WO2011048248A1 - Adyuvante para vacunas, vacunas que lo comprenden y usos. - Google Patents

Adyuvante para vacunas, vacunas que lo comprenden y usos. Download PDF

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WO2011048248A1
WO2011048248A1 PCT/ES2010/070667 ES2010070667W WO2011048248A1 WO 2011048248 A1 WO2011048248 A1 WO 2011048248A1 ES 2010070667 W ES2010070667 W ES 2010070667W WO 2011048248 A1 WO2011048248 A1 WO 2011048248A1
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ova
adjuvant
omp19s
cells
polypeptide
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PCT/ES2010/070667
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Mirta L. Coria
Karina A. Pasquevich
Andrés E. IBAÑEZ
Guillermo H. Giambartolomei
Juliana Cassataro
Maria Victoria Delpino
Original Assignee
Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Conicet)
Inis Biotech Llc
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
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    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides

Definitions

  • Adjuvant for vaccines vaccines that comprise it and uses.
  • the present application relates to a vaccine adjuvant comprising a non-lipidated outer membrane polypeptide (Omp) of bacteria, wherein the bacteria may be of the Brucella genus.
  • the adjuvant can be a modified polypeptide, it can be for example the Omp19S polypeptide or parts thereof, the Omp16S polypeptide or parts thereof, or mixtures thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 1 or parts thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 2 or parts thereof.
  • Immunological adjuvants are substances that, incorporated into the antigen (Ag) or administered simultaneously with it, make the immune response against it more effective. They can be used to improve the immune response to an Ag in several ways: they can improve the magnitude of the immune response against a weak Ag; they can be used to increase the speed and duration of the immune response, they can modulate the avidity of antibodies (Acs), isotypes or subclass distribution; they can stimulate and modulate the cellular immune response; may promote the induction of local immune response (eg mucous membranes); decrease the amount of Ag needed and reduce the cost of a vaccine; or they can help prevent the competition of Ag that exists in the combined vaccines (Singh and O'Hagan. Advances in vaccine adjuvants. Nat Biotechnol. 17 (1 1): 1075-81. 1999).
  • Optimal formulations must be safe, stable, biodegradable, inert, and low production costs.
  • the list of substances that meet all these requirements is short, so far adjuvants approved for use in humans are restricted to aluminum salts, MF59 (an oil-in-water emulsion), MLP (monophosphoryl- glycolipid), viral particles (HBV and HPV), IRIV (proteoliposome composed of phospholipids, influenza virus hemagglutinin and a specific white antigen); and the subunit B of the cholera toxin (Reed, Bertholet, Coler and Friede.
  • Adjuvants should not induce adverse reactions when used in prophylactic vaccines, although certain reactions are accepted in therapeutics. In the field of veterinary health, efficacy is an element of great importance and certain levels of side effects are tolerated (Sesardic. Regulatory considerations on new adjuvants and delivery systems. Vaccine. 24 Suppl 2 S2-86-7. 2006).
  • CT cholera toxin
  • the majority of adjuvants capable of inducing strong Th1 responses are those based on oily emulsions, such as the Incomplete Freund's adjuvant (IFA), however these bring about adverse reactions at the injection site, such as sterile abscesses and granulomas.
  • IFA Incomplete Freund's adjuvant
  • Omp16S and Omp19S Two new adjuvants are provided in the present invention: Omp16S and Omp19S. These substances increase and / or modulate the immune responses against the Ags with which they are co-administered, favoring the development of Th1 or Th17 or CTL immune responses.
  • an adjuvant for vaccines comprising a non-lipidated outer membrane polypeptide (Omp) of bacteria
  • the adjuvant can be a modified polypeptide or it can be for example the Omp19S polypeptide or parts thereof, or the Omp16S polypeptide or parts thereof, or mixtures thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 1 or parts thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 2 or parts thereof.
  • a vaccine comprises as an adjuvant at least one non-lipidated outer membrane polypeptide (Omp) of bacteria and at least one antigen, wherein the bacterium can be of the Brucilla genus and where said vaccine can be mucosal or parenteral
  • the vaccine adjuvant can be a modified polypeptide or it can be for example the Omp19S polypeptide or parts thereof, or the Omp16S polypeptide or parts thereof, or mixtures thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 1 or parts thereof.
  • the adjuvant is the non-lipidated polypeptide comprised in SEQ ID No. 2 or parts thereof.
  • the use of the adjuvant to prepare a vaccine against a pathogen is provided, wherein the pathogen can have at least one phase of its intracellular life cycle.
  • the use of the adjuvant to prepare an anti-tumor vaccine or an immunomodulatory composition is provided.
  • Eukaryotic expression vectors comprising the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2.
  • Modified eukaryotic cells that express the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 are provided.
  • Figure 1 shows: Coomasie Blue 15% polyacrylamide gel stained in purified and depleted Omp19S and Omp16S lipopolysaccharide (LPS). 20 g of total proteins were seeded on all streets. It was also run on the same Omp19S gel degraded with proteinase K (Omp19SPK) that was used as a control in some experiments.
  • Omp19SPK proteinase K
  • Figure 2 shows that expression of the ⁇ 4 ⁇ 7 marker increases in mesenteric lymph cells of BALB / c animals immunized orally with Omp19S as an adjuvant.
  • the animals were immunized orally with: i) bovine ovalbumin (OVA), ii) Omp19S + OVA or iii) Choleric toxin (CT) + OVA.
  • OVA ovalbumin
  • CT Choleric toxin
  • 2x10 6 mesenteric ganglion cells corresponding to each immunization group were labeled with anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE-Cy5.5) and anti-a4p7 (PE) antibodies.
  • FITC anti-CD4
  • PE-Cy5.5 anti-a4p7
  • the data are representative of two independent experiments.
  • Figure 3 shows that Omp19S, when administered as an oral adjuvant, induces a T cell immune response in vivo.
  • the delayed hypersensitivity reaction (DTH) was determined in response to the inoculation of 20 g OVA in the plantar pad of the immunized animals as described in Figure 2. The bars represent the average increase in the plantar skin fold between the right leg.
  • FIG. 4 shows that Omp19S, when administered as an oral adjuvant, induces an increase in the proliferative capacity of splenocytes in response to the antigenic stimulus.
  • the splenocytes of the immunized animals as described in Figure 2 were stimulated with OVA 1 OOpg / ml or without antigen.
  • the cells were labeled with 3 H thymidine for 18 hours and the incorporated radioactivity was measured.
  • results are shown as a stimulation index (Sl) representing the cpm of splenocytes stimulated with OVA / cpm of unstimulated splenocytes.
  • Sl stimulation index
  • a Sl> 2 is considered positive.
  • the values represent the average of triplicate determinations for the 5 animals ⁇ SEM.
  • FIG. 5 shows that Omp19S, when administered as an oral adjuvant, induces a cellular immune response with cytokine production (IFN- ⁇ and IL-17) in response to the antigen.
  • Spleen splenocytes from each immunized group as described in Figure 2 (n / group 5) were stimulated in vitro with different concentrations of OVA (1 OOpg / ml and l OOOpg / ml) or complete medium (RPMI). The culture supernatants were collected 72 hours after stimulation.
  • cytokines A) interferon (IFN) -y, (B) IL-4, (C) IL-2, (D) IL-10 and (E) IL-17 (pg / ml) in supernatants of culture were determined by ELISA. The values represent the average of determinations made in duplicate for each mouse ⁇ SEM. Representative of 2 experiments with similar results.
  • Figure 6 shows that Omp19S when administered as an oral adjuvant, stimulates the induction of specific CD4 + and CD8 + T cells that produce IFN- ⁇ .
  • Splenocytes from animals immunized orally with i) OVA, ii) Omp19S + OVA or iii) TC + OVA were stimulated with OVA 32 3 + A20J + OVA 500 g / ml or with complete culture medium (without stimulation) for 18hs. Then they were treated with Brefeldina A during the last 4 hours. of cultivation Subsequently, the cells were labeled with specific Acs anti-CD4 (PE / Cy5) and anti-CD8 (Alexa Fluor 647). They were then fixed, permeabilized and incubated with an anti-IFN- ⁇ Ac (PE) or isotype control (PE).
  • PE anti-IFN- ⁇ Ac
  • PE isotype control
  • the numbers in the upper right quadrant represent the percentages of CD4 + (A) or CD8 + (B) T lymphocytes that express IFN- ⁇ . In all cases, the percentage of isotype control and IFN- ⁇ production of the same group without stimulation were subtracted, thus the percentage indicated corresponds to the production of specific IFN- ⁇ OVA. The data are representative of 2 independent experiments.
  • Figure 7 shows that expression of the ⁇ 4 ⁇ 7 marker increases in mesenteric ganglion lymphocytes of BALB / c animals orally immunized with Omp16S as an adjuvant.
  • BALB / c animals were immunized orally with: i) OVA, ii) Omp16S + OVA or iii) CT + OVA.
  • 2x10 6 mesenteric ganglion cells corresponding to each immunization group were labeled with anti-CD8 (PE-Cy5.5) and anti-a4 7 (PE).
  • the numbers in the upper right quadrant represent the percentages of CD8 + T cells that express the ⁇ 4 ⁇ 7 marker. In all cases the percentage of isotype control was subtracted.
  • the data are representative of two independent experiments.
  • FIG. 8 shows that Omp16S, when administered as an oral adjuvant, induces a T cell immune response in vivo.
  • the DTH reaction was determined in response to the inoculation of 20 g OVA in the plantar pad of the animals immunized orally as in fig. 7.
  • Figure 9 shows that Omp19S when administered as a nasal adjuvant induces a cellular immune response with cytokine production (IFN- ⁇ ) in response to the antigen.
  • C57BL / 6 animals were immunized nasally with: i) OVA, ii) Omp19S + OVA or iii) CT + OVA.
  • the concentrations of the cytokines (A) IFN- ⁇ , (B) IL-4 and (C) IL-10 (pg / ml) in the culture supernatants were determined by ELISA. The values represent the average of determinations made in duplicate for each mouse ⁇ SEM. Representative of 2 experiments with similar results.
  • FIG 10 shows that Omp19S when administered as a nasal adjuvant, stimulates the induction of specific CD4 + and CD8 + T cells that produce IFN- ⁇ .
  • the splenocytes of the immunized animals as described in Figure 9 were cultured with OVA2 57 + MO5 + OVA 500 g / ml or with complete medium (without stimulation, RPMI) for 18 hours. Then they were treated with Brefeldina A during the last 4 hours. of cultivation Subsequently, the cells were labeled with specific Acs anti-CD4 (PE / Cy5) and anti-CD8 (Alexa Fluor 647). They were then fixed, permeabilized and incubated with an anti-IFN- ⁇ Ac (PE).
  • PE anti-IFN- ⁇ Ac
  • the numbers in the upper right quadrant represent the percentages of CD4 + (A) or CD8 + (B) T lymphocytes that express IFN- ⁇ . In all cases, the percentage of isotype control and IFN- ⁇ production of the same group without stimulation were subtracted, thus the percentage indicated corresponds to the production of specific IFN- ⁇ OVA. The data are representative of 2 independent experiments.
  • Figure 1 1 shows that Omp16S induces a cellular immune response with cytokine production when administered as a nasal adjuvant.
  • Animals C57BL / 6 were immunized nasally with: i) OVA, ii) Omp16S + OVA or iii) CT + OVA.
