PL190237B1

PL190237B1 - Kompozycja adiuwantowa, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji adiuwantowej oraz zastosowanie

Info

Publication number: PL190237B1
Application number: PL98336698A
Authority: PL
Inventors: Thomas R. Crane
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2005-11-30
Also published as: EP0971739B1; EP0971739A2; HUP0001403A3; DE69826842D1; WO1998043670A2; NO994760L; DE69826842T2; AU743114B2; CN1575815A; TR199902437T2; IL132126A0; BR9811262A; JP5019494B2; PL336698A1; KR20010005882A; CA2284586A1; CN1259052A; NZ338101A; ES2227825T3; KR100603884B1

Abstract

1. Kompozycja adiuwantowa zawierajaca adiuwant w wodzie oraz ponadto srodek po- wierzchniowo czynny, znamienna tym, ze jako adiuwant zawiera atenuowana pochodna lipidu A wybrana z grupy obejmujacej monofosforylolipid A i 3-O-deacylowany mo nofosforylolipid A, przy czym woda jest wolna od wspólrozpuszczalnika, a stosunek molowy monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A do srodka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1-2:1. 10. Szczepionka zawierajaca adiuwant w rozpuszczalniku, znamienna tym, ze zawiera kompozycje adiuwantowa okreslona w zastrz. 1, przy czym adiuwant stanowi monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, a rozpuszczalnik stanowi woda wolna od wspól- rozpuszczalnika. 12. Sposób wytwarzania kompozycji adiuwantowej okreslonej w zastrz. 1, znamienny tym, ze laczy sie monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i srodek po- wierzchniowo czynny, przy czym monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i srodek powierzchniowo czynny sa rozpuszczone i dokladnie zmieszane z rozpuszczalnikiem, odparowuje sie rozpuszczalnik, dodaje sie wody i ponownie wytwarza sie zawiesine monofosfory- lolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A 1 srodka powierzchniowo czynnego, zawiesine podczas ogrzewania poddaje sie dzialaniu ultradzwieków az do wyklarowania. 21. Zastosowanie kompozycji adiuwantowej okreslonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej lub odpowiedzi IgA na wydzielanie sluzu i w surowicy zwierzecia cieplokrwistego na antygen bialkowy zdolny do wywolywania odpowiedzi immunolo- gicznej u zwierzecia. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja adiuwantowa, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji adiuwantowej oraz zastosowanie.

Związki, monofosforylolipid A (MLA) i 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (3D-MLA), stanowią atenuowane pochodne lipidowego składnika A bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS). LPS i lipid A są mocnymi immunostymulatorami wywołującymi u pacjentów, którym podaje się te związki, zarówno odpowiedź humoralną pobudzaj ącą wytwarzanie przeciwciał, jak i pośredniczoną przez komórki odpowiedź immunologiczną. Jednakże lipid A i LPS mogą także wywoływać toksyczne skutki uboczne, takie jak działanie gorączkotwórcze i miejscowe odczyny Shwarzmana. MLA i 3D-MLA są cząsteczkami podobnymi do lipidu A, zmodyfikowanymi w celu osłabienia toksyczności LPS.

Podobnie jak lipid A, cząsteczki MLA i 3D-MLA zawierają szkielet cukrowy, do którego są przyłączone długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Szkielet stanowią dwa pierścienie cukrowe o 6 atomach węgla, połączone wiązaniem glikozydowym. MLA i 3D-MLA są fosforylowane w pozycji 4. Do szkieletu cukrowego przyłączonych jest 5-8 długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (12-14 atomów węgla), co powoduje, że MLA i 3D-MLA są bardzo hydrofobowymi cząsteczkami, które nie rozpuszczają się łatwo w wodzie.

Atenuowane pochodne lipidu A (ALD), MLA i 3D-MLA, są stosowane jako immunologiczne adiuwanty w szczepionkach profilaktycznych w przypadku chorób zakaźnych, oraz w szczepionkach terapeutycznych w leczeniu rakowatych nowotworów i przewlekłych infekcji. Preparaty antygenowe wchodzące w skład większości szczepionek często stanowią złożo4

190 237 ne mieszaniny rozpuszczalnych w wodzie białek, co utrudnia wprowadzanie nierozpuszczalnego w wodzie adiuwanta do szczepionek opartych na wodzie. Z tego względu MLA i 3D-MLA należy najpierw zmieszać z rozpuszczalnikami, przed dodaniem do preparatu antygenowego. Jednakże obecność rozpuszczalników może skomplikować formułowanie szczepionki, a w pewnych przypadkach nawet zmniejszyć skuteczność jej składników. Ponadto rozpuszczalniki mogą podrażniać powierzchnie błony śluzowej lub powodować stan zapalny w miejscu iniekcji. Prosty preparat MLA lub 3D-MLA, nie zawierający zakłócających współrozpuszczalników, umożliwiłby osiągnięcie maksymalnych korzyści dzięki zastosowania zarówno adiuwanta, jak i antygenu w szczepionce. Wynalazek spełnia to zapotrzebowanie.

Zatem wynalazek dotyczy kompozycji adiuwantowej zawierającej adiuwant w wodzie oraz ponadto środek powierzchniowo czynny, której cechą jest to, że jako adiuwant zawiera atenuowaną pochodną lipidu A wybraną z grupy obejmującej monofosforylolipid A i 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, przy czym woda jest wolna od współrozpuszczalnika, a stosunek molowy monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 -2:1.

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, która jako atenuowaną pochodną lipidu A zawiera monofosforylolipid A.

Korzystna jest kompozycja według wynalazku, która jako atenuowaną pochodną lipidu A zawiera 3-O-deacylowany monofosforylolipid A.

Korzystnie środek powierzchniowo czynny jest wybrany z grupy obejmującej glikodeoksycholan, deoksycholan, sfingomielinę, sfingozynę, fosfatydylocholinę, 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę, L-cx-fosfatydyloetanoloaminę i l,2-di.palmitoilo-^s^r^-^£^li.c^£^t^o-3-io)sibc.holinę oraz ich mieszaniny, korzystniej l,2-dipałmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC).

