JP2008524261A - インフルエンザウイルスタンパク質の組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2004年12月21日に出願された米国仮出願第60/638,254号、2004年12月21日に出願された第60/638,350号、2005年1月19日に出願された第60/645,067号、2005年2月15日に出願された第60/653,207号、2005年3月31日に出願された60/666,878号、2005年5月18日に出願された第60/682,077号、および2005年11月30日に出願された第60/741,202号の利益を主張する。上記出願の全ての全教示は、参照によって本明細書に援用される。
インフルエンザは、通常RNAウイルスによってもたらされる感染性の疾患である。3種類のインフルエンザウイルス-インフルエンザA、BおよびC型が公知である。インフルエンザA型の自然の宿主は水鳥である。インフルエンザA型ウイルスは、ヒト、トリ、家畜(例えばブタ、ウマ)、および水生動物(例えばアザラシ)に感染し得る。インフルエンザB型ウイルスは、通常ヒトのみに見られる。一般に、インフルエンザへの感染は、発熱、筋痛、頭痛、咳および筋肉痛を特徴とする。年長者および虚弱者において、インフルエンザB型の感染は障害および死をもたらし得る。インフルエンザB型ウイルスは、ヒトにおいて流行を生じ得る。インフルエンザC型ウイルスは、ヒトにおいて軽い疾病を生じ得、流行を生じない。インフルエンザ感染を予防および管理するための戦略としては、不活性化ウイルスを用いたワクチン、およびアマンタジン(塩酸1-アミノアダマンチン(aminoadamantine))、リマンタジン、ザナミビルおよびオセルタミビル等の鼻腔スプレーおよび薬物が挙げられる。しかしながら、かかる戦略は需要を供給することを維持するためにはコストがかかるので、供給が制限され、変動的な防御および決して満足できない症状の軽減に終わり、それにより効果のない疾病の予防または処置を生じ得、いくつかの例において、インフルエンザ感染の結果、死をもたらし得る。従って、インフルエンザ感染の予防および管理のための処置の新しい、改善された効果的な方法の開発が必要である。
本発明は、病原体関連分子パターン(PAMP)およびインフルエンザウイルスタンパク質を含む、組成物、融合タンパク質およびポリペプチドに関する。本発明の組成物、融合タンパク質およびポリペプチドは、被験体の免疫応答を刺激する方法に使用され得る。
これより、本発明の工程または本発明の部分の組合せのいずれかで、本発明の特徴および他の詳細をより具体的に記載し、特許請求の範囲において示す。本発明の特定の態様が本発明の限定としてではなく図示により示されることが理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく種々の態様で使用され得る。
M2eは複数のインフルエンザAサブタイプ(また本明細書において「株」といわれる)にわたり保存されている。M2eは、M2タンパク質、特にM2タンパク質の24アミノ末端(また本明細書において「エクトドメイン」といわれる)の少なくとも一部である。M2エクトドメインは、HA(約566個のアミノ酸)およびNA(約469個のアミノ酸)に比べると比較的小さなアミノ酸配列(24個のアミノ酸)である。典型的な鳥インフルエンザA型分離株のM2e配列はヒト分離株のM2e配列とは異なるが、トリ分離株の間では高度に保存されている(上の表1参照)。フラジェリンSTF2(その全て、またはヒンジ領域が削除されたSTF2)のカルボキシ末端に融合したM2eの4つの直列コピーを作り出した。ヒンジ領域のないSTF2はまた本明細書において「STF2Δ」といわれる。
合成4xM2e配列(4つの連続した24個のアミノ酸配列)のSTF2とのカルボキシ末端融合を以下のように構築した。pET24AベクターをNovagen, San Diego, CAから購入した。方法としては、DNA 2.0 Inc.(Menlo Park, CA)が実施したStratagene(La Jolla, CA www.stratagene.com)のSeamless Cloning Kit(カタログ番号214400)を用いた。融合タンパク質をコードする遺伝子はpDrive 4xM2E G00448にあり、STF2とのC末端融合発現構築物の構築のための挿入物調製のためのPCR鋳型として用いた。合成4xM2E構築物pDrive 4xM2E G00448を、Stratagene (La Jolla, CA)のSeamless Cloning Kit(カタログ番号214400)に概説されるようにPCRの鋳型として用いた。この増幅から期待される生成物は、318bpおよびこの挿入物を増幅するために用いたオリゴヌクレオチドに組み込まれた制限酵素部位を含む。手順は以下の通りであった:
1μL 約20ngのpDrive 4xM2E G00448
5μLの10x クローンのPfuポリメラーゼバッファー
1μLの40mM dNTP混合物
1μL 約10pmolの順方向プライマー4xM2Eforbs1
1μL 約10pmolの逆方向プライマー4xM2Erevwsto
40μL ddH2O
4xM2Eforbs1プライマー配列:
5’-CGCTCTTCAMTGAGCTTGCTGACTGAGGTTGAGACCCCGATTC(配列番号69)
4xM2Erevwstoプライマー配列:
