BR112019019117A2

BR112019019117A2 - métodos e composições para induzir respostas imunes contra clostridium difficile

Info

Publication number: BR112019019117A2
Application number: BR112019019117A
Authority: BR
Inventors: Flyer David; Smith Gale; Glenn Gregory; tian Jing-hui; Liu Ye
Original assignee: Novavax Inc
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2020-05-05
Also published as: MX2019010948A; JP7397145B2; CN110691609A; CN110691609B; WO2018170238A3; US11123419B2; KR20190125470A; JP2020509770A; JP2022179543A; KR102640722B1; AU2018236352B2; SG11201908376UA; US11938179B2; AU2018236352A1; JP7149285B2; RU2019132111A3; IL269258B2; CA3056090A1; IL269258B1; EP3595709A4

Abstract

no presente documento são revelados métodos e composições para o tratamento ou prevenção de infecção bacteriana. em particular, os métodos e composições são direcionados para a infecção por c. difficile. em aspectos particulares, as composições são vacinas contendo polipeptídeos multiméricos contendo porções de múltiplas toxinas de bactérias. os polipeptídeos induzem respostas imunes eficazes, tratando ou prevenindo assim infecções.

Description

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INDUZIR RESPOSTAS IMUNES CONTRA CLOSTRIDIUM DIFFICILE”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADAS [0001] Este pedido reivindica prioridade aos Pedidos Provisórios n² 62/471.636, depositado em 15 de março de 2017 e 62/474. 434, depositado em 21 de março de 2017, cujas revelações estão aqui incorporadas para todos os fins.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO ENVIADO ELETRONICAMENTE [0002] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente com este documento está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade: uma cópia em formato legível por computador da Lista de Sequências (nome do arquivo: NOVV_058_02WO_SeqList_ST25, data registrada: 13 de março de 2018, tamanho do arquivo 187 kilobytes).

ANTECEDENTES [0003] A vacinação contra doenças com o uso de uma vacina à base de subunidades depende da produção de quantidades suficientes do antígeno proteico e da manutenção da estabilidade do antígeno, de modo que a proteína permaneça eficaz quando administrada a uma população-alvo.

[0004] As complicações na produção de vacinas de subunidade surgem em várias etapas durante a produção. A proteína-alvo pode ser produzida em níveis baixos ou pode ser insolúvel, resultando em produção economicamente desfavorável, mesmo quando a proteína tinha perfil de imunogenicidade particularmente favorável.

[0005] As infecções bacterianas continuam sendo um problema de saúde. De fato, as vacinas bacterianas são cada vez mais procuradas, à medida que as bactérias desenvolvem resistência aos antibióticos da linha de frente. As vacinas de subunidades bacterianas dependem da produção de proteínas recombinantes. No entanto, as proteínas

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2/46 bacterianas costumam ser difíceis de produzir em alto nível devido à baixa expressão e insolubilidade, e também podem sofrer de estabilidade reduzida. Melhores abordagens para a produção de vacinas, particularmente para alvos difíceis de antígenos, proporcionariam, portanto, benefícios à saúde global. Em particular, a infecção por bactérias clostridiais, notadamente C. difficile, continua sendo um problema particular. A infecção por Clostridium difficile (CDI) é a principal causa de diarréia hospitalar associada a antibióticos nos países desenvolvidos. As cepas hipervirulentas evoluíram causando doenças graves com aumento da mortalidade. As toxinas de glicosilação homólogas, TcdA e TcdB, e a toxina binária de ADP-ribosilação (CDT) são os principais fatores de virulência que causam patogênese. Há uma necessidade não atendida de vacinas direcionadas a essas toxinas.

SUMARIO DA INVENÇÃO [0006] São revelados aqui métodos e composições de indução de respostas imunes contra C. difficile. As composições contêm polipeptídeos contendo múltiplas toxinas de C. difficile que, quando administradas a um indivíduo, induzem respostas imunes vantajosas. Métodos para produzir os polipeptídeos multi-toxinas também são revelados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0007] Figura 1. Construtos vacinais de toxina tripla de C. difficile. A Figura mostra a ilustração da vacina de toxina tripla C. diff contendo os domínios de ligação de CDTb, Ted B e Ted A com (construto 1420) e sem (construto 1470) um sítio de divagem de furina após o domínio de ativação de CDTb.

[0008] Figura 2. Expressão e solubilidade da vacina de toxina tripla BV1470 e BV1420. As células de inseto Spodoptera frugiperda Sf9 foram infectadas em um MOI de 0,1 com baculovírus recombinante BV1420 e BV1470, coletadas 48 e 72 horas após a infecção e analisadas quanto à expressão de proteínas por SDS-PAGE e manchamento por coomassie. Um volume igual de proteína total (T, células e meio) e meio

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3/46 clarificado (M) foram misturados com tampão de amostra 2X SDS-PAGE e corridos com um gel NuPage de poliacrilamida a 4% a 12%. As células infectadas em pelotas foram solubilizadas em tampão NP9 a 1%, Tris 25 mM, NaCL 50 mM, pH 8,0. As células lisadas foram centrifugadas a 9000 x g durante 40 min. O sobrenadante (S, solúvel) foi removido, o sedimento (I, insolúvel) foi suspenso em tampão até o volume original e analisado por SDSPAGE como descrito acima. Localização da proteína da toxina tripla marcada com uma seta.

[0009] Figura 3. Expressão do curso do tempo da vacina de toxina tripla BV1470 e BV1420. As células de inseto Spodoptera frugiperda Sf9 foram infectadas com baculovírus recombinante BV1420 e BV1470, conforme descrito na Figura 6. A proteína total, o meio, a proteína solúvel e a insolúvel foram analisadas por SDS-PAGE e manchamento com coomassie em vários pontos no tempo após a infecção. A localização da proteína da toxina tripla está marcada com uma seta.

[0010] Figura 4. Purificação da vacina de toxina tripla.

A vacina de toxina tripla foi purificada a partir da cultura celular total de células Sf9 infectadas após a adição de NP9 a uma concentração final de 0,2%. O extrato de N P9 foi clarificado duas vezes e purificado em colunas consecutivas Fractogel EMD TMAE, Phenyl HP e Source 30Q. A toxina tripla foi eluída de cada coluna e carregada na coluna seguinte, como mostrado. As frações positivas de toxina tripla eluída da coluna Source 30Q foram reunidas e esterilizadas por filtro através de um filtro de 0,2 μΜ.

[0011] Figura 5. Purificação da vacina de toxina tripla BV1470 a partir de células Sf9. A vacina de toxina tripla BV1470 foi purificada a partir de células infectadas, como descrito na Figura 8. O produto filtrado final da coluna Source 30Q foi analisado quanto à pureza por SDS-PAGE e manchamento por coomassie. A proteína da toxina tripla foi identificada por western blot usando anticorpos anti-CDTb, anti-TcdB e antiTcdA.

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4/46 [0012] Figura 6. Purificação da vacina de toxina tripla BV1420 a partir de células Sf9. A vacina de toxina tripla BV1420 foi purificada a partir de células infectadas como descrito na Figura 8. O produto filtrado final da coluna Source 30Q foi analisado quanto à pureza por SDS-PAGE e manchamento por coomassie. A proteína da toxina tripla foi identificada por western blot usando anticorpos anti-TcdB.

[0013] Figura 7. Gráfico de distribuição do tamanho de partículas por volume para a toxina tripla BV1420. O tamanho de partícula da toxina tripla BV1420 foi determinado por espalhamento dinâmico de luz com o uso de um Zeta Sizer Nano. O gráfico da distribuição de tamanho por volume é mostrado.

[0014] Figura 8. Distribuição do tamanho de partículas por gráfico de intensidade da toxina tripla BV1470. O tamanho de partícula da toxina tripla BV1420 foi determinado por espalhamento dinâmico de luz com o uso de um Zeta Sizer Nano. O gráfico da distribuição do tamanho por intensidade é mostrado.

[0015] Figuras 9A-9D. Eletromicrografias da toxina tripla corada negativa BV1420. A micrografia eletrônica da toxina tripla purificada BV1420 foi diluída para aproximadamente 10 ug/ml e corada negativamente com acetato de uranil.

[0016] Figura 10. Estudo de desafio com toxina letal para camundongos com vacina de toxina tripla BV1420 1. Os camundongos foram imunizados no dia zero e no dia 14 com a vacina de toxina tripla BV1420 e desafiados no dia 35 com uma dose letal de Ted A ou CDT e monitorados por 10 dias após o desafio. Os camundongos foram sangrados como mostrado e o soro analisado quanto a IgG anti-toxina e a anticorpos neutralizantes de toxina. Os animais foram monitorados quanto à mortalidade e morbidade por 10 dias após o desafio com toxinas.

[0017] Figura 11. Estudo de desafio à toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 1 - respostas séricas

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5/46 anti-toxina IgG. As amostras de soro do dia 42 foram analisadas quanto às titulações de IgG anti-Tcd A, anti-Tcd B e anti-CDT por ELISA usando toxinas nativas ligadas a placas.

[0018] Figura 12. Estudo de desafio à toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 1 - titulações de anticorpos neutralizantes de toxinas (TNA). As titulações de neutralização da toxina foram determinadas com o uso de um ensaio à base de células Vero colorimétricas. As titulações indicadas são aquelas recíprocas da maior diluição de soro que não mata células.

[0019] Figura 13. Estudo de desafio da toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 1 - sobrevivência animal. A sobrevivência dos animais foi determinada 10 dias após o desafio. Os animais que apresentaram perda de peso superior a 20% foram sacrificados e registrados como mortos.

[0020] Figura 14. Estudo de desafio com toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 2 - sobrevida da toxina B. Os camundongos foram imunizados no dia zero e no dia 14 com a vacina de toxina tripla BV1420 e desafiados no dia 35 com uma dose letal de Ted B e monitorados por 10 dias após o desafio. Os camundongos foram sangrados como mostrado e o soro analisado quanto a IgG anti-toxina e a anticorpos neutralizantes de toxina (TNA). Os animais foram monitorados quanto à mortalidade e morbidade por 10 dias após o desafio com toxinas.

[0021] Figura 15. Estudo 2 do desafio da toxina letal de camundongo de vacina de toxina tripla BV1420 2 - níveis de IgG antitoxina. As amostras de soro do dia 42 foram analisadas quanto às titulações de IgG anti-Tcd A, anti-Tcd B e anti-CDT por ELISA usando toxinas nativas ligadas a placas.

[0022] Figura 16. Estudo de desafio com toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 2 - titulações de TNA para toxina B. As titulações de neutralização da toxina foram determinadas

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6/46 utilizando um ensaio à base de células Vero métricas colori. As titulações indicadas são aquelas recíprocas da maior diluição de soro que não mata células.

[0023] Figura 17. Estudo de desafio com toxina letal de camundongo com vacina de toxina tripla BV1420 2 - sobrevida da toxina B. A sobrevivência dos animais foi determinada 10 dias após o desafio. Os animais que apresentaram perda de peso superior a 20% foram sacrificados e registrados como mortos.

[0024] Figura 18. Proteínas de vacina adicionais com o domínio de translocação do gene TcdB são mostradas. O BV1512 é mostrado no diagrama inferior.

[0025] Figura 19. Expressão de proteínas multiméricas: análise de expressão e western blot da proteína multimérica BV1512.