  • the concentrations of the cytokines (A) IFN- ⁇ , (B) IL-4 and (C) IL-10 (pg / ml) in the culture supernatants were determined by ELISA. The values represent the average of determinations made in duplicate for each mouse ⁇ SEM. Representative of 2 experiments with similar results.
  • FIG 12 shows that Omp16S when administered as a nasal adjuvant, stimulates the induction of specific CD4 + and CD8 + T cells that produce IFN- ⁇ .
  • the splenocytes of the immunized animals as described in fig. 1 1 were grown with OVA 2 57+ MO5 + OVA 500 g / ml for 18 hours. Then they were treated with Brefeldina A during the last 4 hours. of cultivation Subsequently, the cells were labeled with specific Acs anti-CD4 (PE / Cy5) and anti-CD8 (Alexa Fluor 647). They were then fixed, permeabilized and incubated with an anti-IFN- ⁇ (PE) Ac.
  • PE anti-IFN- ⁇
  • the numbers in the upper right quadrant represent the percentages of LT CD4 + (A) or CD8 + (B) that express IFN- ⁇ . In all cases, the percentage of isotype control and IFN- ⁇ production of the same group without stimulation were subtracted, thus the percentage indicated corresponds to the production of specific IFN- ⁇ OVA.
  • the data are representative of 2 independent experiments.
  • Figure 13 shows that the administration of Omp19S as a parenteral adjuvant has no effect on the magnitude of the humoral response.
  • Total anti-OVA IgG titers were determined in the sera of BALB / c animals immunized subcutaneously with i) OVA, ii) OVA + Omp19S and iii) OVA + CFA and were determined by ELISA.
  • FIG. 15 shows that Omp19S as a parenteral adjuvant does not induce local toxicity in the subcutaneous tissue of BALB / c mice after immunizations as described in fig. 13.
  • a granuloma at the injection site (box) is observed in the mouse immunized with CFA as adjuvant (A).
  • A On the right, the same area is observed in a mouse immunized with Omp19S as an adjuvant subcutaneously, with no signs of tissue alterations (B).
  • FIG. 16 shows that Omp16S and Omp19S, when administered as parenteral adjuvants, induce a T cell immune response against the antigen in vivo.
  • the DTH reaction was determined in response to the inoculation of 20 g OVA in the plantar pad of animals immunized subcutaneously with i) OVA, ii) OVA + Omp16S, iii) OVA + Omp19S or iv) OVA + CFA as described in fig. 13.
  • the bars represent the average increase in plantar skin fold between the right and left leg ⁇ SEM at 48hs (A) and 72hs (B).
  • n / group 5. Representative of 3 experiments with similar results.
  • FIG 17 shows that Omp19S, when administered as an adjuvant parenterally, induces an increase in splenocyte proliferative capacity in response to Ag.
  • Figure 18 shows that Omp19S when administered as a parenteral adjuvant induces a cellular immune response with cytokine production (IFN- ⁇ ) in response to the antigen.
  • IFN- ⁇ cytokine production
  • Figure 19 shows that Omp19S when administered as a parenteral adjuvant does not induce an increase in the production of IL-4 or IL-10 in response to the antigen.
  • Figure 20 shows that Omp19S when administered as a parenteral adjuvant induces a cellular immune response with IL-17 production in response to the antigen.
  • FIG 21 shows that the use of Omp19S as a parenteral adjuvant increases the proliferation of CD8 + cells specific for OVA2 57 - 264- Cells from OT-1 mice were labeled with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and transferred intravenously (iv) (10x10 6 cels / mouse) to C57BL / 6 mice.
  • CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • iv 10x10 6 cels / mouse
  • the proliferation of the CFSE + OT-1 cells in the spleens and lymph nodes was determined 5 days after immunization by flow cytometry analyzing CFSE fluorescence levels. The percentage of CD8 + cells that suffered more than one division is shown. Representative results of 3 experiments.
  • FIG. 22 shows that the use of Omp19S as a parenteral adjuvant increases intracellular production of IFN- ⁇ in the population of CD8 + cells specific for OVA257-264.
  • Splenocytes from the immunized animals as described in fig 22 were stimulated for 18 hours with: complete medium (RPMI), OVA 500Mg / ml + SIINFEKL peptide 5 pg / ml + MO5 and then treated with Brefeldin A for 6hs. Subsequently, the cells were labeled with an anti-CD8 Alexa Fluor antibody and anti-IFN- ⁇ PE.
  • the upper right quadrant values represent the percentages of IF8- ⁇ producing CD8 + cells.
  • Figure 23 shows that immunization with Omp16S or Omp19S as adjuvants induces a cytotoxic immune response capable of lysing tumor cells expressing Ag.
  • the cytotoxic activity of the splenocytes of the C57BL / 6 mice immunized with: i) OVA, ii was determined.
  • the white cells (MO5 expressing OVA or B16 that do not express OVA) labeled with 51 Cr were incubated with the splenocytes in a ratio of 50 splenocytes: 1 white cell.
  • FIG. 24 shows that the percentage of CD4 + and CD8 + T cells expressing ⁇ 4 ⁇ 7 increases in mesenteric ganglia of BALB / c animals orally immunized with Omp19S as an adjuvant.
  • the animals were immunized orally with: i) tetanus toxoid (TT), ii) TT + Omp19S or iii) TT + CT.
  • 2x10 6 mesenteric ganglion cells corresponding to each immunization group were labeled with anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE-Cy5.5) and anti-a4p7 (PE) antibodies.
  • Figure 25 shows in gels that the Omp16S and Omp19S proteins are correctly expressed in eukaryotic cells transfected with the expression plasmids in eukaryotes pCI-Omp16S or pCI-Omp19S respectively.
  • the expression of (A) Omp16S or (B) Omp19S in eukaryotic cells (COS-7) transiently transfected with plasmids pCI-Omp16S or pCI-Omp19S respectively or with plasmid pCI as a control was studied. After 24 or 48 hours of culture, the expression of Omp16 or Omp19 was evaluated by Western Blot in protein extracts from the transfected cells using specific anti-Omp16 or anti-Omp19 antibodies respectively.
  • FIG 26 shows that Omp19S inhibits the stomach proteases of Balb / c mice.
  • BSA irrelevant protein
  • Omp19S mammalian protease inhibitor cocktail
  • Enzymatic activity was measured using BODIPY FL casein or BODIPY FL OVA as substrates.
  • the graph represents the percentage of enzyme activity remaining after each treatment calculated taking the maximum activity of the stomach extract supernatant on the BODIPY FL casein or BODIPY FL OVA substrate as appropriate.
  • FIG. 27 shows that Omp19S is capable of inhibiting the degradation of eukaryotic (BSA, OVA) and bacterial (BLS, SurA. DnaK) antigens by stomach proteases of Balb / c mice.
  • BSA eukaryotic
  • BLS bacterial
  • DnaK bacterial
  • Each antigen was treated with: i) stomach extract supernatant, ii) stomach extract supernatant and Omp19S iii) stomach extract supernatant and mammalian protease inhibitor cocktail (as a control that stomach enzyme activity can be inhibited ).
  • These reaction mixtures were subjected to a polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and subsequent staining with Coomasie blue.
  • Figure 28 shows the ability of Omp19S to inhibit the degradation of antigens by stomach proteases in vivo using BODIPY FL casein as an antigen model.
  • Balb / c mice were inoculated orally with: i) NaHCO3 buffer (1 M, pH8) (Vehicle), ii) BODIPY FL casein with Omp19S, ii) BODIPY FL casein with aprotinin (a known protease inhibitor), iii) BODIPY FL casein.
  • the graph represents the percentage of enzyme activity remaining after each treatment calculated taking as maximum activity that of the stomach extract supernatant of mice immunized with BODIPY FL casein.
  • Omp19S polypeptide For the purposes of the present application the phrases "Omp19S polypeptide”, “Omp19S protein” and “Omp19S” have the same meaning and correspond to the non-lipidated Omp19S peptide.
  • Omp19S or Omp16S refers to the polypeptide whose sequence may correspond to SEQ No. 1 or SEQ No. 2 respectively obtained by purification from cells, tissues or organisms that express it, or by chemical synthesis.
  • Omp16S polypeptide “Omp16S protein” and Omp16S”
  • Omp16S “have the same meaning and correspond to the non-lipidated Omp16S peptide.
  • immunogen and "antigen” have the same meaning and are defined as any substance against which, in an immunocompetent organism, a humoral or cellular immune response can be induced. In this sense, antigen is synonymous with immunogen.
  • the Omp19S polypeptide was cloned without the consensus sequence of lipidation in a plasmid vector. From this construction competent E. coli cells were transformed so as to express and purify the non-lipidated polypeptide. Purification was carried out using a nickel-agarose resin. The corresponding eluates were seeded on a polyacrylamide gel with SDS ( Figure 1). Then the elutes of similar concentration were combined in different fractions. In these fractions the identity of the purified polypeptide was corroborated, for this a Western Blot was performed using a monoclonal antibody against Omp19.
  • the cloned polypeptide was sequenced and its sequence is shown in SEQ ID No. 1. It is evident that variations of said sequence may exist, all of which are within the scope of the present invention. For example fragments thereof, or additions, or deletions of fragments or amino acids.
  • Non-lipidated Omp19S polypeptides obtained from any Brucella species fall within the scope of the present invention.
  • the Omp16S polypeptide was cloned without the consensus sequence of lipidation in a plasmid vector. From this construction competent E. coli cells were transformed so as to express and purify the non-lipidated polypeptide. Purification was carried out using a nickel-agarose resin.
  • the delayed hypersensitivity response is mediated by T cells that arrive at the site of the antigen injection, recognize peptides derived from that antigen in Ag presenting cells (APCs) and release cytokines such as IFN- ⁇ , which stimulates Recruitment of innate immunity cells causing edema and swelling. Then, to analyze the T response in vivo, the DTH response induced by the injection of OVA was evaluated in mice immunized orally with the adjuvants of the invention. To do this 20 g of OVA was injected into the plantar pad in one of the legs of the immunized mice and in the other physiological solution was injected as a control.
  • APCs Ag presenting cells
  • Omp19S as a mucosal adjuvant would induce an antigen antigen (OVA) T response in vivo.
  • OVA antigen antigen
  • splenocytes from the immunized mice were cultured in the presence of different concentrations of OVA or complete medium for 72 hours. and then the pattern of cytokines produced in the supernatants of these cells was analyzed.
  • a capture ELISA was performed using specific monoclonal antibodies for the detection of IFN- ⁇ , IL-2, IL-10, IL-4 and IL-17 in culture supernatants of stimulated and control splenocytes.
  • Th2 profile cytokine levels such as IL-4 and IL-10 were found to be similar to baseline levels. In this way the use of Omp19S as an oral adjuvant would generate a response of type Th1 and Th17.
  • FIG. 6 shows the IFN- ⁇ production in CD4 + T cells by groups of mice immunized with OVA, OVA + Omp19S and OVA + CT orally.
  • Omp19S as an oral adjuvant, induces i) the migration of CD4 + and CD8 + T cells to the gastrointestinal mucosa, ii) a specific antigen T cell response in vivo, iii) the release of Th1 cytokines, Th17 as well as the proliferation of lymphocytes in response to Ag and iv) CD4 + and CD8 + T lymphocytes producing IFN- ⁇ memory.
  • IFN- ⁇ producing cells are indispensable in generating efficient immune responses against pathogen infections with some phase of their intracellular life cycle such as viruses, bacteria, parasites and fungi; or tumors, the fact that the adjuvant induces the production of this cytokine by T lymphocytes could be beneficial for the development of vaccines against such diseases. All these are very required qualities in the field of mucosal adjuvants.
