BR112012024872B1 - Composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo contendo pelo menos um motivo cxxc e antígenos heterólogos e seus usos - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo contendo pelo menos um motivo cxxc e antígenos heterólogos e seus usos. a presente invenção se refere a composições farmacêuticas utilizando um polipeptídeo que compreende pelo menos um motivo cxxc, tal como o da proteína de superfície variável (vsp) de parasitas como giardia, ou um fragmento dela, para aumentar uma resposta imune, por meio de vacinação oral ou de mucosa, contra um antígeno heterólogo selecionado, tal como um antígeno tumoral, um antígeno microbiano ou outro antígeno.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:

A presente invenção se refere a composições farmacêuticas e a métodos de utilização das mesmas, para produzir, modificar ou regular uma resposta imune num sujeito.

A presente invenção diz respeito, mais particularmente, a composições farmacêuticas que utilizam um polipeptideo compreendendo pelo menos um motivo CXXC, tais como proteinas de superfície variáveis (VSP) do parasita Giardia ou um fragmento delas (por exemplo, o domínio extracelular de uma VSP Giardia ou um fragmento dela) para causar uma resposta imune, por vacinação oral ou mucosal, contra um antigeno heterólogo selecionado, tal como um antigeno do tumor, antigeno microbiano ou outro antigeno.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:

Várias estratégias têm sido propostas no estado da arte para aumentar uma resposta imune num sujeito, tal como a administração direta de um antigeno, estimulação ex vivo e expansão das células imunes (por exemplo, linfócitos T ou células dendriticas), pela injeção de células cancerosas geneticamente ou quimicamente modificadas, pela administração de virus inativados ou por terapia genética utilizando ácidos nucleicos que codificam para antigenos específicos ou citocinas.

Embora estas abordagens diferentes permitam a geração de uma resposta imune contra certos tipos de antigenos ou de agentes patogênicos, não existe ainda uma necessidade de melhores métodos para produzir, regular ou estimular uma resposta imune. Em particular, existe uma necessidade de métodos simples para gerar respostas imunes eficazes e/ou eficientes, tais como respostas imunes humorais celulares contra uma variedade de antigenos, tais como os antigenos de tumores, antigenos virais ou, mais particularmente, antigenos de outros agentes patogênicos por meio de administração oral.

Na verdade, a maioria das vacinas comerciais disponíveis atualmente são utilizadas por injeção, levando a problemas de segurança, aceitabilidade do paciente e de morbidade, e que fazem com que a imunização em massa seja mais cara e menos segura, principalmente em paises com poucos recursos ou em desenvolvimento. Sendo assim, a administração oral oferece uma série de vantagens significativas sobre outras vias de administração e, em particular, em comparação com as vacinas parenterais (apresenta administração simples e melhora a sua segurança). Além disso, ao contrário da imunização sistêmica, a administração oral pode induzir respostas imunes em mucosas.

Assim, as vacinas orais são entregues processadas e são apresentadas pelo sistema imune do tubo digestivo, muitas vezes referido como o tecido linfóide associado ao intestino (GALT). O GALT é um sistema complexo que consiste de sitios indutivos (onde os antigenos são encontrados e onde as respostas são iniciadas) e sitios efetores (locais onde ocorrem as respostas imunes) ligados por um sistema de endereçamento pelo qual as células ativadas por antigeno no GALT migram para a circulação e, consequentemente, para a mucosa (Lavelle et al., 2006). Como resultado, a vacinação oral pode induzir respostas imunes localmente no intestino e em mucosas distantes, bem como respostas sistêmicas humorais e respostas imunes celulares. A vacinação oral normalmente gera uma grande quantidade de IgA secretora (slgA), que desempenha um papel importante na defesa da mucosa.

No entanto, mesmo considerando que a via oral de administração da vacina representa o meio ideal de fornecimento de vacinas profiláticas e terapêuticas,oferecendo vantagens significativas sobre a administração sistêmica, a via oral é também a mais dificil, devido aos numerosos obstáculos colocados pelo trato gastrointestinal. Para facilitar a imunização eficaz com peptideos e vacinas de proteina, os antigenos devem ser protegidos, a absorção deve ser melhorada e a resposta imune inata deve ser ativada. Assim, vários sistemas de entrega e adjuvantes foram avaliados para a distribuição de uma vacina oral, incluindo vetores vivos, partículas inertes e toxinas bacterianas. Contudo, os desenvolvimentos em vacinas orais têm sido decepcionantes até agora, uma vez que nenhuma imunização oral eficaz foi até agora obtida através de proteínas ou partículas semelhantes a virus (VLP) sozinhas.

Sendo assim, existe ainda uma necessidade de melhores métodos para desencadear, regular ou estimular uma resposta imune celular eficiente e/ou respostas imunes humorais, contra uma variedade de antigenos, tais como os antigenos de tumores, antigenos virais ou antigenos de outros agentes patogênicos, por administração oral ou mucosal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

A presente invenção proporciona um método novo, alternativo e melhorado que causa, regula ou estimula uma resposta imune num indivíduo por meio de administração por via oral ou mucosal.

A presente invenção baseia-se, mais particularmente, sobre um novo conceito de utilização de um polipeptideo compreendendo pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um residue de cisteina e X representa qualquer residue de aminoácido, tal como uma proteina de superfície variável (VSP) do parasita Giardia ou um fragmento da mesma (por exemplo, o dominio extracelular de uma VSP de Giardia ou um fragmento dela) para causar uma resposta imune contra um antigeno selecionado, por administração oral ou mucosal, em particular uma reposta imune celular e/ou uma resposta imune humoral, a fim de tratar ou prevenir uma doença causada por um antigeno selecionado num indivíduo.

A presente invenção também descreve composições farmacêuticas que compreendem partículas de vetor e/ou proteínas de fusão relacionadas, a sua preparação e utilização, em que estas permitem a geração de melhores respostas imunes contra antigenos por administração oral ou mucosal.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se, assim, a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos:

um polipeptideo que compreende pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um resíduo de cisteina e X qualquer residue de aminoácido, e

um antígeno heterólogo.

Num segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo que compreende pelo menos um motivo CXXC como definida acima e em que esta retenha a capacidade de se ligar às células epiteliais do intestino e a um antígeno heterólogo.

Num terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos um motivo CXXC tal como definida acima e em que esta retenha a capacidade de se ligar às células epiteliais do intestino ligado a uma partícula de vetor.

Num quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença, uma desordem ou condições fisiológicas em um sujeito.

Em quinto aspecto, a presente invenção diz respeito à utilização de um polipeptídeo compreendendo pelo menos um motivo CXXC como definida acima, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela como um transportador para um antígeno heterólogo para a apresentação e para vacinação, em particular para vacinação oral ou mucosal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

Os inventores demonstraram, pela primeira vez, que uma proteína ou um polipeptídeo que compreende pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um resíduo de cisteína e X qualquer resíduo de aminoácido, tais como as proteínas de superfície variáveis (VSP) de Giardia (por exemplo, o domínio extracelular de uma VSP de Giardia ou um fragmento dele) podem ser utilizadas por via oral, como um veículo de antigeno candidato para vacina ou para induzir imunidade protetora. Além disso, os inventores demonstraram que tais polipeptídeos, tais como o domínio extracelular de VSPs, são resistentes a proteases, pHs diferentes e são capazes de se ligar às células epiteliais do intestino, e são úteis para formar partículas semelhantes a vírus (VLPs) adequadas para serem administradas por via oral.

Definições:

Ao longo do presente relatório descritivo, vários termos são utilizados e são definidos nos parágrafos a seguir.

Tal como aqui utilizado, o termo "imunogênico" designa um produto, composição ou método que provoca, causa, estimula ou regula uma resposta imune ou de reação. A composição imunogênica é, assim, qualquer composição que altera a atividade de um sistema imune de um sujeito ou in vitro. Isto inclui respostas imunes protetoras, resposta imune celular, respostas de anticorpos neutralizantes, respostas imunes, modificação nos níveis de anticorpos e modificação nos niveis de células imunes, entre outras.