5’-CGCTCTTCACGCTTATTATCTAGACGGGTCTGAGCTATCGTTAGAGCGAG(配列番号70)
5μLの10x クローンのPfuポリメラーゼバッファー
1μLの5-メチルdNTP混合物
44μL ddH2O
予め構築したpET24a/STF2.M2e構築物を、Stratagene (La Jolla, CA)のSeamless Cloning Kit(カタログ番号214400)に概説されるようにPCRの鋳型として用いた。この増幅から期待される生成物は、全pET24プラスミド+STF2配列を含むが、この構築物に存在するM2Eの単一コピーを含まない。手順は以下の通りであった:
1μL 約40ngのSTF2.M2E pET22-2
5μLの10x クローンのPfuポリメラーゼバッファー
1μLの40mM dNTP混合物
1μL 約10pmolのプライマー 4xMECpET24
1μL 約10pmolのプライマー 4xM2EC-STF2
40μL ddH2O
1μLのPfuTurbo DNAポリメラーゼ
4xMECpET24プライマー配列:
5’-GCTCTTCAGCGGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGG(配列番号71)
4xM2EC-STF2プライマー配列:
5’-CGCTCTTCACAGACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGCGG(配列番号72)
5μLの10x クローンのPfuポリメラーゼバッファー
1μLの5-メチルdNTP混合物
44μL ddH2O
Eam 1104 I消化物を以下のようにベクターおよび挿入物について別々に準備した:
30μLのエタノール沈殿後の増幅生成物
5μLの10x 一般的なバッファー(Seamless Cloning Kitに同梱されている)
4μL Eam 1104 I制限酵素(Seamless Cloning Kitに同梱されている)
11μL ddH2O
9μL ddH2O
5μLのEam 1104 I消化4xM2E増幅挿入物
5μLのEam 1104 I消化STF2.M2E pET22-2増幅ベクター
2μL 10xリガーゼバッファー
2μL 10mM rATP
1μL T4 DNAリガーゼ(ストックから1:16で希釈した)
1μL Eam 1104 I制限酵素
XL-10(Stratageneカタログ番号200314)コンピテント細胞を氷上で解凍する一方、エッペンドルフ管を10分間冷却した。
50μLのコンピテント細胞をライゲーション毎にストック管から等分した。
XL-10細胞が供給されている2μLのβ-メルカプトエタノールストック。
この混合物を2分毎に静かに混合しながら氷上で10分間インキュベートした。Seamless Cloningライゲーション反応物(4μL)を添加し、静かに旋回し、次いで氷上で30分間インキュベートした。42℃の水浴中で35秒間、管に熱ショックを与えた。管を氷上で少なくとも2分間インキュベートした。SOC培地(400μL)を細胞に添加してかき混ぜながら37℃で1時間インキュベートした。
2つのLB寒天カナマイシン(50μg/mL)プレートを用いて、200μLおよび10μLの形質転換細胞を平板培養し、一晩生育させた。
ミニプレップのためにカナマイシンを含むL培地(25ug/mL)で組み換え候補を生育し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen Valencia, CA カタログ番号27106)を用いて抽出した。候補クローンを制限酵素(New England Biolabs Beverly, MA)でスクリーニングして、カナマイシンを含む100mLのL培地(25ug/mL)で陽性のクローンを生育し、Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit(カタログ番号12643)を用いて抽出した。これらのクローンを塩基配列決定のためにGENEWIZ(North Brunswick, NJ)に提出した。
大腸菌(E. coli) BLR(DE3)pLysS宿主(Novagen, San Diego, CA, カタログ#69053)中のSTF2.4xM2eをグリセロールストックから復活させ、5Lに増やした。細胞を15μg/mlのカナマイシンおよび12.5μg/mlのテトラサイクリンを含むLB培地でOD600=0.4になるまで生育し、1mM IPTGで37℃にて3時間誘導した。細胞を遠心分離(Sorvall RC5C遠心分離機で7000rpm x 7分)により集菌し、2x PBS, 1%グリセロール, DNAse, 1mM PMSF, プロテアーゼインヒビターカクテルおよび1mg/mlのリゾチームに再懸濁した。懸濁液をマイクロフルイダイザーに通して細胞を溶解した。溶解物を遠心分離(45,000gをBeckman Optima L超遠心分離機で1時間)して可溶画分を封入体から分離した。タンパク質を可溶画分および不溶画分においてSDS-PAGEで検出した。