Korzystnie stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 4:1.

Korzystnie kompozycja według wynalazku stanowi czystą wodną zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i środka powierzchniowo czynnego.

Szczególnie korzystnie kompozycja według wynalazku stanowi zawiesinę zawierającą cząstki o wielkości 50 - 70 nm.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera monofosforylolipid A lub 3-O-deacyłowany monofosforylolipid A, środek powierzchniowo czynny i wodę.

Wodne preparaty MLA (MLA/AF) łub 3D-MLA (3D-MLA/AF) eliminują konieczność stosowania niepożądanych układów rozpuszczalników lub współrozpuszczalników w szczepionkach. Trwała wodna kompozycja atenuowanej pochodnej lipidu (ALD) i środka powierzchniowo czynnego według wynalazku, po podaniu myszom wraz z antygenem, wzmacnia komórkową i humoralną odpowiedź immunologiczną zwierzęcia na antygen. Nieoczekiwanie wodny preparat według wynalazku wywołuje wysokie poziomy wydzielonej, surowiczej i śluzówkowej IgA u zwierząt po podaniu do nosa.

Wynalazek dotyczy także szczepionki zawierającej adiuwant w rozpuszczalniku, której cechą jest to, że zawiera powyżej zdefiniowaną kompozycję adiuwantową, przy czym adiuwant stanowi monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, a rozpuszczalnik stanowi woda wolna od współrozpuszczalnika.

Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera powyżej zdefiniowaną kompozycję adiuwantową i antygen.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania powyżej zdefiniowanej kompozycji adiuwantowej, który polega na tym, że łączy się monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny, przy czym monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny są rozpuszczone i dokładnie zmieszane z rozpuszczalnikiem, odparowuje się rozpuszczalnik, dodaje się wody i ponownie wytwarza się zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i środka powierzchniowo czynnego, zawiesinę podczas ogrzewania poddaje się działaniu ultradźwięków aż do wyklarowania.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku rozpuszcza się jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych w rozpuszczalniku, miesza się rozpuszczone środki powierzchniowo czynne z atenuowaną pochodną lipidu A wybraną z grupy obejmującej mono190237 fosforylolipid A i 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, odparowuje się rozpuszczalnik z otrzymanej mieszaniny, do odparowanej mieszaniny dodaje się wody i wytwarza się zawiesinę atenuowanej pochodnej lipidu A w wodzie, przy czym stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 - 2:1 oraz zawiesinę ogrzewa się i poddaje działaniu ultradźwięków aż do wyklarowania.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się środek powierzchniowo czynny wybrany z grupy obejmującej glikodeoksycholan, deoksycholan, sfingomielinę, sfmgozynę, fosfatydylocholinę, 1,2-dimirystoilo-sn-gbcero-3-fosfoetanoloaminę, L-a-fosfatydyloetanoloaminę i l,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę oraz ich mieszaniny.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 4:1.

W sposobie według wynalazku korzystnie końcowy produkt stanowi klarowną wodną zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i środka powierzchniowo czynnego.

W sposobie według wynalazku stosuje się rozpuszczalnik korzystnie wybrany z grupy obejmującej chloroform, alkohole, dimetylosulfotlenek i dimetyloformamid oraz ich mieszaniny, zwłaszcza etanol.

W sposobie według wynalazku korzystnie zawiesinę ogrzewa się do temperatury 60-80°C, zwłaszcza 60°C.

W sposobie według wynalazku korzystnie zawiesinę poddaje się obróbce ultradźwiękami przez 5-60 minut, zwłaszcza przez 10 minut.

Zgodnie z jedną postacią sposobu wytwarzania wodnej kompozycji według wynalazku ALD i środek powierzchniowo czynny rozpuszcza się i dokładnie miesza z etanolem. Następnie etanol odparowuje się i otrzymuje się błonę. Do błony dodaje się wody. ALD i środek powierzchniowo czynny dysperguje się w wodzie przez obróbkę ultradźwiękami. Obróbkę ultradźwiękami prowadzi się aż do otrzymania klarownej zawiesiny.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej zdefiniowanego sposobu do wytwarzania szczepionki.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej zdefiniowanej kompozycji adiuwantowej do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej lub odpowiedzi IgA na wydzielanie śluzu i w surowicy zwierzęcia ciepłokrwistego na antygen białkowy zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej zdefiniowanej kompozycji do wytwarzania leku, który stanowi klarowną, wolną od rozpuszczalnika ciecz wodną zawierającą monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A 3D-MLA, wodę i środek powierzchniowo czynny, przy czym stosunek molowy monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 - 2:1. Korzystnie lek stanowi szczepionka..

Zwierzęta, którym podano zastrzeżoną kompozycję z antygenem, wykazują wzmocnioną humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną na antygen.

Zgodnie z wynalazkiem atenuowaną pochodną lipidu A można formułować w postaci wodnej kompozycji z wytworzeniem mocnego adiuwanta. Atenuowaną pochodną lipidu A stanowi związek podobny do lipidu A, wykazujący korzystne właściwości immunostymulujące lipidu A, ale wywołujący mniej niepożądanych skutków ubocznych niż ten związek. Przykładowo monofosforylolipid A (MLA) i 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (3D-MLA) to pochodne ALD będące silnymi immunostymulatorami, ale o zaskakująco mniejszej toksyczności niż lipid A. W kompozycjach według wynalazku można stosować zarówno MLA, jak i 3D-MLA, przy czym są one dobrze znane i nie trzeba ich szczegółowo opisywać. Patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4436727 z 13 marca 1984 r., dla Ribi bnmunoChem Research, Inc., w którym ujawniono monofosforylolipid A i jego wytwarzanie. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4912094 i świadectwie powtórnego badania BI 4912094, Myers i inni, również dla Ribi ImmunoChem Research, Inc., ujawniono 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i sposób jego wytwarzania.