Como aqui utilizado, o termo "antigeno" refere-se a uma molécula capaz de ser ligada especificamente por um anticorpo ou por um receptor de células T (TCR), se processado e apresentado por moléculas de MHC. O termo "antigeno", tal como aqui utilizado, abrange também epitopos de células T. Um antigeno é adicionalmente capaz de ser reconhecido pelo sistema imune e/ou é capaz de induzir uma resposta imune humoral e/ou uma resposta imune celular que conduz à ativação de linfócitos B e/ou linfócitos T. Isto pode, no entanto, exigir que, pelo menos em certos casos, o antigeno contenha, ou esteja ligado a um epitopo de célula Th e ser apresentado em adjuvante ou requerer que o antigeno seja apresentado de acordo com a presente invenção. Um antigeno pode ter um ou mais epitopos ou sitios antigênicos (epitopos B e epitopos T) . O termo "especificamente ligado", como aqui usado, pretende indicar que o antigeno vai reagir, de preferência, normalmente de uma maneira altamente seletiva com o seu anticorpo correspondente ou TCR e não com os inúmeros outros anticorpos ou TCRs que podem ser evocados por outros antigenos.

Tal como aqui utilizado, o termo "epitopo" refere-se a porções continuas ou descontinuas de um polipeptideo ou de uma molécula não peptidica possuindo atividade antigênica ou atividade imunogênica num animal, de preferência um mamifero, e mais preferivelmente num ser humano. Um epitopo é reconhecido por um anticorpo ou por uma célula T através do seu receptor de células T no contexto de uma molécula de MHC. Um "epitopo imunogênico" tal como aqui utilizado, é definido como uma parte de um polipeptídeo ou de uma molécula não peptidica que induz uma resposta de anticorpos ou induz uma resposta das células T num animal, tal como determinado por qualquer método conhecido na arte. O termo "epitopo antigênico", tal como aqui utilizado, é definido como uma porção de uma proteina ou de uma molécula não peptidica por meio da qual um anticorpo pode ligar ao seu antigeno immunospecificamente, como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica. Uma ligação imunoespecifica exclui a ligação não especifica, mas não necessariamente exclui a reatividade cruzada com outros antigenos. Epitopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Epitopos antigênicos podem também ser epitopos de célula T, caso em que eles podem ser ligados immunospecificamente por um receptor de células T no contexto de uma molécula de MHC.

Como usado aqui, o termo "antigeno heterólogo" refere- se a um antigeno que é heterólogo em relação ao parasite Giardia (nomeadamente Giardia lamblia) ou a um outro microrganismo, tal como definido no contexto da presente invenção e, sendo assim, tal antigeno heterólogo não é derivado do referido parasita Giardia ou de outros microorganismos. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "antigeno heterólogo" abrange, assim, uma planta, um animal, um parasita (por exemplo, de um outro derivado de Giardia), uma bactéria, um virus, um antigeno tumoral, um auto-antigeno ou uma molécula quimica. No entanto, deve se notar que o referido antigeno heterólogo pode ser derivado a partir de Giardia, se o polipeptideo da presente invenção for derivado de outro microrganismo, tal como, por exemplo, Tetrahymena, Paramecium, Entamoeba.

Como aqui utilizados, os termos "Giardia” ou " parasita Giardia" referem-se a um gênero de parasitas que são protozoários flagelados anaeróbicos do filo Metamonada que colonizam e se reproduzem no intestino delgado de vários vertebrados, causando giardiase. Num contexto mundial, a giardiase é comum entre pessoas com higiene fecal-oral precária e seus modos principais de transmissão incluem o abastecimento de água contaminada ou atividade sexual. Trofozoitos flagelados de Giardia se ligam às células epiteliais do intestino delgado (isto é, a superfície da mucosa intestinal), onde podem causar a doença, sem desencadear uma resposta inflamatória pronunciada (Rivero et al, 2010). Não há fatores de virulência conhecidos ou toxinas, e a expressão de proteinas de superficie variável permite a perda de resposta imune do hospedeiro e de adaptação a ambientes de diferentes hospedeiros (Rivero et al. 2010). O ciclo de vida do parasita se alterna entre um ciclo trofozoito que circula ativamente e um cisto infeccioso que é resistente. O parasita Giardia infecta os seres humanos, mas é também um dos parasitas mais comuns que infecta qatos, cães e aves. Hospedeiros mamiferos também incluem vacas, castores, veados e ovelhas. Assim, o termo "Giardia” engloba espécies diferentes, incluindo Giardia lamblia e Giardia muris.

Tal como aqui utilizado, o termo "Giardia lamblia” (também chamado de Giardia intestinalis ou Giardia duodenalis) refere-se a um dos parasitas intestinais mais comuns de seres humanos. Giardia lamblia é o mais prevalente protista parasita nos Estados Unidos, onde a sua incidência pode ser tão elevada como 0,7% (Hlavsa et al. 2005).

Como aqui utilizados, os termos "proteina de superficie variável" ou "VSP" referem-se a um polipeptideo que cobre toda a superficie do parasita Giardia e que são os principais antigenos reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro. VSPs são proteínas ricas em cisteína com regiões CXXC frequentes (onde X é qualquer aminoácido) que têm várias características específicas, incluindo, em alguns VSP, a presença de motivos CXC, a região específica de zinco de Giardia e regiões GGCY (Nash, 2002 , Adam et al, 2010). Mais precisamente, as VSP de tipo 1 são proteínas de membrana integrais, que variam em tamanho de 20 a 200 kDa, que possuem uma região variável rica em cisteína amino-terminal (domínio extracelular que representa a interface hospedeiro/parasita e confere resistência à proteína de digestão proteolítica e pH baixo) e uma região carboxi-terminal conservada que inclui uma região de transmembrana hidrofóbica e uma cauda curta citosólica que compreende apenas 5 aminoácidos (CRGKA), que não são "vistos" pelo sistema imune. Apenas uma VSP é expressa em qualquer momento sobre a superfície de cada um parasita, tal como descrito por Nash (1997) . Dentro do contexto da presente invenção, pretende-se que o termo "proteína de superfície variável" inclua qualquer proteína de superfície variável do repertório completo de VSPs de Giardia, nomeadamente Giardia lamblia. Na verdade, os parasitas Giardia codificam um repertório de genes que codificam cerca de 200 VSPs como descrito por Morrison et al. (2007) e Adam et al. (2010) para o conjunto A, e dois relatórios do grupo Svard ao descrever o repertório VSP de isolados derivados de conjuntos B e E (Jerlstrom-Hultqvist et al. (2010) e Franzen et al. (2009). O dominio extracelular de VSP permite que o parasita sobreviva no ambiente hostil do intestino delgado superior. VSPs são muito resistentes a pHs variáveis (reatividade a um epitopo conformacional por um anticorpo monoclonal (mAb) dirigido a um determinado VSP permanece inalterada entre pH 2 e 12), e a digestão por tripsina e várias outras proteases. Além disso, a VSP permanece ligada à mucosa entérica após os trofozoitos terem se ligado a esta (Rivera et al, 2010).

Deve-se ainda notar que o polipeptideo compreendendo pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um residue de cisteina e X qualquer residuo de aminoácido, tais como VSPs de Giardia, VSPs ou proteinas semelhantes de outros microorganismos também podem ser geradas in vitro por manipulação genética e produzidas em sistemas heterólogos. Assim, polipeptideos produzidos quimicamente ou produzidos por células, incluindo aqueles com as variações de aminoácidos que não são encontradas nos parasitas do tipo selvagem (por exemplo, variantes de VSP de Giardia) estão englobados. VSP podem, assim, ser preparados por qualquer processo conhecido na arte, tais como sintese de fase sólida, sintese em fase liquida ou por engenharia genética.

O VSP da presente invenção pode opcionalmente compreender modificações quimicas. Modificações quimicas visando à obtenção de proteinas com uma melhor proteção das proteinas contra a degradação enzimática in vivo e/ou com a capacidade de atravessar barreiras de membrana aumentada, aumentando assim a sua meia-vida e mantendo ou melhorando a sua atividade biológica. Qualquer modificação quimica conhecida na técnica pode ser empregada de acordo com a presente invenção. Tais modificações quimicas incluem, mas não estão limitadas a: - modificações na região N-terminal e/ou C-terminal de uma das proteinas, tais como, por exemplo, acilação do terminal N (de preferência, a acetilação) ou desaminação, ou a modificação do grupo carboxila C-terminal em uma amida ou em um grupo de álcool; modificações na ligação amida entre os dois aminoácidos: acilação (de preferência, a acetilação) ou alquilação (de preferência metilação) no átomo de nitrogênio ou no carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos; - alterações no carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos, tais como acilação, por exemplo (de preferência acetilação) ou alquilação (de preferência metilação) no átomo de carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos; mudanças de quiralidade, como por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente (L-enantiômero) com os correspondentes enantiômeros D; - retro-inversões em que um ou mais aminoácidos de ocorrência natural (L-enantiômero) são substituídos pelos correspondentes D-enantiômeros, em conjunto com a inversão da cadeia de aminoácidos (a partir da extremidade C- terminal para a extremidade N-terminal) e/ou; - azapeptideos em que um ou mais carbonos alfa são substituídos com átomos de nitrogênio.