  • the expression of ⁇ 4 ⁇ 7 in CD4 + and CD8 + T lymphocytes from mesenteric nodes obtained from animals immunized orally with i) OVA, ii) OVA + Omp16S or iii) OVA + CT was also studied (Figure 7).
  • the delayed hypersensitivity response induced by OVA injection was evaluated in mice immunized orally.
  • Those animals immunized orally with OVA co-administered with Omp16S as an adjuvant presented an increase in plantar skinfold with respect to those animals immunized with OVA without adjuvant at 48 hours and at 72 hours post-immunization of OVA ( Figure 8 A and B ).
  • This increase was slightly greater than that induced by cholera toxin as an adjuvant administered by the same route at 48 hours ( Figure 8 A and B).
  • Omp16S as a mucosal adjuvant induces a delayed hypersensitivity response (DTH) anti-antigen (OVA).
  • DTH delayed hypersensitivity response
  • OVA delayed hypersensitivity response
  • Omp16S administered orally is capable of inducing a T cell response in vivo similar to that generated with an experimental mucosal adjuvant known as choleric toxin.
  • Omp16S as an oral adjuvant would induce i) the migration of CD8 + T lymphocytes to the gastrointestinal mucosa, ii) a specific antigen T cell response in vivo.
  • Omp19S The nasal administration of Omp19S generates the production of specific cytokines for OVA in spleen splenocyte cultures.
  • Splenocytes from animals immunized nasally with OVA + Omp19S produced higher levels of IFN- ⁇ with respect to animals immunized with OVA without adjuvant (Figure 9A) in response to the OVA antigen.
  • OVA + CT administration by nasal route induced higher levels of IFN- ⁇ in the culture supernatants of splenocytes stimulated with OVA.
  • OVA stimulation did not induce the secretion of IL-4 in the splenocytes of any of the groups studied ( Figure 9B).
  • mice immunized with Omp19S + OVA by nasal route showed an increase in the percentage of CD4 + T cells but mostly CD8 + T cells that produce anti-OVA IFN- ⁇ . This production was greater than the OVA control group immunized by the same route without adjuvant and even greater than the control group with an adjuvant known as cholera toxin.
  • Omp16S nasal coadministration induces cytokine production in response to Ag in spleen splenocyte cultures.
  • the results indicate that splenocytes from animals immunized nasally with OVA + Omp16S produced higher levels of IFN- ⁇ with respect to control animals (OVA) in response to the OVA antigen (Figure 1 1 A).
  • Coadministration of nasal CT induced lower levels of IFN- ⁇ in the culture supernatants of splenocytes stimulated with OVA compared to the group immunized with OVA + Omp16S.
  • OVA stimulation did not induce the secretion of IL-4 in the splenocytes of any of the groups studied in response to the antigen (Figure 1 1 B).
  • Omp19S and Omp16S as nasal adjuvants, induces i) the release of Th1 cytokines in response to the antigen and ii) induces specific CD4 + and CD8 + T lymphocytes producing IFN- ⁇ specific antigen.
  • IFN- ⁇ producing T cells are indispensable in generating efficient immune responses against pathogen infections with some phase of their intracellular life cycle (or when the pathogen is internalized by macrophages), such as viruses, bacteria, parasites and fungi ; or tumors, the fact that the adjuvants of the invention induce the production of this cytokine by T lymphocytes could be beneficial for the development of vaccines against such diseases.
  • the humoral response was studied by determining the titer of total IgG immunoglobulins and the profile of induced isotypes (lgG1 and lgG2a) against OVA when co-immunized with Omp19S compared to the immunization of OVA in SF or OVA in CFA. From an indirect ELISA, the total IgG titers in the sera of the animals obtained 3 weeks after the last immunization in the different groups were determined. In the results obtained there is no significant increase in specific antibodies with respect to immunization with OVA without adjuvant (Figure 13), which would indicate that Omp19S does not have an effect on the magnitude of the triggered humoral response. Whereas, immunization with the Freund Adjuvant Positive Complete Control (CFA) generates an increase in the production of specific antibodies as expected. Omp19S as an adjuvant has no effect on the magnitude of the humoral response.
  • CFA Freund Adjuvant Positive Complete Control
  • the CFA has a mechanism of action type deposit, insolubilizing the antigen at the injection site, which promotes the accumulation of macrophages together with other cells, which form the characteristic macrophage granulomas showing signs of toxicity.
  • the preparation of Omp19S with which immunizations are performed is soluble, so it does not cause the formation of granulomas, which suggests a mechanism of adjuvant action different from that of CFA. Immunization with Omp19S as an adjuvant does not generate adverse local reactions in the subcutaneous tissue.
  • mice immunized subcutaneously were evaluated with: i) OVA, ii) OVA + Omp19S, iii) OVA + Omp16S, iv) OVA + CFA ov) physiological solution (SF) induced DTH response by the injection of OVA.
  • OVA physiological solution
  • 20 g of OVA was injected into the plantar pad in one of the legs of the immunized mice and in the other SF was injected as a control.
  • Those animals immunized with OVA co-injected with Omp19S or Omp16S showed an increase in the plantar skin fold compared to those animals immunized with OVA without adjuvant at 48hs. and 72 hours.
  • splenocytes from the immunized mice were cultured in the presence of different concentrations of OVA or complete medium for 72 hours. and then the pattern of cytokines produced in the supernatants of these cells was analyzed.
  • a capture ELISA was performed using specific monoclonal antibodies for the detection of IFN- ⁇ , IL-10, IL-4 and IL-17 in culture supernatants of stimulated and control splenocytes.
  • the cytokine pattern presented suggests that the response triggered by immunization with Omp19S as an adjuvant corresponds to a Th1 profile, in which there is an increase in the production of IFN- ⁇ and not IL- 4 and IL-10.
  • IFN- ⁇ producing T cells are indispensable in generating efficient immune responses against pathogen infections with some phase of their intracellular life cycle (or when the pathogen is internalized by macrophages), such as viruses, bacteria, parasites and fungi ; or tumors, the fact that the adjuvant induces the production of this cytokine by T lymphocytes could be beneficial for the development of vaccines against such diseases. Since the adjuvants of the invention induce Th1 responses could be used in vaccine preparations against such pathogens.
  • Transgenic mice for the T receptor have been used experimentally as a source of T cells with a defined specificity.
  • One of the most widely used models is transgenic OT-1 mice, whose CD8 + T cells express the specific T receptor for the OVA SIINFEKL peptide presented in the context of MHC I (H-2K b ) costimulatory molecules (Harmala, Ingulli , Curtsinger, Lucido, Schmidt, Weigel, Blazar, Mescher and Pennell.
  • MHC I H-2K b
  • mice were used for in vivo analysis of the adaptive immune response T CD8 + against the antigen.
  • the group immunized with SF had a proliferation value of 21.79%, while in the group immunized with OVA without adjuvant the The percentage of cells that divided (75.01%) was lower than when inoculated with Omp19S as an adjuvant (86.44%). The same happened with the cells of the draining lymph nodes.
  • the animals were immunized with said degraded adjuvant. It was observed that immunization with the proteinase K degraded adjuvant induced proliferation levels comparable to those of OVA inoculation without adjuvant.
  • the OT-1 cells of the animals immunized with the positive control (LPS) showed proliferation levels comparable to those of the group immunized with Omp19S as an adjuvant.
  • CD8 + cells were capable of inducing significant levels of IFN- ⁇ , characteristic of a T-helper type 1 response.
  • C57BL / 6 mice were immunized with: i) OVA ii) OVA + Omp19S, or iii) OVA + Omp19S PK sc sc Seven days later the spleens were removed from the animals, then the splenocytes were stimulated with culture medium, OVA 500 g / ml + SIINFEKL Peptide 5 g / ml + APC MO5 or Pma-lonomycin and the production of intracellular IFN- ⁇ was measured by flow cytometry.
  • the population of IFN- ⁇ -producing CD8 + cells is higher in mice immunized using Omp19S as an OVA adjuvant (0.73%) before in vitro stimulation with OVA compared to cells from animals immunized with OVA alone, whose percentage (0.14%) is similar to the isotype, this indicates that the polypeptide used as an adjuvant induces the differentiation of CD8 + T cells capable of producing IFN- ⁇ in response to stimulation with the antigen ( Figure 22).
  • Omp19S is capable of inducing the production of CD8 + T lymphocytes that secrete IFN- ⁇ in response to the antigen.
  • IF8- ⁇ -producing CD8 + cells are indispensable in generating efficient immune responses against pathogen infections with some phase of their intracellular life cycle such as viruses, bacteria, parasites and fungi; or tumors, the fact that the adjuvant induces the production of this cytokine by T lymphocytes could be beneficial for the development of vaccines against such diseases.
  • splenocytes from animals immunized with Omp19S or Omp16S as adjuvants produced a higher percentage of lysis with respect to those cells from the group immunized with OVA without adjuvant.
  • the complete Freund's adjuvant (CFA) was used as a positive control.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • Omp19S and Omp16S as adjuvants induce a cytotoxic response in the splenocytes of the immunized mice greater than that induced by the CFA adjuvant and without signs of alterations in the immunized tissue or other adverse effects.
  • the Omp19S and Omp16S polypeptides have been shown to be vaccine formulations comprising any immunogen or antigen whose adjuvant is at least Omp19S and / or Omp16S.
  • the polypeptides of the invention are good adjuvants for the generation of Th1 and cytotoxic responses in mucous membranes through nasal and oral use and systemically after parenteral administration.
  • T immune responses are considered protective against pathogens and tumors.
  • These adjuvants induce IFN- ⁇ -producing T responses administered parenterally and mucosally (nasal and oral) so they could be useful in vaccine preparations against pathogen infections with some phase of their intracellular life cycle (or when the pathogen is internalized by macrophages) such as viruses, bacteria, parasites and fungi; or tumors They also induce cytotoxicity against a tumor line that expresses the antigen (MO5), so they could be used in vaccines against tumors.
  • MO5 antigen
  • anti-allergic vaccines are intended to induce Th1 responses against the allergen in order to redirect an allergen-specific Th2 response to a modulatory Th1.
  • the adjuvants of the invention may be useful in modulating the allergen response.
  • IL-17 has an important role in the protection against Streptococcus pneumonie and Mycobacterium tuberculosis.
  • the proposed mechanism for the efficacy of vaccines that induce the activation of Th17 cells is through the regulation of chemokines. In this sense, the use of an adjuvant that is capable of inducing the production of this cytokine would be beneficial in vaccines against this type of pathogen.
  • the adjuvants of the invention could be used as immunomodulators or activators of the immune response in different pathologies where the immune response is involved.
  • the adjuvant polypeptides Omp16S and Omp19S could also be expressed in situ, being administered as vectors to DNA or RNA.
  • the Omp16 and Omp19 proteins are correctly expressed after transfection of eukaryotic cells with plasmids pCI-Omp16S or pCI-Omp19S respectively.
  • expression vectors can be administered to eukaryotic cells or higher organisms (vertebrates or mammals) in such a way that the adjuvant is expressed in situ and exerts its effect.
  • the action of the adjuvants of the present invention further comprises an inhibitory mencanism of the action of proteases, which would lead to an increase in the half-life of the antigen (Figure 26).
