JP2008524261A5 - - Google Patents
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上述のように、M2、HAおよびNAは、インフルエンザウイルス(インフルエンザA、B、C)の内在性膜タンパク質(例えば、ウイルスの外部表面からウイルスの内部表面まで伸びているタンパク質)である。インフルエンザウイルスの内在性膜タンパク質について本明細書で使用する場合、「少なくとも一部」は、全内在性膜タンパク質の任意の一部を意味する。例えば、M2タンパク質の24アミノ酸N末端(例えば配列番号:13)、EVETPIRNEWG(配列番号:15)、EVETPIRNE(配列番号:19)、EVETPIRNEW(配列番号:34)またはEVETPIRN(配列番号:20)はM2タンパク質の少なくとも一部であり、PAKLLKERGRRGAIAGFLE(配列番号:33)はHAタンパク質の少なくとも一部である。配列番号:15はGAGGTTGAGACCCCGATTCGCAACGAATGGGGT(配列番号:96)にコードされる。GAGGTCGAAACACCTATCAGAAACGAATGG(配列番号:16)にコードされるタンパク質もM2の少なくとも一部である。
内在性膜タンパク質は、AGCTTGCTGACTGAGGTTGAGACCCCGATTCGCAACGAATGGGGTTCCCGTTCCAACGATTCTTCCGACCCG(配列番号:106)にコードされる配列番号:14または配列番号:47の少なくとも一部にコードされる、SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP(配列番号:13)の少なくとも一部を含むM2タンパク質を含み得る。M2タンパク質としては、さらにEVETPIRNEWG(配列番号:15)、EVETPIRNE(配列番号:19)、EVETPIRNEW(配列番号:34);SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP(配列番号:39)(Flu A H5N1 M2e、システインをセリンで置換した2004ベトナム単離体);SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP(配列番号:40)(Flu A H5N1 M2e、2004ベトナム単離体);SLLTEVETLTRNGWGSRSSDSSDP(配列番号:41)(Flu A H5N1 M2e、システインをセリンで置換したホンコン97単離体);SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP(配列番号:42)(Flu A H5N1 M2e、ホンコン97単離体);SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSDP(配列番号:43)(Flu A H7N2 M2e、システインをセリンで置換したニワトリ/ニューヨーク95単離体);SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSDP(配列番号:44)(Flu A H7N2 M2e、ニワトリ/ニューヨーク95単離体);SLLTEVETLTRNGWESKSRDSSDP(配列番号:45)(Flu A H9N2 M2e、システインをセリンで置換したホンコン99単離体);およびSLLTEVETLTRNGWECKCRDSSDP(配列番号:46)(Flu A、ホンコン99単離体)からなる群より選択される少なくとも一員が挙げられ得る。M2タンパク質の少なくとも一部の天然に存在する配列中の特定のシステイン残基、例えば配列番号:40のアミノ酸16および18;配列番号:42、44および46のアミノ酸17および19はセリンで置換される(配列番号:41、43、45および47それぞれ参照)。
内在性膜タンパク質は、例えば配列番号:65および68それぞれにコードされる配列番号:64および67の少なくとも一部を含む、赤血球凝集素タンパク質を含み得る。赤血球凝集素タンパク質としては、PAKLLKERGRRGAIAGFLE(配列番号:33)(インフルエンザB);SLWSEEPAKLLKERGFFGAIAGFLEE(配列番号:35)(Flu B);SLWSEENIPSIQSRGLFGAIAGFIEE(配列番号:36)(Flu A H1/H0);SLWSEENVPEKQTRGIFGAIAGFIEE(配列番号:37)(Flu A H3/H0);SLWSEEEWEERERRRKKRGLFGAIAGFIEE(配列番号:38)(Flu A H5/H0);PAKLLKERGFFGAIAGFLEE(配列番号:102)(Flu B);NIPSIQSRGLFGAIAGFIEE(配列番号:103)(Flu A H1/H0);NVPEKQTRGIFGAIAGFIEE(配列番号:104)(Flu A H3/H0);およびRERRRKKRGLFGAIAGFIEE(配列番号:105)(Flu A H5/H0)からなる群より選択される少なくとも一員の少なくとも一部が挙げられ得る。
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」とは、共有または非共有結合する少なくとも二つの同様または異なる成分(例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部)から生じるタンパク質のことを言う。融合タンパク質の成分は、例えば合成により(例えばPam3Cys、Pam2Cys)、または組換え核酸技術により(例えば、PAMPの少なくとも一部またはインフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部等の融合タンパク質の成分をコードする核酸配列を用いた宿主細胞のトランスフェクション)作製され得る。融合タンパク質の一成分(例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部)は、ペプチド結合を含む化学結合技術を用いて、または融合タンパク質構築物の生成等の組換え技術を含む分子生物学的技術を用いて、融合タンパク質の別の成分(例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部)と結合し得る。本発明の例示的な融合タンパク質としては、配列番号:32(図14)にコードされる配列番号:31(図13);配列番号:63(図22)にコードされる配列番号:62(図21);配列番号:61(図20)にコードされる配列番号:60(図19);配列番号:83(図29)にコードされる配列番号:82((図28);配列番号:85(図31)にコードされる配列番号:84(図30);配列番号:87(図33)にコードされる配列番号:86(図32);配列番号:91(図37)にコードされる配列番号:90(図36);配列番号:93(図39)にコードされる配列番号:92(図38);配列番号:95(図41)にコードされる配列番号:94(図40);および図15に示されるようなPam3Cysが挙げられる。
さらに別の態様において、本発明の組成物、融合タンパク質およびポリペプチドとしては、配列番号:98を含むサルモネラミュンヘンfliC等の、配列番号:7の少なくとも一部を含むサルモネラミュンヘンfliCを含むフラジェリン、または配列番号:99等の、配列番号:8の少なくとも一部をコードする核酸配列が挙げられ得る。
さらに別の態様において、本発明は配列番号:9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94を含むポリペプチド、ならびに配列番号:10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95にコードされるポリペプチドを含む。