ヒトおよびトリ由来のいくつかのインフルエンザA型株からの共通なM2e配列を表1に示す。M2e配列のクローニングを容易にするために、それぞれが多重クローニング部位(MCS)を含む2つのベクターカセット、pMT/STF2およびpMT/STF2Δを生成した(図17Aおよび17B参照)。pMT/STF2を生成するために、ネズミチフス菌fljb 2型、すなわちSTF2のフラジェリン全てをコードする1.5kb遺伝子を、ショウジョウバエにおける発現のためのpMTBIP/V5-Hisベクター(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)のIg結合タンパク質(BIP)分泌シグナルに融合した。BiP配列はショウジョウバエにおける発現のための分泌シグナルとして構築物の5’末端に含まれる。H1、H2およびH3共通配列、SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP(配列番号47、表1)を示す化学的に合成した4xM2e遺伝子をpMT/STFのMCSにクローニングして、pMT/STF2.4xM2e(H1)を作成した。
tctctgctgactgaagtagaaactccaacgcgtaatgaatgggaatcccgttctagcgactcctctgatcctctcgagtccctgctgacggaggttgaaaccccgacccgcaacgagtgggaaagccgttcctccgattcctctgatccggagagcagcctgctgaccgaggtagaaaccccgacccgtaatgagtgggaatctcgctcctctgattcttctgacccgggatcctctctgctgaccgaagtggagactccgactcgcaacgaatgggagagccgttcttctgactcctctgacccg(配列番号102)でコードされる
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPLESLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPESSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPGSSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP(配列番号101)。
社内実験室株PR8からのゲノムDNAからのHAをコードする遺伝子、A/Puerto Rico/8/34の弱毒化誘導体を単離した(配列番号67をコードする配列番号68)。STF2Δ.HAPR8(配列番号62をコードする配列番号63)を生成するpPICZΔにおいて予め構築したSTF2Δカセットに遺伝子を融合した(図18参照)。精製した組み換えタンパク質を、BALB/cマウスにおける免疫原性および有効性について試験した。A/Vietnam/1203/04株のH5N1をコードする遺伝子をカスタム合成して、STF2Δ.HAH5(配列番号60をコードする配列番号61)を生成するSTF2Δカセットに融合した。ヒトおよびトリ両者のHA構築物をピキアパストリス(Pichia pastoris)株GS115およびX-33(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)に形質転換した。選択したクローンを、SDS-PAGEゲルでの分別による発現およびクマシーブルーによる染色ならびに抗HAおよび抗フラジェリンの抗体を用いるウェスタンブロット分析により発現についてスクリーニングした。
M2e(配列番号47)を、ペプチドのアミノ末端セリン残基を通じてトリパルミトイルシステイン(Pam3Cys)部分に化学的に結合した。融合タンパク質(Pam3Cys.M2e)の構造を図15に示す。Pam3Cys.M2eの化学名は[パルミトイル-Cys((RS)-2,3-ジ(パルミトイルオキシ)-プロピル)-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro-OH酢酸塩]である。Pam3Cys.M2eの分子量は3582.3ダルトンである。
物質および方法
PAM3CYS.M2Eの合成および精製
Pam3Cys.M2eを、固相合成方法論を用いたGenemed SynthesisおよびBachemならびに上述の通りFMOC化学により調製した。質量分析を用いて最終生成物の分子量を確認した。
マイクロプレート法の製造業者の使用説明書に従いQCL-1000 Quantitative Chromogenic LAL test kit(BioWhittaker #50-648U)を用いて、STF2.4xM2eおよびPam3Cys.M2eのエンドトキシンレベルを測定した。
HEK293細胞は、TLR5を構成的に発現して、TLR5シグナル伝達に応答してIL-8を含むいくつかの可溶性因子を分泌する。HEK293細胞を96ウェルマイクロプレートに播種し(50,000細胞/ウェル)、試験タンパク質を添加し一晩インキュベートした。次の日、ならし培地を採取し、清潔な96ウェルマイクロプレートに移して-20℃で冷凍した。解凍後、製造業者の使用説明書に従って、抗ヒトIL-8対応抗体対(Pierce, #M801Eおよび#M802B)を用いたサンドイッチELISAでならし培地をIL-8の存在について分析した。マイクロプレート分光光度計(FARCyte, Amersham)を用いて光学密度を測定した。アッセイにおけるIL8の標準曲線を含んで決定された、mlあたりのIL8のpgとして結果を報告する。