  • Each antigen was treated with: i) stomach extract supernatant, ii) stomach extract supernatant and Omp19S, iii) stomach extract supernatant and mammalian protease inhibitor cocktail (as a control that stomach enzyme activity can be inhibited)
  • stomach extract supernatant and mammalian protease inhibitor cocktail as a control that stomach enzyme activity can be inhibited
  • These reaction mixtures were subjected to a polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and subsequent staining with Coomasie blue (Figure 27).
  • mice were inoculated orally with: i) NaHCO3 buffer (1 M, pH8) (Vehicle), ii) BODIPY FL casein with Omp19S, iii) BODIPY FL casein with aprotinin (a known protease inhibitor), iv) BODIPY FL casein. After a reaction time the mice were sacrificed and the extracts were analyzed by fluorescence emission, observing an inhibition of the degradation of antigens by stomach proteases in vivo ( Figure 28).
  • proteases that are inhibited by the action of the adjuvants of the present invention are serine proteases, aspartyl proteases, metalloproteases and cysteine proteases.
  • the adjuvant polypeptides of the present invention turn out to be ideal since said ability to inhibit the destruction of Ag by proteases increased their half-life and induces an immune response. This could mean that a smaller amount of Ag is required to induce the same immune response, which would reduce vaccine costs.
  • Omp16S and Omp19S act as highly efficient adjuvants for antigens unrelated to Brucella antigens.
  • Example 1 Cloning, expression and characterization of the Omp19S v Omp16S polypeptides of Brucella abortus
  • the Omp19S polypeptide was cloned without the consensus lipidation sequence in the pET22 + vector with the addition of a histidine tail at the terminal carboxyl end (Novagen, Madison, Wl, USA), as described in (Giambartolomei, Zwerdling, Cassataro, Bruno , Fossati and Philipp.
  • Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7): 4635-42. 2004).
  • Antisense 5'AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3 '(SEQ ID N ° 4)
  • the genomic DNA of B. abortus 544 was used as tempering in the PCR reaction.
  • the ligation reaction product was used to transform competent bacteria of strain JM109 and the plasmid DNA was purified with a commercial kit (Promega).
  • the Omp16S polypeptide was cloned without the consensus sequence of lipidation in the pET22 + vector with the addition of a histidine tail at the carboxyl terminal (Novagen, Madison, Wl, USA), as described in (Giambartolomei et al. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7): 4635-42. 2004).
  • oligonucleotides were designed containing the restriction sites for the Ndel and Xhol enzymes at the 5 'end, and 3' region of the Omp16 gene without the aminoterminal end corresponding to the signal peptide sequence and the aminoterminal cysteine:
  • the genomic DNA of B. abortus 544 was used as tempering.
  • the product of the ligation reaction was used to transform competent bacteria of strain JM109 and the plasmid DNA was purified with a commercial kit (Promega).
  • the non-lipidated polypeptides Omp19S and Omp16S were subjected to a polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE), followed by a Coomasie blue staining to monitor the different stages of purification. Their identity was confirmed by Western Blot using a monoclonal antibody anti-Omp19 and another anti-Omp16.
  • the concentration of Omp19S and Omp16S was evaluated by the bicinconinic acid method (Pierce, Rockford, IL) using bovine serum albumin (BSA) as standard.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 2 Immunization assays of animals using Omp19S v Omp16S as an adjuvant:
  • OVA ovalbumin
  • mice 6 to 8 weeks old of the strain Balb / c (H-2 d ) or strain C57BL / 6 (H-2 b ) were used. They were acquired in the bioterio of the National University of La Plata and were maintained in the bioterio of the Institute of Humoral Immunity Studies (IDEHU). They received water and food ad libitum.
  • Routine 1 Two protocols were followed for oral immunization, in which the injection routine of the different groups of mice was varied. The two immunization routines tested gave similar results. Routine 1
  • mice were immunized orally six times on days 0, 7, 8, 14, 15 and 21 with i) ⁇ ⁇ of OVA, ii) ⁇ ⁇ of OVA + ⁇ ⁇ of Omp19S, iii) ⁇ ⁇ of OVA + ⁇ ⁇ of Omp16S, iv) ⁇ ⁇ of OVA + 10 ⁇ g of cholera toxin (CT, Sigma) embedded in a NaHCO3 buffer (1 M, pH8). Two weeks after (day 35) of the last immunization the mice were sacrificed to evaluate the cellular response.
  • CT cholera toxin
  • Balb / c animals were immunized orally six times on days 1, 2, 3, 8, 9 and 10 with i) ⁇ ⁇ of OVA, ii) ⁇ ⁇ of OVA + ⁇ 50 ⁇ g of Omp19S, iii) ⁇ ⁇ of OVA + ⁇ 50 ⁇ g of Omp16S, iv) ⁇ ⁇ of OVA + 5 ⁇ g of cholera toxin (TC, Sigma) embedded in a NaHCO 3 buffer (1 M, pH8).
  • DTH delayed hypersensitivity response
  • C57BL / 6 animals were immunized nasally three times every 7 days with i) 50 ⁇ of OVA, ii) 50 ⁇ of OVA + ⁇ 0 ⁇ g of Omp19S, iii) 50 ⁇ of OVA + ⁇ 0 ⁇ g of Omp16S, iv) 50 ⁇ g of OVA + 1 ⁇ of cholera toxin (TC, Sigma). 12.5 ⁇ were injected through the nostril. Three weeks after the last immunization the animals were sacrificed to evaluate the cellular response.
  • TC cholera toxin
  • the animals were bled retroorbitally and the sera were stored at -20 ° C for the detection of specific Acs.
  • the animals were immunized subcutaneously (sc) three times every 7 days with i) KX ⁇ g of OVA, ii) KX ⁇ g of OVA + KX ⁇ g of Omp19S, iii) KX ⁇ g of OVA + 100 ⁇ of CFA ( Sigma-Aldrich) or iv) SF.
  • the animals were bled to obtain the sera, some (5 per group) were sacrificed to evaluate the cellular response and others underwent DTH (5 per group).
  • DTH Delayed Hypersensitivity Response
  • mice Seven days after the last immunization the animals were inoculated intradermally in the right plantar pad with 20 g of OVA and with physiological solution (SF) in the left plantar pad.
  • the response was evaluated by measuring the increase in the right plantar cutaneous fold with respect to the left, using a digital caliper of 0.01 mm accuracy at 48 hours and 72 hours after inoculation.
  • mice Obtaining splenocytes from mice:
  • mice anesthetized with ether bled white through the retroorbital plexus and were sacrificed by cervical dislocation. An appropriate incision was made, opening the peritoneal cavity, to expose the spleen, which was extracted with tweezers and scissors in aseptic conditions. The spleen was crushed into small fragments using a curved tip scissor. 3 ml of RPMI 1640 (Gibco) was added and homogenized. The suspension was taken at 8 ml and filtered on steel mesh to retain cell debris and tissue debris.
  • RPMI 1640 A wash was then performed with RPMI 1640, and the cells were resuspended in complete culture medium (RPMI 1640 with the addition of 10% fetal bovine serum (SFB, Gibco), 2mM L-glutamine and pyruvate, 25 mM HEPES , 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g ml of streptomycin).
  • lymphocytes from mesenteric ganglia of mice Obtaining lymphocytes from mesenteric ganglia of mice:
  • mice anesthetized with ether bled white through the retroorbital plexus and were sacrificed by cervical dislocation. An appropriate incision was made, opening the peritoneal cavity, to expose the mesenteric ganglia, which were removed with tweezers and scissors under aseptic conditions. They were then incubated with collagenase (2.5mg / ml) for 30 minutes. The collagenase was then removed and the nodes were crushed into small fragments using a curved tip scissors. 3 ml of RPMI 1640 (Gibco) was added and homogenized. The suspension was taken at 8 ml and filtered on steel mesh to retain cell debris and tissue debris.
  • collagenase 2.5mg / ml
  • RPMI 1640 A wash was then performed with RPMI 1640, and the cells were resuspended in complete culture medium (RPMI 1640 with the addition of 10% fetal bovine serum (SFB, Gibco), 2mM L-glutamine and pyruvate, 25 mM HEPES , 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g ml of streptomycin).
  • Trypan Blue exclusion method was used. A solution of Trypan Blue 0.2% in PBS was prepared. 50 ⁇ of the suspension to be counted was taken and 50 ⁇ of Trypan Blue was added. It was loaded into a Neubauer chamber and the number of viable cells was determined under an optical microscope.
  • Splenocytes (4 x 6 6 cells / ml) of mice immunized in the presence of OVA (100 and 1000 g / mi), complete medium, or control mitogen (Concanavalin A, 5 g / mi) were cultured in 48-well plates. The cultures were made in an oven at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 for 72 hours for Balb / c mice and 5 days for C57BL / 6. The supernatants of these cells were used to determine cytokines secreted by ELISA. . Capture ELISA for cytokine detection:
  • a capture ELISA was performed using specific monoclonal Acs for the detection of IFN- ⁇ , IL-2, IL-10, IL-4 (OptEIA TM, PharMingen, San Diego, USA) and IL-17 (Mouse IL-17 Quantikine , R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) in culture supernatants of stimulated splenocytes and control.
  • the protocol was performed according to the manufacturer's instructions.
  • the splenocytes of the immunized mice (2x10 5 cells / ml) were cultured in triplicate in the presence of OVA (100 and 1000 g / mi), complete medium or control mitogen (Concanavalin A, 5 g / mi) in 96-well plates.
  • OVA 100 and 1000 g / mi
  • complete medium or control mitogen Concanavalin A, 5 g / mi
  • the cultures were carried out in an oven at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2. At 5 days they were given a pulse of tritiated thymidine (1 Ci / well) and 18 hours.
  • the cells were then harvested and the incorporation of radioactive thymidine was measured with a beta counter expressed in counts per minute.
  • the results were expressed in SI stimulation index (cpmOVA / cpmRPMI). An SI> 2 is considered significant.
  • A20J cells mouse B lymphoma, syngeneic with BALB / c, ATCC were grown
  • TIB208 in complete culture medium (RPMI 1640 with the addition of 10% fetal bovine serum (SFB, Gibco), 2mM L-glutamine and pyruvate, 25 mM HEPES, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin) for two days. These cells were stimulated with OVA 10 g / ml one day before the test, we will call them A20JOVA. In the same way, MO5 cells (B16 melanoma cells synthesized with C57BL6 and stably transfected with a plasmid expressing OVA) were grown to be used as OVA presenting cells, in complete medium supplemented with 1 mg / ml of geneticin.
  • RPMI 1640 with the addition of 10% fetal bovine serum (SFB, Gibco), 2mM L-glutamine and pyruvate, 25 mM HEPES, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / m
  • mice splenocytes corresponding to each immunization group were grown in T25 bottles, in complete culture medium. The next day they were cultured in a plate of 6 wells 8x10 6 cells / ml, in 1 ml complete medium supplemented with recombinant IL-2 (10 U / ml). Subsequently, the stimuli listed below were added.
  • Negative control complete culture medium with the addition of recombinant mouse IL-2 (10 U / ml) (PeproTech. Inc., Rocky Hill, USA)
  • OVA 500 ⁇ g ml + OVA peptide 323-339 KISQAVH AAH AE IN EAGOVA restricted to MHC-II (I pg / ml) + A20JOVA cells treated with mitomycin in relation to 25 splenocytes was used: 1 APC, all resuspended in 1 ml of complete culture medium supplemented with recombinant IL-2.
  • OVA 500 ⁇ g ml + OVA peptide 257-264 SIINFEKL restricted to MHC-I (0.5ug / ml) + MO5 presenting cells in relation to 25 splenocytes was used: 1 APC, all resuspended in 1 ml of complete culture medium supplemented with recombinant IL-2.
