TWI324160B - - Google Patents

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1324160 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 . 本發明係關於一種禽類新城病病毒(NDV)凝血素·神經氨酸苷酶(HN)重 . 組融合蛋白及含彼之疫苗，特別是指一種以原核生物表達系統產生之榖胱 .甘肽硫轉移酶(Glu_i〇ne S-t_ferase，GST).凝血素神經氨酸芽酶(_重 組融合蛋白，以及含有該重組融合蛋白之抗新城病疫苗。 • 【先前技術】 新城病病毒（Newcastle disease virus，NDV)屬於副黏病毒科 (Pa_yx0Viridae)中第-型鳥類副黏病毒(Type ! Avian Pammyx〇virus)，依毒 f生可刀為強常内臟型(VelogenicViscerotropic Newcastle Disease，WND>、強 毒神經型(Vdogenic)、中間毒型(Mes〇genic)、弱毒型(Lent〇genic)^ ^ 腸道型；不同毒性騎城病病毒會造成不同程度的禽類呼吸道傳染疾病， 其中強毒内臟型甚至可以造成禽類胃腸道的損害，死亡率接近9〇% ;在台 %灣’新城病病毒曾經造成三次重域情以及嚴重祕濟敎，因此，提升 雞隻對於新城病病毒的免疫力，對禽齡殖業來說是非常重要的。 病病毒(NDV)S-種具有類的咖八赫，繩麟由雙層脂質 構成”上具有兩種大出之醣蛋白(giyC〇pr〇tein)—凝血素_神經氨酸苷酶 ’簡稱册蛋白）以及融合蛋白伽i⑽p如他， 簡稱F蛋自），禽類抗體可對麵毒醣蛋自產生反應 ;凝血素-神經氨酸苷酶 (HN蛋白），可使新城病病毒具有凝血功能以及神經氨酸苦酶(此饥 aminidase, )種/舌j·生HN蛋白並可與含有唾液酸的受體(8ϋ 。⑽血㈣ 5 1324160 ' receptor)結合；而融合蛋白(F蛋白)則可使新城病病毒顆膜與宿主細胞膜產 生融合，並使新城病病毒穿透宿主細胞膜而進入宿主細胞内。新城病病毒 的感染力（infectivity)可以被NH蛋白的單株抗體或單一特異性抗血清 (monospecific antisera)給中和掉；除了兩個無毒性的病毒株(ulster strain以 及Queensland strain)之外，一般認為NH蛋白不需要經過轉譯後切割處理 (post-translational cleavage)來進行修飾(modification)。 在新城病病毒蛋白中，大多數誘導中和的抗體之抗原決定位置 # (neutralizing ePit0Pes) ’以及大多數可能的醣類附著位置(carbohydrate attachment sites)是位於該蛋白分子靠近C端之部份；聊蛋白主要的疏水區 域則接近其N端，係為第27〜54個胺基酸，因此第丨〜26個胺基酸為相對親 水性；推測HN蛋白係以其靠近N端的位置附著在新城病病毒的鞘膜上， 且不具有被切獅職序列(Signal sequenee); 蛋㈣認寄主細胞表面含 有唾液酸的受體，促進F蛋白的融合能力，因此可使病毒穿透細胞表面， 並且具有神經氨酸__的作用，會將唾液酸自子代病毒(㈣叫^㈣ ♦子移除以避免子代病毒自身凝結(self_ag咖;所以，冊蛋白決 定了病毒的感染趨性(tropism)及毒性(vimlence)，在新城病病毒感染過程中 :扮演關鍵角色；因此，HN蛋白為發展基因疫苗主要的目標。 -習用禽賴城病疫苗係包含活毒疫苗及死毒疫苗兩種，活毒疫苗係使 用弱毒型或無毒腸道型之新城病病毒株作為疫苗，而死毒疫苗則以強毒性 或中間毒性之新城病病毒株經不活化處理後作為疫苗；因此，病毒的大量 培養是禽_城紐苗生產中極為重要的部分；習㈣雜或巾間毒性之 新城病病毒的製造，係將強毒性或中間毒性病毒株接種至禽類受騎之床 囊腔内以大量繁殖病毒’細此方式f大量取得適t禽類受精_為製造 材枓’且需要大量操作人工，以及較長時間的培養，不但費工、耗時且成 本南。 由此可見’上述習时賴城病疫苗的製作仍有諸多缺失，實非一良 善之设計者，而亟待加以改良。 本案發明人鑑於上述f时麵翻疫苗的製作着生的各項缺點， 乃虽思加以改良鑛’並經多年和職潛心研究後，終於成功研發完成 本件禽類新城病病毒(NDV)凝血素·神經氨酸_陶重組融合蛋白及含彼 之疫苗。 【發明内容】 本發明之目的即在讀供-種他職病絲_v)凝血素神經氨酸 重組融合蛋自，該重歸合蛋__核生録達綠大量生產 所得，其製程較真核生物表達系統簡便、產量大，生產速度快，安全性高， 成本低廉，具有經濟效益。 本發月之A目齡在於^種含有該禽類新城病病麵請)凝金 素-神經氨酸苦酶_重組融合蛋白的疫苗，係將該重組融合蛋白直接添加 於傳統疫苗之基本配方中，以提高禽類之免疫效力。 本發明之另-目的係在於提供一種含有該禽類新城病病毒⑽V)凝血 素-神經氨酸重組融合蛋白的疫苗，該疫苗除了可以增加禽類之免 疫效力外，並可減少傳統疫苗的全病毒使用之比例，以節省成本。 可達成上述發明目的之禽類新城病病毒(NDV)凝血素-神經氨酸皆酶 (HN)重組融合蛋白’係由_縠胱倾補㈣(Glu嘯。μ s也nsferase， GST)以及-禽崎城病病錢场·神經紐鶴卿)蛋^段所組成。 錢類新城病病毒凝血素-神經氨酸普酶_蛋白片段係選自該凝血 素-神經氨«酶(_蛋白线c端之諸；於—較佳實施射，該凝血素 神、錢㈣酶(HN)蛋白片段係為如SEQ ID N〇:(所示之凝血素神經氨酸 __蛋白基因帛796個鹽基以後所編碼之蛋白質部分，係具有如卿 ID No: 5所示之胺基酸序列。 忒禽類新城病病毒凝血素-神經氨酸苷酶(HN)重組融合蛋白係藉由基 因轉殖方式而得，係將禽類新城病病毒凝血素神經氨酸：^酶㈣)蛋白片段 之基因選殖到含有榖胱甘肽硫轉移酶(GST)基因之表現載體中，形成含有穀 胱甘肽硫轉移酶(GST)-凝血素·神經氨酸苷酶(hn)蛋白片段之基因序列的載 體，再將該載體經轉殖到原核生物後大量表現而得之重組融合蛋白；於一 較佳實施例中’該榖胱甘肽硫轉移酶(GST)-凝血素-神經氨酸苷酶(HN)蛋白 片段之基因序列為具有如SEQ ID No: 5所示之核苷酸序列，該穀胱甘肽硫 轉移酶(GST)係具有如SEQ ID No: 7所示之胺基酸序列，該重組融合蛋白 (GST-HNs)則為具有如SEQIDNo:9所示之胺基酸序列。 該含有穀胱甘肽硫轉移酶(GST)基因之表現載體包含但不限於pGEX載 體系統以及pET載體系統等；於一較佳實施例中，該表現載體係為 pGEX-4T-3 ;該原核生物表現系統包含但不限於大腸桿菌(iEsr/zm'c/H'a c<9") 以及沙門氏桿菌〇SWmo«e//a)等，於一較佳實施例中，該原核生物表現系統 係為大腸桿菌〇& cW) DH5a。 進步提供種3有該禽類新城病病毒凝血素-神經氨酸普酶 且融合版㈣’峨姆傳_峨赫毒疫苗或含 几禽類新域病病毒之混合财苗中，加人上叙禽類峨病病毒凝血素_ 〒錢料_>〇重錄合蛋自；财苗純糾上叙錢贼病病毒