RAW264.7細胞(ATCC)は、TLR2を発現して、TLR2シグナル伝達に応答してTNFαを含むいくつかの可溶性因子を分泌する。RAW264.7細胞を96ウェルマイクロプレートに播種し(50,000細胞/ウェル)、試験化合物を添加し一晩インキュベートした。次の日、ならし培地を採取し、清潔な96ウェルマイクロプレートに移して-20℃で冷凍した。解凍後、製造業者の使用説明書に従って、抗マウスTNFα対応抗体対(Pierce)を用いたサンドイッチELISAでならし培地をTNFαの存在について分析した。マイクロプレート分光光度計(FARCyte, Amersham)を用いて光学密度を測定した。アッセイに含まれるTNFの標準曲線を参照して決定された、mlあたりのTNFのngとして結果を報告する。
約6〜8週齢の雌BALB/cマウス(National Cancer Institute)を用いた。マウスをグループあたり5〜10匹のマウスのグループに分け、0日目および21日目に尾の付け根の各側の皮下に、指示濃度のSTF2.4xM2eまたはPam3Cys.M2e融合タンパク質で免疫した。10日目(初回)および28日目(追加)に、個々のマウスを眼窩後穿刺(retro-orbital puncture)により採血した。ヘパリンを含まない血液試料の凝固および遠心分離により血清を採取した。
M2e特異的IgGレベルをELISAにより測定した。100μl/ウェルの5μg/ml M2eペプチドのPBS溶液で4℃にて一晩96ウェルELISAプレートをコーティングした。200μl/ウェルのAssay Diluent Buffer(ADB; BD Pharmingen)で室温にて1時間プレートをブロックした。プレートをPBS含有0.05%Tween-20(PBS-T)で3回洗浄した。血清のADB希釈液を添加して(100μl/ウェル)プレートを4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS-Tで3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはADBで希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Immunochemical)を添加して(100μl/ウェル)、プレートを室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tで3回洗浄した。TMB Ultra基質
(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン; Pierce)を添加して着色を監視した後、Tecan Farcyte顕微分光光度計でO.D. 450を測定した。
約13〜17週齢の雌および雄のNZWウサギ(Covance Research Products)を用いた。ウサギをグループあたり3羽の雄および3羽の雌のウサギのグループに分け、0日目および21日目ならびに42日目に交互の(alternating)大腿部の筋肉内に、指示濃度のPam3Cys.M2eペプチドまたはSTF2.4xM2e融合タンパク質で免疫した。動物を、-1日目(前採血(prebleed))、14日目(初回)および28日目ならびに42日目(追加)に採血した。試料の凝固および遠心分離により血清を調製した。
M2e特異的IgGレベルをELISAにより測定した。100μl/ウェルのPBS中のM2eペプチド(5μg/ml)で約4℃にて一晩96ウェルELISAプレートをコーティングした。200μl/ウェルのAssay Diluent Buffer(ADB; BD Pharmingen)で室温にて1時間プレートをブロックした。プレートをPBS-Tで3回洗浄した。血清のADB希釈液を添加して(100μl/ウェル)プレートを約4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS-Tで3回洗浄した。HRP共役ヤギ抗ウサギIgG(Jackson Immunochemical)を用いて結合IgGを検出した。プレートをPBS-Tで3回洗浄した。TMB Ultra基質(Pierce)を添加して着色を監視した後、Molecular Devices Spectramax顕微分光光度計でO.D.450を測定した。各動物の免疫後のO.D.450から前採血の各動物のO.D.450測定値を引いて決まるDelta O.D.として、結果を報告する。
通常の実験において、約5〜6週齢の雌BALB/cマウス(グループあたり10〜20匹)を入手して1週間順応させる。PBSまたは他の適切な製剤を処方された融合タンパク質を皮下注射により投与した。マウスを0日目および14日目に免疫した。21日目に、眼窩後穿刺により血清を採取し、ELISAによるM2e特異的IgGを評価した。十分に特性化されマウスに適合したインフルエンザA型株、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)のLD90を1回鼻腔内投与によりマウスを攻撃した。マウスを生存および体重減少について14日間毎日監視した。最初の体重の約30%を減じたマウスを人道的に犠牲にし、犠牲日を死亡日として記録した。有効性データを生存期間として報告した。
インビトロ生物活性
これらのアッセイは、関連のTLRを発現する細胞株に基づいており、TLR刺激に応答してIL8またはTNF-αのいずれかを生じる能力についてスクリーニングされる。図44において、STF2.4xM2e(■)またはSTF2.OVA(○)のTLR5に依存するIL8生成を刺激する能力を、TLR5陽性のHEK293細胞の刺激の後に評価した。結果は、両者の融合タンパク質が用量に依存する様式でIL8生成を刺激したこと、および融合の状況でPAMPの活性を保持したことを示す。