[0026] Figura 20. Expressão de proteínas multiméricas quadrivalentes: a Figura 25 ilustra duas proteínas multiméricas quadrivalentes. Em ambos os casos, um peptídeo de uma segunda cepa TcdB é introduzido para ampliar a imunidade contra múltiplas cepas. No diagrama superior, o peptídeo TcdB da linhagem 027 é adicionado no terminal C. No diagrama inferior, o peptídeo é introduzido entre a proteína TcdB e a proteína TcdA (R19) da primeira cepa, cepa 630.

[0027] Figura 21. Expressão quadrivalente de proteínas multimídia: Análise de expressão e western blot da proteína quadrivalente mostrada no diagrama superior da Figura 20.

[0028] Figura 22. Expressão quadrivalente de proteínas multimídia: Análise de expressão e western blot da proteína quadrivalente mostrada no diagrama inferior da Figura 20.

[0029] Figura 23. Toxinas C. difficile e Design de Proteínas de Fusão Químicas Trivalentes (T) e Quadravalentes (Q). A Figura 23A mostra a ilustração dos domínios funcionais da toxina C. difficile A

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7/46 (TcdA), toxina B (TcdB) e toxina binária (CDT) usada para construir as proteínas de fusão quiméricas trivalentes e quadravalentes quiméricas. TcdA e TcdB compartilham domínios funcionais comuns, incluindo o domínio enzima glucosiltransferase (GT), domínio autocatalítico de cisteína protease (CP), domínio de translocação de formação de poros (PT) (laranja) e domínio de ligação a receptores (RBD). A toxina binária (CDT) consiste no componente enzimático da ADP- ribosiltransferase (CDTa) e no componente de ligação ao receptor (CDTb). O CDTb contém uma sequência de sinal de 42 aminoácidos (aa) com dois sítios de divagem proteolítica do tipo serina (seta) que, quando clivados, geram um fragmento de 20 kDa e 75 kDa. A Figura 24B mostra a ilustração da proteína de fusão de toxina trivalente quimérica (toxina T) e uma proteína de fusão de toxina quadravalente quimérica (toxina Q). A proteína de fusão da toxina T consiste na sequência de codificação completa para CDTb com o RBD de TcdB (oo3) contendo 24 repetições e o RBD truncado de TcdA com 19 repetições. A proteína de fusão da toxina T expressa consiste em 1813 aa com um peso molecular (MW) de 205 kDa. A proteína de fusão da toxina Q consiste na sequência de codificação completa para CDTb para o RBD de TcdB (003) contendo 24 repetições, o RBD de TcdA truncado em 19 repetições e o RBD de TcdB (027) contendo 24 repetições. A proteína de fusão da toxina Q expressa consiste em 2359 aa com um peso molecular de 268 kDa.

[0030] Figuras 24A-24C. Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão de T-Toxina e Q-Toxina. A SDS-PAGE da toxina T purificada (pistas 2 e 3) migra com um peso molecular de 205 kDa e a toxina Q (pistas 4 e 5) migra com um peso molecular de 268 kDa. Marcador de peso molecular (faixa 1). A Figura 24A mostra que a pureza da toxina T e Q-toxina foi> 90%, conforme determinado pela densitometria de varredura por SDSPAGE. A Figura 24B mostra a análise de transferência de Western como sondada com anticorpos específicos de coelho anti-CDTb. A Figura 24C mostra a análise de western blot como sondada com anticorpos específicos de frango

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8/46 anti-TcdB. A Figura 24D mostra a análise de transferência de Western como sondada com anticorpos específicos para anti-TcdA de galinha.

[0031] Figuras 25A-25C. Imunogenicidade das proteínas de fusão T-toxina e Q-toxina em camundongos. Grupos de camundongos C57BL/6 fêmeas (N = 10/grupo) foram imunizados IM nos dias 0 e 14 com toxina T (100 pg) ou Q-toxina (100 pg) adjuvada com alúmen (50 pg) ou PBS (controle grupo). O soro foi coletado 18 dias após a segunda vacinação. A Figura 25A mostra as titulações séricas de IgG para TcdA, TcdB (003) e CDTb determinados por ELISA. A Figura 25B mostra titulações de anticorpos neutralizantes de toxinas para cada toxina determinada no ensaio de células Vero. Na Figura 25C, os camundongos receberam uma dose letal (MLD 100% = 2,0 pg) de TcdB (oo3) administrada IP 21 dias após a segunda imunização. * A significância foi determinada pelo teste log-rank de Mantel-Cox comparando os grupos toxina T ou toxina Q com o grupo controle PBS.

[0032] Figuras 26A-26D. Imunogenicidade das proteínas de fusão T-toxina e Q-toxina em hamsters. Os hamsters machos (N = 8/grupo) foram imunizados IM três vezes em intervalos de 21 dias com 30 pg de toxina Q adjuvante com 120 pg de alúmen ou PBS (grupo controle). Duas semanas após a terceira dose, as amostras foram coletadas e analisadas. A Figura 26A mostra as titulações séricas de IgG para TcdA, TcdB (003) e CDTb determinados por ELISA. A Figura 26B mostra titulações de anticorpos neutralizantes de toxinas para cada toxina determinada no ensaio de células Vero. Nas Figuras 26C e 26D, duas semanas após a terceira imunização, todos os animais foram tratados com clindamicina (10 mg/kg) IP um dia antes do desafio de esporos e foram desafiados por gavagem com 200 cfu de C. difficile cepa 630 (C) ou com 500 ufc de C. difficile cepa B1/NAP1/027 (D). Os animais foram observados por 8 dias após o desafio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

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9/46 [0033] Como usado aqui, o termo “adjuvante” se refere a um composto que, quando usado em combinação com um imunogênio, aumenta ou altera ou modifica a resposta imune induzida contra o imunogênio. A modificação da resposta imune pode incluir intensificação ou ampliação da especificidade de uma ou de ambas as respostas imunológicas e de anticorpos.

[0034] Conforme usado aqui, os termos “imunogênio”, “antígeno” e “epítopo” são usados de forma intercambiável e se referem a substâncias como proteínas e peptídeos que são capazes de provocar uma resposta imune.

[0035] Como usado aqui, o termo “proteína de fusão” significa uma proteína composta de duas ou mais proteínas ou fragmentos de proteína que são unidos ou fundidos, direta ou indiretamente por meio de um peptídeo de ligação, no terminal amino de uma proteína e no terminal carboxi de outra proteína, para formar um único polipeptídeo contínuo. Em alguns aspectos, uma proteína de fusão pode ser referida como uma “proteína multivalente”. Uma proteína multivalente contém proteínas ou fragmentos de proteína de dois ou mais três antígenos de proteína discretos que são fundidos.

[0036] Os termos “tratar”, “tratamento” e “que trata”, conforme aqui usados, se referem a uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, por exemplo, resultados clínicos. Para os fins desta invenção, os resultados benéficos ou desejados podem incluir inibir ou suprimir a iniciação ou progressão de uma infecção ou doença; melhorar ou reduzir o desenvolvimento de sintomas de uma infecção ou doença; ou uma combinação dos mesmos.

[0037] “Prevenção”, como usado aqui, é usado de forma intercambiável com “profilaxia” e pode significar prevenção completa de uma infecção ou doença ou prevenção do desenvolvimento de sintomas dessa infecção ou doença; um atraso no início de uma infecção ou doença ou seus

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10/46 sintomas; ou uma diminuição na gravidade de uma infecção ou doença desenvolvida posteriormente ou seus sintomas.

[0038] Como aqui utilizado, uma “dose eficaz” ou “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade de um imunogênio suficiente para induzir uma resposta imune que reduz pelo menos um sintoma da malária. Uma dose ou quantidade eficaz pode ser determinada, por exemplo, medindo quantidades de anticorpos neutralizantes e/ou séricos neutralizantes, por exemplo, por neutralização da placa, fixação de complemento, imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou ensaio de microneutralização.

[0039] Como usado aqui, o termo “vacina” se refere a uma preparação que inclui um imunogênio (por exemplo, uma proteína de fusão aqui descrita) derivado de um patógeno, que é usado para induzir uma resposta imune contra o patógeno que fornece imunidade protetora (por exemplo, imunidade que protege um indivíduo contra a infecção pelo patógeno e/ou reduz a gravidade da doença ou condição causada pela infecção pelo patógeno). A resposta imune protetora pode incluir a formação de anticorpos e/ou uma resposta mediada por células. Dependendo do contexto, o termo “vacina” também pode se referir a uma suspensão ou solução de um imunogênio que é administrado a um vertebrado para produzir imunidade protetora.

[0040] Conforme usado aqui, o termo “indivíduo” inclui seres humanos e outros animais. O indivíduo, em uma modalidade, é um humano.

[0041] Como aqui utilizado, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa ser aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA, Farmacopeia Européia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em mamíferos e, mais particularmente, em seres humanos. Estas composições podem ser úteis como vacina e/ou composições antigênicas para induzir uma resposta imune protetora em um vertebrado.

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11/46 [0042] Conforme usado aqui, o termo “cerca de” significa mais ou menos 10% do valor numérico indicado.

Visão Geral

A presente revelação fornece métodos e composições para alcançar alta expressão de proteínas grandes, particularmente proteínas multivalentes contendo múltiplos antígenos, a partir de células de insetos. A produção de altos níveis de proteínas como aqui revelado é particularmente inesperada em vista de experiências anteriores no campo.

Proteínas multivalentes [0043] As proteínas multivalentes (a proteína multivalente também pode ser aqui referida como um multímero) aqui reveladas podem proteger contra múltiplos patógenos e/ou os efeitos de múltiplas proteínas patogênicas do mesmo organismo. Por exemplo, certos patógenos podem produzir várias moléculas que afetam negativamente um indivíduo. Uma resposta mais eficaz é produzida pela indução de respostas contra múltiplos antígenos separados.

[0044] A proteína multivalente contém porções de proteínas de múltiplas toxinas bacterianas. Em alguns aspectos, a proteína multivalente compreende, ou consiste em, porções de proteínas do mesmo organismo, como toxinas, por exemplo. Em outros aspectos, a proteína multivalente compreende ou consiste em proteínas de mais de um organismo. Em aspectos particulares, não existem duas proteínas de uma proteína multivalente do mesmo organismo. Em alguns aspectos, as mesmas proteínas de diferentes cepas (isto é, isólogos) podem ser usadas para produzir a porção. O uso da mesma proteína de uma cepa diferente permite proteção contra várias cepas e é particularmente útil em situações em que cepas virulentas surgem recentemente. Outros exemplos incluem C. botuliem um, que tem 8 tipos sorológicos, de A a H. Os métodos e composições aqui revelados podem ser utilizados para fornecer uma única vacina contra todos os 8 sorotipos. Outros exemplos particulares incluem vacinas combinadas de toxinas para

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12/46 proteção contra cólera, difteria e shigella, ou tétano, purtussis e difteria. Assim, em alguns aspectos, uma proteína multimérica pode conter porções de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 proteínas diferentes. As porções podem ser usadas como componentes para produzir os polipeptídeos imunogênicos multiméricos.

[0045] Multímeros e componentes exemplificadores usados para produzir vacinas são descritos na tabela abaixo. Sequências de ácido nucleico que codificam a toxina Q e BV1512, bem como sequências alternativas de ácido nucleico para BV1420 e BV1470, são aquelas que utilizam códons degenerados apropriados de conversão de códon padrão que codificam o aminoácido indicado.

