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFVΔI226R。
实施例3
I226R与CD2v基因联合缺失毒株ASFVΔI226RΔCD2v的构建
因ASFVΔI226R携带绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将CD2v的左同源臂（CD2v基因左侧约1200bp,CD2v-Left Arm）和右同源臂（CD2v基因右侧约1200bp,CD2v-Right Arm）克隆至图3所示位置，构建得到重组质粒pΔCD2v-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFVΔI226R；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFVΔI226RΔCD2v。
实施例4
I226R与MGF505/360基因联合缺失毒株ASFVΔI226RΔMGF505/360的构建
因ASFVΔI226R为绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因MGF505/360。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将MGF505的左同源臂（MGF505-1R基因左侧约1200bp,MGF505/360-Left Arm）和右同源臂（MGF360-14L基因右侧约1200bp, MGF505/360-Right Arm）克隆至图4所示位置，构建得到重组质粒pΔMGF505/360-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFVΔI226R；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFVΔI226RΔMGF505/360。
实施例5
基因缺失非洲猪瘟减毒疫苗的制备及其安全性和免疫原性评价
将实施例2~4中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；用103TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗：
1）I226R基因缺失的ASFV疫苗（ASFVΔI226R）
毒株培养和滴度测定
将实施例2中构建的病毒ASFVΔI226R接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的p30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/mL为单位。
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至107TCID50/mL、103TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A29），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照；免疫后观察14日，测定体温，以判断本疫苗的安全性；免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为250TCID50，观察28日。
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.75TCID50/mL。
免疫后的安全性观察和测定结果如表1：
表1 ASFVΔI226R免疫猪后安全性结果
免疫后攻毒结果如表2：
表2 ASFVΔI226R免疫猪攻毒结果
2）I226R与CD2v基因联合缺失的疫苗（ASFVΔI226RΔCD2v株）
毒株培养和滴度测定
将实施例3中构建的病毒ASFVΔI226RΔCD2v接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的p30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/mL为单位。
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至107TCID50/mL、103TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A29），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察14日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为250TCID50，观察28日。
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.25TCID50/mL。
免疫后的安全性观察和测定结果如表3：
表3 ASFVΔI226RΔCD2v免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表4：
表4 ASFVΔI226RΔCD2v免疫猪攻毒结果
3）I226R与MGF505/360基因联合缺失的疫苗（ASFVΔI226RΔMGF505/360株）
毒株培养和滴度测定
将实施例4中构建的病毒ASFVΔI226RΔMGF505/360接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的p30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/mL为单位。
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至107TCID50/mL、103TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A29），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察14日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为250TCID50，观察28日。
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为108.0TCID50/mL。
免疫后的安全性评价结果，如表5：
表5 ASFVΔI226RΔMGF505/360免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表6：
表6 ASFVΔI226RΔMGF505/360免疫猪攻毒结果
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 681
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 1
atgaaaatgg aaacattttt agtctgttta tttcacaatg cagatggttt acatcaacag 60
attcaggaaa ttttgtattt attgcggatg catatttacg aaacaaatct ttacttaaag 120
caggaactat cacggcttat atatccaaat aggcaacttt cttttgtgtt acttatgccc 180
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caaaagctga caaaaccata cttcctttta gcggtcaagc gggtcagcga aaaactcaac 360
aaaaagcagc gacattcatt ttacgaggta ttggtaacct ccgaaacctt gaataattat 420
gaaaacctat ctaaaaacat tttaaatacg ttgatgtttg ccgtgcgcta cgtatttaaa 480
cctacgccga actattcaga aattctcgca gagttggaaa aaaaaaataa aattcaccat 540
attattttta atatggtaat tacggatttt gcgcaaatcc gtgaacaaca aatggataaa 600
catctgtgtg aaacaaataa tgagcttcgt caggaatgta aagaaactat ttttgattta 660
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<210> 2
<211> 226
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
Met Lys Met Glu Thr Phe Leu Val Cys Leu Phe His Asn Ala Asp Gly
1 5 10 15
Leu His Gln Gln Ile Gln Glu Ile Leu Tyr Leu Leu Arg Met His Ile
20 25 30
Tyr Glu Thr Asn Leu Tyr Leu Lys Gln Glu Leu Ser Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Pro Asn Arg Gln Leu Ser Phe Val Leu Leu Met Pro Leu Ser Leu Leu
50 55 60
Arg Asn Trp Asp Asp Ile Glu Tyr Leu Thr Asp Val Val Asp Asp Lys
65 70 75 80
Gln Thr Leu His Tyr Ala Ala Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Val Leu His
85 90 95
Leu Ser Met Phe Gln Lys Leu Thr Lys Pro Tyr Phe Leu Leu Ala Val
100 105 110
Lys Arg Val Ser Glu Lys Leu Asn Lys Lys Gln Arg His Ser Phe Tyr
115 120 125
Glu Val Leu Val Thr Ser Glu Thr Leu Asn Asn Tyr Glu Asn Leu Ser
130 135 140
Lys Asn Ile Leu Asn Thr Leu Met Phe Ala Val Arg Tyr Val Phe Lys
145 150 155 160
Pro Thr Pro Asn Tyr Ser Glu Ile Leu Ala Glu Leu Glu Lys Lys Asn
165 170 175
Lys Ile His His Ile Ile Phe Asn Met Val Ile Thr Asp Phe Ala Gln
180 185 190
Ile Arg Glu Gln Gln Met Asp Lys His Leu Cys Glu Thr Asn Asn Glu
195 200 205
Leu Arg Gln Glu Cys Lys Glu Thr Ile Phe Asp Leu Lys Val Val Gly
210 215 220
Asn Val
225

Claims (3)

1.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，缺失的基因序列如：SEQ No.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ No.2所示，基因缺失前亲本毒株为非洲猪瘟病毒SY-18株。
2.根据权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于：在I226R基因缺失基础上，构建联合缺失CD2v的重组病毒。
3.根据权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于：在I226R基因缺失基础上，构建联合缺失MGF505和MGF360的重组病毒。
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