O termo "proteína" ou o termo "polipeptídeo", como aqui utilizados, são utilizados de maneira intercambiável e referem-se a uma molécula de composto de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). Modificações de pós-tradução do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e similares estão também englobadas. Os termos "proteína" ou "polipeptídeo" incluem também variantes que deverão incluir qualquer polipeptídeo que compreenda ou, em alternativa ou de preferência, seja constituído por qualquer polipeptídeo natural ou geneticamente modificado possuindo mais de 70%, de preferência mais do que 80%, ainda mais preferencialmente mais do que 90%, mais uma vez mais preferivelmente mais do que 95% e mais preferivelmente mais de 97% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência do polipeptideo em questão. Os métodos preferidos de produção de uma variante de um polipeptideo se dão através da engenharia genética, de preferência através da inserção, substituição, deleção ou de uma combinação destes. Quando o termo "variante de uma proteina" é aplicado, de acordo com a presente invenção, para o antigeno, tal variante deve ser capaz de induzir a produção de anticorpos ou a estimulação de células T in vivo. Quando o termo "variante de uma proteina" é aplicado, de acordo com a presente invenção, para a VSP de Giardia ou VSP de proteina semelhante de outros microorganismos, tais variantes devem ser capazes de reter a capacidade de se ligar às células, em particular a células das mucosas, mais em particular células epiteliais do intestino e, eventualmente, células que induzem uma resposta imune em si.

Tal como aqui usado, quando o termo "um fragmento de uma proteina" é aplicado, de acordo com a presente invenção, para a VSP, ou quando o termo intercambiavelmente "um fragmento de um polipeptideo" é utilizado, tal fragmento deve abranger gualquer polipeptideo que compreende, ou, alternativamente ou preferencialmente seja constituído por, pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 aminoácidos contíguos ou descontínuos da proteína, polipeptideo ou antigeno, tal como aqui definido, bem como a qualquer polipeptideo possuindo mais de 65%, de preferência mais de 80%, mais preferivelmente mais de 90% e ainda mais preferencialmente mais do que 95% de identidade de sequência de aminoácidos com os respectivos compostos. Quando o termo "fragmento de uma proteina" é aplicado, de acordo com a presente invenção, para o antigeno, tal fragmento deve ser capaz de induzir a produção de anticorpos ou a estimulação de células T in vivo. Assim, um fragmento de uma proteina deve compreender, pelo menos, um epitopo imunogênico. Quando o termo "fragmento de uma proteina" é aplicado, de acordo com a presente invenção, para uma VSP de Giardia ou VSP de proteina semelhante de outros microorganismos, tais fragmentos devem ser capazes de reter a capacidade de se ligar a células, em particular a células das mucosas, mais em particular células epiteliais do intestino e, eventualmente, a células que induzem uma resposta imune em si.

Tal como aqui utilizado, o termo "ligado" refere-se a uma ligação covalente que pode ser, por exemplo, por acoplamento químico ou não-covalente, por exemplo interações iônicas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, etc. As ligações covalentes podem ser, por exemplo, de tipo éster, éter, fosfoéster, amida, peptidica, imida, carbono-enxofre, ligações carbono-fósforo e similares. O termo inclui também o encapsulamento ou encapsulamentolo parcial de uma substância (por exemplo, o antígeno heterólogo). O termo "ligado" é mais amplo do que o normalmente empregado e inclui termos tais como "acoplado", "fundido","preso" , "empacotado", "pseudoligado", "expresso em uma dupla camada de lípido" e "ligado".

Como usado aqui, o termo "fusão" refere-se à combinação de sequências de aminoácidos de origem diferente em uma cadeia polipeptídica em um enquadramento por combinação das suas sequências de nucleotídeos que as codificam. Deve ser notado que mais do que uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma determinada sequência de aminoácidos, devido à degenerescência do código genético. O termo "fusão" abrange explicitamente fusões internas (isto é, a inserção de sequências de origem diferente no interior de uma cadeia polipeptídica, além da fusão de uma das suas extremidades) .

Tal como aqui utilizado, o termo "conjugado" refere-se ao produto de conjugação entre (a) uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, e (b) uma molécula orgânica (por exemplo, um antigeno heterólogo que consiste de um antigeno não proteico) , em que os elementos (a) e (b) estão ligados um ao outro. Tais elementos (a) e (b) podem estar ligados, por exemplo, através de um ligante.

O termo "sequência de ligante", ou o termo também utilizado de maneira intercabiável "ligante", tal como aqui utilizado, refere-se a uma entidade molecular que se liga covalentemente a proteinas ou antigenos não proteicos, tais como a molécula de nicotina a um polipeptideo bem como uma partícula de vetor de um polipeptideo. O ligante pode compreender, por exemplo, um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo de glicol ou um grupo peptidico. Ligantes incluem moléculas de ligação cruzada e alguns exemplos estão listados no pedido de patente internacional publicado sob o N° WO 2004/009116, a qual é incorporado por referência.

Como usado aqui, o termo "partícula de vetor" denota qualquer partícula susceptível de apresentar uma VSP de Giardia ou um fragmento dela e/ou o antigeno heterólogo, na sua superficie. Dentro do contexto da presente invenção, pretende-se que o termo "partícula de vetor" inclua uma partícula de vetor virai, partícula semelhante a virus (VLP) e nanoparticulas.

O termo "partícula de vetor viral", como aqui utilizado, refere-se à forma morfológica de um vírus. Há alguns tipos de vírus que compreendem um genoma rodeado por um capsídeo de proteína, enquanto que outros têm estruturas adicionais (por exemplo, envelopes, caudas, etc).

O termo "partícula semelhante a vírus" (VLP), tal como aqui utilizado, refere-se a uma estrutura semelhante a uma partícula de vírus. Uma partícula semelhante a vírus de acordo com a invenção é não replicativa, uma vez que carece do todo ou de parte do genoma virai, normalmente, e de preferência, sem a totalidade ou parte dos componentes infecciosos e de replicação do genoma virai. O termo "não replicativo", tal como aqui utilizado, refere-se ao fato deste ser incapaz de se replicar no genoma e compreende, ou não, a VLP.

Composições farmacêuticas da invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica, de preferência imunogênica, que compreende pelo menos: um polipeptideo que compreende pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um resíduo de cisteina e X qualquer resíduo de aminoácido, e um antigeno heterólogo.

Quando a composição farmacêutica da presente invenção é administrada a um indivíduo, esta pode estar numa forma que contém sais, tampões, adjuvantes, transportadores ou outras substâncias que são desejáveis para melhorar a eficácia da composição. Exemplos de materiais farmaceuticamente adequados para utilização na preparação de composições farmacêuticas são fornecidos em numerosas fontes, incluindo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)). O termo "farmaceuticamente" ou "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem um efeito adverso, reação alérgica ou outra que seja inconveniente, quando administradas a um mamífero, especialmente um humano, como apropriado. Um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a um material de enchimento não-tóxico, sólido, semi-sólido ou líquido, diluente, material de encapsulamento ou formulação auxiliar de qualquer tipo.

Além disso, as composições farmacêuticas podem compreender adjuvantes adicionais ou agentes imunogênicos ou biologicamente ativos. No entanto, numa forma de realização preferida, as composições farmacêuticas encontram-se desprovidas de adjuvante, uma vez que uma característica vantajosa da invenção é a elevada imunogenicidade da composição, mesmo na ausência de adjuvantes. A ausência de um adjuvante, além disso, minimiza a ocorrência de respostas de células T inflamatórias indesejáveis, o que representa um problema de segurança na vacinação.

As composições farmacêuticas da presente invenção são, de preferência, formuladas para uma administração oral ou por mucosa. As doses utilizadas para a administração oral ou por mucosa podem ser adaptadas em função de diferentes parâmetros e, em particular, em função do modo de operação da patologia relevante ou, alternativamente, da duração desejada do tratamento.

A composição farmacêutica pode ser administrada a qualquer mucosa adequada, e inclui a administração por via oral (pela mucosa do sistema digestivo), nasal, vaginal, sublingual, ocular, retal, mictória, intramamal, pulmonar, otolar (ou seja, através da orelha) e administração bucal, preferencialmente administração bucal ou sublingual (administração oromucosal).