免疫原性のマウスモデルを用いて、M2eへのPam3Cysの化学的結合は、単独で送達されたM2eペプチドまたは遊離のPam3Cysと共送達されたM2eペプチドと比較してM2e抗原の免疫原性を高める。図46に示す実験において、マウスグループを0日目および21日目に、陰性対照としてPBS(*)、遊離のTLR2リガンド、Pam3CSK-4(()、M2eペプチドのみ(○)、M2eペプチドと混合した遊離のPam3CSK-4(□)、またはPam3.M2eといわれるPam3CysおよびM2eの融合物(◆)で免疫した。送達されたM2eペプチドの相当するモル比は一定のままであった。28日目に、血清を採取してELISAによりM2e特異的抗体力価を分析した。結果は、M2eへのPam3Cysの化学的結合(Pam3Cys.M2e)がM2e抗原に対する検出できる血清抗体応答を生じることを示す。
5匹のBALB/cマウスのグループを0日目および14日目に、30μgのPam3Cys.M2e(◆)、30μgのPam3Cys.M2e中でM2eのモル当量である22.5μgのM2e(◇)、従来のアジュバントであるミョウバンに吸収された22.5mgのM2e(□)、または25mgの組み換えタンパク質STF2.4xM2e(■)で免疫した。PBSを受けたグループを陰性対照(○)として含めた。2回目の投与後7日目に血清を採取し、M2e特異的IgGをELISAで評価した。図48に示す結果は、バックグラウンドより高い抗体力価を引き出さなかったという点で、M2e単独では免疫原性が乏しいことを示す。従来のアジュバントであるミョウバンは、M2eに対する免疫応答に小幅な上昇をもたらした。PAMPが結合したM2e構築物は、しかし、免疫原性に最も大きな上昇をもたらした。これらの結果は、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質部分へのPAMPの直接的な結合が、従来のアジュバントであるミョウバンによって引き出される免疫応答よりも強い免疫応答を引き出し得ることを示す。
用量範囲調査を行い、Pam3Cys.M2eおよびSTF2.4xM2eの有効性をさらに評価した。STF2.4xM2eについて、BALB/cマウスを0日目および14日目に、免疫あたり0.25〜25μgのSTF2.4xM2eにわたるSTF2.4xM2eの希釈液で免疫した。識別コードD002とはこの実験で用いるSTF2.4xM2eの特定のバッチをいい、一方R-028とはこの実験で用いるSTF2.4xM2eの歴史的な参照バッチをいう。最後の免疫の7日後(21日目)にマウスを採血し、M2e特異的IgG応答をELISAにより評価した。図49に示す結果は、免疫あたり0.25μgもの低い用量のSTF2.4xM2eの免疫が、検出できるレベルのM2e特異的IgGを生じ、マウスにおける最適な用量が約2.5〜約25μgの範囲にあったことを証明する。
Pam3Cys.M2eの免疫原性を、BALB/c(●)、C57BL/6(■)、CB6/F1(◆)、DBA/2(▲)、Cr:NIH(Swiss)(X)およびC3H/HeN(*)を含む複数のマウス系統において評価した。各系統あたり5匹のグループを0日目および14日目に免疫あたり30μgのPam3Cys.M2eで免疫した。21日目に血清を採取してELISAでM2e特異的IgGのレベルを評価した。Pam3Cys.M2eの免疫原性を示すM2e特異的IgGの有意のレベルを示した全ての系統は、特定のMHCに依存しない(図51)。
第二の種、ウサギにおけるPam3Cys.M2およびSTF2.4xM2eの免疫原性を評価することを目的とした調査を実施した。第一の調査において、ウサギ(3羽の雌および3羽の雄/グループ)を0日目、21日目および42日目に500、150、50、15または5μgのPam3Cys.M2eで(筋肉内に)免疫した。対照として、追加のグループが製剤バッファーF111(10mM Tris、10mMヒスチジン、75mM NaCl、5%スクロース、0.02%ポリソルベート-80、0.1mM EDTA、0.5%エタノール、20mg/mLヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、pH7.2)を受けた。追加2の後7日目に末梢血を得て抗M2e抗体力価をELISAで評価した。図52に示す結果は、血清の1:125希釈液での個々のウサギ抗体力価を表す。データは、初回/追加のワクチン注射に用いるPam3Cys.M2の量と達した抗体力価のレベルの間の用量反応関係を示唆する。
BALB/cマウスにおいて、十分に特性化されマウスに適合したインフルエンザA型株、A/Puerto Rico/8/34(PR/8)を攻撃ウイルスとして用いてPam3Cys.M2eおよびSTF2.4xM2eの有効性を評価した。10匹のマウスのグループを0および14日目に製剤バッファーF111中の30μgのPam3Cys.M2e(■)、専売バッファーF120(10mM Tris、10mMヒスチジン、10%スクロース、0.02%ポリソルベート-80、0.1mM EDTA、0.5%エタノール、0.075%ドキュセートナトリウム、pH7.2)中の30μgのPam3Cys.M2e(▲)、バッファーF119(10mM Tris、10mMヒスチジン、75mM NaCl、5%スクロース、0.02%ポリソルベート-80、0.1mM EDTA、0.5%エタノール、0.1%ドキュセートナトリウム、pH7.2)中の30μgのPam3Cys.M2e、バッファーF105(10mM Tris、10mMヒスチジン、75mM NaCl、5%スクロース、0.02%ポリソルベート-80、0.1mM EDTA、0.5%エタノール、pH7.2)中の30μgのSTF2.4xM2e、バッファーF105(10mM Tris、10mMヒスチジン、75mM NaCl、5%スクロース、0.02%ポリソルベート-80、0.1mM EDTA、0.5%エタノール、pH7.2)中の3μgのSTF2.4xM2e(●)またはバッファーF105中の0.3μgのSTF2.4xM2e (□)で皮下に免疫した。