Construção da vacina	Componentes	Sequência de proteínas	Sequência de ácidos nucleicos
BV1420 (SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 13)	CDTb TcdB TcdA	SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
BV1470 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5)	CDTb TcdB TcdA	SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
BV1512 (SEQ ID NO: 17)	CDTb TD TcdAR19	SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
Q-toxina (SEQ ID NO: 21)	CDTb TcdB003 TcdA TcdB027	SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25

[0046] Construtos de vacina adicionais podem usar os vários componentes acima em diferentes orientações. Além disso, proteínas com pelo menos 90% de identidade para cada uma dessas sequências reveladas podem ser usadas como componentes para produzir uma proteína multimérica.

Ligantes

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13/46 [0047] Em alguns aspectos, os ligantes podem ser usados entre uma ou mais proteínas nas proteínas multivalentes. Em alguns aspectos, o ligante é um ligante poli- (Gly) n, em que n é 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em outros aspectos, o ligante é GG, GGG ou GGGG (SEQ ID NO: 26). Em ainda outros aspectos, o ligante é selecionado do grupo que consiste em: dipeptídeos, tripeptídeos e quadripeptídeos. Os dipeptídeos preferenciais são Alanina-Serina (AS), Ácido Leucina-Glutâmico (LE), Serina-Arginina (SR).

[0048] Antígenos multivalentes são particularmente adequados para proteção contra organismos que liberam várias toxinas em um indivíduo. Por exemplo, as bactérias são conhecidas por produzir toxinas que causam doenças em seres humanos. Assim, enquanto o foco principal da revelação é C. difficile; os polipeptídeos multiméricos da revelação podem ser preparados usando porções da Toxinas de proteínas de outras espécies.

[0049] As espécies produtoras de toxinas incluem C. perfringes, C. botuliem um, C. difficile e C. tetani), Bacillus (por exemplo, B. anthracis), Vibrio (por exemplo, Vibrio cholerae), Shigella e Corynebacterium. C. difficile libera duas toxinas entéricas, A e B, que são produzidas por cepas toxigênicas. A toxina A é uma enterotoxina com atividade citotóxica mínima, enquanto a toxina B é uma citotoxina potente, mas com atividade enterotóxica limitada. Uma terceira toxina, a Toxina Binária, também conhecida como CDT, também é produzida pela bactéria. As sequências que codificam as toxinas A e B são conhecidas (Moncrief et al., Infect. Immun. 65: 1105-1108 (1997); Barroso et al., Nucl. Acids Res. 18: 4004 (1990); Dove et al. Infectar. Immun. 58: 480-488 (1990)). Também são conhecidas sequências que codificam a toxina binária (números de acesso ABS57477, AAB67305, AAF81761).

[0050] A utilidade da presente revelação para proteção contra infecção por patógenos é ilustrada por uma vacina trivalente contra proteínas contra C. difficile. A Figura 1 mostra a estrutura de duas proteínas multiméricas exemplificadores (BV1420 e BV1470). Cada multímero contém

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14/46 porções de três proteínas tóxicas, Toxina A (TcdA), Toxina B (TcdB) e toxina binária (CDTb), de C. difficile. A toxina tripla 1420 também contém um sítio de divagem de furina. Essas proteínas são grandes - mais de 1.800 aminoácidos e não se esperava que produzissem quantidades utilizáveis de proteína quando expressas em células de insetos. Surpreendentemente, no entanto, ambas as proteínas são expressas em altos níveis. Consulte a Figura 3. De fato, como mostra a Figura 5, o rendimento para BV1470 foi de 269 mg/L Da mesma forma, o rendimento para BV1420 foi de 166 mg/L [0051] A análise das proteínas multiméricas purificadas confirmou que as mesmas estavam em estruturas de nanopartículas com diâmetros de pico em torno de cerca de 16 nm para BV1420 e cerca de 18 nm para BV1470. Notavelmente, a distribuição dos diâmetros mostrados nas Figuras 7 e 8 ilustra que uma alta porcentagem das proteínas multiméricas reteve a estrutura das nanopartículas após a purificação.

[0052] A administração das nanopartículas trivalentes BV1420 em camundongos demonstra que foram obtidas respostas imunes às três proteínas. Além disso, como a Figura 13 ilustra a resposta imune obtida, protegeu 100% dos camundongos do desafio letal com toxina A e toxina binária, bem como 67% a 83% dos camundongos em resposta ao desafio letal com a toxina B. Por outro lado, todos os camundongos do grupo controle PBS morreram, com exceção de dois camundongos do grupo controle da toxina binária.

[0053] As toxinas quadrivalentes também são um tipo preferido de peptídeo imunogênico multimérico. A Figura 20 mostra dois exemplos ilustrativos com quatro porções ou componentes dispostos em sequência. Apesar do comprimento substancial do multímero, foi obtida boa produção de proteína. Figura 22.

[0054] A Figura 23 ilustra a conversão de uma proteína de fusão tri-toxina em uma toxina quadrivalente por adição de porção de uma toxina de um segundo tipo de TcdB. A comparação dessas duas proteínas s

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15/46 mostra que a expressão de células de insetos é capaz de produzir produção de alto nível. Consulte a Figura 24A-D.

[0055] Assim, multímeros exemplificadores incluem porções organizadas em várias orientações. Por exemplo, a partir do terminal N, a primeira porção pode ser uma porção TcdA, uma porção TcdB ou uma porção de CDTb. A segunda porção pode ser uma porção TcdA, uma porção TcdB ou uma porção de CDTb. A terceira porção pode ser uma porção TcdA, uma porção TcdB ou uma porção de CDTb. A quarta porção, se presente, pode ser uma porção TcdA, uma porção TcdB ou uma porção de CDTb. Assim, cada porção pode ocupar cada posição. Normalmente, embora nem sempre, duas porções adjacentes não sejam do mesmo tipo de toxina. Em modalidades preferidas, a porção N-terminal é uma porção de CDTb.

Técnicas de Biologia Molecular [0056] As proteínas multivalentes aqui reveladas são preparadas através de abordagens de biologia molecular. Os textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular, que são aplicáveis à presente invenção, como clonagem, mutação, cultura de células e similares, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2000 (“Sambrook”) e protocolos atuais em biologia molecular, FM Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre a Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (“Ausubel”). Esses textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados, por exemplo, à clonagem e mutação do PfCSP, etc. Assim, a invenção também abrange o uso de métodos conhecidos de engenharia de proteínas e tecnologia de DNA recombinante para melhorar ou alterar as características das proteínas expressas nas ou nas proteínas de fusão da invenção. Vários tipos de mutagênese podem ser utilizados para produzir e/ou isolar ácidos nucleicos

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16/46 variantes que codificam para moléculas de proteína e/ou para modificar/modificar ainda mais as proteínas nas ou nas proteínas de fusão da invenção. Os mesmos incluem, mas não estão limitados a, mutagênese de ponto aleatório sítio-dirigida, recombinação homóloga (embaralhamento de DNA), mutagênese usando modelos contendo uracil, mutagênese dirigida a oligonucleotídeo, mutagênese de DNA modificada com fosforotioato, mutagênese usando DNA duplex gapped ou similar. Métodos adequados adicionais incluem reparo de incompatibilidade pontual, mutagênese usando cepas hospedeiras deficientes em reparo, seleção e purificação de restrição, mutagênese por deleção, mutagênese por síntese total de genes, reparo de quebra de fita dupla e similares. A mutagênese, por exemplo, envolvendo construções quiméricas, também está incluída na presente invenção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informações conhecidas da molécula de ocorrência natural ou molécula de ocorrência natural alterada ou mutada, por exemplo, sequência, comparação de sequências, propriedades físicas, estrutura cristalina ou similares.

[0057] Os métodos de clonagem das proteínas são conhecidos na técnica. Um gene pode ser clonado como uma inserção de DNA em um vetor. O termo “vetor” se refere aos meios pelos quais um ácido nucleico pode ser propagado e/ou transferido entre organismos, células ou componentes celulares. Os vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fagomoides, transposons, cromossomos artificiais e similares, que se replicam autonomamente ou podem se integrar a um cromossomo de uma célula hospedeira. Um vetor também pode ser um polinucleotídeo de RNA nu, um polinucleotídeo de DNA nu, um polinucleotídeo composto de DNA e RNA dentro da mesma fita, um DNA ou RNA conjugado com poli-lisina, um DNA ou RNA conjugado com peptídeo, um DNA ou RNA conjugado com peptídeo, um conjugado com lipossomo DNA, ou algo semelhante, que não está replicando autonomamente. Em muitas, mas não em todas as modalidades comuns, os vetores da presente invenção são plasmídeos ou bacmídeos.

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17/46 [0058] Assim, a invenção compreende nucleotídeos que codificam proteínas, incluindo moléculas quiméricas, clonadas em um vetor de expressão que pode ser expresso em uma célula que induz a formação de proteínas de fusão da invenção. Um “vetor de expressão” é um vetor, como um plasmídeo, capaz de promover a expressão, bem como a replicação de um ácido nucleico incorporado no mesmo. Tipicamente, o ácido nucleico a ser expresso está “operacionalmente ligado” a um promotor e/ou potenciador e está indivíduo ao controle regulador da transcrição pelo promotor e/ou potenciador. Em uma modalidade, os nucleotídeos codificam para uma proteína Plasmodium (como discutido acima). Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de baculovírus.

[0059] Em algumas modalidades da invenção, as proteínas podem compreender mutações que contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, por exemplo, para otimizar a expressão do códon para um hospedeiro específico (alterar os códons no mRNA humano aos preferenciais pelas células de insetos, como células Sf9)Veja, por exemplo, a Publicação de Patente US 2005/0118191, aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0060] Além disso, os nucleotídeos podem ser sequenciados para garantir que as regiões codificadoras corretas foram clonadas e não contêm mutações indesejadas. Os nucleotídeos podem ser subclonados em um vetor de expressão (por exemplo, baculovírus) para expressão em qualquer célula. O exemplo acima é apenas um exemplo de como as proteínas podem ser clonadas. Uma pessoa versada na técnica entende que métodos adicionais podem ser usados.

Células hospedeiras [0061] A expressão de alto nível foi obtida em sistemas de expressão de células de insetos. Exemplos não limitativos de células de inseto são as células de Spodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, células Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, por exemplo, células High Five e células Drosophila S2.

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18/46 [0062] Os vetores, por exemplo, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam proteínas de fusão, podem ser transfectados para células hospedeiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a introdução de ácidos nucleicos nas células eucarióticas pode ser conseguida por co-precipitação, eletroporação, microinjeção, lipofecção e transfecção de fosfato de cálcio utilizando reagentes de transfecção de poliamina. Em uma modalidade, o vetor é um baculovírus recombinante.

Produção de nanopartículas [0063] As nanopartículas podem ser produzidas através do crescimento de células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão sob condições nas quais as proteínas recombinantes são expressas. Em um aspecto, um método de produção de uma proteína multivalente compreende a transfecção de vetores que codificam a proteína em uma célula hospedeira adequada e a expressão da proteína sob condições que permitem a formação de nanopartículas. Em outra modalidade, a célula eucariótica é selecionada do grupo que consiste em células de levedura, inseto, anfíbio, aviária ou mamífero. A seleção das condições de crescimento apropriadas está dentro da habilidade ou de uma pessoa com habilidade de um versado na técnica.