Bez szczegółowego opisywania stanu ujawnionego we wspomnianych opisach, stosowany tu monofosforylolipid A (MLA) pochodzi od lipidu A, składnika enterobakteryjnych

190 237 lipopolisacharydów (LPS), mocnego, ale wysoce toksycznego modulatora układu odpornościowego. Edgar Ribi i współpracownicy opracowali sposób wytwarzania monofosforylolipidu A (MLA), określanego początkowo jako oczyszczona odtruta endotoksyna. MLA wytwarza się przez ogrzewanie ekstraktu endotoksyny (LPS lub lipidu A), otrzymanego z pozbawionych heptozy mutantów Gram-ujemnych bakterii w roztworach kwasu mineralnego o umiarkowanej mocy (np. 0,1 N HC1), w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez około 30 minut. W wyniku tej obróbki zostaje usunięta grupa fosforanowa znajdująca się w pozycji 1 redukującego końca glukozaminy.

Równocześnie podczas tej obróbki usuwany jest rdzeniowy węglowodan z pozycji 6 nieredukującej glukozaminy. Otrzymany produkt (MLA) wykazuje znacząco atenuowany poziom aktywności endotoksycznej, zwykle związanej z wyjściowym materiałem endotoksynowym, takiej jak działanie gorączkotwórcze, miejscowy odczyn Shwarzmana i toksyczność, ocenianą na podstawie dawki śmiertelnej (50%) w teście na embrionach kurczaka (CELD₅o). Jednakże nieoczekiwanie zostaje zachowane działanie lipidu A i LPS jako imtnunomodulatora.

Inna atenuowana pochodna lipidu A, którą można stosować w realizacji wynalazku, jest określana jako 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (3D-MLA). 3D-MLA jest znany z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4912094, świadectwa powtórnego badania BI 4932094 (patent Ό94) i różni się od MLA tym, że z cząsteczki MLA została selektywnie usunięta grupa acylowa pochodząca z kwasu β-hydroksymirystynowego, połączona wiązaniem estrowym z redukującym końcem glukozaminy w pozycji 3 w warunkach, które nie wpływają niekorzystnie na inne grupy. 3-O-Deacylowany monofosforylolipid A jest dostępny z Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840.

Cząsteczki MLA i 3D-MLA stanowią kompozycję lub mieszaninę o różnych układach podstawienia kwasami tłuszczowymi, takich jak np. heptaacyl, heksaacyl, pentaacyl itp., o różnych długościach łańcuchów ugrupowań kwasów tłuszczowych. Zatem zakresem wynalazku są objęte różne postacie MLA i 3D-MLA. Ponadto zakresem wynalazku są objęte mieszaniny postaci tych związków oraz poszczególne związki wytworzone sposobami syntetycznymi lub półsyntetycznymi. Szkielet lipidu A podany w patencie '094 odpowiada produktowi otrzymanemu przez 3-deacylowanie heptaacylowego lipidu A z S.minnesota R 595. Ujawnienie to obejmuje inne układy podstawienia kwasami tłuszczowymi, podstawową cechą jest to, że produkt jest 3-O-deacylowany.

Zmodyfikowany 3D-MLA stosowany zgodnie z wynalazkiem wytwarza się przez poddanie MLA hydrolizie alkalicznej w takich warunkach, że następuje usunięcie tylko jednej reszty kwasu tłuszczowego z pozycji 3 szkieletu lipidu A. Ugrupowanie kwasu 15-hydroksymirystynowego w pozycji 3 jest niezwykle labilne w środowisku alkalicznym. Do całkowitego 3-deacylowania lipidu A wystarcza jedynie bardzo łagodna obróbka alkaliczna. Inne wiązania estrowe w lipidzie A wymagają nieco mocniejszych warunków do zajścia hydrolizy, tak że można selektywnie deacylować takie substancje w pozycji 3 bez znaczącego wpływania na resztę cząsteczki. Przyczyna niezwykłej wrażliwości wiązania estrowego z ugrupowaniem 15-hydroksymirystynowego kwasu tłuszczowego w pozycji 3 na środowisko alkaliczne nie jest obecnie znana.

Jakkolwiek sposoby hydrolizy alkalicznej są znane, istotny jest dobór takich warunków, aby nie spowodować dalszej hydrolizy poza hydrolizą wiązania estrowego do ugrupowania kwasu β-hydroksymirystynowego w pozycji 3. Hydrolizę można zasadniczo przeprowadzić w środowisku wodnym lub organicznym. W tym ostatnim przypadku można stosować takie rozpuszczalniki jak metanol (alkohole), dimetylosulfotlenek (DMSO), dimetyloformamid (DMF), chloroform, dichlorometan itp., oraz ich mieszaniny. Można też stosować mieszaniny wody i jednego lub większej liczby wymienionych rozpuszczalników organicznych.

Zasadę alkaliczną można wybrać spośród różnych wodorotlenków, węglanów, fosforanów i amin. Do przykładowych zasad należą zasady nieorganiczne, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, węglan sodu, węglan potasu, wodorowęglan sodu, wodorowęglan potasu itp., oraz zasady organiczne, takie jak alkiloaminy, takie jak, lecz nie wyłącznie, dietyloamina, trietyloamina itp.

190 237

W środowisku wodnym pH wynosi zazwyczaj od około 10 do 14, przy czym korzystny zakres pH wynosi od około 12 do około 13,5. Reakcję hydrolizy zwykle prowadzi się w temperaturze od około 20°C do około 80°C, korzystnie od około 50°C do 60°C przez okres czasu od około 10 do około 30 minut. Przykładowo hydrolizę można prowadzić w 3% roztworze trietyloaminy w wodzie w temperaturze pokojowej (22-25°C) przez okres 48 godzin. Jedynym wymaganiem w doborze temperatury i czasu jest to, aby deacylowanie doprowadziło do usunięcia tylko ugrupowania kwasu P-hydroksymirystynowego w pozycji 3.