凝血素-神經氨«酶(_纽齡蛋白，禽鑛城病病毒及/或―種以上之 其他禽類病原菌’以及適#之細或佐劑。 、錢類新城病病毒凝血素_神經氨酸普酶_重組融合蛋白係先經去 活性反應舰；性反應福馬林(—in麻生素k__ ；下進订反應M6小時’於一較佳實施例中，該去活性反應係為以福 馬林於37t下進行反應16小時。 “傳·先抗禽類新城病病毒疫苗係為含有弱毒型或無毒腸道型之新城病 :丙母株的㈣毒之疫苗’或為含有經去活性反應處理之強毒性或中間毒性 之新城病病雜之疫苗；於—触實施财，賴統抗禽_城病病毒疫 苗係含有去活性後之新城病病毒石井株。 "玄3有抗禽類新城病病毒之混合型疫苗係為含有新城病病毒以及一種 乂上之其他禽類病原g的疫苗；該新城病病毒係為弱毒型或無毒腸道型之 新城病病絲的活病毒，或是經去減反應纽之強毒性或中間毒性之新 城病病毋株，該其他禽類病原菌包含但不限於禽類傳染性鼻炎桿菌 (Infectious coryza，iC) ’家禽霍亂桿菌(F〇wl也〇1啦,Fc)，傳染性支氣管炎病 毒(Infectious bronchitis，IB) ’ 禽類產卵下降症病毒(Egg drop syndr〇me， 1324160 EDS) ’以及傳染性華氏囊病毒(infecti〇us bursai disease，IBD)等；於一較佳 實施例中’該混合型疫苗係為含有新城病病毒石井株以及禽類傳染性鼻炎 桿菌A型(IC-A)之疫苗。 該佐劑包含但不限於水性氫氧化鋁膠’明礬，Freund氏不完全佐劑， ，由狀佐劑’水溶性佐劑，或水包油包水雙相佐劑(water_in_〇il_in_water， W/0/W);於一較佳實施例中，該佐劑為水性氫氧化鋁膠。 【實施方式】 實施例一材料與方法 1.新城病病毒(NDV)凝血素·神經氨酸苷酶(hn)基因的選殖 將新城病病毒石井株(Isizi)的病毒RNA (viral RNA)以Trizol®萃取，萃 取的方法係按照其操作手冊進行(Life Technologies，USA)，萃取出之病毒 RNA係進行反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcripti〇n p〇iymerase也也

reaction，RT-PCR) ; RT-PCR 係使用 RT-PCR試劑套組(RT-PCR Reagent Kit,

Irwitr〇gen，USA)來進行，反應内容物包含：RT_PCRbuffer(最終反應濃度為 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KC1, 3mM MgC^) ' Superscript™ RNase

Η-Reverse Transcriptase、ImM dNTP、0·5 μΜ primer、2.5 U Taq DNA polymerase ’以及5 μΐ病毒RNA ;將上述50 μΐ混合物置於6(TC 5分鐘以 將RNA變性(denature)，42°C 45分鐘以合成cDNA，接著進行聚合酶連鎖 反應(polymerase chain reaction, PCR)進行擴增反應(amplification)以及定序 (sequencing)0 1324160 • 以PCR對HN蛋白的cDNA序列進行擴增反應，PCR所用之引子 (primers)序列如SEQ ID No: 1 (正向引子)及SEQ ID No: 2 (反向引子)所示， 係自其DNA序列設計而來(Genbank accession number Y18898 以及 Y19021) ; PCR反應條件為：94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C 1分鐘，共 40個#環，最後以70 C反應10分鐘以進行延伸反應(elongation) (Thermocycler，TaKaRa，Japan);擴增之產物以丨.5%瓊脂凝膠(agarose gei)電 泳分析’以溴化乙鍵(ethidium bromide，EtBr)染色後，置於紫外光下照射觀 •察。 PCR擴增所得之HN蛋白的cDNA序列如SEQIDNo: 3所示，以限制 酶I進行酶切後’將該cDNA片段選殖到PGEM-T-Easy載體(Invitrogen， USA)以开》成pGEM-T-Easy-HN質體(plasmid)(如圖1 (a)所示），其後再以 DNA 定序套組(Rhodamine Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit，