[0064] Os métodos para cultivar células hospedeiras incluem, mas não estão limitados a, técnicas de cultura celular em batelada, alimentada em batelada, contínua e de perfusão. Cultura celular significa o crescimento e a propagação de células em um biorreator (uma câmara de fermentação) onde as células se propagam e expressam proteínas (por exemplo, proteínas recombinantes) para purificação e isolamento. Tipicamente, a cultura de células é realizada sob temperatura estéril e controlada e condições atmosféricas em um biorreator. Um biorreator é uma câmara usada para cultivar células nas quais condições ambientais como temperatura, atmosfera, agitação e/ou pH podem ser monitoradas. Em uma modalidade, o biorreator é uma câmara de aço inoxidável. Em outra modalidade, o biorreator

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19/46 é um saco plástico pré-esterilizado (por exemplo, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Em outra modalidade, os sacos de plástico pré-esterilizados são de cerca de 50 a 1000 litros.

Extração e purificação de detergentes de nanopartículas [0065] As nanopartículas podem ser coletadas das células hospedeiras usando detergentes. Detergentes adequados incluem surfactantes não iônicos. Por exemplo, o surfactante não iônico pode ser Bis (polietilenoglicol bis [imidazoilcarbonil]), nonoxinol-9, Bis (polietilenoglicol bis [imidazilcarbonil]), Brij® 35, Brij®56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Cremophor® EL, éter monododecílico de decaetilenoglicol, Ndecanoil-N-metilglucamina, n-decil alfa-Dglucopiranósido, decil beta-Dmaltopiranósido, n-dodecanoil-N-metilglucamida, nDodecil alfa-D-maltósido, nDodecil beta-D-maltósido, n-Dodecil beta-D-maltósido, éter monodecílico de heptaetilenoglicol, éter monododecílico de heptaetilenoglicol, éter monododecílico de heptaetileno glicol, éter monotetradecílico de heptaetilenoglicol, n-hexadecílico Éter monododecílico de hexaetileno glicol, éter monohexadecílico de hexaetileno glicol, éter monooctadecílico de hexaetileno glicol, éter monotetradecílico de hexaetileno glicol, éter monotetradecílico de hexaetileno glicol, Igepal CA-630, Igepal CA-630, metil-6O-(N-heptilanopirolcarbamil) éter monododecílico, N-Nonanoil-Nmetilglucamina, N-Nonanoil-N-metilglucamina, Octaeth éter monodecílico de ileno glicol, éter octaetilenoglicolmonododecílico, éter monohexadecílico de octaetileno glicol, éter monooctadecílico de octaetileno glicol, éter monotetradecílico de octaetilenoglicol, éter octiletilenoglicol etil-glicopiranodecil etilenoglicol, éter monooctadecílico de pentaetilenoglicol, éter monooctil de pentaetilenoglicol, éter diglicidílico de polietilenoglicol, éter de polietileno glicol W-1, éter de polioxietileno 10 tridecílico, estearato de polioxietileno 10, estearato de polioxietileno 100, estearato de polioxietileno 100, estearato de polioxietileno 20 isohexadecil, éter de polietileno etil 20 Estearato de

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20/46 polioxietileno 8, bis de polioxietileno (imidazolil carbonil), estearato de polioxietileno 25 propileno glicol, Saponina de casca de Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol tipo 15- S-12, Tergitol tipo 15-S-30, Tergitol tipo 15-S-5, Tergitol tipo 15-S-7, Tergitol tipo 15S-9, Tergitol tipo NP-10, Tergitol tipo NP-4, Tergitol tipo NP-40, Tergitol tipo NP-7 Tergitol tipo NP-9, Tergitol tipo TMN- 10, Tergitol Tipo TMN-6, Tetradecilbeta-D-maltósido, éter monodecílico de tetraetilenoglicol, éter monododecílico de éter tetraetilenoglicol, éter monotetradecílico éter de tetraetilenoglicol, éter monodeciléter de trietileno glicol, éter monodecílico e trietileno glicol, éter monodecílico e trietilenoglicol, éter monotetradecílico de trietileno glicol, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X200, Triton X-207, Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® X-165, Triton® X-305, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, TWEEN® 20, TWEEN® 21, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 61, TWEEN® 65, TWEEN® 80, TWEEN® 81, TWEEN® 85, Tiloxapol, n-Undecil beta-D-glucopiranósido, derivado semi-sintético seus derivados ou combinações dos mesmos. O Tergitol NP-9 é um detergente preferido.

[0066] Depois que as células hospedeiras cresceram por 48 a 72 horas, as células são isoladas do meio e uma solução contendo detergente é adicionada para solubilizar a membrana celular, liberando as nanopartículas em um extrato de detergente. O detergente pode ser adicionado a uma concentração final de cerca de 0,1% a cerca de 1,0%. Por exemplo, a concentração pode ser de cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8% ou cerca de 1,0%. Em certos aspectos, o intervalo pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 0,3%. De preferência, a concentração é de cerca de 0,2%.

[0067] As nanopartículas podem então ser isoladas usando métodos que preservam a integridade das mesmas, como a centrifugação. Em alguns aspectos, a centrifugação em gradiente, como o uso

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21/46 de cloreto de césio, sacarose e iodixanol, pode ser usada. Outras técnicas podem ser usadas como alternativas ou além disso, como técnicas de purificação padrão, incluindo, por exemplo, cromatografia de troca iônica e filtração em gel.

[0068] Em um aspecto, o extrato de detergente é adicionado a várias colunas sequencialmente. Por exemplo, a primeira coluna pode ser uma coluna de cromatografia de íons, como TMAE, a segunda coluna pode ser uma coluna de interação hidrofóbica, como Phenyl HP, e a terceira coluna pode ser uma coluna de troca aniônica forte, como uma coluna Source 30Q. Pode-se obter maior pureza repetindo o procedimento de três etapas.

[0069] A seguir, é apresentado um procedimento geral para produzir proteínas de isolamento e purificação. Uma pessoa versada na técnica entendería que existem variações que podem ser utilizadas [0070] A produção é iniciada semeando células Sf9 (não infectadas) em frascos agitadores, permitindo que as células se expandam e aumentem conforme as células crescem e se multiplicam (por exemplo, de frascos de 125 ml para sacos de 50 I). O meio usado para crescer a célula é formulado para a linha celular apropriada (preferencialmente meio isento de soro, por exemplo, meio de inseto ExCell-420, JRH). Em seguida, as células são infectadas com baculovírus recombinante na multiplicidade de infecção mais eficiente (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 3 unidades formadoras de placas por célula). Depois que a infecção ocorre, as proteínas de fusão (e, opcionalmente, outros imunógenos) são expressas a partir do genoma do vírus. Normalmente, a infecção é mais eficiente quando as células estão na fase midlog de crescimento (4-8 x 10 ⁶ células/ml) e são, pelo menos, cerca de 90% viáveis.

[0071] As proteínas da revelação podem ser coletadas aproximadamente 48 a 96 horas após a infecção. Em alguns aspectos, a coleta ocorre cerca de 48 horas, cerca de 72 horas ou entre 48 e 72 horas. Normalmente, a coleta ocorre quando os níveis de VLPs no meio de cultura de

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22/46 células estão próximos do máximo, mas antes da extensa lise celular. A densidade de células Sf9 e viabilidade no momento da coleta pode ser de cerca de 0,5 x 10 ⁶ células/ml a cerca de 1,5 x 10 ⁶ células/ml com, pelo menos, 20% de viabilidade, como mostrado pelo ensaio de exclusão com corante.

[0072] Para solubilizar as partículas, adicione diretamente o Tergitol NP9 à cultura de células até a concentração final de 0,2% de NP9/25 mM de Tris/50 mM de NaCI/pH8,0. Incubar à temperatura ambiente por 1 hora e depois centrifugar o lisado a 9000 g por 30 min duas vezes. Recolheu o sobrenadante contendo as nanopartículas. O sobrenadante é, então, adicionado ao Tampão A e eluído no Tampão B (Tampão A: Tris 25 mM pH 8,0/NaCI 50 mM Tampão B: Tris 25 mM pH 8,0/NaCI 1 Μ). O eluato é aplicado às colunas Phenyl HP (Tampão A: Na-Citrato 350 mM/Tris 25 mM pH7,5 e Tampão B: Tris 5 mM pH8,0) e depois a uma coluna Fonte 30Q (Tampão A: Tris 25 mM pH8. 0/250 mM de tampão NaCI B: Tris 25 mM, pH 8,0/1 M NaCI). As frações reunidas contendo o produto são passadas através de um filtro de 2 microns. Veja as Figuras 8-10.

[0073] Os procedimentos descritos acima permitem um grau de pureza de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 98% com um rendimento de 150 mg/l a cerca de 300 rng/l. A pureza pode ser medida por abordagens à base de gel que indicam proteína total.

[0074] O baculovírus intacto pode ser inativado, se desejado. A inativação pode ser conseguida por métodos químicos, por exemplo, formalina ou -propiolactona β (BPL). A remoção e/ou inativação de baculovírus intacto também pode ser amplamente realizada usando precipitação seletiva e métodos cromatográficos conhecidos na técnica, como exemplificado acima. Os métodos de inativação compreendem a incubação da amostra contendo as VLPs em 0,2% da BPL por 3 horas a cerca de 25 °C a cerca de 27 °C. O baculovírus também pode ser inativado incubando a amostra

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23/46 contendo as VLPs a 0,05% de BPL a 4 °C por 3 dias, depois a 37 °C por uma hora.

[0075] As técnicas acima podem ser praticadas em uma variedade de escalas. Por exemplo, frascos em T, frascos de agitação, garrafas giratórias, até biorreatores de tamanho industrial. Os biorreatores podem compreender um tanque de aço inoxidável ou um saco plástico pré-esterilizado (por exemplo, o sistema vendido pela Wave Biotech, Bridgewater, NJ.). Um indivíduo versado na técnica saberá o que é mais desejável para a circunstância específica.

Tamanho e rendimento da proteína [0076] O rendimento para as proteínas multiméricas usando os métodos aqui revelados é notável. Em alguns casos, o rendimento é de cerca de 150 mg/l a cerca de 300 mg/L Em algumas modalidades, o rendimento é de cerca de 40 mg/l, cerca de 60 mg/l, cerca de 80 mg/l, cerca de 100 mg/l, cerca de 150 mg/l, cerca de 150 mg/l, cerca de 200 mg/l, cerca de 200 mg/l cerca de 300 mg/l. Em aspectos particulares, o rendimento varia de cerca de 40 mg/l a cerca de 300 mg/l, de cerca de 80 mg/l a cerca de 250 mg/l, ou cerca de 100 mg/ml a cerca de 300 mg/l.

[0077] As grandes proteínas multiméricas aqui reveladas variam tipicamente de cerca de 1.500 a 2.500 aminoácidos. Em alguns aspectos, os mesmos variam de cerca de 1.500 a cerca de 2.000 aminoácidos. Em outros aspectos, os mesmos variam de cerca de 1.800 a cerca de 2.000 aminoácidos.

[0078] As proteínas multiméricas formam nanopartículas com um diâmetro típico de cerca de 11 nm a cerca de 3 5 nm. A faixa de diâmetro pode ser de cerca de 15 nm a cerca de 25 nm. Exemplos ilustrativos de nanopartículas de proteínas multiméricas nessas faixas são mostrados na Figura 9.