W praktyce stwierdzono, że szczególnie dogodny sposób hydrolizy polega na rozpuszczeniu lipidu A lub monofosforylolipidu A w mieszaninie chloroform:metanol 2:1 (v/v), nasyceniu roztworu wodnym buforem w postaci 0,5 M Na₂CO₃ o pH 10,5 i rzutowym odparowaniu rozpuszczalnika w 45-50°C pod próżnią lub z użyciem pompki ssawkowej (około 13,33 kPa). Otrzymany produkt jest selektywnie deacylowany w pozycji 3. W tym sposobie można również stosować dowolne z zasad nieorganicznych wymienionych powyżej. W pewnych przypadkach może być pożądany dodatek katalizatora przenoszenia międzyfazowego, takiego jak bromek tetrabutyloamoniowy, do roztworu organicznego przed nasyceniem wodym buforem.

Przy wytwarzaniu kompozycji według wynalazku zwykle atenuowaną pochodną lipidu A (ALD) łączy się ze środkiem powierzchniowo czynnym, przy czym każda z tych substancji jest rozpuszczona w rozpuszczalniku. Rozpuszczalnik odparowuje się i otrzymuje się błonę. Do błony dodaje się wody i otrzymaną zawiesinę poddaje się obróbce ultradźwiękami, w warunkach ogrzewania, aż do wyklarowania. Otrzymuje się zawiesinę o wielkości cząstek około 40-150 nm, korzystnie od około 50 do około 70 nm.

ALD i środek powierzchniowo czynny łączy się w stosunku molowym 10 części ALD na około 1-5 części środka powierzchniowo czynnego. Korzystnie składniki łączy się w stosunku molowym wynoszącym około 4 części ALD na 1 część środka powierzchniowo czynnego. Zgodnie z wynalazkiem do przydatnych środków powierzchniowo czynnych należą lecz nie wyłącznie, sole żółciowe, naturalne fosfolipidy i sfingolipidy. Jako środki powierzchniowo czynne w zastrzeżonych kompozycjach są przydatne sole żółciowe, takie jak glikodeoksycholan i deoksycholan. Do innych odpowiednich środków powierzchniowo czynnych należą sfingolipidy, takie jak sfingomielina i sfmgozyna, oraz fosfolipidy, takie jak fosfatydylocholina z jaj, l,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina, L-a-fosfatydyloetanoloamina i l,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina lub ich mieszaniny. W korzystnej postaci, środek powierzchniowo czynny stanowi fosfolipid l,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fbsf'ocholina (DPPC). DPPC jest dopuszczona do stosowania u ludzi i jest szczególnie skuteczna przy podawaniu preparatu donosowo.

ALD i środek powierzchniowo czynny rozpuszcza się i dokładnie miesza w rozpuszczalniku. Zgodnie z wynalazkiem do użytecznych wodnych lub organicznych rozpuszczalników należą chloroform, alkohole (np. etanol), dimetylosulfotlenek (DMSO), dimetyloformamid (DMF) itp., a także ich mieszaniny.

Rozpuszczalnik odparowuje się z mieszaniny ALD i środka powierzchniowo czynnego i otrzymuje się błonę. Do błony dodaje się wody i otrzymaną zawiesinę poddaje się obróbce ultradźwiękami, w warunkach ogrzewania, aż do wyklarowania. Korzystnie zawiesinę poddaje się obróbce ultradźwiękami w ultradźwiękowej łaźni wodnej. Temperatura łaźni wodnej może wynosić od 40°C do 80°C, korzystnie około 60°C. Zawiesinę można poddawać obróbce ultradźwiękami przez okres od 5 minut do około 1 godziny, aż do wyklarowania. Okres obróbki ultradźwiękowej będzie zmieniać się w zależności od objętości i stężenia zawiesiny, lecz może być łatwo ustalony przez fachowca. Końcowa zawiesina zawiera cząstki o wielkości około 40-150 nm, korzystnie od około 50 do około 70 nm.

Skuteczną ilość kompozycji według wynalazku podaje się zwierzęciu ciepłokrwistemu wraz z antygenem w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej zwierzęcia na antygen. Kompozycja według wynalazku wzmacnia zarówno humoralną odpowiedź immunologiczną zwierzęcia na antygen, jak i komórkową odpowiedź immunologiczną. Ilość podawanego antygenu w celu wywołania żądanej odpowiedzi może łatwo ustalić fachowiec, przy czym zmienia się ona w zależności od typu podawanego antygenu, drogi podawania i schematu szczepienia. Przykładowo 0,1 pg toksoidu tężca podawanego wraz z zastrzeżoną kompozycją

190 237 podskórnie myszy w dwóch szczepieniach w odstępie 21 dni wywołuje humoralną odpowiedź immunologiczną na antygen. Po podaniu donosowym kompozycja według wynalazku i antygen pobudzają wytwarzanie cytotoksycznych limfocytów T. Powierzchniowy antygen zapalenia wątroby typu B (2,5 pg) podawany donosowo w dniach 0 i 21 w zastrzeżonej kompozycji pobudzal wytwarzanie cytotoksycznych limfocytów T u immunizowanych zwierząt. Ponadto kompozycja według wynalazku jest szczególnie skuteczna w wywoływaniu odpowiedzi IgA u immunizowanych zwierząt, przy podawaniu donosowo. Myszy, którym podawano 0,5-2.2,5 pg toksoidu tężca w wodnym preparacie 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A (3D-MLA/AF) wykazywały wzrost miana IgA na antygen. Skuteczną ilość kompozycji według wynalazku stanowi taka ilość, która pobudza lub wzmacnia odpowiedź immunologiczną. Przykładowo skuteczna ilość zastrzeżonej kompozycji może zawierać od 1 do około 250 pg atenuowanej pochodnej lipidu A, korzystnie od około 25 do około 50 jag przy podawaniu typowemu dorosłemu pacjentowi o wadze 70 kg.