Após formulação, as composições farmacêuticas serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem, tais como as tipo de, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral ou uma para administração por mucosa, cápsulas de libertação em função de tempo e qualquer outra forma utilizado atualmente. Sendo assim, a composição farmacêutica pode estar na forma de um spray, um aerossol, uma mistura, uma suspensão, uma dispersão, uma emulsão, um gel, uma pasta, um xarope, um creme, uma pomada, implantes (ouvido, olho, pele, nariz, retal e vaginal), preparações intramamárias, vagitórios, supositórios ou uteritórios). Em certas modalidades, o uso de lipossomas é contemplado. A formação e utilização de lipossomas são conhecidas dos técnicos no assunto.

Como mencionado anteriormente, numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica é adequada para administração oral.

Mais particularmente, a composição farmacêutica é formulada de modo a que o antigeno e o polipeptideo heterólogo são resistentes a uma degradação enzimática e quimica da parte superior do trato gastrointestinal, quando necessário. Além disso, deve notar-se que o polipeptideo deve ser capaz de se ligar a células, mais particularmente a células epiteliais do intestino. Assim, numa modalidade, o polipeptideo é capaz de se ligar às células epiteliais do intestino e a composição é formulada de modo a que o antigeno e o polipeptídeo heterólogo sejam resistentes a uma degradação enzimática e química da parte superior do trato gastrointestinal, quando necessário.

Numa modalidade, o polipeptídeo é composto por um polipeptídeo que compreende pelo menos duas regiões CXXC separadas por pelo menos dois aminoácidos.

Sendo assim, as duas regiões CXXC são separadas por uma sequência de aminoácidos compreendendo entre 3 e 20 aminoácidos, de preferência de 5 a 8 aminoácidos.

Deve notar-se que os aminoácidos que separam as pelo menos duas regiões CXXC podem ser qualquer resíduo de aminoácido.

Numa outra forma de realização, o polipeptídeo compreende 1 a 10 regiões CXXC, de 1 a 20 regiões CXXC, 1 a 30 regiões CXXC, 1 a 40 regiões CXXC, 1 a 50 regiões CXXC, 1 a 60 regiões CXXC, 1 a 70 regiões CXXC, 1 a 80 regiões CXXC, 1 a 90 regiões CXXC ou 1 a 100 regiões CXXC.

Assim, o polipeptídeo pode, por exemplo, compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70 regiões CXXC.

Numa modalidade particular, o polipeptídeo tal como definido acima é uma proteína de superfície variável (VSP), uma proteína de tipo VSP de um microrganismo ou um fragmento dela.

Assim, o microrganismo é preferencialmente selecionado no grupo que consiste de espécies de Giardia, Tetrahymena, Paramecium e Entamoeba.

Numa forma de realização preferida, o polipeptideo é o domínio extracelular de uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, (uma vez que o referido domínio extracelular é a região amino-terminal rica em cisteína compreendendo múltiplas regiões CXXC da proteína VSP de Giardia) .

Com efeito, o domínio extracelular de uma VSP de Giardia é o domínio resistente à digestão proteolítica, pH e temperatura.

Sendo assim, numa outra modalidade preferida, o polipeptideo de acordo com a invenção compreende apenas o domínio extracelular de uma VSP de Giardia ou um fragmento dela. A região transmembranar e de cauda citoplasmática de uma VSP de Giardia são, assim, eliminadas.

Deve notar-se que o peptídeo de sinal pode também ser removido.

Proteína de superfície variável (VSP)

Assim sendo, a proteína de superfície variável (VSP) ou um fragmento dela pode ser escolhida entre o repertório completo de VSPs, que são codificadas no nível de DNA no genoma do parasita. Este repertório é composto de cerca de 200 genes codificadores de homólogas VSP (VSPs), o qual varia em isolados de Giardia diferentes. Deve ainda notar- se que as variantes de VSP podem ser também utilizadas na composição de acordo com a invenção.

Tal como acima mencionado, as VSPs de Giardia e, mais particularmente, o dominio extracelular de VSPs de Giardia compreendem várias regiões CXXC, de preferência várias regiões CXXC separadas por vários aminoácidos, de 3 a 20 aminoácidos e, mais particularmente, 5 a 8 aminoácidos (como observado por alinhamentos de sequências múltiplas).

Numa forma de realização particular, o parasita Giardia é Giardia lamblia.

Numa forma de realização preferida, a VSP de Giardia é selecionada a partir do grupo consistindo de VSP9B10, VSP1267, VSPAβ, VSPS1, VSPS2, VSPS3, VSPS4, VSPS5, VSPS6, VSPS7, VSPS8, VSPAS1, VSPAS2, VSPAS3, VSPAS4, VSPAS5, VSPASβ, VSPAS7, VSPAS8, VSPAS9, VSPAS10, VSPAS11, VSPAS12 e VSPH7 de Giardia lamblia.

Dominio de tipo VSP

Um dominio semelhante à VSP ou um fragmento dele pode ser escolhido entre os polipeptideos derivados de outros microrganismos que não são Giardia desde que partilhem homologia de sequência e propriedades bioquímicas com Giardia e, nomeadamente, os polipeptideos contendo várias regiões CXXC, de preferência várias regiões CXXC separadas por 5 a 8 aminoácidos. Com efeito, o alinhamento do dominio extracelular de sequência VSP1267 (query) com outras sequências de moléculas semelhantes à VSP (resultados de arquitetura de dominio após a remoção de Giardia por análise BLASTP), conduziu a uma observação da presença de regiões CXXC múltiplas, nomeadamente separadas por 5 a 8 aminoácidos, em proteinas que pertencem a espécies Paramecium, Tetrahymena e Entamoeba. Assim, os fragmentos representativos de sequências primárias de quinases de superfície de Entamoeba sp. e proteinas de superfície de Paramecium sp. e Tetrahymena sp. prevêm um dominio conservado contendo regiões CXXC em uma arquitetura de tipo VSP (em comparação com VSP de Giardia 1267, 9B10, e H7) como responsável pela resistência ao pH, temperatura e a uma digestão proteolitica.

Numa forma de realização, o microorganismo Tetrahymena é Tetrahymena thermophila.

Noutra forma de realização, o microorganismo Entamoeba é Entamoeba histolytica.

Noutra forma de realização, o microorganismo Paramecium é Paramecium tetraurelia.

Antigeno heterólogo

O antigeno heterólogo pode ser constituído por um antigeno de ocorrência natural, ou uma porção dele, em que a porção do antigeno que ocorre naturalmente compreende ou alternativamente consiste em, pelo menos, um epitopo imunogênico. Um antigeno de ocorrência natural refere-se a um antigeno que existe na natureza, de preferência, e existe como um organismo, tal como uma planta, um animal, um parasita, uma bactéria ou um virus.

Em formas de realização preferidas, o antigeno heterólogo é, portanto, selecionado dentre o grupo consistindo de uma planta, um animal, um parasita, uma bactéria, um virus, um antigeno de tumor ou uma molécula quimica.

Assim, numa forma de realização preferida da presente invenção, o antigeno heterólogo é um antigeno não próprio de proteinas (ou exterior), um fragmento ou um variante dele.

Exemplos de antigenos não próprios de proteinas que são contemplados incluem um antigeno de proteina bacteriana, um antigeno de proteina virai, um antigeno de proteina de parasita, um antigeno de proteinas de tumores, um antigeno de proteina por micoplasma e um antigeno de proteina alérgeno.

Deve-se ainda notar que o antigeno heterólogo pode ser constituído por partículas do próprio vetor, quando a referida partícula (por exemplo, uma partícula semelhante a vírus (VLP), como descrita a seguir) é derivada de um vírus ou de partes de um vírus contra o qual a vacinação é feita. Por exemplo, quando a partícula deriva de um vírus da imunodeficiência humana (HIV), a referida partícula pode constituir um antigeno heterólogo.

Numa outra forma de realização preferida da presente invenção, o antigeno heterólogo é um antigeno de proteína própria, um fragmento ou uma sua variante.

De fato, as doenças autoimunes, como as doenças crônicas e doenças inflamatórias, podem ser causadas pela produção excessiva ou mau funcionamento de um antigeno de proteína própria.

Exemplos de antigenos de proteína própria (auto- proteínas) que são contemplados incluem as citocinas, interleucinas, hormônios, fatores de crescimento e receptores.

Em ainda outra modalidade preferida, o antigeno é um antigeno heterólogo não-proteico.

Como exemplos de antigeno não-proteico que são contemplados, estes incluem um antigeno de polissacarídeo, um antigeno lipídico, um antigeno de ácido nucleico, um antigeno de lipopolissacarídeo e uma molécula química tal como uma droga.

Drogas típicas, incluindo ambas as drogas viciantes e drogas terapêuticas, alcalóides, tais como a nicotina, esteroides, carboidratos e compostos aromáticos, toxinas, incluindo as muito poluentes, e outros compostos contra o qual uma resposta imune pode ser criada.