PBSのみをうけたグループを陰性対照(○)として含め、PR/8への免疫を有する回復期グループを、ウイルスによる致死下の攻撃後に陽性対照(◇)として含めた。28日目に、PR/8攻撃ストックのLD90により動物を攻撃した。攻撃後14日間、体重減少および生存を追跡調査した(図54)。
ネズミチフス菌フラジェリン(fljb)はTLR5のリガンドである。M2eの4つの直列反復部に融合したflijB(STF2)全てからなる組み換えタンパク質を大腸菌で発現し、低いエンドトキシンレベルで>95%純度に精製した。レポーター細胞株において、このタンパク質(STF2.4xM2e)はTLR5に依存するやり方でIL8生成を引き起こした。従来のアジュバントまたは担体を含まないバッファーF105中に処方した0.25μg〜25μgにわたるSTF2.4xM2e希釈液で免疫したマウスは、活発な抗体応答を開始した。わずか5μgのタンパク質を受けた動物が1回の投与後に血清変化したウサギ免疫原性調査において、組み換えタンパク質の有効性をさらに証明した。インフルエンザA/Puerto Rico/8/34を攻撃ウイルスとして用いたマウス攻撃モデルにおいて、PAMP融合タンパク質の有効性を証明した。投与あたりわずか0.3μgのタンパク質で免疫されたマウスは、軽い病的状態を示し、100%のマウスが攻撃を生き延びた。
本発明をその好ましい態様に関して特に説明し記載するが、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本明細書でなされ得ることを当業者は理解する。
Claims (51)
- 少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物。
- インフルエンザウイルスタンパク質がインフルエンザA型ウイルスタンパク質である、請求項1記載の組成物。
- インフルエンザタンパク質がインフルエンザB型ウイルスタンパク質である、請求項1記載の組成物。
- インフルエンザタンパク質がインフルエンザC型ウイルスタンパク質である、請求項1記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質が、赤血球凝集素膜タンパク質、ノイラミニダーゼ膜タンパク質およびM2膜タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項2記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質がM2タンパク質を含み、M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項5記載の組成物。
- M2タンパク質が配列番号15、配列番号19および配列番号34からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項5記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質が配列番号64および配列番号67からなる群より選ばれる少なくとも一員の少なくとも一部を含む赤血球凝集素タンパク質を含む、請求項5記載の組成物。
- 赤血球凝集素タンパク質が配列番号35、配列番号36、配列番号37および配列番号38からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項8記載の組成物。
- 少なくとも一つのPam2Cysをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- Pam3Cys、Pam2Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項10記載の組成物。
- Pam3Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項1記載の組成物。
- 組成物の少なくとも一つのPam3Cysと少なくとも一つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項12記載の組成物。
- リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項13記載の組成物。
- 組成物の少なくとも二つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項15記載の組成物。
- TLR5アゴニストをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項17記載の組成物。
- フラジェリンがFljb/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項18記載の組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない融合タンパク質。