Poniższe przykłady dokładniej ilustrują kompozycje i sposób według wynalazku, ale go nie ograniczają. Należy zdawać sobie sprawę, że przedstawione modele mysie są reprezentatywne dla zwierząt cieplokrwistych i zapewniają dobrą korelację z przebiegiem u innych zwierząt cieplokrwistych i u ludzi. Wszystkie udziały procentowe podano wagowo, a wszystkie proporcje rozpuszczalników w mieszaninach to proporcje objętościowe, o ile nie zaznaczono inaczej.

Przykład 1. Wytwarzanie wodnego preparatu atenuowanej pochodnej lipidu A

Wodny preparat 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A (3D-MLA/AF) według wynalazku, zawierający 1000 pg/ml 3D-MLA (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hatnilton, Montana 59840), atenuowaną postać lipidu A z Salmonella minnesota R 595 i 118 pg/ml 1,2 dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) w wodzie do iniekcji wytworzono w następujący sposób:

Przygotowano roztwór DPPC o stężeniu 4 mg/ml w etanolu i mieszano w vorteksie aż do wyklarowania. Podwielokrotną porcję 2,7 ml roztworu DPPC dodano do fiolki zawierającej 100 mg liofilizowanego 3D-MLA i powoli obracano fiolkę dla zwilżenia 3D-MLA. Etanol usunięto przez łagodne przedmuchiwanie fiolki strumieniem przefiltrowanego azotu. Do fiolki dodano wody do iniekcji (91,7 ml), po czym fiolkę zakorkowano, uszczelniono i zawieszono w ultradźwiękowej łaźni wodnej Labline 9303. Zawiesinę poddawano obróbce ultradźwiękami przez 10 minut w 60°C, do wyklarowania. Otrzymany wodny preparat zawierający cząstki o wielkości 70 nm, oznaczonej w aparacie PSC100 Spectrometer z Malvern Instrument, wyjałowiono drogą filtracji przez filtr 0,2 pm.

Przykład 2. Pobudzanie odpowiedzi na przeciwciało

Myszy immunizowane toksoidem tężca (TT) w wodnym preparacie według wynalazku wytwarzały przeciwciało specyficzne względem toksoidu tężca. Całkowite miano IgG i miana izotypów IgG (2a, 2b, 1) specyficznych względem TT oznaczono przeprowadzając enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) z użyciem surowicy myszy po itnmunizacji.

Samice myszy ICR immunizowano dawką szczepionki zawierającej 0,1 pg toksoidu tężca (TT) + 50 pg 3D-MLA/AF lub 0,1 pg TT w roztworze soli fizjologicznej. 3D-MLA7AF otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Szczepionki podawano drogą iniekcji podskórnej w dniach 0 i 21. Surowicę zebrano 14 dni po drugiej immunizacji i zanalizowano standardowymi technikami ELISA w celu określenia względnych ilości specyficznych względem toksoidu tężca izotypów przeciwciał IgG1, IgG₂a i IgG₂b oraz całkowitej IgG.

Na figurze 1 a-d przedstawiono miana przeciwciał u myszy, którym podano antygen toksoidu tężca (TT) w wodnym preparacie 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A (3D-MLA/AF) * lub antygen toksoidu tężca w roztworze soli. Na fig. 1a przedstawiono całkowite miano przeciwciał IgG u myszy, którym podano antygen toksoidu tężca. Na fig. 1b przedstawiono całkowite miano przeciwciał IgG₂a u myszy, którym podano antygen toksoidu tężca. Na fig. 1c przedstawiono całkowite miano przeciwciał IgG₂b u myszy, którym podano antygen toksoidu tężca, a na fig. 1d przedstawiono miano przeciwciał IgC u zwierząt.

3D-MLA/AF podawany z antygenem toksoidu tężca pobudzał wytwarzanie przeciwciała IgG u immunizowanych zwierząt, a zwłaszcza aktywnie pobudzał wytwarzanie IgG₂a.

190 237

Przykład 3. Pobudzanie proliferacji komórek

Myszy zaszczepione przez immunizację adiuwantem według wynalazku i oczyszczoną pochodną białka (PPD) (tuberkuliną) wykazywały proliferacyjną odpowiedź in vitro, gdy komórki śledziony potraktowano antygenem.

Samice myszy BALB/c immunizowano przez podskórną iniekcję dawki szczepionek zawierających 50 pg PPD + 50 pg 3D-MLAAE. 3D-MLA/AF otrzymano w sposób podany w przykładzie 1.

Komórki śledziony zebrano w 14 dni po immunizacji i użyto jako źródło limfocytów w teście proliferacji. Komórki śledziony hodowano przez 96 godzin w studzienkach do mikromianowania w stężeniu 10⁶ komórek/ml w pożywce zawierającej 0,1, 1 lub 10 pg PPD/ml. Do hodowli dodano irytowanej tymidyny w końcowych 24 godzinach inkubacji. Komórki zebrano na filtrach z włókna szklanego i oznaczono włączony tryt. Wskaźniki pobudzenia określono przez podzielenie impulsów/minutę (CPM) w przypadku komórek pobudzanych PPD przez CPM w przypadku komórek hodowanych w samej pożywce. Na fig. 2 przedstawiono odpowiedź proliferacyjną komórek T u myszy immunizowanych oczyszczoną pochodną białkową. Przedstawiono odpowiedź proliferacyjną u myszy, którym podano toksoid tężca w 3D-MLA/AF * i u normalnych myszy kontrolnych w 14 dni po pierwszym szczepieniu.