Exemplos de antigenos heterólogos (proteinas ou antigenos não proteicos) incluem, mas não estão limitados a, os descritos no pedido de patente internacional N° WO 2006/02674.

Numa modalidade, o polipeptídeo é ligado ao antigeno heterólogo.

Noutra forma de realização, o polipeptídeo é fundido com o antigeno heterólogo.

Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo é ligado a uma particula de vetor contendo o antigeno heterólogo. Sendo assim, a particula de vetor pode ser uma particula virai, uma particula de tipo virai '(VLP) ou uma nanoparticula.

Numa forma de realização particular, a particula de vetor é uma VLP exibindo na sua superfície o polipeptídeo da presente invenção.

Numa outra forma de realização particular, um antigeno heterólogo está contido no interior ou sobre a superfície da VLP.

Polipeptideos de acordo com a presente invenção são ligados a um antigeno heterólogo.

Outro aspecto da invenção relaciona-se com o polipeptideo compreendendo pelo menos um motivo CXXC acordo com a invenção, tais como VSP de Giardia ou um fragmento dela ligado a um antigeno heterólogo.

Polipeptideos de acordo com a invenção, proteinas de fusão heterólogas são ligadas ao antigeno.

Quando o antigeno heterólogo é um antigeno de proteinas próprias ou não-próprias, os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como definidos acima, tais como VSP de Giardia ou um fragmento dela podem ser fundidos com o antigeno heterólogo.

Portanto, um aspecto da invenção refere-se, assim, a uma proteina de fusão compreendendo um polipeptideo que compreende pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um residue de cisteina e X qualquer residue de aminoácido, e que mantém a capacidade de se ligar às células epiteliais do intestino e um antigeno heterólogo.

Numa forma de realização, o polipeptideo é uma VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Numa modalidade particular, o polipeptideo é o dominio extracelular de VSP de Giardia ou um fragmento dela.

As proteinas de fusão da presente invenção podem ser preparadas de acordo com técnicas conhecidas na arte (por exemplo, através da utilização de tecnologias recombinantes de ácidos nucleicos).

Deve-se notar que a presente invenção também se relaciona com os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como o dominio extracelular de VSPs de Giardia ou seus fragmentos fundidos com antigenos de proteinas heterólogas tal como definidas acima, bem como aos ácidos nucleicos que compreendem sequências que codificam as mesmas.

Polipeptideos de acordo com a invenção são conjugados de antigenos heterólogos.

Quando o antigeno é um antigeno heterólogo não proteico, os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como definidos acima, tais como VSP de Giardia ou um fragmento dela podem ser ligados covalentemente ao antigeno não-proteico por uma sequência de ligação.

Portanto, outro aspecto da invenção se refere, assim, a um conjugado compreendendo um polipeptideo que contém pelo menos um motivo CXXC, em que C representa um residue de cisteina e X qualquer residue de aminoácido, e que mantém a capacidade de se ligar às células epiteliais do intestino, e um antigeno heterólogo.

Numa forma de realização, o polipeptideo é uma VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Numa modalidade particular, o polipeptideo é o dominio extracelular de uma VSP de Giardia ou de um fragmento dela.

Os conjugados da presente invenção podem ser preparados de acordo com técnicas conhecidas na arte (por exemplo, através de técnicas de acoplamento de moléculas orgânicas de aminoácidos) e por exemplo, tal como descrito no pedido de patente internacional publicado sob o N° WO 2004/009116, que é incorporado por referência.

Deve-se notar que a presente invenção também se relaciona com os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como o dominio extracelular de VSPs de Giardia ou fragmentos dela conjugados com antigenos heterólogos não proteicos, tal como definidos acima.

Polipeptideos de acordo com a invenção são ligados a uma particula de vetor.

Em ainda outro aspecto, os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como definidos acima, tais como VSP de Giardia ou um fragmento dela são ligados a uma particula de vetor.

Numa forma de realização, o polipeptídeo é uma VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Numa modalidade particular, o polipeptídeo é o dominio extracelular de VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Numa outra modalidade, o antigeno heterólogo é ligado a uma particula de vetor.

Em ainda outra modalidade, os polipeptideos de acordo com a invenção, tal como definidos acima, tais como VSP de Giardia ou um fragmento dela e o antigeno heterólogo estão ambos ligados a uma particula de vetor.

Consequentemente, uma proteina de fusão ou um conjugado, tal como descritos acima, podem ser ligados a uma particula de vetor.

Dentro do contexto da presente invenção, a particula de vetor pode ser uma particula de vetor virai, uma particula do tipo virus (VLP) ou uma nanoparticula.

Numa forma de realização particular, a particula de vetor é uma particula do tipo virai (VLP).

Quando particulas semelhantes a virus são usadas, elas podem ser preparadas de acordo com técnicas conhecidas na arte e, por exemplo, tal como descrito no pedido de patente internacional publicado sob o N° WO 02/34893, que é incorporado por referência.

Numa forma de realização preferida, a VLP exibe na sua superficie o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de um parasita Giardia ou um fragmento dela.

Assim, o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela podem ser expostos à superficie da VLP. A este respeito, o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, podem ser expostos através da ligação a várias estruturas, tais como a proteina de envelope ou de um fragmento dela, um ligante sintético ou por meio de reação quimica ou enzimática, incluindo anticorpos.

Numa forma de realização particular, a VLP compreende um invólucro que pode ser modificado de um envelope (quimérico) sintético compreendendo pelo menos uma porção do dominio de transmembrana do envelope retroviral fundida com o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como um ou uma VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Sendo assim, numa modalidade preferida, a VLP exibe uma proteina do invólucro de um virus, tal como uma proteina do invólucro de um virus da estomatite vesicular (VSV) ou um fragmento dela (por exemplo, a região de transmembrana (TM) da glicoproteina VSV G) fundido com o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, exposta na superfície da VLP, por exemplo, por fusão genética ou quimica com a proteina do envelope de VSV ou um fragmento dela.

Numa outra modalidade preferida, as composições de VLP possuem (i) uma proteina de envelope de um virus, tal como uma proteina do invólucro de um virus da estomatite vesicular (VSV) ou um fragmento dela (por exemplo, a região de transmembrana (TM) da glicoproteina VSV G) fundida com o polipeptídeo de acordo com a invenção, tai como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, e (ii) o antígeno heterólogo.

Noutra forma de realização particular, o envelope sintético pode ser funcionalizado, permitindo assim que a ligação ao envelope de síntese se dê através da interação, covalente ou não covalente, de qualquer molécula de interesse selecionada. 0 envelope funcionalizado pode compreender um ligante, em que o ligante (específico) permite a ligação de qualquer molécula de interesse selecionada. Como exemplo, o envelope pode compreender uma porção avidina ou biotina, o que permite ao mesmo a ligação específica de uma molécula. A molécula pode ser ligada ao polipeptídeo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, assim como o antígeno heterólogo (ou seja, antígeno não proteico e antígeno proteico).

Numa forma de realização particular, um antígeno heterólogo está contido no interior da VLP.

Numa forma de realização preferida, a partícula de tipo de vírus (VLP) compreende uma proteína retroviral Gag ou lentiviral (por exemplo, o vírus da leucemia murina (MLV) ou proteínas gag de HIV, ou seus fragmentos), ainda mais preferivelmente uma proteína Gag retroviral modificada. Num exemplo especifico, a proteina Gag é uma proteina de fusão que compreende o antigeno heterólogo (ou seja, hemaglutinina da gripe (HA) ou um fragmento dela (por exemplo, o peptideo consistindo de SFE, peptideo HA 111- 119) que conduz ao fato de que o antigeno heterólogo é contido dentro da VLP.

Assim, o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela, pode formar uma superficie de proteção (como ocorre naturalmente nos trofozoitos parasitas) que permitem a entrega correta do antigeno heterólogo na mucosa (por exemplo, mucosa intestinal), sem sofrer degradação no trato digestivo e ao mesmo tempo o antigeno heterólogo pode ser adjuvado pela particula de tipo VSP para o desenvolvimento de uma resposta imune protetora apropriada.

Deve-se notar que a presente invenção também se relaciona com a particula semelhante a virus (VLP), descrita acima, de acordo com a invenção.

Numa outra forma de realização, a particula é uma nanoparticula de vetor.

Dentro do contexto da presente invenção, as nanoparticulas são de tamanho pequeno, suficientemente pequenas para serem absorvidas pelas células para permitir que o antigeno seja apresentado na superficie celular. Em formas de realização preferidas, as nanoparticulas têm um núcleo com um diâmetro médio entre 0,5 e 10 nm, mais preferencialmente entre 1 e 2,5 nm.