  • the stimulated and control splenocytes were incubated for 30 min. at 4 ° C with specific monoclonal Acs anti-CD4 mouse labeled with PE-Cy5.5 and anti-CD8 mouse labeled with Alexa fluorine 647 (BD Biosciences, San Jose, CA). They were then washed with PBS and then fixed by treatment for 20 min. at room temperature with a 4% paraformaldehyde solution. After a wash with PBS they were permeabilized by treatment with permeabilization buffer (2% saponin, 10% SFB in PBS) for 30 min. The cells thus permeabilized, were centrifuged at 600g for 5 min., And treated with a specific anti-IFN- ⁇ mouse Ac labeled with PE for 30 min.
  • permeabilization buffer 2% saponin, 10% SFB in PBS
  • poles were assembled according to the immunization group. From each of them, 2x10 6 cells were taken, and labeled with FITC-labeled mouse anti-CD4, PE-Cy5.5-labeled mouse anti-CD8 and PE-labeled mouse anti-a4 7 (BD Biosciences , San Jose, CA). Subsequently, the cells were fixed with 100 ⁇ of 4% paraformaldehyde, and then analyzed by flow cytometer (BD FACSCalibur) and the results were analyzed using the FlowJo program (Version 5.7.2).
  • ELISA polystyrene plates were used (Maxisorp, NUNC, Denmark). The plates were sensitized with 1 g of OVA per well and blocked with 200 ml of 3% skim milk (Molico) in PBS buffer. The plates were then incubated with serial dilutions of the sera and developed with mouse anti-lgG antibodies conjugated to HRP. For the determination of the specific isotypes, the plates were incubated with antibodies specific for the mouse Ig, lgG1 and lgG2a isotypes, conjugated to HRP (Santa Cruz). Incubations were performed for 1 hour at room temperature.
  • MO5 cells (B16 melanoma cells synthesized with C57BL6 and stably transfected with a plasmid expressing OVA) cultured in complete medium + supplemented with 1 mg / ml of geneticin were used as blank.
  • B16 cells (melanoma cells not transfected with OVA plasmid) were used.
  • MO5 cells cultured in complete medium + supplemented with 1 mg / ml of geneticin were used as stimulation, which were pre-incubated with 10 g of OVA for 18 hours and then treated with mitomycin C (25 ⁇ g / ml) at 37 ° C for 30 min, washed with RPMI on 23 occasions and resuspended in complete medium.
  • Effector cells were the splenocytes of the immunized and control mice (2.5 x 10 7 total cells) previously stimulated for 5 days with the described stimulator cells (0.5 x 10 6 cells) in complete medium + 10U / ml of recombinant IL-2.
  • the white cells were incubated with radioactive sodium chromate in aqueous solution (Cr51, Amersham Biosciences) at a rate of 0.1 mCi / 1 x 1 0 6 cells, for 1 h in a 37 ° C water bath and then washed 3 times with RPMI Test:
  • Lysis% c P m * + c P m ⁇ x 1 00
  • Example 4 Experiments showing the adjuvant activity of Omp19S performed in transgenic mice:
  • mice of the OT-1 strains whose CD8 + T cells express the specific T receptor for the bovine ovalbumin SIINFEKL (OVA) peptide, were used as donors of specific CD8 + T antigen specific cells. These mice were purchased from the Jackson Laboratory and brought to the country by Dr. Fernando Goldbaum, who kindly offered us this strain. C57 mice Singeneics acquired in the bioterium of the National University of La Plata were used as receptors for cells from OT-1 animals. All mice received water and food ad libitum and were kept under pathogen-free conditions.
  • OVA bovine ovalbumin SIINFEKL
  • OVA ovalbumin
  • polypeptide was digested with proteinase K as a control.
  • Omp19S was treated with K-agarose proteinase from tricirachium album (Sigma Aldrich) for 2 hours at 37 ° C following the manufacturer's instructions. Then, the resin was centrifuged and the supernatants were incubated for 1 h at 60 ° C in order to inactivate any trace of enzyme that could have been solubilized. Then the digestion was checked by SDS-PAGE and subsequent staining with Coomasie blue.
  • the polypeptide so treated (Omp19S PK) was used as a control that the adjuvant effect is induced by said polypeptide.
  • CD8 + OVA-specific cells were obtained from the spleen and lymph nodes of the OT-1 mice which were purified by negative selection using the mouse CD8 + T lymphocyte enrichment kit (BD Imag) and then labeled with 5 ⁇ of CFSE at 37 ° C for 15 minutes.
  • the free carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) (Molecular Probes) was quenched by adding 10% SFB saline phosphate buffer (PBS). Subsequently, the labeled cells were washed with PBS and resuspended in a volume of 0.1 ml. The cells were then injected intravenously (iv) into the lateral veins of the animals' tail.
  • mice were sacrificed three weeks after the last immunization and the percentage of T cells expressing the ⁇ 4 ⁇ 7 marker was analyzed in mesenteric ganglia.
  • Example 6 Cloning of the genes encoding Omp16S and Omp19S into a eukaryotic expression vector:
  • the oligonucleotide primers were designed from the nucleotide sequence of Omp16 and Omp19 (Genbank Omp16: ACCESSION L27996. Omp19: ACCESSION L27997).
  • the primers contain Xhol and Xbal restriction sites (in bold). All "primers” were added the Kozak sequence of known efficiency for transcription in eukaryotes (underlined in the sequence).
  • Omp16S "Sense”: 5 ' CTC CTC GAG ACC ACC ATG GCG TCA AAG AA 3 ' (SEQ ID No. 7)
  • Antisense 5 'TTG TCT AGA TTA CCG TCC GGC CCC GTT GA 3 ' (SEQ ID No. 8)
  • Antisense 5 ' TTT TCT AGA TCA GCG CGA CAG CGT CAC 3 ' (SEQ ID No. 10).
  • the genes of interest were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the corresponding "primers” with an "anneling" temperature of 55 ° C and using Brucella genomic DNA as tempering.
  • the pCI-Neo vector (Promega) was used to clone Omp16S and Omp19S. This vector was digested with Xhol and Xbal and then repurified by the phenol method: chloroform.
  • the PCR amplification products were digested with the corresponding restriction enzymes. All PCR amplification products were repurified by Wizard PCR Preps (Promega, Madison, WI.USA).
  • the ligation reactions were performed at 4 ° C overnight in the presence of the enzyme T4 DNA ligase (Promega), 1 ⁇ of the digested plasmid (pCI) and 2 ⁇ of the corresponding digested insert. Competent cells E. coli JM109 (Promega) were then transformed, using the C ⁇ Ca method with 5 ⁇ of the ligation reaction. The transformed bacteria were selected, growing at 37 ° C on LB plates with ampicillin (25 ⁇ g ml). To determine which colonies contained the plasmid with the appropriate insert, a "screening" was performed by the "colony PCR" method.
  • COS-7 cells (ATCC, CRL1651, Rockville, MD, USA) were transfected by the liposome method with 2 ⁇ g of the following constructs: pCI-Omp16S, pCI-Omp19S, or the pCI vector (as a control) and 20 ⁇ of Lipofectamine (Gibco BRL, Gaithersburg, MD. USA) following the protocol of the provider.
  • Plasmid expression was studied at 24 and 48 hours after transfection (transient expression) in total protein extracts. It was analyzed by Western Blot, using different monoclonal antibodies: anti-Omp16 or anti-Omp19 and was revealed using an ECL chemiluminescence kit (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden).
  • Example 7 Inhibition of the enzymatic activity of the stomach in vitro.
  • BODIPY FL Bovine Ovalbumin (OVA) and BODIPY FL Casein were used as antigens. Both antigens are marked intramolecularly so that they do not flow when they are intact, but when they are degraded (EnzChek® Protease Assay Kit * green fluorescence * , Molecular probes).
  • mice 6 to 8 weeks old of the strain Balb / c (H-2d) were used. They were acquired in the bioterium of the National University of La Plata and were maintained in the bioterium of the Institute of Studies of Humoral Immunity (IDEHU). They received water and food ad libitum. Obtaining mouse stomachs
  • mice were sacrificed by cervical dislocation. An appropriate incision was made, opening the peritoneal cavity, to expose the stomach that was extracted with tweezers and scissors in aseptic conditions Processing of the stomachs of the mouse
  • stomachs were first broken down with tweezers and scissors and the pieces obtained were transferred to a poter and embedded in a NaHCO3 buffer (1 M, pH8) to complete the disintegration.
  • the extracts obtained were centrifuged at 10,000xg and the supernatants used to perform the test.
  • Omp19S the stomachs were overcoated with Omp19S (100ug / ml) for 30 min and then with BODIPY FL casein or BODIPY FL OVA in 100 ⁇ of a NaHCO3 buffer.
  • the stomachs were matched with BODIPY FL casein or BODIPY FL OVA (10ug / ml) in 100 ⁇ of a NaHCO3 buffer
  • stomachs were matched with a mammalian protease inhibitor cocktail (Sigma) for 30 min and then with BODIPY FL casein or BODIPY FL OVA (1 Oug / rnl) in 100 ⁇ of a NaHCO3 buffer.
  • BODIPY FLCasein or BODIPY FL OVA (10ug / ml) in a NaHCO3 buffer (1 M, pH8) treated with proteinase K (Sigma).
  • a NaHCO3 buffer (1 M, pH8) treated with proteinase K (Sigma).
  • the reaction mixtures were transferred to black opaque 96 well plates (low autofluorescence) (Costar). Fluorescence emission was performed on a Victor3 plate reader, Perkin Elmer, Waltham, MA
  • Example 8 Inhibition of the degradation of different eukaryotic or bacterial antigens by stomach enzymes.
  • Eukaryotic antigens Bovine ovalbumin (OVA), Serum bovine albumin (BSA)
  • Bacterial antigens Recombinant Brucella Lumazine synthetase (BLS), Recombinant Brucella Chaperone (DnaK) and recombinant Brucella trans isomerase prolyl cis peptidyl cis (SurA).
  • each reaction mixture was subjected to a polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and subsequent staining with Coomasie blue.
  • Example 9 Co-administration of Omp19S inhibits the degradation of antigens by stomach proteases in vivo.
  • BODIPY FL Casein EnzChek® Protease Assay Kit * green fluorescence * , Molecular probes
  • mice 6 to 8 weeks old of the strain Balb / c (H-2d) were used. They were acquired in the bioterium of the National University of La Plata and were maintained in the bioterium of the Institute of Studies of Humoral Immunity (IDEHU). They received water and food ad libitum.
  • mice After 15 min. from inoculation the mice were sacrificed by cervical dislocation, and the stomachs were extracted and processed.
  • the supernatants of the stomach extracts obtained were transferred to black opaque 96 well plates (low autofluorescence) (costar). Fluorescence emission was performed on a Victor3 plate reader, Perkin Elmer, Waltham, MA.

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Abstract

Adyuvante para vacunas que comprende un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias, en donde las bacterias pueden ser del género Brucella. El adyuvante puede ser un polipéptido modificado, o puede ser por ejemplo el polipéptido Omp19S o Omp16S, partes del mismo, o mezclas de ambos. En una realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 1 o partes de la misma. En otra realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 2 o partes de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Adyuvante para vacunas, vacunas que lo comprenden y usos.