Przykład 4. Pobudzanie odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T

Wywoływanie odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T po podaniu wodnego adiuwanta według wynalazku i antygenu białkowego określono w teście cytotoksyczności. Grupę myszy C57/BL/6 poddano pierwszej immunizacji podskórnie (w obszarze pachwinowym) zużyciem 25 pg albuminy jaja kurzego (OVA) w 3D-MLA/AF. 3D-MLA/AF otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Wstrzykiwana objętość wynosiła 200 pl. Po 21 dniach 3 myszy z każdej grupy uśmiercono, po czym śledziony usunięto i zebrano jako pojedyncze zawiesiny komórek, które następnie zliczono.

Komórki śledziony (75 x 106 komórek w 3-4 ml pożywki) z grup doświadczalnych umieszczono w kolbie T o pojemności 25 cm³. Następnie do kolby dodano 1,0 ml napromienionych (20000 rad) komórek E.G7 (OVA) w ilości 5 x 106/ml. Objętość doprowadzono do 10 ml. Hodowle utrzymywano przez zanurzenie w pozycji stojącej w inkubatorze w 37°C. 5% CO₂, przez 4 dni. W dniu 4 żywe komórki odzyskano z kolb, przemyto 1 raz, ponownie zawieszono w 5,0 ml i zliczono.

Odzyskane komórki efektorowe doprowadzono do stężenia 5 x 106 żywych komórek/ml i porcje o objętości 100 pl kolejno trzykrotnie rozcieńczono w studzienkach na płytkach o 96 okrągłodennych studzienkach (Corning 25850) z użyciem 100 pl pożywki/studzienkę jako rozcieńczalnika. Następnie do studzienek dodano po 100 pl znaczonych ⁵¹ Cr komórek docelowych (patrz poniżej) [E.G7 (OVA)- linia komórek EL-4 transfekowana genem albuminy jaja kurzego] w ilości 1 x 105 komórek/ml. Studzienki z samorzutnym uwalnianiem (SR) zawierały 100 pl komórek docelowych i 100 pl pożywki. Studzienki z maksymalnym uwalnianiem (MR) zawierały 100 pl komórek docelowych i 100 pl detergentu (2% Tween 20). Stosunek komórki efektorowe/komórki docelowe (E/T) wynosił 50:1., 25:1., 12,5:1, 6,25:1. Płytki odwirowano przy 400 x g i inkubowano w 37°C, 5% CO 2 przez 4 godziny. Po inkubacji supematanty ze studzienek zebrano z za-stosowaniem układu Skatron Supernatant Collection System.

Procent specyficznej lizy = 100 (Uwaln.exp.-SR ) (mr-sr)

Komórki docelowe, E.G7 (OVA), oznakowano 51Cr (chromian sodu) w następujący sposób. W łącznej objętości 1,0 ml zmieszano 5 x 106 komórek docelowych i 250 pCi ³¹ Cr w 15 ml kolbie stożkowej. Zawiesiny komórek inkubowano w łaźni wodnej w 37°C przez 90 minut, przy czym łagodnie je mieszano co 15 minut. Po inkubacji znaczone komórki przemyto 3x przez odwirowanie i dekantowanie 15 ml pożywki. Po trzecim odwirowaniu komórki ponownie zawieszono w 10 ml świeżej pożywki i odstawiono w temperaturze pokojowej na 30 minut, po czym odwirowano. Na koniec komórki zawieszono w pożywce do uzyskania stężenia 1 x 105 komórek/ml. Wyniki testu cytotoksyczności podano w tabeli 1.

190 237

Tabela 1

Material	Cytotoksyczność (%) (uwalnianie ⁵¹ Cr) Stosunek komórki efektorowe : docelowe
50:1	25:1	12,5:1	6,25:1
PBS*	13	10	7	2
3D-MLA/AF	61	60	59	45
Nieimmurizoware komórki śledziony	8	4	2	2

* roztwór soli buforowany fosforanami

Przykład 5. Pobudzanie odpowiedzi przeciwciała przez donosowe podawanie wodnego preparatu ALD

Myszy, którym podano donosowo toksoid tężca (TT) w 3D-MLA/AF wytworzyły miana IgA wykrywalne zarówno w surowicy, jak i w ekstraktach odchodów. Ponadto donosowe podawanie wodnego preparatu według wynalazku i TT powodowało wytworzenie wyższych mian izotypów IgG, IgCHa i IgG2bGrupom myszy ICR podano donosowo 0,5, 2,5, 10 lub 12,5 pg toksoidu tężca w roztworze soli buforowanej fosforanami (PBS) lub w mieszaninie z 25 pg 3D-MLA/AF. 3D-MLA/AF otrzymano w sposób podany w przykładnie 1. Myszy zaszczepiono w dniu 0, pobrano krew w dniu 10 (dlOPł⁰), zastosowano dawkę wspomagającą w dniu 14, pobrano krew w dniu 24 (d1OP2°), zastosowano dawkę wspomagającą w dniu 28 i pobrano krew w dniu 38 (d10P3°). Wykonano test ELISA dla przeciwciał IgG i IgA, specyficznych przeciw toksoidowi tężca na uśrednionych próbkach surowicy z każdej pobranej próbki krwi. Ekstrakty odchodów badano w dniu 22 (d7P2°). Miana IgG i IgA w surowicy i ekstraktach odchodów dla immunizowanych myszy podano w tabelach 2-5.