O núcleo da nanoparticula pode ser um núcleo metálico. De preferência, o núcleo metálico é composto por Au, Ag ou Cu, como por exemplo, uma liga selecionada a partir de Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd, Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd ou Au/Fe/Cu/Gd.

De preferência, as nanoparticulas da presente invenção são solúveis em solventes orgânicos e mais particularmente em água.

Quando as nanoparticulas são utilizadas, elas podem ser preparadas de acordo com técnicas conhecidas na arte e, por exemplo, tal como descrito no pedido de patente internacional publicado sob o N° WO 2007/122388, o qual é incorporado por referência.

Numa forma de realização preferida, as nanoparticulas apresentam, na sua superfície, um polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela.

Numa outra modalidade preferida, o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela e o antigeno heterólogo são ambos ligados à superfície da nanoparticula.

Consequentemente, uma proteína de fusão ou um conjugado, tal como descrito acima, pode ser ligado a uma nanopartícuia.

Utilizações terapêuticas e preventivas das composições farmacêuticas da presente invenção.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica da invenção para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença, uma desordem ou condições fisiológicas em um sujeito.

Como aqui utilizado, o termo "sujeito" significa um mamífero, tal como um roedor, um felino, um canino e um primata. De preferência, um sujeito de acordo com a invenção é um ser humano.

No contexto da presente invenção, o termo "tratar" ou "tratamento", como usado aqui, significa reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou prevenir a desordem ou condição à qual tal termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tal desordem ou condição.

Dentro do significado da presente invenção, o termo "prevenção" ou "prevenir", com respeito a um evento, pretende significar a redução do risco de ocorrência de tal evento.

Assim sendo, uma doença, uma desordem ou condições fisiológicas consideradas na presente invenção podem ser selecionadas do grupo consistindo de câncer, doenças imunológicas, doenças autoimunes, rejeições de aloenxerto, doenças virais, como a gripe ou a AIDS, doenças parasitárias, tais como a malária ou tripanosomiase, infecções bacterianas, tais como tuberculose e alergias.

A invenção também se relaciona com uma composição farmacêutica da invenção para uso como uma vacina.

A invenção diz ainda respeito a uma composição farmacêutica da presente invenção contendo um polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela ligado a um antigeno heterólogo do invento (incluindo proteinas de fusão e seus conjugados), um polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela ligado a uma particula de vetor da presente invenção para induzir uma resposta imune e/ou para aumento de uma resposta imune.

A invenção também se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença, uma desordem ou condições fisiológicas, num individuo, em que o dito método compreende a administração ao referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da presente invenção.

Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica é administrada por via oral.

Numa outra forma de realização, a composição farmacêutica é administrada por via mucosal.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se a uma quantidade minima de agente ativo, que é necessária para conferir o beneficio terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para um mamifero é uma quantidade tal que induza, melhore a ou de outra forma provoque uma melhoria dos sintomas patológicos, progressão da doença ou condições fisiológicas associadas com ou resistência ou com a instalação de uma doença.

A invenção também se refere a um método de imunização de um sujeito, em que o dito método compreende a administração ao referido individuo da composição farmacêutica da presente invenção.

A invenção diz ainda respeito à utilização de um polipeptideo de acordo com a invenção, tal como uma VSP de Giardia ou um fragmento dela como um veiculo para a apresentação de antigeno heterólogo e para vacinação, em particular uma vacinação oral ou mucosal.

Como anteriormente mencionado, o polipeptideo de acordo com a invenção, tal como VSPs de Giardia ou seus fragmentos favorece uma distribuição correta do antigeno heterólogo para a mucosa, sem sofrer degradação extensiva no aparelho digestivo.

Numa forma de realização, o polipeptídeo é capaz de se ligar às células epiteliais do intestino e/ou é resistente à degradação enzimática e/ou química da parte superior do trato gastrointestinal.

Numa modalidade particular, o polipeptídeo é uma proteína de superfície variável (VSP), uma proteína de tipo VSP de um microrganismo ou de um fragmento dela.

A invenção será ainda ilustrada pelas figuras e exemplos a seguir. No entanto, estes exemplos e figuras não devem ser interpretados de modo algum como limitativos do âmbito da presente invenção.

FIGURAS:

Figura 1: CFSE rotulados de esplenócitos de camundongos SFE-TCR (106/poço) foram cultivadas com CDllc DCs purificada (razão 5T:1DC) durante 72h em meio sozinho, VLP-VSP-HA recombinante ou peptídeo SFE (controle positivo) nas concentrações indicadas. Os histogramas mostram a proliferação de células T por diluição CFSE de células T específicas SFE (visualizadas utilizando um anticorpo anti- CD4 + e o anti-anticorpo 6,5 clonotípico que reconhece especificamente as células T transgênicas). Os números indicam a percentagem de células divididas.

Figura 2: Ensaio de ELISPOT (imunização oral com HA- VSP proteína de fusão) . HA específico de produção IFN-y foi determinado por um ensaio ELISPOT padrão (Mabtech, Sophia Antipolis, França). Os esplenócitos (5 x 105 células/poço) foram estimuladas durante a noite a 37 °C em 5% de CO2 com 1 μg/mL de proteina HA. PBS ou concanavalina A (5 μl/mL; ConA; Sigma-Aldrich) foram utilizados como controles negativos e positivos, respectivamente. Depois da revelação, os pontos foram contados utilizando o leitor AID ELISPOT (ELR03, AID AutoimmunDiagnostika, Strasberg, Alemanha) e pontos inespecificos detectados nos controles negativos foram subtraídos. Os simbolos representam camundongos individuais e as linhas horizontais representam a média geométrica de cada grupo. *p<0,05, **p<0,01.

Figura 3: Resposta humoral em camundongos por via oral vacinados com a proteina de fusão VSP-HA. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Placas de 96 poços de microtitulação foram revestidas com recombinante HA H5N1. Diluições em série de soros foram adicionadas e incubadas durante 2h em temperatura ambiente, reveladas por lh em temperatura ambiente com biotina de cabra marcada com Ig de cabra anti camundongos (H + L) (Biot. humano adsorvida. Cat Southern Biotech # 1010-08) e, por lh em temperatura ambiente com um ultra-estreptavidina-peroxidase de polimero (Sigma-Aldrich). A atividade da peroxidase foi medida usando substrato de TMB (Sigma-Aldrich) e as densidades ópticas foram lidas a 450 nm (OD450) , após o bloqueio da reação por adição de HC1. A quantidade de anti HA foi calculada com base num anticorpo monoclonal padrão anti H5N1 HA (rato anti Influenza A, H5N1 aviária hemaglutinina (HA), Cat # 17649-55B. USBiological).

Figura 4: Ensaio de ELISPOT (imunização oral com VLPs pseudotipado com HA e VSP) . HA especifico de IFN-y (A) e IL-4- (B) , em que a produção foi determinada por um ensaio ELISPOT padrão (Mabtech, Sophia Antipolis, França). Os esplenócitos (5 x 105 células/poço) foram estimuladas durante a noite a 37 °C em 5% de CO2 com 20 ng de HIV Gag- particulas baseadas pseudotipadas com HA e NA t. Meio sozinho ou concanavalina A (2 μL/mL; ConA, Sigma-Aldrich) foram utilizados como controles negativos e positivos, respectivamente. Depois da revelação, os pontos foram contados utilizando o leitor AID ELISPOT (ELR03, AID AutoimmunDiagnostika, Strasberg, Alemanha) e pontos inespecificos detectados nos controles negativos foram subtraídos. Os símbolos representam animais individuais e as linhas horizontais representam a média geométrica de cada grupo. *p<0,05, **p<0,01, ***p <0,001. f: HIV Gag-baseado em partículas lentivirais foram geradas por transfecção de células T 293 com vetores de expressão que codificam os componentes virais (pCMV9 (Gag) + HA (pXD14) + NA (pXD15). Um ensaio HIV p24 especifico de ELISA (Kit RETRO-TEK. # HIV-1 p24 Antigen ELISA,. ZeptoMetrixCorp, Nova Iorque, EUA) foi utilizado para determinar as concentrações de p24 nas amostras de vetor lentiviral, de acordo com as instruções do fabricante.