- M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項20記載の融合タンパク質。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンと少なくとも一つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項21記載の融合タンパク質。
- 少なくとも二つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項21記載の融合タンパク質。
- M2タンパク質が配列番号15を含む、請求項21記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがTLR5アゴニストである、請求項20記載の融合タンパク質。
- TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項25記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがfljB/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項26記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがfljB/STF2を含み、fljB/STF2が配列番号1の少なくとも一部を含む、請求項27記載の融合タンパク質。
- fljB/STF2が配列番号3を含む、請求項28記載の融合タンパク質。
- フラジェリンが大腸菌fliCを含み、大腸菌fliCが配列番号5の少なくとも一部を含む、請求項27記載の融合タンパク質。
- 大腸菌fliCが配列番号66を含む、請求項30記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがサルモネラミュンヘンfliCを含み、サルモネラミュンヘンfliCが配列番号7の少なくとも一部を含む、請求項27記載の融合タンパク質。
- サルモネラミュンヘンfliCが配列番号99を含む、請求項32記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがインフルエンザM2タンパク質のカルボキシ末端に融合する、請求項20記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがインフルエンザM2タンパク質のアミノ末端に融合する、請求項20記載の融合タンパク質。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンが少なくとも二つのインフルエンザM2タンパク質の間にある、請求項20記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがTLR2アゴニストである、請求項20記載の融合タンパク質。
- TLR2アゴニストがPam3Cysである、請求項37記載の融合タンパク質。
- 赤血球凝集素膜タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、請求項20記載の融合タンパク質。
- ノイラミニダーゼ膜タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、請求項20記載の融合タンパク質。
- インフルエンザB型ウイルスタンパク質およびインフルエンザC型ウイルスタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員をさらに含む、請求項20記載の融合タンパク質。
- インフルエンザB型ウイルスタンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項41記載の融合タンパク質。
- インフルエンザC型ウイルスタンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項41記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンおよびM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない融合タンパク質。
- 少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体における免疫応答の刺激方法。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない、被験体における免疫応答の刺激方法。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではなく、M2タンパク質がM2eタンパク質ではない、被験体における免疫応答の刺激方法。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む組成物を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答の刺激方法。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答の刺激方法。
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