PE Applied Biosystems，USA)進行定序確認序列無誤；如序列表SEQ ID

NO : 3所示，經新城病病毒石井株選殖出的hn蛋白的CDNA序列，其中 轉譯區域(coding region)由1731個核苷酸所組成，將該轉譯區域命名為 HNc ’如圖1 (b)所示’經演譯(deduced)後得到具有577個胺基酸之HN蛋 白，其HN蛋白序列如SEQIDNO:4所示。 再將該pGEM-T-Easy-HN質體以限制酶I以及I進行酶切，將 HN基因之cDNA自該質體切下，如圖1 (b)所示，HN基因會被限制酶j/mi 切成三個片段，分別為第1至第3奶個鹼基對、第350個鹼基對至第793 個鹼基對、以及第794個鹼基對之後’將第794個鹼基對之後的基因片段

11 1324160 命名為HNs，HNs基因片段所編碼之蛋白質序列如SEQ ID NO: 5所示(其 開放讀碼框架(open reading frame, 〇rf)不變）；並以凝膠電泳將HNs基因片 段之DNA與其他基因片段和pGEM_T_Easy載體之DNA分離，再以膠體純 化套組(gel purification kit, Amersham Phamacia Biotech，USA)純化酶切後之 HNs基因片段之DNA，將該DNA選殖到表現載體pGEX-4T-3 (Amersham Phamacia Biotech, USA)之榖胱甘肽硫轉移酶(Glutathione S-transferase，GST) 基因序列之3端之後(GST基因序列如SEQ ID No: 6所示，其編碼之GST 籲胺基酸序列如SEQ ID No: 7所示），以形成pGEX-4T-3-HNs質體，如圖2 所示，pGEX-4T-3-HNs質體上具有GST-HNs重組融合蛋白之DNA序列(SEQ IDNo: 8)，並以DNA定序確認HNs基因片段之DNA已插入該表現載體； 再將上述接合後的pGEX-4T-3-HNs質體利用轉殖作用(transf〇rmati〇n)送入 大腸桿菌(五_ co" DH5c〇中。 2.新城病病毒HN重組融合蛋白的表現 將上述經轉殖作用而含有pGEX-4T-3-HNs質體之大腸桿菌DH5ct，以 含有100 pg/ml ampicillin之LB固體培養基於3rt下培養隔夜，挑選單一 菌落(a single colony)至 5 ml 含有 1〇〇 pg/mi ampicuiin 之 lb 液體培養基内， 於37°C下培養隔夜；取前述1 ml之隔夜培養液至50 ml含有1〇〇 μ§/πι1 ampicillin之LB液體培養基内，於37t下以12〇 φιη振盪培養4小時後， 再加入2mMIPTG以誘導HNs重組融合蛋白（即gsphns蛋白，其胺基酸 序列如SEQ ID No: 9所示)表現，加入2 mM IPTG後繼續培養2-4小時；每 隔1小時取一樣本，並進行去活性試驗。 12 1324160 3.新城病病毒HN重組融合蛋白的去活性(inactivation)試驗 將經過IPTG誘導4小時的轉殖pGEX-4T-3-HNs質體之大腸桿菌DH5a 進行去活性試驗，去活性試驗共分為三種處理方法：（a)熱處理；（b)福馬林 (formalin)處理；（c)抗生素kanamycin處理；熱處理係於6〇。(：水浴進行去活 性(inactivation) 15、30、45以及60分鐘，或於55t水浴進行去活性30分 鐘，福馬林處理之方法為使用0.128 %福馬林(Sigma, USA)於37°C下進行去 活性16小時；抗生素處理則是以200pgkanamycin於37°C下震盛1小時； Φ 去活性後’以SDS-PAGE檢驗蛋白質狀態，並取1〇〇 μι去活性之大腸桿菌 DH5a於LB固體培養基上培養，以檢驗剩餘活菌數(remaining仏此 bacteria)。 4.西方墨潰法 SDS-PAGE電泳分析之後，以西方墨潰法來決定蛋白質專一性(pr〇把出 specificity) ’首先’將蛋白質轉移到尼龍膜(Hyb〇nd_p，Amersham，驭)上，

鲁並以 1%小牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA，係由 i〇〇/0 BSA diluent/bloddng solution kit (KPL，USA)稀釋 1〇倍而來)填平(bl〇cking)該尼龍 膜上的空位，再以抗-新城病病毒Ishi株的兔血清(rabbit semm anti_Ishi strain NDV ’ 稀釋 2560 倍 ’ Ka〇hSiimgBi〇l〇gicalProductCo·，台灣)作為初級抗體 (primary antibody) ’並以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(HRp明站 anti-mbbit antibody，KPL，USA)作為次級抗體來偵測新城病病毒HN蛋白， 最後以ECL試劑（ECL reagent)反應，並偵測其化學螢光訊號 (chemi· luminescent signal)〇 13 1324160 s.疫苗抗原及疫苗的製備 將新城病病毒石井株接種至受精11天之雞胚胎中，脾化96小時後採 收該病毒’分析該病毒之50%胚胎感染劑量(50% embryonic infectivity dose, EIDSQ) ’然後將病毒以最終濃度為0.2。/。的福馬林(f〇rmaHn，Sigma，USA)去活 性，禽類傳染性鼻炎桿菌A型(Infectious coryza, IC-A)(即嗜血桿菌 «卿m，HP ’係為造成禽類傳染性鼻炎之病原菌)或家 禽霍亂桿菌(Fowl cholera，FC)(即巴斯德桿菌p嫌咖//α卿⑹洫，係為造 鲁成豕禽霍亂之病原菌)則以血清培養基(serum broth)培養18-20小時後採 收’並以0.2%福馬林去活性；疫苗中的活性成分分別為：1〇9.〇ει〇5〇新城病 病毒、lxlO9 CFU/ml (colony forming unit)的 IC-A、lxlO9 CFU/ml 的巴斯德 桿菌(P /m/toc油〇以及l(^g/mlHNs重組融合蛋白；並分別將上述各活性成 分與佐劑(adjuvant)--3〇%鋁膠或 Μ%雙相佐劑(water_in_〇il_in_water, w/〇/w) 混合製成疫苗。 ^ 6.雞隻免疫試驗設計1 共有3組試驗組及1組對照組，每組各包含5隻5週大無特定病原 _ (Specific-pathogen-free，SPF)雞隻；將3組試驗組之雞隻以肌肉内注射 (intramuscular injecti〇n，i.m.)分別接種1/2劑量(1邮的新城病病毒石井株、 (NDV+HNs重組融合蛋白）以及hns重組融合蛋白疫苗，對照組則未注射任 何疫田，所有雞隻進行為期2週的觀察，以確認是否有負面效果產生；接 種疫苗後1至4週内，以7天為-間隔，所有的雞隻皆進行採血，以測量