さらなる態様において、本発明は、配列番号:9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94のポリペプチドならびに配列番号:10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95の核酸配列に少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%および少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
二つのアミノ酸配列(または二つの核酸配列)のパーセント同一性は、(例えば、第一配列の配列中にギャップが挿入され得る)最適な比較のために配列を整列することにより決定され得る。次いで、アミノ酸配列または核酸配列は対応する位置で比較され、二配列間のパーセント同一性は配列に共有される同一である位置の数の関数(すなわち%同一性=同一である位置の#/位置の総計# x 100)である。比較のために整列されたPAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部、本発明の融合タンパク質または本発明のポリペプチドをコードするタンパク質または核酸の長さは、参照配列、例えば、例えば配列番号:9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94ならびに配列番号:10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95で示されるような、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部またはポリペプチドもしくは融合タンパク質の核酸配列の長さの少なくとも30%、好ましくは、少なくとも40%、より好ましくは、少なくとも60%、およびさらにより好ましくは、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%である。
PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部、本発明の融合タンパク質および本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、選択的ハイブリダイゼーション条件(例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)下で、例えば、fljB/STF2(例えば配列番号:2、4)、fliC(例えば配列番号:6、8、99)、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部(例えば、配列番号:11、13、15、18、19、21、33、35〜59、64および67)および本発明の融合タンパク質(例えば、配列番号:31、64および60)にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「低ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」、「中程度ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」、「高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」または「非常に高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする」は、核酸配列のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表す。水性および非水性の方法を含み得るハイブリダイゼーション反応を行なうガイダンスは、その教示が全体として本明細書に援用される、Aubusel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (2001)中に見出され得る。
「異種配列」とは本明細書で使用される場合、異なる種からの配列を意味する。例えば、H1配列はヒトの配列であり、H5配列はトリの配列である。従って、H1配列およびH5配列は異種配列である(例えば、
tctctgctgactgaagtagaaactccaacgcgtaatgaatgggaatcccgttctagcgactcctctgatcctctcgagtccctgctgacggaggttgaaaccccgacccgcaacgagtgggaaagccgttcctccgattcctctgatccggagagcagcctgctgaccgaggtagaaaccccgacccgtaatgagtgggaatctcgctcctctgattcttctgacccgggatcctctctgctgaccgaagtggagactccgactcgcaacgaatgggagagccgttcttctgactcctctgacccg(配列番号101)でコードされる
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPLESLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPESSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPGSSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP(配列番号100)。
tctctgctgactgaagtagaaactccaacgcgtaatgaatgggaatcccgttctagcgactcctctgatcctctcgagtccctgctgacggaggttgaaaccccgacccgcaacgagtgggaaagccgttcctccgattcctctgatccggagagcagcctgctgaccgaggtagaaaccccgacccgtaatgagtgggaatctcgctcctctgattcttctgacccgggatcctctctgctgaccgaagtggagactccgactcgcaacgaatgggagagccgttcttctgactcctctgacccg(配列番号101)でコードされる
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPLESLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPESSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPGSSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP(配列番号100)。
異種構築物としては、例えば配列番号86および87においてH1(ヒト)およびH5(トリ)などの少なくとも2つの内在性膜タンパク質が挙げられる。
pMT/STF2Δを生成するために、配列番号2のフラジェリン遺伝子全てのアミノ酸170から415にわたる超可変領域を除去し、TLR5シグナル伝達に必要なアミノ末端配列およびカルボキシ末端配列の相互作用を容易にするように設計した短い(10個のアミノ酸)フレキシブルリンカー(GAPVDPASPW、配列番号97)と置き換えた。この構築物から発現されるタンパク質は、単独で発現されようと試験抗原と融合して発現されようと、強力なTLR5活性を保持する。従って、予言的に、M2e構築物の第二の系列をpMT/STF2Δに基づき生成する。予言的に、10%FBSおよび抗生物質を補足したシュナイダー培地で室温にて生育したショウジョウバエDmel-2細胞(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を、製造業者の使用説明書に従いCellfectin試薬(Invitrogen)を用いて上述の構築物でトランスフェクトする。トランスフェクション24時間後、予言的に、FBSを欠いた培地において細胞を0.5mM CuSO4で誘導して、さらに48時間インキュベートする。予言的に、誘導した培養物からならし培地(CM)を採取して、SDS-PAGEならびに抗フラジェリンおよび抗M2e特異的抗体を用いるウェスタンブロット分析によりタンパク質発現についてスクリーニングする。予言的に、ELISAおよび免疫原性についてのインビボマウス調査により評価される、融合タンパク質の同一性、TLR生物活性、抗原性を実施する。