[0079] É importante ressaltar que, embora as proteínas sejam grandes, as mesmas permanecem solúveis. Por exemplo, a proteína

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24/46 multimérica purificada pode ser cerca de 80% solúvel, cerca de 85% solúvel, cerca de 90% solúvel, cerca de 95% solúvel, cerca de 97% solúvel ou cerca de 99% solúvel. Em alguns aspectos, a solubilidade é de cerca de 90% a cerca de 99% ou cerca de 90% a cerca de 95%.

Antígenos e polipeptídeos modificados [0080] Os antígenos aqui revelados abrangem variações e mutantes desses antígenos. Em certos aspectos, o antígeno pode compartilhar identidade com um antígeno revelado. Geralmente, e a menos que definido especificamente no contexto de um antígeno especificamente identificado, a identidade percentual pode ser de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%. A identidade percentual pode ser calculada com o uso do programa de alinhamento Clustal Omega, disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo, com o uso de parâmetros padrão.

[0081] Em aspectos particulares, a proteína contida nas nanopartículas consiste nessa proteína. Em outros aspectos, a proteína contida nas nanopartículas compreende essa proteína. As extensões da própria proteína podem ter vários propósitos.

[0082] Em alguns aspectos, o antígeno pode ser estendido no terminal N, no terminal C ou em ambos. Em alguns aspectos, a extensão é uma etiqueta útil para uma função, como purificação ou detecção. Em alguns aspectos, a etiqueta contém um epítopo. Por exemplo, a etiqueta pode ser uma etiqueta de poliglutamato, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta HA, uma etiqueta poliHis (com cerca de 5 a 10 histidinas), uma etiqueta Myc, uma etiqueta Glutationa-S-transferase, uma etiqueta de proteína fluorescente Green, etiqueta de proteína de ligação à Maltose, etiqueta de Thioredoxin ou etiqueta Fc. Em outros aspectos, a extensão pode ser um peptídeo sinal Nterminal fundido à proteína para melhorar a expressão. Embora esses peptídeos de sinal sejam frequentemente clivados durante a expressão na célula, algumas nanopartículas podem conter o antígeno com um peptídeo de

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25/46 sinal intacto. Assim, quando uma nanopartícula compreende um antígeno, o antígeno pode conter uma extensão e, portanto, pode ser uma proteína de fusão quando incorporado nas nanopartículas. Para fins de cálculo de identidade para a sequência, extensões não são incluídas. Em alguns aspectos, o antígeno pode estar truncado. Por exemplo, o terminal N pode ser truncado por cerca de 10 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, cerca de 75 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos ou cerca de 200 aminoácidos. Por exemplo, o terminal C pode ser truncado por cerca de 10 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, cerca de 75 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos ou cerca de 200 aminoácidos.

Composições Farmacêuticas [0083] As composições farmacêuticas aqui reveladas compreendem uma proteína multimérica e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer agente farmacêutico que possa ser administrado a um indivíduo sem toxicidade, irritação ou reação alérgica indevida. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis também podem incluir um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Um excipiente farmaceuticamente aceitável é qualquer excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente segura e não tóxica e é aceitável para uso farmacêutico veterinário e humano.

[0084] As composições farmacêuticas úteis aqui contêm um veículo farmaceuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente adequado, que inclui qualquer agente farmacêutico que não induza a produção de uma resposta imune prejudicial ao vertebrado que recebe a composição e que pode ser administrada sem toxicidade indevida e um imunogênio; por exemplo, uma proteína de fusão multimérica.

[0085] Em alguns aspectos, as formulações podem incluir um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, tampão aquoso

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26/46 isotônico estéril e combinações dos mesmos. Uma discussão completa de veículos, diluentes e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis é apresentada em Ciências Farmacêuticas de Remington (Mack Pub. Co., NJ, edição atual). A formulação pode ser adaptada para se adequar ao modo de administração. Em uma modalidade exemplar, a formulação é adequada para administração a seres humanos, é estéril, não particulada e/ou não pirogênica.

[0086] A composição também pode conter agentes umectantes, ou agentes emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH, ou misturas dos mesmos. A composição pode ser uma forma sólida, como um pó liofilizado adequado para reconstituição (por exemplo, com água ou solução salina), uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada ou pó. As formulações orais podem incluir carreadores padrão, como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.

Adjuvantes [0087] A imunogenicidade de uma composição particular pode ser aumentada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes foram utilizados experimentalmente para promover um aumento generalizado da imunidade contra antígenos (por exemplo, Patente n° US 4.877.611). Os protocolos de imunização usaram adjuvantes para estimular respostas por muitos anos e, como tal, os adjuvantes são bem conhecidos dos versados na técnica. Alguns adjuvantes afetam a maneira pela qual os antígenos são apresentados. Por exemplo, a resposta imune é aumentada quando os antígenos proteicos são precipitados por alume. A emulsificação de antígenos também prolonga a duração da apresentação do antígeno. A inclusão de qualquer adjuvante descrito em Vogel et al., “A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2- edição)”, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os fins, está prevista no escopo desta revelação.

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27/46 [0088] Exemplos de adjuvantes incluem o adjuvante completo de Freund (um estimulador não-específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto), os adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio. Outros adjuvantes compreendem compostos GMCSP, BCG, MDP, como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídio A e monofosforil lipídio A (MPL), MF-59, RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimerolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) em uma emulsão de esqualeno a 2%/Tween® 80. Em outros aspectos preferenciais, o alúmen, como 2% de alidrogel (AI(OH)3) é usado. Em alguns aspectos, o adjuvante pode ser uma vesícula lipídica paucilamelar; por exemplo, Novasomes®. Novasomes® são vesículas não fosfolipídicas paucilamelares que variam de cerca de 100 nm a cerca de 500 nm. Eles incluem Brij 72, colesterol, ácido oleico e esqualeno. Demonstrou-se que novosomessomas são um adjuvante eficaz (consulte as Patentes n° US 5.629.021,6.387.373 e 4.911.928.

Adjuvantes de saponina [0089] Os adjuvantes contendo saponina também podem ser combinados com os imunogênios aqui revelados. Saponinas são glicosídeos derivados da casca da árvore Quillaja saponaria Molina. Normalmente, a saponina é preparada com o uso de um processo de purificação em várias etapas, resultando em várias frações. Como aqui utilizado, o termo “uma fração de saponina de Quillaja saponaria Molina” é usado genericamente para descrever uma fração de saponina semi-purificada ou definida de Quillaja saponaria ou uma fração substancialmente pura.

Frações de saponina [0090] Várias abordagens para a produção de frações de saponina são adequadas. As frações A, B e C são descritas na Patente n° US 6.352.697 e pode ser preparado como se segue. Uma fração lipofílica do Quil A, um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, é separada por cromatografia e eluída com acetonitrila a 70% em água para recuperar a fração

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28/46 lipofílica. Esta fração lipofílica é, então, separada por HPLC semi-preparativa com eluição utilizando um gradiente de 25% a 60% de acetonitrilo em água ácida. A fração aqui referida como “Fração A” ou “QH-A” é, ou corresponde à fração, que é eluída em aproximadamente 39% de acetonitrila. A fração aqui referida como “Fração B” ou “QH-B” é ou corresponde à fração que é eluída em aproximadamente 47% de acetonitrila. A fração aqui referida como “Fração C” ou “QH-C” é, ou corresponde à fração, que é eluída em aproximadamente 49% de acetonitrila. Informações adicionais sobre a purificação de frações são encontradas na Patente n° US 5.057.540. Quando preparadas como aqui descrito, as frações A, B e C de Quillaja saponaria Molina representam, cada uma, grupos ou famílias de moléculas quimicamente relacionadas com propriedades definíveis. As condições cromatográficas sob as quais são obtidas são tais que a reprodutibilidade de lote para lote em termos de perfil de eluição e atividade biológica é altamente consistente.

[0091] Outras frações de saponina foram descritas. As frações B3, B4 e B4b são descritas na EP 0436620. As frações QA1-QA22 são descritas EP03632279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Dinamarca), Quillaja saponaria Molina Spikoside (Isconova AB, Ultunaallén 2B, 756 51 Uppsala, Suécia). Frações QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA -13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21 e QA-22 da EP 0 3632 279 B2, especialmente QA-7, QA-17, QA-18 e QA-21 podem ser usados. São obtidos como descrito na EP 0 3632 279 B2, especialmente na página 6 e no Exemplo 1 nas páginas 8 e 9.

[0092] As frações de saponina aqui descritas e utilizadas para formar adjuvantes são frequentemente frações substancialmente puras; isto é, as frações estão substancialmente livres da presença de contaminação de outros materiais. Em aspectos particulares, uma fração de saponina substancialmente pura pode conter até 40% em peso, até 30% em peso, até 25% em peso, até 20% em peso, até 15% em peso, até 10% em peso, até 7% em peso, até 5% em peso, até 2% em peso, até 1% em peso, até 0,5% em

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29/46 peso, ou até 0,1% em peso de outros compostos, como outras saponinas ou outros materiais adjuvantes.

Estruturas ISCOM [0093] Frações de saponina podem ser administradas sob a forma de uma partícula em forma de gaiola referida como um ISCOM (Immune Stimulating COMplex). Os ISCOMs podem ser preparados como descrito nos documentos EP0109942B1, EP0242380B1 e EP0180546 B1. Em modalidades particulares, um transporte e/ou um antigeno de passageiro pode ser usado, como descrito no documento EP 9600647-3 (PCT/SE97/00289).

Adjuvantes de Matriz [0094] Em alguns aspectos, o ISCOM é um complexo de matrizes ISCOM. Um complexo de matriz ISCOM compreende pelo menos uma fração de saponina e um lipídio. O lipídio é pelo menos um esterol, como o colesterol. Em aspectos particulares, o complexo da matriz ISCOM também contém um fosfolipídeo. Os complexos da matriz ISCOM também podem conter uma ou mais outras substâncias imunomoduladoras (ativadas por adjuvantes), não necessariamente um glicosídeo, e podem ser produzidas conforme descrito no documento EP0436620B1.

[0095] Em outros aspectos, o ISCOM é um complexo do ISCOM. Um complexo ISCOM contém pelo menos uma saponina, pelo menos um lipídeo e pelo menos um tipo de antigeno ou epítopo. O complexo ISCOM contém antigeno associado ao tratamento com detergente, de modo que uma porção do antigeno se integre à partícula. Em contraste, a matriz ISCOM é formulada como uma mistura com antigeno e a associação entre partículas da matriz ISCOM e antigeno é mediada por interações eletrostáticas e/ou hidrofóbicas.

[0096] De acordo com uma modalidade, a fração de saponina integrada em um complexo de matriz ISCOM ou em um complexo ISCOM, ou pelo menos um adjuvante adicional, que também é integrado no complexo de matriz ISCOM ou ISCOM ou misturado com ele, é selecionada a

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30/46 partir da fração A, fração B, ou fração C de Quillaja saponaria, uma preparação semipurificada de Quillaja saponaria, uma preparação purificada de Quillaja saponaria ou qualquer subtração purificada, por exemplo, QA 1-21.