雞新城病之凝血抑制抗體效價(Hemagglutinin inhibition antibody titers, HI 1324160 titers) 〇 7·難隻免疫試驗設計2 共有3組式驗組及1組對照組，每試驗組各包含1〇隻5週大無特定病 原(SPF)雞t ’而對照組包含5隻5週大無特定病原(spF)雞隻；將3組試驗 組之雞隻以肌肉内注射(i.m.)分別接種1/2劑量（1 的_ν+ΐ(：)、 _V+IC+FC)以及勵重組融合蛋白)疫苗，對照組則未注射任 何疫苗；接種疫苗2週後，再以肌肉注射感染I· MLD (1〇3.75邮) 新城病病毒強毒株Sat。strain ;所有雞隻再進行為期2週的觀察，觀察新城 病的臨床症狀以及計算存活率，並於接種疫苗後丨週及2週時進行採血， 以測量雞新城病之凝血抑制抗體效價(如哪㈣也祕脇加减吻 titers) 〇 8.凝血抑制抗趙測試(Hemagglutinin inhibiti〇n antib〇dy ㈣ 在接種疫苗後每週收集血清樣本，將各樣本置於机去活化扣分鐘， 儲存於撕朗時進倾墻織_試：壯清樣本置於％孔V形盤 内進行連續2倍獅’再與4麵血單病毒混合並置 於抑3咖之後’加入1%雞紅血球以進行接續之培養並觀察各樣本 凝血狀H全抑制紅血球凝集之最高稀釋倍數的峨即為凝血抑制抗 15 (S > 1324160 實施例二新城病病毒HN重組融合蛋白的表現 HNs重組融合蛋白(GST-HNs)的分子量為60 4 ’包含26 的榖 胱甘肽硫轉移酶(Glutathione S-transferase，GST)以及 34.4 kDa 的 HNs 蛋白； • 以新城病病毒超免疫血清(NDV hyperimmune serum)進行西方墨潰法分析， -結果如圖3所示，圖3第2道箭頭標示處即為本發明招如重組融合蛋白， 其蛋白質大小經西方墨潰法分析後證實為60.4 kDa。 φ 經1PTG誘導之大腸桿菌(五.co// DH5a)的蛋白質表現量如圖4所示，圖 4⑷為陰性對照組(negative control)，係為經轉殖而含有表現載體pGEX_4T3 之大腸桿菌(五· co/z DH5a)的蛋白質表現量，不論有無IPTG誘導，在 SDS-PAGE上皆偵測不到HNs重組融合蛋白；圖4 (b)則為經轉殖而含有 pGEX-4T-3-HNs質體之大腸桿菌(五c〇" DH5a)的蛋白質表現量，經IpTG誘 導1.5小時後，在SDS-PAGE上可偵測到60.4kDa大小的HNs重組融合蛋 白(如圖4(b)第8道所示）’HNs重組融合蛋白的表現量隨著IPTG誘導時間 ^的增加(3小時)而增加(如圖4 (b)第9道所示），未經iptg誘導者，則皆偵 測不到HNs重組融合蛋白(如圖4 (b)第1〇_12道所示）。 實施例三新城病病毒！!]^重組融合蛋白的去活性試驗 在去活性試驗方面，以55_65〇C加熱後，汾^重組融合蛋白會被降解(如 圖5 (a)、（b)所示），以福馬林或kanamydn於37<>c下進行去活性反應16小 時後’則仍可在SDS-PAGE上看到清楚的HNs重組融合蛋白條帶(bands)(如 圖5(c)、表1所示)；因此，上: 以大腸桿菌表現之重經融合蛋白並 不建議 以加熱方式來進行去活性 表I不同去活性方法

去活性方法 剩餘活菌數 職重組融合蛋白條帶 ----- 0 蛋白嚴重降解 0 蛋白條帶消失 100 蛋白條帶清楚呈現 0 蛋白條帶清楚呈現 110 蛋白條帶清楚呈現 0 _青楚呈現 60°C>15 分鐘 65°C，15 分鐘 55 C，15分鐘 〇.128%福馬林，37°C，16小時 2〇〇Mgkanamycin，37。(：，1 小時 200μ§ kanamycin，37°C，16 小時 實施例四難隻免疫試驗1 所有的雞隻皆保持臨床上正常的狀態，且對疫苗沒有產生局部反應； 表2顯示施打NDV疫苗或HNs重組融合蛋白疫苗之雞隻的凝血抑制抗體 效價(HI titers) ’其中反應最高者來自接種NDV+HNs疫苗後2週之雞隹， 其凝血抑制抗體效價(HI titers)為1:194’明顯較其他組別的效價(12至ι ΐ6) 1324160 表2新城病疫苗效價測試 凝金抑制抗體效價(GMT)4 疫苗 雞隻數3 (接種後週數） 1週 2週 3週 4週 ND Lot 870' 5 4 16 11 7 ND+HNs2 5 2 194 97 32 HNs2 5 2 2 2 2 對照組 5 2 2 2 2