Figura 5: Resposta humoral em camundongos vacinados com a via oral VLP-VSP-HA/NA. Inibição da hemaglutinação (Hl) respostas de anticorpos. Amostras de soro foram diluidas em série e incubou-se lh a 37 °C, com 4 unidades de HA de H5Nl-pseudotipado MLV Gag-particulas baseadas em 25 μl PBS. Em seguida, 50 μl de uma suspensão a 0,5% de eritrócitos de galinha foi adicionada a cada poço. Os titulos de anticorpos Hl são expressos como o reciproco da diluição mais elevada de amostras de aglutinação de inibição. Os símbolos representam animais individuais e as linhas horizontais representam a média geométrica de cada grupo.

EXEMPLOS:

Para se obter uma prova do principio e, simultaneamente, para o desenvolvimento de uma vacina candidata potencial, foi utilizado antigeno hemaglutinina de gripe (HA) como um modelo de antigeno vacinai.

Assim, para determinar se uma resposta imune protetora e completa (T e B) pode ser provocada por administração oral de antigenos de HA transportados pela VSP, construiu- se vários vetores que permitam a expressão concomitante do VSP e os antigenos de HA. A proteina HA de virus Influenza A H5N1/Hong Kong foi utilizada como antigeno para induzir células B e células T especificas respostas imunes.

Exemplo 1: Material e Métodos Geração de três construções diferentes VSP/HA para serem utilizadas como vacinas orais

Para determinar se uma proteção imune completa e resposta imune (T e B) pode ser provocada por administração oral de antigenos de hemaglutinina da gripe (HA) transportados por VSP de Giardia, várias construções são feitas de modo a permitir a expressão concomitante de VSP e dos antigenos de HA. A proteina HA e o seu peptideo imunodominante SFE são utilizados como antigenos heterólogos para induzir respostas imunes de células B e células T especificas, respectivamente.

Estas construções VSP/HA incluem proteinas de fusão e de particula semelhante a virus (VLP), na qual os antigenos VSP e HA estão vinculados.

Mais precisamente, três diferentes construções VSP/HA são assim geradas, sendo elas: 1 - VSP fundida com o peptideo de SFE para monitorar respostas imunes especificas de células T. 2 - VSP fundida com a porção extracelular do HA (ΔHA) para monitorar respostas imunes especificas de células B e células T. 3 - Uma partícula do tipo vírus (VLP) que indica VSP e HA proteínas (forma de comprimento completo), na sua superfície e/ou o peptídeo SFE no interior da partícula, como uma proteína de fusão gag. VLP são formadas por proteínas Gag MLV fundidas com o peptídeo SFE. Para a visualização da proteína VSP na superfície de partículas VLP, VSP está fundida com o VSV-G da região de transmembrana (TM).

Produção das proteínas de fusão VSP e caracterização bioquímica

Controle: MIA sozinho e polipeptideo da presente invenção: VSP Ex fundido com a porção extracelular do HA (ΔHA).

Mais particularmente, as sequências de cDNA que codificam o ΔHA foram derivadas de Influenza A H5N1 (Hong Kong). A empresa Genscript foi empregada para a produção da proteína. A sequência de DNA recombinante da proteína foi de códons otimizados e transformados em bactérias utilizando vetores de expressão da empresa. HA recombinante foi obtido no sistema de expressão em bactérias utilizando E. coll de linhagem BL21 (DE3) . Para a purificação da proteina HA, uma coluna Q sob condições desnaturantes foi usada e a proteina resultante foi redobrada através de diálise contra Tris 50 mM-HCl, 5% de Glicerol, pH 8,0.

Para a produção da VSP soldada da parte extracelular da proteina HA, foram utilizados HA, na sua forma solúvel, e a região TM foi suprimida (ΔHA). Sequências de proteina foram analisadas utilizando a linha de previsão topologia da plataforma Phobius (http://phobius.sbc.su.se/).

A VSP de comprimento completo contém uma região rica em cisteína extracelular contendo várias regiões CXXC. O peptídeo de sinal, a região de transmembrana e citoplasmática dos cinco resíduos foram eliminados (VSP Ex). VSP 1267 foi utilizada nestas experiências.

A sequência da proteína de fusão foi de códons otimizados para a clonagem no sistema de baculovírus. A proteína foi expressa e purificada por uma etapa de purificação por afinidade utilizando a marca presente na sua porção terminal carboxila da proteína.

Produção das partículas retrovirais (VLP) pseudotipada com VSP e HA na superfície VLP feita a partir de uma amarração e pseudotipada com HA e NA (neuraminidase):

Para o vetor de HA, a sequência HA H5N1 (Hong Kong) foi clonada incluindo o seu próprio domínio TM (vetor pXD14). HA tipo selvagem é naturalmente e de forma muito eficiente pseudotipada em partículas virais ou pseudovirais. Para a expressão do vetor NA 15 PXD foi usado.

VLP feita a partir de uma Gag e pseudotipada com VSP e HA e NA

Para pseudotipagem de sequências VSP para as VLPs, o dominio extracelular de VSP foi fundido com o dominio de transmembrana (TM) da proteina G do virus da estomatite vesicular (VSV-G), que é conhecido por ser eficazmente exportado na membrana plasmática em células de mamíferos, co-localizadas com as proteínas Gag, e foram pseudotipadas para conjuntos recém-formados de partículas virais ou pseudovirais (vetor pCP1267). Nota: para algumas experiências a proteína Gag-Gp33-41 de fusão foi utilizada em vez de GAG, assim como para medir a resposta de CD8. Para visualizar o peptideo Gp33-41 no interior da partícula, Gp33-41 foi fundida com o terminal carboxila de Gag MLV (vetor PEB1).

Produção de DNA

Uma vez que todas as construções foram validadas, os plasmídeos foram amplificados e purificados. A produção de plasmídeo foi realizada utilizando kits de preparação de livres de endotoxinas (Nucleobond PC 2000 ® EF; Macherey- Nagel, Hoerd, França).

Produção de VLP

Para gerar partículas retrovirais recombinantes, células T 293 foram transfectadas com os vetores de expressão gerados (pEBl, pCP1267, pXD15 e pXD14). Os sobrenadantes contendo partículas foram concentrados e purificados por ultracentrifugação, com ou sem uma etapa de purificação adicional por FPLC.

Cada lote de VLPs foi submetido à análise de controle de qualidade para validar a presença de MLV Gag, HA ou VSP por diferentes técnicas. - A funcionalidade da construção VSP-TM é demonstrada pela sua expressão adequada na superfície de células transfectadas pelo vetor pCP1267.

A eficiência da produção de partículas VLPs e incorporação de VSP dentro ou sobre as VLPs foi avaliada por Western blot em sobrenadante ultracentrifugado.

Resultados:

A pseudotipagem correta de HA para as VLPs foi avaliada por um ensaio de hemaglutinação. Células vermelhas do sangue de galinha (RBC) foram incubadas na presença de diluições em série de VLPs diferentes para avaliar a aglutinação na presença de uma proteína HA conformacional.

VLP-HAH5N1/NA foi utilizado como controle positivo e VLP- Gag-GFP como controle negativo. A incubação de RBC com PBS serve para avaliar o tempo de sedimentação. Por este teste mostrou-se que o VLP-VSP-HA/NA que foi desenvolvido durante este estudo foi capaz de promover aglutinação de RBC.

Exemplo 2: Material e Métodos: Validação in vitro das três construções: 2.1- nivel bioquímico:

VSP - imunoprecipitação especifica foi feita a fim de validar as construções VSP-ΔHA e VLP. Os imunoprecipitados foram analisados por Western-blot. A detecção de HA e a detecção de HA/proteinas Gag são feitas de modo a validar as construções, respectivamente.

2.2- nivel imunológico:

Para determinar se os antigenos de HA podem ser reconhecidos por células T especificas para HA, testes in vitro de proliferação são realizadas com SFE-especificas células T CD4 + (obtidas a partir dos camundongos transgênicos SFE como descrito por Kirberg et al. 1994), na presença de DC sensibilizadas com cada uma das três construções ou carregadas com proteinas recombinantes purificadas.

Resultados:

Confirmou-se que o antigeno HA presente nas VLPs foi corretamente processado e ativa as células T especificas de HA por um ensaio in vitro de proliferação utilizando CFSE rotulados SFE CD4 + especificas para células T transgênicas para um TCR que reconhece especificamente a forma SFE110 HA-119 de peptideo (obtido a partir de camundongos transgênicos SFE (Kirberg J., 1994). Tal como observado na Figura 1, as células transgênicas se dividem ativamente na presença de células dendriticas (DC) pulsadas com o VLP- VSP-HA, indicando que a presente proteina HA na VLP foi corretamente processada e apresentada de uma forma de MHC c II restrita.

Exemplo 3: Caracterização da resposta imune anti-HA e anti-VSP em camundongos imunizados oralmente com as construções de VSP/HA

As respostas imunes locais e sistêmicas em ratos são analisadas em diferentes tempos após a vacinação oral.