[0097] Em aspectos particulares, cada partícula ISCOM pode conter pelo menos duas frações de saponina. Podem ser utilizadas quaisquer combinações de percentual em peso de diferentes frações de saponina. Qualquer combinação de percentual em peso de quaisquer duas frações pode ser usada. Por exemplo, a partícula pode conter qualquer percentual em peso da fração A e qualquer percentual em peso de outra fração de saponina, como uma fração bruta de saponina ou fração C, respectivamente. Por conseguinte, em aspectos particulares, cada partícula da matriz ISCOM ou cada partícula complexa ISCOM pode conter de 0,1 a 99,9 em peso, 5 a 95% em peso, 10 a 90% em peso 15 a 85% em peso, 20 a 80% em peso, 25 a 75% em peso, 30 a 70% em peso, 35 a 65% em peso, 40 a 60% em peso, 45 a 55% em peso, 40 a 60% em peso ou 50% em peso de um fração de saponina, por exemplo, fração A e o restante até 100% em cada caso de outra saponina, por exemplo, qualquer fração bruta ou qualquer outra facção, por exemplo, fração C. O peso é calculado como o peso total das frações de saponina. Exemplos de complexo da matriz ISCOM e adjuvantes do complexo ISCOM são revelados no Pedido Publicado n° US 2013/0129770.

[0098] Em modalidades particulares, a matriz ISCOM ou o complexo ISCOM compreende de 5 a 99% em peso de uma fração, por exemplo, fração A e o restante até 100% em peso de outra fração, por exemplo, uma fração bruta de saponina ou fração C. O peso é calculado como o peso total das frações de saponina.

[0099] Em outra modalidade, a matriz ISCOM ou complexo ISCOM compreende de 40% a 99% em peso de uma fração, por exemplo, fração A e de 1% a 60% em peso de outra fração, por exemplo, uma fração bruta de saponina ou fração C é calculada como o peso total das frações de saponina.

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31/46 [0100] Em ainda outra modalidade, a matriz ISCOM ou complexo ISCOM compreende de 70% a 95% em peso de uma fração, por exemplo, fração A, e de 30% a 5% em peso de outra fração, por exemplo, uma fração bruta de saponina ou fração C. O peso é calculado como o peso total das frações de saponina. Em outras modalidades, a fração de saponina de Quillaja saponaria Molina é selecionada a partir de qualquer um dos QA 1 -21.

[0101] Além das partículas que contêm misturas de frações de saponina, as partículas da matriz ISCOM e as partículas do complexo ISCOM podem ser formadas usando apenas uma fração de saponina. As composições aqui reveladas podem conter múltiplas partículas em que cada partícula contém apenas uma fração de saponina. Ou seja, certas composições podem conter um ou mais tipos diferentes de partículas dos complexos da matriz ISCOM e/ou um ou mais tipos diferentes de partículas dos complexos ISCOM, em que cada partícula individual contém uma fração de saponina de Quillaja saponaria Molina, em que a fração de saponina em um complexo é diferente da fração saponina nas outras partículas complexas.

[0102] Em aspectos particulares, um tipo de fração de saponina ou uma fração de saponina bruta pode ser integrado a um complexo ou partícula de matriz ISCOM e outro tipo de fração de saponina substancialmente pura, ou uma fração de saponina bruta, pode ser integrado a outro complexo ou partícula de matriz ISCOM. Uma composição ou vacina pode compreender pelo menos dois tipos de complexos ou partículas, em que cada tipo tem um tipo de saponinas integradas em partículas fisicamente diferentes.

[0103] Nas composições, misturas de partículas do complexo da matriz ISCOM e/ou partículas do complexo ISCOM podem ser usadas nas quais uma fração de saponina Quillaja saponaria Molina e outra fração de saponina Quillaja saponaria Molina são incorporadas separadamente em diferentes partículas do complexo da matriz ISCOM e/ou partículas do complexo ISCOM.

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32/46 [0104] A matriz ISCOM ou partículas do complexo ISCOM, cada uma com uma fração de saponina, pode estar presente na composição em qualquer combinação de% em peso. Em aspectos particulares, uma composição pode conter 0,1% a 99,9% em peso, 5% a 95% em peso, 10% a 90% em peso, 15% a 85% em peso, 20% a 80% em peso, 25% a 75% em peso, 30% a 70% em peso, 35% a 65% em peso, 40% a 60% em peso, 45% a 55% em peso, 40 a 60% em peso ou 50% em peso, de uma matriz ou complexo ISCOM contendo uma primeira fração de saponina com a porção restante composta por uma matriz ou complexo ISCOM contendo uma fração de saponina diferente. Em alguns aspectos, a porção restante é uma ou mais matrizes ou complexos ISCOM, em que cada matriz ou partícula complexa contém apenas uma fração de saponina. Em outros aspectos, a matriz ISCOM ou partículas complexas podem conter mais de uma fração de saponina.

[0105] Em composições preferenciais, a fração de saponina em uma primeira matriz ISCOM é a Fração A (uma “Matriz de Fração A”) e a fração de saponina em uma segunda matriz ISCOM ou partícula complexa de ISCOM é a Fração C (uma “Matriz de Fração C”). Assim, as composições preferenciais compreendem, como adjuvante, um adjuvante da Fracção A Matrix e um adjuvante da Fracção C Matrix. As quantidades de cada matriz na composição podem variar. Por exemplo, a quantidade de matriz da fração A pode ser de cerca de 80% (m/m), cerca de 85% (m/m), cerca de 90% (m/m), cerca de 92% (m/m) ou cerca de 95 % (p/p) com o restante da matriz de frações C. Um exemplo adequado de uma combinação adequada de Matriz de Fração A e Matriz de Fração C 85:15 é Matrix-M™ (Novavax AB, Uppsala, Suécia), uma mistura de Matriz de Fração A e Matriz de Fração C a uma razão de cerca de 85 a cerca de 15.

[0106] Outras frações de saponina, tais como as frações QS-7 e QS-21, a sua produção e a sua utilização estão descritas nas Patentes n° US 5.057.540; 6.231.859; 6.352.697; 6.524.584; 6.846.489; 7.776.343 e

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8.173.141. Essas frações podem ser usadas nos métodos e composições aqui revelados.

Estimuladores Imunes [0107] As composições da revelação também podem ser formuladas com “estimuladores imunes”. Estes são os mensageiros químicos do próprio corpo (citocinas) para aumentar a resposta do sistema imunológico. Os estimuladores imunes incluem, mas não estão limitados a, várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimuladoras, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM) (GM)) e outras moléculas imunoestimuladoras, como fator inflamatório de macrófagos, ligante Flt3, B7. 1; B7. 2, etc. As moléculas imunoestimuladoras podem ser administradas em a mesma formulação que as composições da revelação ou pode ser administrada separadamente. A proteína ou um vetor de expressão que codifica a proteína podem ser administrados para produzir um efeito imunoestimulador. Assim, em uma modalidade, a revelação compreende formulações antigênicas e de vacina compreendendo um adjuvante e/ou um estimulador imune.

Métodos de indução de respostas imunes [0108] Também são fornecidos na presente revelação métodos para obter uma resposta imune contra patógenos. O método envolve a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição compreendendo uma proteína multimérica a um indivíduo. A administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição da revelação provoca uma resposta imune específica para epítopos presentes na proteína de fusão. Essa resposta imune pode incluir respostas de células B e/ou respostas de células T. Quando administradas a um indivíduo, as proteínas multiméricas induzem preferencialmente anticorpos neutralizantes. De preferência, a resposta imune inclui elementos que são específicos para

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34/46 pelo menos um epítopo conformacional presente cada proteína contida na proteína multimérica.

Administração [0109] A administração pode ser por qualquer via adequada. As vias adequadas incluem administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosa (por exemplo, vias intranasal e oral ou pulmonar ou por supositórios), transdérmica ou intradérmica. A administração pode ser por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, cólon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, bexiga e mucosa intestinal, etc.) e pode ser administrada em conjunto com outras agentes biologicamente ativos. Em alguns aspectos, as vias de administração intranasais ou outras mucosas podem resultar em um anticorpo ou outra resposta imune que é substancialmente mais alta do que outras vias de administração. A administração pode ser sistêmica ou local.

[0110] Em alguns aspectos, a administração pode ser por injeção com o uso de uma agulha e seringa, por um dispositivo de injeção sem agulha. Em outros aspectos, a administração é feita por gotas, aerossol de partículas grandes (maior que cerca de 10 microns) ou por aspersão no trato respiratório superior.

[0111] Em alguns aspectos, é fornecida uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos componentes das formulações. Em um aspecto particular, o kit pode incluir dois recipientes, um primeiro recipiente contendo uma proteína multimérica e um segundo recipiente contendo um adjuvante. Associado a esse recipiente (recipientes), pode haver um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso que reflete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana. As formulações também

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35/46 podem ser embaladas em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de composição.

[0112] Em alguns aspectos, a administração pode ser direcionada. Por exemplo, as composições podem ser administradas de maneira a atingir tecidos da mucosa, a fim de provocar uma resposta imune no sítio da imunização. Os tecidos da mucosa, como o tecido linfoide associado ao intestino (GALT), podem ser direcionados para imunização usando a administração oral de composições que contêm adjuvantes com propriedades específicas de direcionamento da mucosa. Também podem ser direcionados tecidos mucosos adicionais, como tecido linfoide nasofaríngeo (NALT) e tecido linfoide associado a brônquios (BALT).

[0113] Em alguns aspectos, várias composições podem ser administradas cada uma com diferentes coleções de antígenos. Onde mais de uma proteína multimérica é administrada, as proteínas podem ser coadministradas simultaneamente na mesma posição do indivíduo; por exemplo, por injeção de material de um ou mais recipientes contendo proteínas multímeras. Em outros aspectos, os mesmos podem ser coadministrados sequencialmente em diferentes sítios dentro de um curto espaço de tempo; por exemplo, uma administração pode estar na coxa e uma segunda administração pode estar no braço, com ambas as administrações ocorrendo dentro de um curto período (por exemplo, até 30 minutos).

[0114] Estudos clínicos em humanos podem ser realizados para determinar a dose eficaz preferida para humanos por um especialista. Tais estudos clínicos são rotineiros e bem conhecidos na arte. A dose precisa a ser empregada também dependerá da via de administração. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou in vivo. A dose pode ser ajustada com base em, por exemplo, idade, condição física, peso corporal, sexo, dieta, tempo de administração e outros fatores clínicos.

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36/46 [0115] Embora seja possível o estímulo da imunidade com uma dose única, podem ser administradas doses adicionais, pela mesma ou por outra via, para alcançar o efeito desejado. Em neonatos e bebês, por exemplo, várias administrações podem ser necessárias para obter níveis suficientes de imunidade. A administração pode continuar a intervalos durante toda a infância, conforme necessário para manter níveis suficientes de proteção contra infecções. Da mesma forma, adultos que são particularmente suscetíveis a infecções repetidas ou graves, como, por exemplo, profissionais de saúde, creches, familiares de crianças pequenas, idosos e indivíduos com função cardiopulmonar comprometida, podem exigir várias imunizações para estabelecer e/ou manter respostas imunes protetoras. Os níveis de imunidade induzida podem ser monitorados, por exemplo, medindo quantidades de anticorpos secretores e séricos neutralizantes e dosagens ajustadas ou vacinas repetidas conforme necessário para provocar e manter os níveis desejados de proteção.