新城病死毒(inactivated)铭膠疫苗 含有10 pg/mlHNs重組融合蛋白 將5週大無特定病原(SPF)雞隻以肌肉内注射(i.m.)接種1/2劑量(1 mi)的疫 苗，每週採血並測量雞新城病之凝血抑制抗體效價 幾何平均抗體效價(Geometric Mean Titer, GMT) 實施例五雞隻免疫試驗2 表3所示為雞隻接種疫苗後的新城病病毒凝血抑制抗體效價(hj titers) 反應’以及接種1，000^11^)(10£1〇)新城病病毒強毒株|§&1；〇5113丨11後的存 活率；接種NDV+IC+HNs以及NDV+IC+FC (0/W/0)疫苗的雞隻，在接種 不同株(strain)新城病病毒之後，仍維持臨床上正常的狀態；而在接種 NDV+IC以及NDV+IC+FC (以鋁膠為佐劑者)疫苗的組別中，則分別有1隹 及2隻雞隻產生局部反應，所有未接種疫苗的對照組雞隻在接種新城病病 毒之後’則皆發病死亡，且具有強毒神經型新城病(VelogeniCND)的損宝症 1324160 狀；具有最高的凝血抑制抗體效價（HI titers)之雞隻群組為接種 NDV+IC+HNs疫苗者，接種該疫苗2週後，其凝血抑制抗體效價即(㈣ 為1:64，較其他組別的效價(I:24至1:42)高。 表3新城病多價疫苗效價測試 疫苗 佐劑雞隻數 凝血抑制抗體效價(GMT)6 (接種後週數） 鋁膠 ND+IC+HNs2 鋁膠 ND+ie+rc3 鋁膠 ND+IC+FC w/o/w4 對照組 無 ND+IC1 10 10 10 10 5 1週 2 2 2 4 2 2週 42 64 24 37 2 感染後 存活率1 90% 100% 80% 100% 0% 新城病死毒+禽類傳染性鼻炎(1C)死毒鋁膠合併疫苗 2含有lOpg/mlHNs重組融合蛋白 3新城病死毒+禽類傳染性鼻炎(1C)死毒+家禽霍亂(FC)死毒合併疫苗 水包油包水(water-in-oil-in-water)雙相佐劑 5將5週大無特定病原(SPF)雞隻以肌肉内注射(i.m.)接種1/z劑量(1吨的疫 苗，每週採血並測量雞新城病之凝血抑制抗體效價 6 幾何平均抗體效價(Geometric Mean Titer，GMT) strain 7接種疫苗2週後’感染1，000^0!)(1037生10)新城病病毒強毒株8站〇 由此可知’以原核生物表現之HNs重組融合蛋白疫苗可以保護雞隹免 於強毒神經型新城病的侵害。由上述實施例可知，本發明HNS重組融合蛋 19 1324160 白可以增進傳統全毒疫苗（包括活毒疫苗及死毒疫苗)以及多價疫苗(即新城 病病毒與其他禽類病毒合併之疫苗)的免疫效果。 本發明所長:供之禽類新城病病毒^)V)凝血素_神經氨酸苷酶(m)重組 融σ蛋白及3彼之疫邊，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點： 1. 由於元整的禽類新城病病毒表面抗原分子Ην蛋白表現困難，本發 明利用基因重組及轉殖技術，只取ΗΝ蛋白近c端之蛋白質片段的基因來 表現，不會有表現困難的問題產生。 2. 本發明之重組融合蛋白係以原核生物來大量生產，其製程簡便，產 量大，生產速度快，安全性高，成本低廉。 3. 本發明之重組融合蛋自可直接添加於傳統疫苗之基本配方中，即可 明顯提升免疫效果。 4·相對於傳統疫苗，含有本發明之重組融合蛋白的疫苗，其主要成份 沒有變動，對消費者而言沒有抗原改變而可能使免疫失敗的疑慮。 上列詳細說縣針對本發明之—可行實施例之具體說明，惟該實施例 並非用以限制本發明之專利翻，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實 施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。 π上所述’本案不但在方法上確屬麟，並能較制疫苗增進上述多 項功效，應已充錢合_性及進雜之法定發明專财件，絲法提出 申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。 20 1324160 【圖式簡單說明】 圖1 (a)為pGBM-T-Easy-HN質體構築圖；圖1 (b)為編碼hn蛋白之具 因結構示意圖。 圖2為pGEX-4T-3-HNs質體構築圖。 圖3為HNs重組融合蛋白(GST-HNs)西方墨潰法分析結果；第【道· 轉殖PGEX-4T-3載體之大腸桿菌DH5ot的蛋白質萃取物；第2道：轉殖 PGEX-4T-3-HNS質體之大腸桿菌DH5cx的蛋白質萃取物，箭頭標示處即為 ® 本發明HNs重組融合蛋白(60.4kDa);第3道：新城病病毒蛋白質萃取物。 圖4為以SDS-PAGE電泳後經coomassie blue染色分析大腸桿菌DH5a 的蛋白質表現量；圖4(a)為轉殖pGEX-4T-3載體之大腸桿菌DH5a的蛋白 質萃取物；第I·3道：分別經IPTG誘導〇、丨5、3小時；第道：無ιρτ〇 誘導；圖4(b)為轉殖pGEX-4T-3-HNs質體之大腸桿菌DH5a的蛋白質萃取 物；第7-9道：分別經IPTG誘導〇、L5、3小時，方框標示處即為本發明 HNs重組融合蛋白(6〇·4k〇a);第10-12道：無IPTG誘導。 • ® 5 M SDS_PAGE電泳後經eGGmassie Wue染色分析肠重組融合 蛋白去活性試驗之結果；圖5⑻第1-3道：分別為小牛血清蛋白(bsa⑽、 250、500 ，第4道.無IPTG誘導之轉殖質體的大腸桿 -菌DH5a的蛋白質萃取物；第5道：經腿誘導4小時之轉殖 PGEX-4T-3-HNS質體的大腸桿菌DH5a的蛋白質萃取物；第卜8道：分別 為以6〇C進订去活化3〇、45、6〇分鐘後之轉殖質體的大 腸才干菌DH5a的蛋白質萃取物；圖5(b)為轉殖腦質體之大腸 21 山 4160 桿菌DH5a的蛋白質萃取物；第1道：無IPTG誘導；第2道：經IPTG誘 導4小時；第3道：以65°C進行去活化15分鐘；圖5 (c)為轉殖pGEX-4T-3-HNs 質體之大腸桿菌DH5a的蛋白質萃取物；第1道：無IpTG誘導；第2-3道： 分別經IPTG誘導2、4小時；第4道：以6(TC進行去活化I5分鐘；第5 道.以55 C進行去活化3〇分鐘；第6-7道：分別以kanamycin於37°C下進 行去活性1、16小時；第8道：以福馬林(fomalin)於37。(：下進行去活性16 小時。 【主要元件符號說明】 無

22 1324160 序列表 <110〉高生製藥股份有限公司 <120〉禽類新城病病毒(NDV)凝血素_神經氨酸苷酶(HN)重組融合蛋白及含彼之疫苗 <160> 9 <210〉 1 <211> 28 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉

<223〉PCR 引子，ND-HN F’ <400〉 1 28

ATAAGCTTAT GGACCGCGCC GTTAGCCA <210〉 2 <211〉 29 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉PCR 5丨子，ND-HN R， <400> 2