Modelo:

Os camundongos (H-2d) foram imunizados por via oral com VSP-ΔHA, ou HA-VLPs (VSP-) . Como controle, os animais são imunizados por via oral com ΔHA ou HA-VLP (VSP) e imunizados subcutaneamente com HA-VLPs em Al(OH)3. [Controle positivo]. Análise: - Respostas T sistêmicas de células: a frequência de células T especificas para HA são analisadas por IFN-y ELISPOT após HA especifico de re-estimulação das células do baço. - Respostas sistêmicas de células B: a resposta de anticorpo HA-especifico é estudada no soro por ELISA ou ensaios de inibição da hemaglutinação.

Imunização oral com a proteina de fusão VSP-HA Protocolo de imunização:

Camundongos fêmea Balb/c (H-2d), de 7 semanas de idade, receberam três sucessivas administrações orais de 35 μg da proteina recombinante ΔHA ou da proteina recombinante ΔHA-VSP - suspensas em PBS - Tween estéril 20, 0,01%, com 3 dias de intervalo. Como controle, os animais receberam apenas o veiculo (controle negativo) e foram imunizados uma vez s.c. com 35 μg de ΔHA em alumina (controle positivo).

A resposta anti-HA das células T foi analisada num grupo de camundongos sacrificados no dia 17 (10 dias após a última dose oral). A resposta anti-HA das células B foi estudada em um outro grupo de camundongos no dia 21 (14 dias após a última imunização).

Resultados: Análise da resposta de células T:

Como pode ser observado na Figura 2, a imunização com a proteina de fusão HA-VSP induziu, com êxito, uma resposta HA de IFN-y de célula T especifica em 2 de 2 camundongos imunizados, ao contrário da imunização oral com a proteina HA sozinha, que não induziu uma resposta significativa em 3 de 3 camundongos vacinados.

Estes resultados estabelecem que a fusão do antigeno HA com a proteina VSP faz com que a proteina de fusão tenha a capacidade única de gerar um antigeno HA com resposta das células T especifica sistêmica quando administrada por via oral.

Análise da resposta de células B:

A geração de anticorpos anti-HA específicos Ab foi analisada por ELISA. A administração oral da proteina HA foi incapaz de induzir anti-HA Ab, ao passo que a proteína de fusão HA-VSP induziu títulos elevados de anti-HA Abs em um dos camundongos imunizados por via oral, indicando que, na presença da VSP, uma resposta das células B sistêmica pode ser gerada contra HA (Figura 3).

Imunização oral com as VLPs pseudotipadas com VSP e HA na superfície: Protocolo de imunização:

Camundongos fêmea Balb/c (H-2d), de 7 semanas de idade, receberam três sucessivas administrações orais de 35 μg de VLP-HA/NA, VLP-VSP-HA/NA suspensas em PBS estéril - Tween 20, 0,01%, em 3 dias separados. Como controle, os animais receberam apenas o veiculo (controle negativo), ou foram imunizados uma vez s.c. com 35 μg de VLP-VSP-HA/NA em alumina (controle positivo).

Os camundongos foram sacrificados no dia 17 (10 dias após a última dose oral) e as respostas celulares T e B para HA foram analisadas.

Resultados: Análise da resposta de células T:

Como se pode observar na Figura 4, a imunização com a proteina de fusão VLP-VSP-HA/NA induziu, com êxito, uma resposta de HA IFN-y HA de célula T especifica em 3 dos 3 camundongos imunizados, ao contrário da imunização oral com a VLP-HA/NA, que induziu uma resposta não significativa em 3 dos 3 camundongos vacinados. Nenhuma produção IL-4 HA especifica significativa foi detectada, sugerindo que a resposta imune gerada pela proteina de fusão é do tipo Thl. Estes resultados estabelecem que a blindagem VSP-HA com a proteina VSP faz com que a particula tenha a capacidade única de gerar uma resposta a antigeno HA das células T especifica e sistêmica quando administrada por via oral.

Análise da resposta de células B:

Para a análise das respostas de células B sistêmicas, a resposta de anticorpos HA específicos é quantificada no soro utilizando um ensaio de inibição da hemaglutinação, como mostrado na Figura 5. Pode ser visto que apenas VLP pseudotipada com HA e VSP pode gerar anticorpos específicos anti HA, o que indica que a presença de VSP para a VLP foi necessária para a geração de uma resposta sistêmica de células B anti-HA.

Conclusão:

Nós produzimos as vacinas orais compostas de proteínas quiméricas VSP-HA ou HA-expressando VLP cobertas com VSPs e HA e os controles correspondentes. Foi bioquimicamente validado que as VSPs e as proteínas HA mantêm sua conformação correta nas construções correspondentes. Sendo assim, a produção de imunização de animais por via oral foi expandida. Nestas experiências observou-se que, contrariamente à administração oral da proteína HA sozinha, que não induz uma resposta T específica ou resposta de células B, a administração oral de HA transportado por VSPs - sendo como uma proteína de fusão ou como uma formulação de VLP - gera uma resposta HA-specífica humoral e celular.

Este trabalho demonstra a validade de nossa estratégia.

O desenvolvimento desta plataforma universal para a administração oral de vacinas deve ter uma ampla aplicação em várias doenças infecciosas. Há um grande interesse na via de administração oral, em particular para as vacinas profiláticas para a vacinação em massa.

Este resultado das experiências que utilizam VSPs de Giardia e, mais geralmente, polipeptideos que compreendem pelo menos um motivo CXXC de acordo com a presente invenção, parecem constituir um excelente suporte para uma via de transporte para o antigeno candidato do trato digestivo para o intestino, onde pode permanecer durante um tempo que permita o desenvolvimento de uma resposta imune. E, não menos importante, a VSP pode também atuar como um adjuvante de mucosa, tal como sugerido pela sua capacidade de induzir uma resposta imune (resposta de anticorpos) por si só.

Com efeito, como prova de principio do dominio extracelular dos parasitas intestinais de VSPs de Giardia como portador de suportes para antigenos candidatos para vacinas orais demonstrou ter capacidade para induzir uma resposta imune eficaz para HA de gripe por vacinação oral.

Referências:

Ao longo deste relatório descritivo, várias referências descrevem o estado da arte à qual este invento pertence. As revelações destas referências são aqui incorporadas por referência, na presente invenção.

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Morrison HG, McArthur AG, Gillin FD, Aley SB, Adam RD, Olsen GJ, Best AA, Cande WZ, Chen F, Cipriano MJ, Davids BJ, Dawson SC, Elmendorf HG, Hehl AB, Holder ME, Huse SM, 5 Kim UU, Lasek-Nesselquist E, Manning G, Nigam A, Nixon JE, Palm D, Passamaneck NE, Prabhu A, Reich CI, Reiner DS, Samuelson J, Svard SG, Sogin ML; Genomic minimalism in the early diverging intestinal parasite Giardia lamblia; Science. 2007 Sep 28;317(5846): 1921-6.

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Rivero FD, Saura A, Prucca CG, Carranza PG, Torri A,Lujan HD; Disruption of antigenic variation is crucial for effective parasite vaccine; Nat Med. 2010 May;16(5):551-7.

Claims (11)

1. Vacina contra um antígeno caracterizada pelo fato de compreender: - um antígeno ligado a um polipeptídeo, em que o polipeptídeo: - é heterólogo ao antígeno, - compreende 10 a 14 motivos CXXC, em que C representa um resíduo de cisteína e X representa qualquer resíduo de aminoácido, e - é capaz de se ligar a células epiteliais do intestino, em que o polipeptídeo é uma proteína de superfície variável (VSP), uma proteína semelhante a VSP de um microrganismo ou um fragmento da mesma, e em que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de espécies de Giardia, Tetrahymena, Paramecium e Entamoeba.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é resistente à degradação enzimática e/ou química da parte superior do trato gastrointestinal.

3. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é o domínio extracelular da VSP ou um fragmento do mesmo.

4. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é fundido com o referido antígeno.

5. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é ligado a uma partícula de vetor contendo o referido antígeno.

6. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a partícula de vetor é uma partícula viral, de uma partícula de tipo viral (VLP) ou uma nanopartícula.

7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a partícula de vetor é uma VLP exibindo, na sua superfície, o polipeptídeo.

8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o antígeno está contido no interior ou sobre a superfície da VLP.

9. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a partícula de vetor é uma nanopartícula exibindo, na sua superfície, o polipeptídeo e o antígeno heterólogo.

10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a vacina é uma vacina oral.

11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende, pelo menos, a vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 e uma veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

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