[0116] As composições de vacina também podem ser usadas para preparar anticorpos contra as toxinas úteis para terapias de administração passiva. Consulte Casadevall. “Passive Antibody Administration (Immediate Immunity) as a Specific Defense Against Biological Weapons”, Emerging Infections Diseases. 2002 ; 8 (8): 833-841.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Construtos de vacina de toxina tripla C. difficile [0117] Duas vacinas triplas contra toxinas foram construídas. Um diagrama da estrutura da proteína s é mostrado na Figura 1. A toxina tripla 1420 (também referida como BV1420) contém, do terminal N ao terminal C, um peptídeo do domínio de Ativação, um peptídeo CDTb maduro, um peptídeo TcdB RBD e um peptídeo TcdA RBD contendo 19 repetições (R19). Um sítio de divagem de furina (RARRRKKR; SEQ ID NO: 27) foi localizado entre o domínio de ativação e os peptídeos maduros de CDTb. As

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Figuras 2 e 3 mostram a proteína e a sequência genética do BV1470, respectivamente. Locais de ligação em cada extremidade do peptídeo TcdB.

EXEMPLO 2

Expressão da Vacina de Toxina Tripla [0118] As células Sf9 foram transformadas com um vetor de baculovírus que expressa a vacina tripla como um único transcrito. Os dados de expressão das células Sf9 são mostrados na Figura 2. A Figura 2 mostra a expressão de cada proteína colhida às 48 horas e às 72 horas. Surpreendentemente, mesmo que cada proteína tenha mais de 200kDa, é alcançada uma produção de alto nível. A Figura 7 mostra um curso de expressão no tempo de 48 horas a 96 horas. Os dados mostram que, para ambas as proteínas, a proteína é altamente solúvel.

EXEMPLO 3

Purificação da Vacina de Toxina Tripla [0119] Para solubilizar e purificar as partículas, Tergitol (NP9) foi adicionado diretamente à cultura de células para concentração final de 0,2% de NP9/25 mM de Tris/50 mM de NaCI/pH8,0. Incubar à temperatura ambiente por 1 hora e depois centrifugar o lisado a 9000 g por 30 min duas vezes. Recolheu o sobrenadante contendo as nanopartículas. O sobrenadante é, então, adicionado ao Tampão A e eluído no Tampão B (Tampão A: Tris 25 mM pH 8,0/NaCI 50 mM Tampão B: Tris 25 mM pH 8,0/NaCI 1 Μ). O eluato é aplicado às colunas Phenyl HP (Tampão A: Na-Citrato 350 mM/Tris 25 mM pH7,5 e Tampão B: Tris 5 mM pH8,0) e depois a uma coluna Fonte 30Q (Tampão A: Tris 25 mM pH8,0/250 mM de tampão NaCI B: Tris 25 mM, pH 8,0/1 M NaCI). As frações reunidas contendo o produto são passadas através de um filtro de 2 microns. Veja as Figuras 4-6. A purificação de 1470 a partir de Sf9 produziu 269 mg/litro de proteína. A purificação de 1420 a partir de células Sf9 produziu 166 mg/litro.

EXEMPLO 4

Análise de Partículas Triplas de Vacinas com Toxina

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38/46 [0120] A distribuição do tamanho de partícula por gráfico de volume para a toxina tripla BV1420 foi analisada por espalhamento dinâmico de luz com o uso de um Zeta Sizer Nano. O gráfico da distribuição de tamanho por volume é mostrado na Figura 7. O diâmetro médio foi de ~ 30 nm. A Figura 8 mostra a distribuição do tamanho de partícula por gráfico de intensidade para a toxina tripla BV1470. O diâmetro médio foi de ~ 18 nm.

[0121] A Figura 9 mostra várias eletromicrografias da toxina tripla corada negativa BV1420. A micrografia eletrônica da toxina tripla purificada BV1420 foi diluída para aproximadamente 10 ug/ml e corada negativamente com acetato de uranil.

EXEMPLO 5

Vacina de Toxina Tripla C.difficile: desafio de Toxina Letal e Sobrevivência Animal [0122] A Figura 10 fornece os resultados de um teste em camundongos da vacina de toxina tripla contra a toxina A e a toxina binária. Grupos 1-6 foram administrados antígeno BV1420 (30 μ g) ou PBS como mostrado. Os grupos 1 e 4 contêm 50 pg de Alum OH; Grupos 2 e 5 continha 50 pg de Alum OH e 50 pg de adjuvante ISCOM Matrix M. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14, com sangramentos nos dias 0, 14 e 32. Os camundongos foram desafiados com Toxina A ou Toxina Binária no Dia 35.

[0123] A Figura 11 mostra as respostas séricas de IgG. O PBS não induziu anticorpos, como esperado. As vacinas de toxina tripla, com Alum OH ou com Alum OJ e Matrix M, induziram titulações variando de cerca de 10 ⁴ a cerca de 10 ⁶ contra a toxina A, toxina B e CDTb. A Figura 12 estabelece que os anticorpos neutralizaram a toxina A e CTDb. A Figura 13 mostra a sobrevivência animal para os 6 grupos. Grupos 1,2, 4 e 5 mostraram 100% de sobrevivência. Exceto por dois camundongos no desafio da toxina binária, todos os animais nos grupos PBS controle morreram. Esses dados estabelecem que a vacina de toxina tripla protege contra o efeito das toxinas.

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39/46 [0124] Em um segundo estudo de desafio, para a toxina B, várias construções foram produzidas e testadas isoladamente ou em combinação. Os camundongos do grupo 1 foram administradas BV1420 (30 pg) com Alum OH. Grupo 2 os camundongos foram administrados BV1470 (30 pg) com Alum OH, Grupo 3 foi administrada uma proteína em tandem contendo VP6 de rotavirus e o RBD TcdB (10 pg) com Alum OH. Os camundongos do grupo 4 foram administrados BV1470 e VP6/TcdB RBD. O Grupo 5 foi administrado toxoide B (10 p g). O grupo 6 foi o controle e foi administrado PBS. A resposta anti-lgG é mostrada na Figura 15. Anticorpos de altas titulações foram obtidos em cada caso. Cada um dos grupos que contém o peptídeo Toxina A induziu respostas anti-Toxina A de alta titulação variando entre 10⁴ e cerca de 10⁵. Todos os grupos receberam o peptídeo Toxina B e cada um demonstrou uma alta titulação variando entre 10⁴ e cerca de 10⁶. Cada um dos grupos que contém o peptídeo da toxina binária induziu respostas de alta titulação variando entre 10⁵ e cerca de 10⁶. A Figura 16 estabelece que os anticorpos foram produzidos que neutralizaram a toxina B, com o toxoide B mostrando níveis mais altos.

[0125] A sobrevivência dos camundongos dos Grupos 16 é mostrada na Figura 17. Todos os camundongos do grupo de controle de PBS morreram no dia 3, com 5 de 6 mortos em um dia. A sobrevivência da toxina B foi de 100%. Para os grupos 1 a 4, as taxas de sobrevivência variaram de 67% a 83%.

EXEMPLO 6

Vacinas de toxina tripla adicionais [0126] Vacinas adicionais podem ser produzidas enquanto se obtém altos níveis de expressão. As Figuras 18 e 19 mostram proteínas de vacina trivalentes adicionais com o gene de translocações do gene TcdB. O BV1512 é mostrado no diagrama inferior. A Figura 18 mostra estruturas adicionais de vacinas: sequência proteica multimérica: Sequência da

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40/46 proteína vacinai multimérica BV1512 mostrando a proteína CDTb separada do domínio de translocação (TD) por um ligante AS e o TD separado da porção TcdAR19 por um ligante SR. A Figura 19 mostra a expressão da proteína multimérica BV1512 a partir de células Sf9.

EXEMPLO 7

Vacinas quadrivalentes [0127] Foram produzidas proteínas multiméricas contendo quatro peptídeos. Figura 20. Neste exemplo, um peptídeo de uma segunda cepa TcdB foi introduzido para ampliar a imunidade contra uma cepa adicional de C. difficile. A primeira proteína multipara quadrivalente (CBAB, ou pCDTb/TcdB63o/TcdAR19/TcdBo27) incluía um peptídeo TcdB da linhagem 027 adicionado no terminal C (consulte a Figura 20, diagrama superior). Em um segundo peptídeo multivalente quadrivalente, um peptídeo TcdB do peptídeo da cepa 027 foi introduzido entre a proteína TcdB e a proteína TcdA (R19) da primeira cepa, cepa 630 (consulte a Figura 20, diagrama inferior). A Figura 21 mostra a expressão do multímero quadrivalente CBBA a partir de células Sf9 como descrito acima. Os dados mostram que o rendimento obtido foi de 42 mg/l. Uma segunda proteína (CBBA, ou pCDTb/TcdB63o/TcdAR19/TcdBo27, como mostrado na Figura 26) também foi produzida no sistema Sf9 e alcançou um rendimento de 40 mg/l. Consulte a Figura 22.

EXEMPLO 8

Projeto, expressão e purificação de proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q [0128] Proteínas de fusão quiméricas foram construídas para codificar RBD de C. difficile TcdA, TcdB(oo3), TcdB(027) e CDTb. A sequência de aminoácidos RBD para TcdA foi derivada da cepa VPI 10463 de C. difficile (ATCC 43255), NCBI P16154 (toxinótipo 0, ribótipo 003); TcdB(oo3) da cepa VPI 10463 (ATCC 43255), NCBI P18177 (toxinótipo 0, ribótipo 003); TcdB(027) da cepa CD196, NCBI WP_009888442. 1 (toxinótipo III, ribótipo 027); e CDTb da cepa CD196, GenBank ABS57477. 1 (toxinótipo III, ribótipo 027).

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41/46 [0129] As sequências de codificação para TcdA RBD (truncado com 19 de 38 repetições), TcdB(oo3) e TcdB(027) RBDs (24 repetições cada) e CDTb foram otimizadas para expressão em células de insetos (GenScript).

[0130] As sequências nucleotídicas que codificam o fragmento do gene CDTb (aminoácidos 1-835), TcdA RBD (1314 pares de bases [bp], 6816-8130 pb) e TcdB(oo3) RBD (1608 pb, 5493-7098 pb) foram obtidas por amplificação por PCR a partir do gene sintetizado. Os fragmentos de genes amplificados por PCR foram digeridos com a enzima de restrição: CDTb com BamHI/Nhel; TcdB(oo3) RBD com Nhel/Xbal; e TcdA RBD com Xbal/Hindlll. Após digestão, os três genes foram ligados nos sítios BamH1 e Hindlll de pFastBad (Invitrogen). O plasmídeo que codifica os três RBDs foi usado para construir um baculovírus recombinante de Autographs californica Vírus da Poliedrose Nuclear Múltipla (AcMNPV) com o uso do sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac (Invitrogen) em células de inseto Spodoptera frugiperda (Sf9) para expressar a proteína de fusão trivalente, doravante referido como toxina T (Figura 23B).

[0131] O TcdB(₀27) RBD (1608 pb, 5493-7098) digerido com Spel/Hinlll foi fundido ao terminal C do gene de fusão trivalente para formar o plasmídeo e o baculovírus que codificam o RBD de todas as quatro toxinas, que foi expresso de maneira semelhante em Células Sf9 para produzir a proteína de fusão quadravalente, daqui em diante referida como toxina Q (Figura 23B; SEQ ID NO: 21).