ATATCTAGAA CGCGCCGGCA TTCGGTTTG 29

<210〉 3 <211〉 1894 <212> DNA <213〉新城病病毒（Newcastle disease virus, NDV) <400> 3

GGCCGCGGGA ATTCGATTAT ATGATGAAAG AGAGGCAAAA TAACAGTAGT GACCTTGGCT CACCTAGCGA TCTTGTAGGC

AAGCTTATGG ACCGCGCCGT AATACATGGC GCTTGATATT GTATCTGTAG CCTCCCTTTT ATACCGACTA GGATTTCCAG

TAGCCAAGTT GCGHAGAGA CCGGATTGCA ATCTTATTCT ATATAGCATG GGGGCTAGCA GGCAGAAGAA AAGATTACAT 60 120 180 240

1324160

CTACACTTGG TTCCAATCAA GATGTAGTAG ATAGGATATA TAAGCAAGTG GCCCTTGAGT CTCCGTTGGC ATTGTTAAAA ACTGAGACCA CAATTATGAA CGCAATAACA TCTCTCTCTT ATCAGATTAA TGGAGCTGCA AACAACAGTG GGTGGGGGGC ACCTATCCAT GACCCAGATT ATATAGGGGG GATAGGCAAA GAACTCATTG TAGATGATGC TAGTGATGTC ACATCATTCT ATCCCTCTGC ATTTCAAGAA CATCTGAATT TTATCCCGGC GCCTACTGCA GGATCAGGTT GCACTCGAAT ACCCTCATTT GACATGAGTG CTACCCATTA CTGCTACACC CATAATGTAA TATTGTCTGG ATGCAGAGGT CACTCACATT CATATCAGTA TTTAGCACTT GGTGTGCTCC GGACATCTGC AACAGGGAGG GTATTCTTTT CTACTCTGCG TTCCATCAAC CTGGACGACA CCCAAAATCG GAAGTCTTGC AGTGTGAGTG CAACTCCCCT GGGTTGTGAT ATGCTGTGCT CGAAAGTCAC GGAGACAGAG GAAGAAGATT ATAACTCAGC TGTCCCTACG CGGATGGTAC ATGGGAGGTT AGGGTTCGAC GGCCAGTACC ACGAAAAGGA CCTAGATGTC ACAACATTAT TCGGGGACTG GGTGGCCAAC TACCCAGGAG TAGGGGGTGG ATCTTTTATT GACAGCCGCG TATGGTTCTC AGTCTACGGA GGGTTAAAAC CCAATTCACC CAGTGACACT GTACAGGAAG GGAAATATGT GATATACAAG CGATACAATG ACACATGCCC AGATGAGCAA GACTACCAGA TTCGAATGGC CAAGTCTTCG TATAAGCCTG GACGGTTTGG TGGGAAACGC ATACAGCAGG CTATCTTATC TATCAAGGTG TCAACATCCT TAGGCGAAGA CCCGGTACTG ACTGTACCGC CCAACACAGT CACACTCATG GGGGCCGAAG GCAGAATTCT CACAGTAGGG ACATCTCATT TCTTGTATCA ACGAGGGTCA TCATACTTCT CTCCCGCGTT ATTATATCCT ATGACAGTCA GCAACAAAAC AGCCACTCTT CATAGTCCTT ATACATTCAA TGCCTTCACT CGGCCAGGTA GTATCCCTTG CCAGGCTTCA GCAAGATGCC CCAACCCGTG TGTTACTGGA GTCTATACAG ATCCATATCC CCTAATCTTC TATAGAAACC ACACCTTGCG AGGGGTATTC GGGACAATGC TTGATGGTGT ACAAGCAAGA CTTAACCCTG CGTCTGCAGT ATTCGATAGC ACATCCCGCA GTCGCATTAC TCGAGTGAGT TCAAGCAGTA CCAAAGCAGC ATACACAACA TCAACTTGTT TTAAAGTGGT CAAGACTAAT AAGACCTATT GTCTCAGCAT TGCTGAAATA TCTAATACTC TCTTCGGAGA ATTCAGAATC GTCCCGTTAC TAGTTGAGAT CCTCAAAGAT GACGGGGTTA GAGAAGCCAG GTCTGGCTAG 丁TGAGTCAAT TATAAAGGAG TTGGAAAGA丁 GGCATTGTAT CACCTATCTT CTGCGACATC AAGAATCAAA CCGAATGCCG GCGCGTTCTA GATATAATCA CTAGTGAATT CGCG

〈210〉 4 <211〉 577 <212〉 PTR <213〉新城病病毒（Newcastle disease virus, NDV) <400〉 4

Met Asp Arg Ala Val Ser Gin Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu 15 10 15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu lie Phe Arg lie Ala lie Leu Phe Leu 20 25 30

Thr Val Val Thr Leu Ala Val Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met 35 40 45 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1874 2 1324160

Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly He Pro Thr Arg lie Ser 50 55 60

Arg Ala Glu Glu Lys lie Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gin Asp Val 65 70 75 80

Val Asp Arg lie Tyr Lys Gin Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu 85 90 95

Leu Lys Thr Glu Thr Thr lie Met Asn Ala He Thr Ser Leu Ser Tyr 100 105 110

Gin lie Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro lie His 115 120 125

Asp Pro Asp Tyr He Gly Gly He Gly Lys Glu Leu He Val Asp Asp 130 135 140

Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gin Glu His Leu 145 150 155 160

Asn Phe He Pro Ala Pro Thr Ala Gly Ser Gly Cys Thr Arg lie Pro 165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val lie 180 185 190

Leu Ser Gly Cys Arg Gly His Ser His Ser Tyr Gin Tyr Leu Ala Leu 195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu 210 215 220

Arg Ser lie Asn Leu Asp Asp Thr Gin Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val 225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu 245 250 255

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His 260 265 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gin Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val 275 280 285

Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly 290 295 300

Gly Ser Phe lie Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu 305 310 315 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gin Glu Gly Lys Tyr Val lie 325 330 335

Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gin Asp Tyr Gin He 340 345 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg 355 360 365 lie Gin Gin Ala lie Leu Ser lie Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu 370 375 380 1324160

Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala 385 390 395 400

Glu Gly Arg lie Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gin Arg 405 410 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser 420 425 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr 435 440 445

Arg Pro Gly Ser lie Pro Cys Gin Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Pro 450 455 460

Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu lie Phe Tyr Arg 465 470 475 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gin 485 490 495

Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser 500 505 510

Arg He Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr 515 520 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser 530 535 540 lie Ala Glu lie Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg lie Val Pro 545 550 555 560

Leu Leu Val Glu He Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser 565 570 575

Gly 577 <210〉 5 <211> 312 <212> PTR <213〉新城病病毒（Newcastle disease virus, NDV) <400〉 5

Val Pro Thr Arg Met Val His Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gin Tyr 1 5 10 15

His Glu Lys Asp Leu Asp Val Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala 20 25 30

Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly Gly Ser Phe lie Asp Ser Arg Val Trp 35 40 45

Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val 50 55 60 1324160

Gin Glu Gly Lys Tyr Val lie Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro 65 70 75 80

Asp Glu Gin Asp Tyr Gin He Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro 85 90 95

Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg lie Gin Gin Ala lie Leu Ser lie Lys 100 105 110

Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn 115 120 125

Thr Val Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg lie Leu Thr Val Gly Thr 130 135 140

Ser His Phe Leu Tyr Gin Arg Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu 145 150 155 160

Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro 165 170 175

Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr Arg Pro Gly Ser lie Pro Cys Gin Ala 180 185 190

Ser Ala Arg Cys Pro Asn Pro Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro 195 200 205

Tyr Pro Leu lie Phe Tyr Arg Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly 210 215 220

Thr Met Leu Asp Gly Val Gin Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser Arg lie Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser 245 250 255

Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr 260 265 270

Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser lie Ala Glu lie Ser Asn Thr Leu Phe 275 280 285

Gly Glu Phe Arg He Val Pro Leu Leu Val Glu lie Leu Lys Asp Asp 290 295 300

Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser Gly 305 310 312

<210〉 6 <211> 688 〈212〉 DNA <2\y> B 本h·吸备^Schistosoma japonicuni) 〈400〉 6 60

ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120 5 1324160 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180 GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240 ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAMG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360 GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420 ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480 GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTMA 540 AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660 CTGGTTCCGC GTGGATCCCC GAATTCCC 688

<210> 7 <211> 229 <212> PTR <213〉Q 豕缸吸备（Schistosoma japonicum) <400〉 7

Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro 15 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60

Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr He Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu 85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser 100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala He Pro Gin lie Asp Lys Tyr 180 185 190

(S 6 1324160

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220

Gly Ser Pro Asn Ser 225 229 <210〉 8 <211〉 1789 <212〉 DNA <213〉融合 DNA (fusion DNA) <400> 8

ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 60 TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180 GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240 ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360 GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420 ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480 GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660 CTGGTTCCGC GTGGATCCCC GAATTCCCCT GTCCCTACGC GGATGGTACA TGGGAGGTTA 720 GGGTTCGACG GCCAGTACCA CGAAAAGGAC CTAGATGTCA CAACATTATT CGGGGACTGG 780 GTGGCCAACT ACCCAGGAGT AGGGGGTGGA TCTTTTATTG ACAGCCGCGT ATGGTTCTCA 840 GTCTACGGAG GGTTAAAACC CAATTCACCC AGTGACACTG TACAGGAAGG GAAATATGTG 900 ATATACAAGC GATACAATGA CACATGCCCA GATGAGCAAG ACTACCAGAT TCGAATGGCC 960 AAGTCTTCGT ATAAGCCTGG ACGGTTTGGT GGGAAACGCA TACAGCAGGC TATCTTATCT 1020 ATCAAGGTGT CAACATCCTT AGGCGAAGAC CCGGTACTGA CTGTACCGCC CAACACAGTC 1080 ACACTCATGG GGGCCGAAGG CAGAATTCTC ACAGTAGGGA CATCTCATTT CTTGTATCAA 1140 CGAGGGTCAT CATACTTCTC TCCCGCGTTA TTATATCCTA TGACAGTCAG CAACAAAACA 1200 GCCACTCTTC ATAGTCCTTA TACATTCAAT GCCTTCACTC GGCCAGGTAG TATCCCTTGC 1260 CAGGCTTCAG CAAGATGCCC CAACCCGTGT GTTACTGGAG TCTATACAGA TCCATATCCC 1320 CTAATCTTCT ATAGAAACCA CACCTTGCGA GGGGTATTCG GGACAATGCT TGATGGTGTA 1380 CAAGCAAGAC TTAACCCTGC GTCTGCAGTA TTCGATAGCA CATCCCGCAG TCGCATTACT 1440 CGAGTGAGTT CAAGCAGTAC CAAAGCAGCA TACACAACAT CAACTTGTTT TAAAGTGGTC 1500 AAGACTAATA AGACCTATTG TCTCAGCATT GCTGAAATAT CTAATACTCT CTTCGGAGAA 1560 TTCAGAATCG TCCCGTTACT AGTTGAGATC CTCAAAGATG ACGGGGTTAG AGAAGCCAGG 1620 TCTGGCTAGT TGAGTCAATT ATAAAGGAGT TGGAAAGATG GCATTGTATC ACCTATCTTC 1680 TGCGACATCA AGMTCAAAC CGAATGCCGG CGCGTTCTAG ATATAATCAC TAGTGAATTC 1740

7 1324160 1789

GCGGCCGCCT GCAGGTCGAC CATATGGGAG AGCTCCCAAC GCGTGGAGC

<210〉 9 <211〉 542 <212〉 PRT <213〉融合蛋白（fusion protein) <400〉 9

Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro 15 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60

Leu Thr Gin Ser Met Ala He He Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu 85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp He Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser 100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg He Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr 180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220

Gly Ser Pro Asn Ser Pro Val Pro Thr Arg Met Val His Gly Arg Leu 225 230 235 240

Gly Phe Asp Gly Gin Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val Thr Thr Leu 245 250 255 8 1324160

Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly Gly Ser Phe 260 265 270 lie Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu Lys Pro Asn 275 280 285

Ser Pro Ser Asp Thr Val Gin Glu Gly Lys Tyr Val lie Tyr Lys Arg 290 295 300

Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gin Asp Tyr Gin lie Arg Met Ala 305 310 315 320

Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg lie Gin Gin 325 330 335

Ala lie Leu Ser lie Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu Asp Pro Val 340 345 350

Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg 355 360 365

lie Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gin Arg Gly Ser Ser 370 375 380

Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser Asn Lys Thr 385 390 395 400

Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr Arg Pro Gly 405 410 415

Ser lie Pro Cys Gin Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Pro Cys Val Thr 420 425 430

Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu lie Phe Tyr Arg Asn His Thr 435 440 445

Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gin Ala Arg Leu 450 455 460

Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser Arg lie Thr 465 470 475 480

Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys 485 490 495

Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser lie Ala Glu 500 505 510 lie Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg lie Val Pro Leu Leu Val 515 520 525

Glu He Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser Gly 530 535 540 542

Claims (1)

1. 修例((日修正替换頁I 十、申請專利範圍： 一種禽類新城病病毒凝血素、神經氨酸苦酶 (haemaggiutinin_neuraminidase，HN)重組融合蛋白，係由—穀脱甘狀硫轉 0S|(Glutathione S-transferase, 氨酸苷酶(HN)蛋白片段所組成， 其中該禽類新城病病毒凝血素-神經氨酸苷酶(HN)蛋白係具有如 SEQ K) No: 5所示之胺基酸序列。 2‘如申請專利範圍第1項所述之禽類新城病病毒凝血素神經氨酸普酶_ 重級融合蛋白，其中該重組融合蛋白係具有如SEQidn。:9所示之胺基 酸序列。 如申。月專利範圍第1項所述之禽類新城病病毒凝血素神經氨酸苦酶(聊 重組融合蛋白’其中該穀胱甘肽硫轉移酶(GST)係具有如seqidn〇:7 所示之胺基酸序列。 4·如申請專利範圍第1項所述之禽類新城病病毒凝血素_神經氨酸鶴_ 重、.且融5蛋自’其係為將禽類新城病病毒凝血素神經氨酸#^(hn)蛋白 片段之基因選_含有穀胱錄硫轉移酶(GST)基因之表現載體中形 成3有•又胱甘肽硫轉移酶(GST)-凝血素-神經氨酸普酶(HN)蛋白片段之 基因序列的載體，再將該載體經轉殖到原核生物後大量表現而得之重組 融合蛋白。 5.如申請專纖圍第4項所述之禽輯城病赫凝血素神練㈣酶剛 重組融合蛋自’其巾該含有穀胱魏铺輔(gst)基因之表現載體包 Ί 日修正替換裒i 含pGEX載體系統以及pET載體系統等。 6. 如申明專利乾圍第4項所述之禽類新城病病毒凝血素神經氨酸_(_ 重組齡蛋白，其中該原核生物包含大腸桿菌(Escherichi_以及沙門 氏桿囷(Salmonella)等。 7. 一種含有禽__病毒凝蛛神經氨_酶_重綠合蛋白之疫 苗，包括如申請專利範圍第！項所述之禽類新城病病毒凝血素-神經氨酸 重组融合蛋白，禽類新城病病毒，以及適當之載劑或佐劑。 8. 如申請專纖Μ 7斯述之含錢_麵赫耻素_神經氨酸苦 酶_)重組融合蛋白之疫苗，其令該禽類新城病病毒凝血素 -神經氨酸苷 酶(ΗΝ)重組融合蛋白係經去活性反應處理。 9. 如申請專利範圍第8項所述之含有禽類新城病病毒凝血素神經氨酸苦 酶_重組融合蛋白之疫苗，射該去活性反應係為以福馬林如_ 或抗生素kanamyci晴3rc下進行反應16小時。 K)·如申請專職_ 7項所述之含有禽_顧縣凝血素♦經氨酸皆 酶_重_輪姻，㈣_城瓣 腸道型之新城病病毒株的活病毒。 .，、、毋 U.如申請專利顧第7項所述之含有翻職病騎凝血素 __祕合蛋白之疫苗，其巾騎_城病錢麵經去活性反; 處理之強毒性或中間毒性之新城病病毒株。 Π.如申請專·_ 7項所述之含錢崎_病毒凝 酶(離㈣如嫩，其恤輪⑽化轉，· 1324160 昨调(丨日敍Si F_d氏不完全佐劑，油狀佐劑，水溶性佐劑，劑 (water-in-oil-in-water，W/0/W)。 13. -種含有禽麵城病病毒凝血素·神經紐鶴(陶重錄合蛋白之疫 苗’包括如申請專利範圍第i項所述之禽類新城病病毒凝血素神經氨酸 普酶_)重組融合蛋白，禽類新城病病毒，—種以上之其他禽類病原 菌，以及適當之载劑或佐劑。 14. 如申請專利範圍第u項所述之含有禽_城病病毒凝▲素神經氨酸苦 酶_重組融合蛋白之疫苗，其中該禽類新城病病毒凝血素神經氛酸苦 酶(HN)重組融合蛋白係經去活性反應處理。 •如申請專利範圍第14項所述之含有禽類新城病絲凝血素神經氨酸苦 酶剛重組融合蛋白之疫苗，其中該去活性反應係為以福馬林(f_麵 或抗生素kanamycin於37°C下進行反應16小時。 他如申請專利麵第B補叙含轴_城病病錢血素神經氨_ 酶_重組融合蛋白之疫苗，其中該禽類新城病病毒係為弱毒型或無毒 腸道型之新城病病毒株的活病毒。 Π.如申請專利細第13 _述之含有禽_城病病錢血素神經氨㈣ 酶_重組融合蛋白之疫苗，其中該禽類新城病病毒係為經去活性反應 處理之強毒性或中間毒性之新城病病毒株。 i8·如申請專利細第Π補述之含麵類新翻絲凝岭神經氨酸皆 酶_重組融合蛋白之疫苗，其中該其他禽類病原菌包含禽類傳染性鼻 炎桿菌⑽ecti⑽coryza，IC)，家禽霍亂桿菌(F〇wi咖 3 1324160 ;._____ ^ — _.··_··—-—-— 支氣管炎病毒(Infectious bronchitis, IB)，禽類產卵下降症病毒(Egg dr〇p syndrome，EDS)，以及傳染性華氏囊病毒(infectiousbursaldisease，IBD)。 19.如申請專利範圍第13項所述之含有禽類峨病病毒凝血素_神經氨酸苦 酶_重組融合蛋白之疫苗，其中該佐劑為水性氮氧化_ n Freund氏《全_ ’綠_ ’水雜㈣，或水包油包水雙相佐劑 (water-in-oil-in-water5 W/0/W) 〇 4