Tabela 2

Miano'¹ przeciw toksoidowi tężca w surowicy
Szczepionka*	Droga	IgG-specyficzne	IgA-specyficzne
d10P1°	d10P2°	d1OP3°	d1OP10	d1OP2°	dlOP3°
0,5 pg TT + PBS	IN	200	400	25600	<200	<200	<200
2,5 pg TT+ PBS	IN	400	51200	25600	<200	<200	<200
12,5 pg TT + PBS	IN	3200	51200	102400	<200	200	400
0,5 pg TT + 3D-MLA/AF	IN	12800	>409600	>409600	<200	800	6400
2.5 pg TT + 3D-MLA/AF	IN	51200	>409600	>409600	<200	12800	25600
12,5 pg TT + 3D-MLA/AF	IN	102400	>409600	>409600	<200	25600	102400
0,5 pg TT + PBS	SQ	800	204800	409600	<200	<200	<200

*n = 4; N = donosowo ; SQ = podskórnie

190 237

Tabela 3

Analiza izotypów IgG surowicy z próbek krwi d10P3° w tabeli 2

Szczepionka	Droga	Miano'¹ przeciw toksoidowi tężca w surowicy
IgG1	IgGia	IgG₂b
0.5 ąg TT + PBS	IN	25600	6400	25600
2,5 ąg TT + PBS	IN	51200	3200	25600
12,5 ag TT + PBS	IN	204800	12800	51200
0,5 ag TT + 3D-MLA/AF	IN	819200	409600	819200
2,5 ag TT + 3D-MLA/AF	IN	>819200	819200	>819200
12,5 ag TT + 3D-MLA/AF	IN	>819200	>819200	>819200
0,5 ag TT + PBS	SQ	819200	6400	25600
Zwykła surowica mysia	—	<400	<400	<400

Tabela 4

Szczepionka	Droga	Miano-1 przeciw toksoidowi tężca w surowicy
IgG-specyficzne	IgA-specyficzne	Ekstrakt odchodów d7P2°
d10P2°	dlOP3°	d1OP2°	d10 P3°	IgG	IgA
TT* + 3D-MLA/AF/PBS	IN	>102400	»102400	6400	25600	<50	1600
TT + DPPC/PBS	IN	6400	6400	100	200	<50	<50
TT + 3D-MLA/AF/PBS	SQ	>102400	>102400	100	100	<50	<50
Normalna surowica mysia	—	50	50	100	100	<50	<50

* podano 10 pg toksoidu tężca

Tabela 5

Analiza izotypów IgG surowicy z próbek krwi d10P3° w tabeli 4

Szczepionka	Droga	Miano-1 przeciw toksoidowi tężca
IgG1	IgG_2a	IgG₂b
TT + 3D-MLA/AF/PBS	IN	>819200	102400	409600
TT + DPPC/PBS	IN	25600	1600	3200
TT + 3D-MLA/AF/PBS	SQ	>819200	51200	102400
Normalna surowica mysia	—	<400	<400	<400

Przykład 6. Pobudzanie odpowiedzi immunologicznej na powierzchniowy antygen zapalenia wątroby typu B przez donosowe podawanie wodnego preparatu ALD

Podany donosowo myszom powierzchniowy antygen zapalenia wątroby typu B (HBSAG) w kompozycji według wynalazku powodował wytworzenie mian IgG i IgA na antygen. Wydzielanie IgA wykryto w płukankach pochwowych, a wywoływanie odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T wykryto w teście cytotoksyczności.

Grupę myszy Balb/C poddano pierwszej immunizacji (1°) podając donosowo 2,5 pg HBsAg + 10 pg 3D-MLA/AF w objętości 20 pl. 3D-MLA/AF otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Po 21 dniach myszy poddano drugiej immunizacji (2°) podając donosowo

7,5 pg HBsAg + 10 pg 3D-MLA/AF w 20 pl. Trzecią immunizację (3°) z użyciem kompozycji o składzie identycznym jak przy drugiej immunizacji przeprowadzono w 28 dni po drugiej immunizacji. Wykonano testy w celu wykrycia aktywności cytotoksycznych limfocytów T w 16 dni po drugiej immunizacji (d 16, po 2°) i w 8 dni po trzeciej immunizacji (d8, po 3°).

Miana przeciwciał w surowicy i śluzówce oznaczono w 22 dni po drugiej immunizacji (d22, po 2°) i w 21 dni po trzeciej immunizacji (d21, po 3°). Wszystkie testy wykonano znanymi sposobami, opisanymi uprzednio w przykładach 2 i 4. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabelach 6-8.

Tabela 6

Materiał	Dzień	Cytotoksyczność (%) (uwalnia nie³'Cr) Stosunek komórki efektorowe:docelowe
50:1	25:1	12,5:1	6,25:1
3D-MLA/AF	d 16, po 2°	38	22	15	9
Nośnik		3	2	0	0
Nieimmunizowane komórki śledziony		3	3	0	0
3D-MLA/AF	d8, po 3°	82	65	49	36
Nośnik		5	2	1	1
Nieimmunizowane komórki śledziony		7	5	3	3

Tabela 7

Material	Dzień	Miano'1 przeciw-HBsAg
IgG,	IgG_2a	IgA
3D-MLA/AF	d22, po 2°	256000	64000	1600
Nośnik		<2000	<2000	<200
3D-MLA/AF	d21,po3°	1000000	1000000	25600
Nośnik		<2000	<2000	<200

Grupy myszy Balb/C immunizowano 2,5 pg HBsAg +10 pg 3D-MLA/AF donosowo i podano donosowo dawkę wspomagającą 7,5 pg HBsAg + 10 pg 3D-MLA/AF po 21 dniach. Próbki z pochwy pobrano w 10 dni po immunizacji wspomagającej.

Tabela 8

Material	Płukanka pochwowa
Miano^ przeciw-HBsAg
IgG	IgA
3D-MLA/AF	100	6400
Nośnik	<50	<50

Donosowe podanie HBsAg w kompozycji według wynalazku pobudzało zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź immunologicznną na antygen. Donosowa immunizacja preparatem antygenu w 3D-MLA/AF wywoływała odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T oraz specyficzną względem antygenu humoralną i śluzówkową odpowiedź immunologiczną.

Przykład 7. Wywoływanie ochronnej odpowiedzi immunologicznej na grypę przez donosowe podawanie wodnego preparatu ALD

Myszy imtnunizowane donosowo szczepionką przeciwgrypową FLUSHIELD, zawierającą antygen hemaglutyniny, formułowaną w kompozycji według wynalazku, wytwarzały zarówno IgG, jak i IgA, które odzyskano z płukanek pochwowych. Immunizowane myszy były również w 100% chronione przed przeprowadzoną następnie prowokacją wirusem grypy.