Claims (45)
- 少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物。
- インフルエンザウイルスタンパク質がインフルエンザA型ウイルスタンパク質、インフルエンザB型ウイルスタンパク質またはインフルエンザC型ウイルスタンパク質である、請求項1記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質が、赤血球凝集素膜タンパク質、ノイラミニダーゼ膜タンパク質およびM2膜タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項2記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質がM2タンパク質を含み、M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項3記載の組成物。
- M2タンパク質が配列番号15、配列番号19および配列番号34からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項3記載の組成物。
- 内在性膜タンパク質が配列番号64および配列番号67からなる群より選ばれる少なくとも一員の少なくとも一部を含む赤血球凝集素タンパク質を含む、請求項3記載の組成物。
- 赤血球凝集素タンパク質が配列番号35、配列番号36、配列番号37および配列番号38からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項6記載の組成物。
- 少なくとも一つのPam2Cysをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- Pam3Cys、Pam2Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項8記載の組成物。
- Pam3Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項1記載の組成物。
- 組成物の少なくとも一つのPam3Cysと少なくとも一つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項10記載の組成物。
- 組成物の少なくとも二つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項11または12記載の組成物。
- TLR5アゴニストをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項14記載の組成物。
- フラジェリンがFljb/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項15記載の組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない融合タンパク質。
- M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項17記載の融合タンパク質。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンと少なくとも一つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項18記載の融合タンパク質。
- 少なくとも二つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項18記載の融合タンパク質。
- M2タンパク質が配列番号15を含む、請求項18記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがTLR5アゴニストである、請求項17記載の融合タンパク質。
- TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項22記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがfljB/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項23記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがfljB/STF2を含み、fljB/STF2が配列番号1の少なくとも一部を含む、請求項24記載の融合タンパク質。
- fljB/STF2が配列番号3を含む、請求項25記載の融合タンパク質。
- フラジェリンが大腸菌fliCを含み、大腸菌fliCが配列番号5の少なくとも一部を含む、請求項24記載の融合タンパク質。
- 大腸菌fliCが配列番号66を含む、請求項27記載の融合タンパク質。
- フラジェリンがサルモネラミュンヘンfliCを含み、サルモネラミュンヘンfliCが配列番号7の少なくとも一部を含む、請求項24記載の融合タンパク質。
- サルモネラミュンヘンfliCが配列番号98を含む、請求項29記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがインフルエンザM2タンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端に融合する、請求項17記載の融合タンパク質。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンが少なくとも二つのインフルエンザM2タンパク質の間にある、請求項17記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンがTLR2アゴニストである、請求項17記載の融合タンパク質。
- TLR2アゴニストがPam3Cysである、請求項33記載の融合タンパク質。
- 赤血球凝集素膜タンパク質またはノイラミニダーゼ膜タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、請求項17記載の融合タンパク質。
- インフルエンザB型ウイルスタンパク質およびインフルエンザC型ウイルスタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員をさらに含む、請求項17記載の融合タンパク質。
- インフルエンザB型ウイルスタンパク質またはインフルエンザC型ウイルスタンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項36記載の融合タンパク質。
- 病原体関連分子パターンおよびM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない組成物。
- 少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない融合タンパク質。
- 被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物の使用。
- 病原体関連分子パターンがPam2Cysではない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物の使用。
- 病原体関連分子パターンがPam2Cysではなく、M2タンパク質がM2eタンパク質ではない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む組成物の使用。
- 病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む組成物を含む組成物の使用。
- 病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む組成物の使用。
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