La presente solicitud se refiere a un adyuvante para vacunas que comprende un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias, en donde las bacterias pueden ser del género Brucella. El adyuvante puede ser un polipéptido modificado, puede ser por ejemplo el polipéptido Omp19S o partes del mismo, el polipéptido Omp16S o partes del mismo, o mezclas de ambos. En una realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 1 o partes de la misma. En otra realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 2 o partes de la misma.
ANTECEDENTES
Los adyuvantes inmunológicos son sustancias que, incorporados al antígeno (Ag) o administrados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune contra el mismo. Pueden utilizarse para mejorar la respuesta inmune hacia un Ag en varios sentidos: pueden mejorar la magnitud de la respuesta inmune contra un Ag débil; pueden usarse para aumentar la velocidad y duración de la respuesta inmune, pueden modular la avidez de los anticuerpos (Acs), isotipos o distribución de subclases; pueden estimular y modular la respuesta inmune celular; pueden promover la inducción de respuesta inmune local (ej.: mucosas); disminuir la cantidad de Ag necesaria y reducir el costo de una vacuna; o pueden ayudar a impedir la competencia de Ag que existe en las vacunas combinadas (Singh and O'Hagan. Advances in vaccine adjuvants. Nat Biotechnol. 17 (1 1 ):1075-81 . 1999).
A lo largo de la historia de las vacunas, y desde el adyuvante de Freund completo (CFA) basado en una emulsión de micobacterias con agua y aceite, son muchos los preparados que se han ensayado con más o menos éxito. El más utilizado y permitido de uso humano es el aluminio, en sales de hidróxido o de fosfato. Otros adyuvantes consisten en componentes bacterianos como endotoxinas, partículas como liposomas, emulsiones oleosas como saponinas, y otras diferentes moléculas (Petrovsky and Aguilar. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol. 82 (5):488-96. 2004). La mayoría de los adyuvantes históricamente empleados, como las sales de aluminio, estimulan preferentemente la respuesta linfocitaria de tipo T helper (Th) 2 (Liljeqvist and Stahl . Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J Biotechnol. 73 (1 ):1 -33. 1999), incrementando la producción de Acs. Sin embargo, también hay otras, como la vacuna de la BCG y los adyuvantes que incorporan compuestos oleosos, que estimulan la respuesta Th1 (Victoratos, Yiangou, Avramidis and Hadjipetrou. Regulation of cytokine gene expression by adjuvants in vivo. Clin Exp Immunol . 109 (3):569-78. 1997). La elección del adyuvante de una vacuna deberá sopesarse cuidadosamente en el futuro, y no sólo en función de la cantidad de respuesta, sino de dirigirla cualitativamente. Por otro lado, la metodología utilizada tradicionalmente (vacuna por vía intramuscular o intradérmica en hidróxido de aluminio) ha sido útil para inducir respuestas inmunes humorales sistémicas pero generalmente fallan en inducir respuestas inmunes celulares y locales como en mucosas (Moyle, McGeary, Blanchfield and Toth. Mucosal immunisation: adjuvants and delivery systems. Curr Drug Deliv. 1 (4):385-96. 2004). Hay una mayor necesidad en el diseño de vacunas capaces de inducir fuertes respuestas inmunes celulares del tipo Th1 y células T citotóxicas (CTL) que puedan prevenir infecciones crónicas virales, infecciones relacionadas con patógenos intracelulares o el cáncer (vacunas terapéuticas) (Seder and Hill. Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature. 406 (6797):793-8. 2000).
Otras consideraciones importantes, (además de promover una respuesta inmune específica eficaz contra el antígeno) están relacionadas con aquellas características importantes para que la sustancia pueda ser empleada en la práctica clínica. Las formulaciones óptimas deben ser seguras, estables, biodegradables, inertes, y de bajos costos de producción. Es corta la lista de sustancias que cumplen con todos estos requisitos, hasta el momento los adyuvantes aprobados para empleo en humanos se restringen a las sales de aluminio, MF59 (una emulsión de aceite en agua), MLP (monofosforil- glicolípido), partículas virales (HBV y HPV), IRIV (proteoliposoma compuesto por fosfolípidos, hemaglutinina del virus de la influenza y un antígeno blanco determinado); y la subunidad B de la toxina colérica (Reed, Bertholet, Coler and Friede. New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends Immunol. 30 (1 ):23-32. 2009). Los adyuvantes no deben inducir reacciones adversas cuando son empleados en vacunas profilácticas, aunque en las terapéuticas se aceptan ciertas reacciones. En el campo de la salud veterinaria, la eficacia es un elemento de gran importancia y se toleran ciertos niveles de efectos colaterales (Sesardic. Regulatory considerations on new adjuvants and delivery systems. Vaccine. 24 Suppl 2 S2-86-7. 2006).
Como la puerta de entrada de la mayoría de las infecciones son las mucosas, la habilidad de generar inmunidad de mucosas luego de la administración de un Ag podría proveer una defensa temprana contra estos patógenos. Lamentablemente luego de la administración de Ags por vía oral hay degradación en el tracto gastrointestinal, poca absorción y baja eficacia a largo plazo, necesitándose administraciones repetidas y en grandes cantidades de Ag para estimular y mantener la respuesta inmune. Además se ha observado tolerancia inmunológica a aquellos Ags solubles administrados por vía oral (Moyle et al. Mucosal immunisation: adjuvants and delivery systems. Curr Drug Deliv. 1 (4):385-96. 2004). Los adyuvantes orales empleados hasta el momento como la toxina colérica (TC), por ej ., tienen serios riesgos luego de la administración (Fujihashi, Koga, van Ginkel, Hagiwara and McGhee. A dilemma for mucosal vaccination: efficacy versus toxicity using enterotoxin-based adjuvants. Vaccine. 20 (19-20):2431 -8. 2002), de manera que es muy importante en este campo, desarrollar adyuvantes que permitan la entrada eficiente de Ags a las superficies de mucosas, con la subsecuente inducción de respuesta inmune en mucosas.
En el nivel internacional, la lista de productos con propiedades adyuvantes, es cada vez mayor; sin embargo, sólo un reducido número se utiliza en la formulación de vacunas veterinarias y humanas (Aucouturier, Dupuis and Ganne. Adjuvants designed for veterinary and human vaccines. Vaccine. 19 (17-19):2666-72. 2001 ; Petrovsky et al. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol. 82 (5):488-96. 2004). Por tal razón, es importante desarrollar adyuvantes eficaces y a la vez seguros para vacunas humanas y animales.
En la actualidad la mayoría de los adyuvantes capaces de inducir fuertes respuestas Th1 son aquellos basados en emulsiones oleosas, como el adyuvante de Freund Incompleto (IFA), sin embargo estos traen aparejado reacciones adversas en el sitio de inyección, como abscesos estériles y granulomas. Por todo lo dicho anteriormente el desarrollo de adyuvantes parenterales y de mucosas que induzcan respuestas Th1 y CTL es muy relevante.
En la presente invención se proveen dos nuevos adyuvantes: Omp16S y Omp19S. Estas sustancias aumentan y/o modulan las respuestas inmunes frente a los Ags con los que son co-administradas favoreciendo el desarrollo de respuestas inmunes de tipo Th1 o Th17 o CTL.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Se describe un adyuvante para vacunas que comprende un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias, en donde las bacterias pueden ser del género Brucella. El adyuvante puede ser un polipéptido modificado o puede ser por ejemplo el polipéptido Omp19S o partes del mismo, o el polipéptido Omp16S o partes del mismo, o mezclas de ambos. En una realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 1 o partes de la misma. En otra realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 2 o partes de la misma.
Se provee además una vacuna que comprende como adyuvante al menos un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias y al menos un antígeno, en donde la bacteria puede ser del género Brucilla y en donde dicha vacuna puede ser de aplicación mucosal o parenteral. El adyuvante de la vacuna puede ser un polipéptido modificado o puede ser por ejemplo el polipéptido Omp19S o partes del mismo, o el polipéptido Omp16S o partes del mismo, o mezclas de ambos. En una realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 1 o partes de la misma. En otra realización preferida el adyuvante es el polipéptido no lipidado comprendido en la SEQ ID N° 2 o partes de la misma.
Se provee el uso del adyuvante para preparar una vacuna contra un patógeno, en donde el patógeno puede tener al menos una fase de su ciclo de vida intracelular.
Se provee el uso del adyuvante para preparar una vacuna antitumoral o una composición inmunomoduladora.
Se proveen vectores de expresión en eucariotas que comprenden las secuencias SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2.
Se proveen células eucariotas modificadas que expresan las secuencias SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra: Gel de poliacrilamida 15% teñido con Coomasie Blue en el que se sembraron Omp19S y Omp16S purificadas y depletadas de lipopolisacárido (LPS). En todas las calles se sembraron 20 g de proteínas totales. Se corrió también en el mismo gel Omp19S degradada con proteinasa K (Omp19SPK) que fue usado como control en algunos experimentos.
La Figura 2 muestra que la expresión del marcador α4β7 aumenta en linfocitos de ganglios mesentéricos de animales BALB/c inmunizados por vía oral con Omp19S como adyuvante. Los animales fueron inmunizados por vía oral con: i) ovoalbúmina bovina (OVA), ii) Omp19S +OVA o iii) Toxina colérica (TC) +OVA. 2x106 células de ganglios mesentéricos correspondientes a cada grupo de inmunización fueron marcadas con anticuerpos anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE- Cy5.5) y anti-a4p7 (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de células T CD8+ (A) y CD4+ (B) que expresan el marcador α4β7. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo. n/grupo=5. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. La Figura 3 muestra que Omp19S, al ser administrada como adyuvante oral, induce una respuesta inmune celular T in vivo. Se determinó la reacción de hipersensibilidad retardada (DTH) en respuesta a la inoculación de 20 g OVA en la almohadilla plantar de los animales inmunizados como fuera descripto en la figura 2. Las barras representan la media del incremento del pliegue cutáneo plantar entre la pata derecha y la izquierda ± error estándar de la media (SEM) a las 48hs (A) y 72hs (B), n/grupo=5. Representativo de 2 experimentos con similares resultados. La Figura 4 muestra que Omp19S, al ser administrada como adyuvante oral, induce un aumento en la capacidad proliferativa de los esplenocitos en respuesta al estímulo antigénico. Los esplenocitos de los animales inmunizados como fuera descripto en la figura 2 fueron estimulados con OVA l OOpg/ml o sin antígeno. Las células fueron marcadas con 3H timidina por 18hs y se midió la radioactividad incorporada. Los resultados se muestran como índice de estimulación (S.l.) que representa las cpm de los esplenocitos estimulados con OVA/cpm de los esplenocitos sin estimular. Se considera como positivo un S.l. > 2. Los valores representan la media de determinaciones hechas por triplicado para los 5 animales ± SEM.