Myszy ICR immunizowano 3 razy w odstępach po 21 dni donosowo szczepionką przeciwgrypową FLUSHIELD (Wyeth-Lederle), zawierającą 0,3 pg antygenu hemaglutyniny

190 237 (HA) + 10 μg 3D-MLA/AF. 3D-MLA/AF otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Płukanki pochwowe w 14 dni po końcowej immunizacji. Myszy prowokowano 10 LD 50 (dawka śmiertelna 50) infekcyjnego wirusa grypy A/HK/68, w 35 dni po końcowej immunizacji i śledzono przypadki śmiertelności.

Tabela 9

Grupa	IgA	IgG	Ochrona (%)
Płukanka pochwowa	Płukanka pochwowa
N ieimmurizoware	<20	<20	0
Nośnik	160	80	60
3D-MLA/AF	2560	1280	100

Przykład 8. Kompozycje monofosforylolipidu A

Monofosforylolipid A (MLA) można formułować jako wodne kompozycje według wynalazku i podawać w takich samych ilościach i porcjach jak w przykładach 1-7 i osiągnąć podobne wyniki.

190 237

Absorbancja (490 nm)

FIG. 1(A)

FIG. 1(B)

190 237

Absorbancja (490 nm)

FIG. 1(C)

FIG. 1(D)

190 237

Wskaźnik pobudzenia

FIG. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja adiuwantowa zawierająca adiuwant w wodzie oraz ponadto środek powierzchniowo czynny, znamienna tym, że jako adiuwant zawiera atenuowanąpochodną lipidu A wybraną z grupy obejmującej monofosforylolipid A i 3-O-deacylowany mo nofosforylolipid A, przy czym woda jest wolna od współrozpuszczalnika, a stosunek molowy monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 - 2:1.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako atenuowaną pochodną lipidu A zawiera monofosforylolipid A.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako atenuowaną pochodną lipidu A zawiera 3-O-deacylowany monofosforylolipid A.
4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera środek powierzchniowo czynny wybrany z grupy obejmującej glikodeoksycholan, deoksycholan, sfmgomielinę, sfmgozynę, fosfatydylocholinę, l^-dimirystoilo-sn-glicero^-fosfoetaolominę, L-a^-fbslatydylo-etanoloaminę i l,2-di-paliriitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę oraz ich mieszaniny.

.
5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że jako środek powierzchniowo czynny zawiera l,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę.
6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 4:1.
7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi czystą wodną zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monbfbsfbrylblipidu A i środka powierzchniowo czynnego.
8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że stanowi zawiesinę zawierającą cząstki o wielkości 50 - 70 nm.
9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mcnofosfcrylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, środek powierzchniowo czynny i wodę.
10. Szczepionka zawierająca adiuwant w rozpuszczalniku, znamienna tym, że zawiera kompozycję adiuwantową określoną w zastrz. 1, przy czym adiuwant stanowi monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A, a rozpuszczalnik stanowi woda wolna od współrozpuszczalnika.
11. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera kompozycję adiuwantową określoną w zastrz. 1 i antygen.
12. Sposób wytwarzania kompozycji adiuwantowej określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że łączy się monofosforylblipid A lub 3-O-deacylowany mbnofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny, przy czym monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny są rozpuszczone i dokładnie zmieszane z rozpuszczalnikiem, odparowuje się rozpuszczalnik, dodaje się wody i ponownie wytwarza się zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i środka powierzchniowo czynnego, zawiesinę podczas ogrzewania poddaje się działaniu ultradźwięków aż do wyklarowania.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że

a) rozpuszcza się jeden lub większą liczbę środków po wierzchniowo czynnych w rozpuszczalniku;

b) miesza się rozpuszczone środki powierzchniowo czynne z atenuowaną pochodną lipidu A wybraną z grupy obejmującej mcnofosforylolipid A i 3-O-deacylowany monofosforylolipid A;

c) odparowuje się rozpuszczalnik z otrzymanej mieszaniny;

190 237

d) do odparowanej mieszaniny dodaje się wody i wytwarza się zawiesinę atenuowanej pochodnej lipidu A w wodzie, przy czym stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 - 2:1; oraz

e) zawiesinę ogrzewa się i poddaje działaniu ultradźwię ków aż do wyklarowania.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się środek powierzchniowo czynny wybrany z grupy obejmującej glikodeoksycholan, deoksycholan, sfingomielinę, sfingozynę, fosfatydylocholinę, l,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę, L-a.-fosfatydyloetanoloaminę i 1, 2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę oraz ich mieszaniny.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że stosunek molowy atenuowanej pochodnej lipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 4:1.
16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że końcowy produkt stanowi klarowną wodną zawiesinę monofosforylolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A i środka powierzchniowo czynnego.
17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej chloroform, alkohole, dimetylosulfotlenek i dimetyloformamid oraz ich mieszaniny, zwłaszcza etanol.
18. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiesinę ogrzewa się do temperatury 60 - 80°C, zwłaszcza 60°C.
19. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiesinę poddaje się obróbce ultradźwiękami przez 5-60 minut, zwłaszcza przez 10 minut.
20. Zastosowanie sposobu określonego w zastrz. 13 do wytwarzania szczepionki.
21. Zastosowanie kompozycji adiuwantowej określonej w zastrz. 1 do -wywarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej lub odpowiedzi IgA na wydzielanie śluzu i w surowicy zwierzęcia ciepłokrwistego na antygen białkowy zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.
22. Zastosowanie kompozycji adiuwantowej określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku, który stanowi klarowną, wolną od rozpuszczalnika ciecz wodną zawierającą monofosforylolipid A lub 3-O-deacylowany monofosforylolipid A 3D-MLA, wodę i środek powierzchniowo czynny, przy czym stosunek molowy mono fosforyłolipidu A lub 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 - 2:1.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, w którym lek stanowi szczepionka.