[0132] A construto contém assim pCDTb: 835 aminoácidos de 1-835; cepa: CD196; toxinótipo: III, ribótipo: 027; GenBank: ABS57477. 1; TcdBoos: 536 aminoácidos de 838-1373; NCBI: P18177, CEPA = ATCC 4325/VPI 10463, Toxinótipo 0, Ribótipo: 087; TcdA: 438 aminoácidos de 1376-1813; NCBI: P16154, STRAIN = ATCC 4325/VPI 10463, Toxinótipo 0; Ribótipo: 087 e TcdBo27 : 536 aminoácidos de 1815-2351; NCBI: 013315, cepa CD196; toxinótipo: III, ibótipo: 027. Cada uma das porções é separada por um

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42/46 ligante de dois aminoácidos: AS entre a porção pCDTb e a porção TcdB003, SR entre a porção TcdB003 e a porção TcdA, TS entre a porção TcdA e a porção TcdB027.

[0133] As proteínas de fusão foram extraídas por lise detergente em um tampão compreendendo 0,2% de Tergitol NP-9 em tampão Tris 25 mM (pH 8,0), NaCI 250 mM e 2 pg/ml de leupeptina. Os lisados foram purificados por centrifugação e as proteínas de fusão foram purificadas com Fractogel EMD TMAE, fenil HP e cromatografia em coluna 30Q. A toxina Tea toxina Q purificadas foram formuladas em Tris 25 mM e NaCI 250 mM (pH 8,0) a aproximadamente 4,0 mg/ml e armazenadas a <-60 °C. A recuperação da toxina Tt purificada e da toxina Q foi de 267 e 154 mg/l, respectivamente. A toxina Tea toxina Q migram nos géis de SDS-PAGE com pesos moleculares de 205 kDa e 268 kDa, respectivamente, e pureza> 90% (Figura 23A). A análise de Western blot com anticorpos específicos para toxinas confirmou a expressão de CDTb, TcdB e TcdA em cada proteína de fusão (Figura 23B-D).

EXEMPLO 9

Imunoqenicidade das proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q em camundonqos [0134] Para avaliar a imunogenicidade das proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q, os estudos com camundongos foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Noble Life Sciences (IACUC). Camundongos C57BL/6 fêmeas (6-8 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0 e 14 com toxina T (30 ou 100 pg) ou toxina Q (100 pg) formulada com 50 pg de hidróxido de alumínio (alúmen) ou PBS (ao controle). O soro foi coletado 18 dias após a segunda dose. Os camundongos foram desafiados intraperitonealmente (IP) 3 semanas após a segunda imunização com uma dose letal mínima de 100% (MLDioo%) de TcdA, TcdB(oo3) ou CDTa e CDTb.

[0135] Os soros de camundongo foram avaliados quanto a anticorpos para as toxinas por ELISA. Placas de microtitulação MaxiSorp de

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43/46 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com cada toxina (2 pg/ml) durante a noite a 2-8 °C. Diluições em série de soros cinco vezes foram adicionadas às placas em duplicado. Os anticorpos ligados foram detectados com IgG de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Southern Biotech). Foi adicionado substrato de 3,3’,5,5’tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) e a reação foi interrompida com tampão de parada TMB (Scytek Laboratories). As placas foram lidas a 450 nm com um leitor de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices); os resultados foram analisados com o uso do software SoftMax P ro. As titulações foram relatadas como a diluição recíproca que resultou em uma leitura de 50% da DO 450nm máximo. Os valores das titulações registrados abaixo do limite inferior de detecção (LLOD) receberam um título 50 para o cálculo do GMT. As titulações de IgG no soro de camundongo após a imunização foram altos para TcdA, TcdB e CDT e comparáveis entre a toxina Tea toxina Q (Figura 25A).

[0136] As células Vero (CCL-81, ATCC) foram mantidas em DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (FBS) e antibióticos (Gibco). As diluições em série de soros de camundongo foram preparadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano (Thermo Scientific). Um volume igual (50 pl) de meio de ensaio (1x DMEM com 5% de FBS inativado pelo calor, 1x NEAA, 0,3% de dextrose, 1x penicilina/estreptomicina/glutamina, 0,006% de vermelho de fenol) contendo 2x dose citotóxica mínima de TcdA, TcdB, ou CDT foi adicionado ao soro diluído e incubado por 1 hora a 37 °C. Células Vero (7,5 x 10 ⁴ células/ml) em suspensão em 50 ml médio e 150 ul de óleo mineral estéril (Sigma) foram adicionados e as placas foram incubadas durante 6-7 dias a 37 °C. Após a incubação, as placas foram observadas quanto à cor do poço. Os meios e os poços de controle tratados com toxinas eram vermelho/rosa avermelhado; os poços de controle celular eram amarelo/amarelo-laranja. Para cada diluição da amostra, o último poço que foi amarelo/amarelo-alaranjado foi registrado como o título de neutralização do anticorpo do ponto final. Os valores das titulações

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44/46 registrados como cLLOD receberam um valor de 5 para o cálculo do GMT. As titulações de anticorpos neutralizantes de toxinas (TNA) para cada uma das três toxinas foram comparáveis entre as proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q (Figura 25B).

[0137] Três semanas após a segunda imunização, os camundongos foram desafiados a TcdB(oo3). O grupo vacinado com toxina Q teve sobrevida de 80% (p = 0,0043), enquanto 65% (p = 0,018) do grupo de toxina T sobreviveu ao desafio. Por outro lado, apenas 20% sobreviveram ao desafio de toxinas no grupo controle (Figura 25C).

EXEMPLO 10

Imunoqenicidade das proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q em hamsters [0138] Os hamsters sírios dourados (HsdHan: Aura; Harlan Laboratories), machos com idades entre 5-7 semanas e 70 a 100 gramas, receberam 3 imunizações em intervalos de 3 semanas com 30 pg de toxina Q e 120 pg de alúmen, ou PBS (controle), administrados IM na coxa alternada s. Duas semanas após a terceira imunização, o soro foi coletado e os animais foram tratados com 10 mg/kg de clindamicina IP. Um dia depois, os animais foram desafiados por gavagem com a cepa 630 ou NAP1 e foram observados durante 8 dias.

[0139] Os soros de hamster foram avaliados quanto a anticorpos para as toxinas por ELISA. Placas de microtitulação MaxiSorp de 96 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com cada toxina (2 pg/ml) durante a noite a 2-8 °C. Diluições em série de soros cinco vezes foram adicionadas às placas em duplicado. Os anticorpos ligados foram detectados com IgG antihamster de coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Southern Biotech). Foi adicionado substrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) e a reação foi interrompida com o TMB Stop Buffer (Scytek Laboratories). As placas foram lidas a 450 nm com um leitor de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices); os resultados foram analisados com o

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45/46 uso do software SoftMax P ro. As titulações foram relatadas como a diluição recíproca que resultou em uma leitura de 50% do OD 450nm máximo. Os valores das titulações registrados abaixo do limite inferior de detecção (LLOD) receberam um título 50 para o cálculo do GMT. Os hamsters imunizaram três vezes em intervalos de 3 semanas com a toxina Q produziram altas titulações de IgG para as toxinas TcdA, TcdB e CDTb (Figura 26A).

[0140] As células Vero (CCL-81, ATCC) foram mantidas em DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (FBS) e antibióticos (Gibco). Diluições em série duplas de soros de hamster foram preparadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano (Thermo Scientific). Um volume igual (50 pl) de meio de ensaio (1x DMEM com 5% de FBS inativado pelo calor, 1x NEAA, 0,3% de dextrose, 1x penicilina/estreptomicina/glutamina, 0,006% de vermelho de fenol) contendo 2x dose citotóxica mínima de TcdA, TcdB, ou CDT foi adicionado ao soro diluído e incubado por 1 hora a 37 °C. Células Vero (7,5 x 10⁴ células/ml) em suspensão em 50 ml médio e 150 ul de óleo mineral estéril (Sigma) foram adicionados e as placas foram incubadas durante 6-7 dias a 37 °C. Após a incubação, as placas foram observadas quanto à cor do poço. Os meios e os poços de controle tratados com toxinas eram vermelho/rosa avermelhado; os poços de controle celular eram amarelo/amarelo-laranja. Para cada diluição da amostra, o último poço que foi amarelo/amarelo-alaranjado foi registrado como o título de neutralização do anticorpo do ponto final. Os valores das titulações registrados como cLLOD receberam um valor de 5 para o cálculo do GMT. As titulações de TNA para cada uma das três toxinas foram comparáveis entre as proteínas de fusão da toxina T e da toxina Q (Figura 31B).

[0141] Após o tratamento com clindamicina, os animais infectados com a cepa de C. difficile 630 tiveram 90% de sobrevivência (Figura 26C), enquanto os animais infectados com NAP1 tiveram 75% de sobrevivência (Figura 31 D). Todos os animais do grupo placebo morreram dentro de 48 a 72 horas após a infecção por qualquer uma das cepas.

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INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0142] Cada uma das patentes e aplicativos publicados identificados aqui são incorporados aqui para todos os fins.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo imunogênico multivalente caracterizado pelo fato de que compreende porções de pelo menos quatro proteínas da toxina C. difficile.
2. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as porções são selecionadas do grupo de toxinas que consistem em toxina binária (CDT), proteína da toxina A (TcdA) e toxina B (TcdB).
3. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as porções são de uma proteína CDT, uma proteína da Toxina A e duas proteínas da Toxina B, em que as proteínas da Toxina B são de cepas distintas de C. difficile.
4. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da Toxina B é de uma cepa epidêmica.
5. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cepa epidêmica é a cepa NAP1 (TcdB₍o27)).
6. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um da porção da Toxina B é da cepa 630 (TcdB(oo3)).
7. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as porções são orientadas com a Porção da Toxina A entre as duas porções da Toxina B.
8. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção de CDT é Nterminal para uma ou ambas as porções da Toxina B.
9. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção de CDT tem uma sequência de aminoácidos que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 22 ou

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2/4 uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia com a sequência.
10. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma das porções da Toxina B tem uma sequência de aminoácidos que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de homologia com a sequência.
11. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda porção da Toxina B tem uma sequência de aminoácidos que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia com a sequência.
12. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção da Toxina A tem uma sequência de aminoácidos que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de homologia com a sequência.
13. Peptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as porções são separadas por um ligante de dois aminoácidos, um ligante de três aminoácidos ou um ligante de quatro aminoácidos.
14. Peptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as porções são separadas por um ligante de dois aminoácidos e o ligante é selecionado do grupo que consiste em Alanina-Serina (AS), Leucina-Ácido Glutâmico (LE) e SerinaArginina (SR).
15. Polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
16. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de

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3/4 que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
17. Método para preparar o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) expressar o polipeptídeo em uma célula hospedeira de inseto, (b) purificar o polipeptídeo na presença de um detergente não iônico sob a forma de uma nanopartícula, e (c) suspender a nanopartícula em um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de inseto é uma célula Sf9.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira do inseto é transfectada com um construto de baculovírus recombinante sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo.
20. Composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
21. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um adjuvante.
22. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante à base de saponina.
23. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que o adjuvante à base de saponina contém Matriz da Fração A e Matriz da Fração C.
24. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que a quantidade de

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Matriz da Fração A é de cerca de 85% a cerca de 92% e o restante é Matriz da Fração C.
25. Uso de um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou do ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da infecção por Clostridium Difficile.
26. Nanopartícula caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo imunogênico multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um detergente não iônico.