La Figura 5 muestra que Omp19S, al ser administrada como adyuvante oral, induce una respuesta inmune celular con producción de citoquinas (IFN-γ e IL- 17) en respuesta al antígeno. Los esplenocitos de bazo de cada grupo inmunizado como fuera descripto en la figura 2 (n/grupo = 5) fueron estimulados in vitro con diferentes concentraciones de OVA (l OOpg/ml y l OOOpg/ml) o medio completo (RPMI). Los sobrenadantes de cultivo fueron colectados 72hs luego de la estimulación. Las concentraciones de las citoquinas (A) interferón (IFN)-y, (B) IL-4, (C) IL-2, (D) IL-10 y (E) IL-17 (pg/ml) en los sobrenadantes de cultivo fueron determinadas por ELISA. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados. La Figura 6 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante oral, estimula la inducción de células T CD4+ y CD8+ específicas que producen IFN- γ. Los esplenocitos de los animales inmunizados por vía oral con i) OVA, ii) Omp19S+OVA o iii) TC+OVA, se estimularon con OVA323+A20J+OVA 500 g/ml o con medio de cultivo completo (sin estimular) por 18hs. Luego fueron tratados con Brefeldina A durante las últimas 4 hs. de cultivo. Posteriormente las células fueron marcadas con Acs específicos anti-CD4 (PE/Cy5) y anti-CD8 (Alexa Fluor 647). Seguidamente fueron fijadas, permeabilizadas e incubadas con un Ac anti-IFN-γ (PE) o control de isotipo (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de linfocitos T CD4+ (A) o CD8+ (B) que expresan IFN-γ. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo y la producción de IFN-γ del mismo grupo sin estimular, de esta manera el porcentaje indicado corresponde a la producción de IFN-γ OVA específica. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.
La Figura 7 muestra que la expresión del marcador α4β7 aumenta en linfocitos de ganglios mesentéricos de animales BALB/c inmunizados por vía oral con Omp16S como adyuvante. Los animales BALB/c fueron inmunizados por vía oral con: i) OVA, ii) Omp16S+OVA o iii) TC+OVA. 2x106 células de ganglios mesentéricos correspondientes a cada grupo de inmunización fueron marcadas con anti-CD8 (PE-Cy5.5) y anti-a4 7 (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de células T CD8+ que expresan el marcador α4β7. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
La Figura 8 muestra que Omp16S, al ser administrada como adyuvante oral, induce una respuesta inmune celular T in vivo. Se determinó la reacción DTH en respuesta a la inoculación de 20 g OVA en la almohadilla plantar de los animales inmunizados por vía oral como en la fig. 7. Las barras representan la media del incremento del pliegue cutáneo plantar entre la pata derecha y la izquierda ± SEM a las 48hs (A) y 72hs (B), n/grupo=5. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La Figura 9 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante nasal induce una respuesta inmune celular con producción de citoquinas (IFN-γ) en respuesta al antígeno. Animales C57BL/6 fueron inmunizados por vía nasal con: i) OVA, ii) Omp19S+OVA o iii) TC+OVA. Los esplenocitos de bazo de cada grupo inmunizado (n/grupo = 5) fueron estimulados in vitro con una concentración de OVA 500 pg/ml o medio completo (RPMI). Los sobrenadantes de cultivo fueron colectados 5 días luego de la estimulación. Las concentraciones de las citoquinas (A) IFN-γ, (B) IL-4 y (C) IL-10 (pg/ml) en los sobrenadantes de cultivo fueron determinadas por ELISA. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La Figura 10 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante nasal, estimula la inducción de células T CD4+ y CD8+ específicas que producen IFN- γ. Los esplenocitos de los animales inmunizados como fuera descripto en la figura 9 se cultivaron con OVA257+ MO5+OVA 500 g/ml o con medio completo (sin estimular, RPMI) por 18hs. Luego fueron tratados con Brefeldina A durante las últimas 4 hs. de cultivo. Posteriormente las células fueron marcadas con Acs específicos anti-CD4 (PE/Cy5) y anti-CD8 (Alexa Fluor 647). Seguidamente fueron fijadas, permeabilizadas e incubadas con un Ac anti-IFN- γ (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de linfocitos T CD4+ (A) o CD8+ (B) que expresan IFN-γ. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo y la producción de IFN-γ del mismo grupo sin estimular, de esta manera el porcentaje indicado corresponde a la producción de IFN-γ OVA específica. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.
La Figura 1 1 muestra que Omp16S induce una respuesta inmune celular con producción de citoquinas al ser administrado como adyuvante nasal. Animales C57BL/6 fueron inmunizados por vía nasal con: i) OVA, ii) Omp16S+OVA o iii) TC+OVA. Los esplenocitos de bazo de cada grupo inmunizado (n/grupo = 5) fueron estimulados in vitro con una concentración de OVA 500 g/ml o medio completo (RPMI). Los sobrenadantes de cultivo fueron colectados 5 días luego de la estimulación. Las concentraciones de las citoquinas (A) IFN-γ, (B) IL-4 y (C) IL-10 (pg/ml) en los sobrenandantes de cultivo fueron determinadas por ELISA. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La Figura 12 muestra que Omp16S al ser administrada como adyuvante nasal, estimula la inducción de células T CD4+ y CD8+ específicas que producen IFN- γ. Los esplenocitos de los animales inmunizados como fuera descripto en la fig. 1 1 se cultivaron con OVA257+ MO5+OVA 500 g/ml por 18hs. Luego fueron tratadas con Brefeldina A durante las últimas 4 hs. de cultivo. Posteriormente las células fueron marcadas con Acs específicos anti-CD4 (PE/Cy5) y anti-CD8 (Alexa Fluor 647). Seguidamente fueron fijadas, permeabilizadas e incubadas con un Ac anti-IFN-γ (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de LT CD4+ (A) o CD8+ (B) que expresan IFN-γ. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo y la producción de IFN-γ del mismo grupo sin estimular, de esta manera el porcentaje indicado corresponde a la producción de IFN-γ OVA específica. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. La figura 13 muestra que la administración de Omp19S como adyuvante parenteral no tiene un efecto sobre la magnitud de la respuesta humoral. Los títulos de IgG total anti-OVA se determinaron en los sueros de animales BALB/c inmunizados por vía subcutánea con i) OVA, ii) OVA+Omp19S y iii) OVA+CFA y fueron determinados por ELISA. n/grupo=5, los valores representan la media de determinaciones hechas para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados. La figura 14 muestra que la administración de Omp19S como adyuvante parenteral tiene un efecto sobre el perfil de isotipos de Acs inducidos. La relación de isotipos lgG1 /lgG2a anti-OVA se determinó en los sueros de los animales inmunizados como fuera descripto en la fig. 13. Los valores representan la media de determinaciones hechas para cada ratón ± SEM. n/grupo=5. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La figura 15 muestra que Omp19S como adyuvante por vía parenteral no induce toxicidad local en el tejido subcutáneo de ratones BALB/c luego de las inmunizaciones como fuera descripto en la fig. 13. Se observa un granuloma en el sitio de inyección (recuadro) en el ratón inmunizado con CFA como adyuvante (A). A la derecha se observa la misma zona en un ratón inmunizado con Omp19S como adyuvante por vía subcutánea, sin signos de alteraciones en el tejido (B).
La figura 16 muestra que Omp16S y Omp19S, al ser administradas como adyuvantes por vía parenteral, inducen una respuesta inmune celular T contra el antígeno in vivo. Se determinó la reacción DTH en respuesta a la inoculación de 20 g OVA en la almohadilla plantar de los animales inmunizados por vía subcutánea con i) OVA, ii) OVA+Omp16S, iii) OVA+Omp19S o iv) OVA+CFA como fuera descripto en la fig. 13. Las barras representan la media del incremento del pliegue cutáneo plantar entre la pata derecha y la izquierda ± SEM a las 48hs (A) y 72hs (B). n/grupo=5. Representativo de 3 experimentos con similares resultados.
La figura 17 muestra que Omp19S, al ser administrada como adyuvante por vía parenteral, induce un aumento en la capacidad proliferativa de los esplenocitos en respuesta al Ag. Se estudió la proliferación in vitro en respuesta a diferentes dosis de OVA en los esplenocitos de los ratones inmunizados como fuera descripto en la fig. 13. Los resultados fueron expresados como índice de estimulación SI (cpm OVA/cpm RPMI). n/grupo=5. Los valores representan la media de determinaciones hechas por triplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La figura 18 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante parenteral induce una respuesta inmune celular con producción de citoquinas (IFN-γ) en respuesta al antígeno. Se determinó la producción de IFN-γ por los esplenocitos de los ratones inmunizados como fuera descripto en la fig. 13 estimulados in vitro durante 72 hs. con distintas concentraciones de OVA o medio completo.n/grupo=5. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La figura 19 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante parenteral no induce un aumento en la producción de IL-4 ni de IL-10 en respuesta al antígeno. Se estudió la producción de IL-4 (A) e IL-10 (B) por los esplenocitos de los ratones inmunizados como fuera descripto en la fig. 13 estimulados in vitro durante 72 hs. con distintas concentraciones de OVA o medio completo (RPMI). n/grupo=5. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 2 experimentos con similares resultados.
La figura 20 muestra que Omp19S al ser administrada como adyuvante parenteral induce una respuesta inmune celular con producción de IL-17 en respuesta al antígeno. Se determinó la producción de IL-17 por los esplenocitos de los ratones inmunizados como fuera descripto en la fig. 13 estimulados in vitro durante 72 hs. con distintas concentraciones de OVA o medio completo (RPMI). n/grupo = 5. Los valores representan la media de determinaciones hechas por duplicado para cada ratón ± SEM. Representativo de 1 experimento.
La Figura 21 muestra que la utilización de Omp19S como adyuvante por vía parenteral aumenta la proliferación de células CD8+ específicas para OVA257- 264- Células provenientes de ratones OT-1 fueron marcadas con carboxifluoresceina succinimidil ester (CFSE) y transferidas por vía intravenosa (i.v) (10x106cels/ratón) a ratones C57BL/6. Un día después los ratones receptores C57BL/6 fueron inmunizados con: i) OVA, ii) OVA+Omp19S, iii) OVA+Omp19S degradada con proteinasa K (Omp19SPK) o iv) OVA+LPS por vía subcutánea (s.c). La proliferación de las células de los OT-1 CFSE+ en los bazos y ganglios linfáticos fue determinada 5 días después de la inmunización por citometría de flujo analizando los niveles de fluorescencia de CFSE. Se muestra el porcentaje de células CD8+ que sufrieron más de una división. Resultados representativos de 3 experimentos.
La Figura 22 muestra que la utilización de Omp19S como adyuvante por vía parenteral aumenta la producción intracelular de IFN-γ en la población de células CD8+ específicas para OVA257-264. Esplenocitos de los animales inmunizados como fuera descripto en la fig 22 fueron estimulados durante 18hs con: medio completo (RPMI), OVA 500Mg/ml + péptido SIINFEKL 5 pg/ml + MO5 y luego tratadas con Brefeldina A durante 6hs. Posteriormente las células fueron marcadas con un anticuerpo anti-CD8 Alexa Fluor y anti-IFN-γ PE. Los valores del cuadrante superior derecho representan los porcentajes de células CD8+ productoras de IFN-γ.
La Figura 23 muestra que la inmunización con Omp16S u Omp19S como adyuvantes inducen una respuesta inmune citotóxica capaz de lisar células tumorales que expresan el Ag. Se determinó la actividad citotóxica de los esplenocitos de los ratones C57BL/6 inmunizados con: i) OVA, ii) Omp16S+OVA ¡ii) Omp19S+OVA o iv) CFA+OVA. Las células blanco (MO5 que expresan OVA o B16 que no expresan OVA) marcadas con 51 Cr fueron incubadas con los esplenocitos en una relación 50 esplenocitos: 1 célula blanco. Luego de 6hs se midió las cpm en los sobrenadantes y los resultados se analizaron según el porcentaje de lisis especifica. La Figura 24 muestra que el porcentaje de células T CD4+ y CD8+ que expresan α4β7 aumenta en ganglios mesentéricos de animales BALB/c inmunizados por vía oral con Omp19S como adyuvante. Los animales fueron inmunizados por vía oral con: i) toxoide tetánico (TT), ii) TT+Omp19S o iii) TT+TC. 2x106 células de ganglios mesentéricos correspondientes a cada grupo de inmunización fueron marcadas con anticuerpos anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE-Cy5.5) y anti-a4p7 (PE). Los números en el cuadrante superior derecho representan los porcentajes de células T CD8+ (A) y CD4+ (B) que expresan el marcador α4β7. En todos los casos se restó el porcentaje del control de isotipo. n/grupo=5.
La figura 25 muestra en geles que las proteínas Omp16S y Omp19S se expresan correctamente en células eucariotas transfectadas con los plásmidos de expresión en eucariontes pCI-Omp16S o pCI-Omp19S respectivamente. Se estudió la expresión de (A) Omp16S u (B) Omp19S en células eucariotas (COS-7) transfectadas transitoriamente con los plásmidos pCI-Omp16S o pCI- Omp19S respectivamente o con el plásmido pCI como control. Luego de 24 o 48hs de cultivo se evaluó la expresión de Omp16 u Omp19 por Western Blot en extractos proteicos provenientes de las células transfectadas utilizando anticuerpos específicos anti-Omp16 o anti-Omp19 respectivamente.
La figura 26 muestra que Omp19S inhibe las proteasas del estómago de ratones Balb/c. Los sobrenadantes de los extractos de estómago fueron incubados con BSA (proteína irrelevante), Omp19S, cóctel inhibidor de proteasas de mamíferos (como control de que la actividad enzimática del estómago puede ser inhibida). La actividad enzimática fue medida usando BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA como sustratos. El gráfico representa el porcentaje de actividad enzimática remanente luego de cada tratamiento calculado tomando como máxima actividad la del sobrenadante del extracto de estómago sobre el sustrato BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA según corresponda. La capacidad de fluorecer de los sustratos BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA una vez degradados, fue chequeada tratando estos sustratos con PK (proteinasa K).
La figura 27 muestra que Omp19S es capaz de inhibir la degradación de antígenos eucariotas (BSA, OVA) y bacterianos (BLS, SurA. DnaK) por proteasas del estómago de ratones Balb/c. Cada antígeno se trató con: i) sobrenadante de extracto de estómago, ii) sobrenadante de extracto de estómago y Omp19S iii) sobrenadante de extracto de estómago y cóctel inhibidor de proteasas de mamíferos (como control de que la actividad enzimática del estómago puede ser inhibida). Estas mezclas de reacción se sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y posterior tinción con Coomasie blue.
La figura 28 muestra la capacidad de Omp19S de inhibir la degradación de antígenos por parte de las proteasas del estómago in vivo usando como modelo de antígeno BODIPY FL caseína. Los ratones Balb/c fueron inoculados por vía oral con: i) buffer de NaHCO3 (1 M, pH8) (Vehículo), ii) BODIPY FL caseína con Omp19S, ii) BODIPY FL caseína con aprotinina (un inhibidor de proteasas conocido), iii) BODIPY FL caseína. El gráfico representa el porcentaje de actividad enzimática remanente luego de cada tratamiento calculado tomando como máxima actividad la del sobrenadante del extracto de estómago de los ratones inmunizados con BODIPY FL caseína.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A los efectos de la presente solicitud las frases "polipéptido Omp19S", "proteína Omp19S" y "Omp19S" tienen el mismo significado y corresponde al péptido Omp19S no lipidado.
El término Omp19S o Omp16S se refiere al polipéptido cuya secuencia puede corresponderse con la SEQ N°1 o la SEQ N°2 respectivamente obtenido por purificación a partir de células, tejidos u organismos que lo expresan, o por síntesis química. A los efectos de la presente solicitud las frases "polipéptido Omp16S", "proteína Omp16S" y Omp16S" tienen el mismo significado y corresponde al péptido Omp16S no lipidado.
En la presente solicitud el término "inmunógeno" y "antígeno" tienen el mismo significado y se definen como cualquier sustancia frente a la cual, en un organismo inmunocompetente, se puede inducir una respuesta inmune humoral o celular. En esta acepción, antígeno es sinónimo de inmunógeno.
En una realización preferida se clonó al polipéptido Omp19S sin la secuencia consenso de lipidación en un vector plasmídico. A partir de esta construcción se transformaron células competentes de E. coli de manera de expresar y purificar al polipéptido no lipidado. La purificación se llevó a cabo utilizando una resina de níquel -agarosa. Los eluidos correspondientes fueron sembrados en un gel de poliacrilamida con SDS (Figura 1 ). Seguidamente se juntaron en distintas fracciones los eluidos de concentración similar. En estas fracciones se corroboró la identidad del polipéptido purificado, para ello se realizó un Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal contra Omp19.
El polipéptido clonado fue secuenciado y su secuencia se muestra en SEQ ID N° 1 . Es evidente que puden existir variaciones de dicha secuencia estando todas ellas dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo fragmentos de la misma, o adiciones, o deleciones de fragmentos o aminoácidos. Caen dentro del alcance de la presente invención los polipéptidos de Omp19S no lipidados obtenidos a partir de cualquier especie de Brucella. En otra realización preferida se clonó al polipéptido Omp16S sin la secuencia consenso de lipidación en un vector plasmídico. A partir de esta construcción se transformaron células competentes de E. coli de manera de expresar y purificar al polipéptido no lipidado. La purificación se llevó a cabo utilizando una resina de níquel -agarosa. Los eluidos correspondientes fueron sembrados en un gel de poliacrilamida con SDS (Figura 1 ). Seguidamente se juntaron en distintas fracciones los eluidos de concentración similar. En estas fracciones se corroboró la identidad del polipéptido purificado, para ello se realizó un Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal contra Omp16. El polipéptido clonado fue secuenciado y su secuencia se muestra en SEQ ID N° 2. Es evidente que puden existir variaciones de dicha secuencia estando todas ellas dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo fragmentos de la misma, o adiciones, o deleciones de fragmentos o aminoácidos. Caen dentro del alcance de la_presente invención los polipéptidos de Omp16S no lipidados obtenidos a partir de cualquier especie de Brucella.
A partir de lo divulgado en la presente solicitud resulta obvio que otros polipéptidos Omp de Brucella podrían ser utilizados como adyuvantes siempre y cuando los mismos se encuentren en una forma no lipidada. La forma no lipidada puede obtenerse mediante modificaciones en el esqueleto peptídico, como por otros métodos conocidos. Cualquier polipéptido Omp no lipidado se encuentra dentro del alcance de la presente invención.
Estudios utilizando Omp19S u Omp16S por via mucosal :
Se estudió la expresión de α4β7 en los linfocitos T CD4+ y CD8+ de ganglios mesentéricos obtenidos de animales inmunizados por vía oral con i) OVA (ovoalbúmina), ii) Omp19S+OVA o iii) toxina colérica (TC)+OVA.
Los resultados indican que hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD4+ y T CD8+ que expresan el marcador de migración a mucosas (lámina propia) α4β7 en los ganglios mesentéricos de aquellos animales inoculados por vía oral con Omp19S+OVA (7,7%; 12,16%) y TC+OVA (7,15%; 16,43%) como adyuvantes, en comparación con la administración del antígeno sin adyuvante OVA (0,74%; 1 ,64%) (Figura 2 A y B). Por lo tanto se pude decir que Omp19S administrada por via oral induciría la migración de los linfocitos T CD4+ y CD8+ efectores hacia la mucosa intestinal.
La respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH) está mediada por células T que llegan al lugar de la inyección del antígeno, reconocen péptidos derivados de ese antígeno en las células presentadoras de Ag (APCs) y liberan citoquinas como el IFN-γ, el cual estimula el reclutamiento de células de la inmunidad innata provocando edema e hinchazón. Entonces para analizar la respuesta T in vivo se evaluó en los ratones inmunizados por via oral con los adyuvantes de la invención la respuesta DTH inducida por la inyección de OVA. Para ello se inyectó 20 g de OVA en la almohadilla plantar en una de las patas de los ratones inmunizados y en la otra se inyectó solución fisiológica como control. Aquellos animales inmunizados por via oral con OVA co-administrada con Omp19S presentaron un incremento en el pliegue cutáneo plantar con respecto a aquellos animales inmunizados con OVA sin adyuvante a las 48hs y a las 72hs post-inyección de OVA (Figura 3 A y B). Este incremento fue levemente mayor al inducido por la toxina colérica como adyuvante administrada por la misma vía (Figura 3 A y B).
Estos resultados demuestran que el adyuvante Omp19S administrado por vía oral sería capaz de inducir una respuesta celular in vivo similar o superior a la generada con un adyuvante mucosal experimental conocido como es la toxina colérica. Omp19S como adyuvante de mucosas induciría una respuesta T anti- el antigeno (OVA) in vivo. Para caracterizar la respuesta inmune celular inducida se determinó la capacidad de los esplenocitos de los animales inmunizados de proliferar in vitro en respuesta al antígeno. Se cultivaron las células en presencia de distintas concentraciones de OVA o medio completo y luego de 5 días se les dio un pulso de 3H-timidina por 18 hs. y se midió la radioactividad incorporada. Los resultados obtenidos demuestran que la coadministración de OVA con el adyuvante Omp19S administrados por vía oral genera un aumento de la respuesta proliferativa antígeno específica en las células de estos ratones con respecto a las de los animales inmunizados solo con OVA (Figura 4). La estimulación con Concanavalina A (ConA, mitógeno control) produjo un aumento significativo en la proliferación celular. Por el contrario la utilización de toxina colérica como adyuvante no indujo un aumento en la capacidad proliferativa de los esplenocitos en respuesta al Ag. Estos resultados indicarían que la utilización del adyuvante Omp19S por via oral tendría un efecto sobre la generación de una eficiente respuesta adaptativa evidenciada por un incremento en la capacidad proliferativa de las células T antigeno específicas. En base a los resultados de DTH y proliferación se evidenció una respuesta celular desarrollada en respuesta a la estimulación con el antígeno. Posteriormente se caracterizó el perfil de respuesta T que se desarrolla en los animales cuando son inmunizados con el adyuvante de la invención por vía oral.
Para la determinación del tipo de respuesta T helper (Th) anti-OVA que se induce con Omp19S como adyuvante se cultivaron los esplenocitos de los ratones inmunizados en presencia de distintas concentraciones de OVA o medio completo durante 72 hs. y luego se analizó el patrón de citoquinas producidas en los sobrenadantes de estas células. Se realizó un ELISA de captura empleando anticuerpos monoclonales específicos para la detección de IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-4 e IL-17 en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados y control.
Los resultados indican que las células de los animales inmunizados por vía oral con OVA+Omp19S produjeron niveles mayores de IFN-γ, IL-2 e IL-17 respecto de los animales control (OVA) y respecto de los animales inmunizados con OVA+TC (Figura 5), y la secreción de estas citoquinas fue antígeno especifica y dosis dependiente.
Por el contrario, los niveles de citoquinas del perfil Th2 como IL-4 e IL-10 resultaron ser similares a los niveles básales. De esta manera el uso de Omp19S como adyuvante por vía oral generaría una respuesta de tipo Th1 y Th17.
No solo es importante la cantidad de respuesta inducida por un adyuvante sino también la calidad de dicha respuesta. Dado que los linfocitos de los ratones co-inmunizados con Omp19S y OVA liberaban IFN-γ, se estudió la subpoblación T CD4+ o CD8+ que produce esta citoquina. Para ello se determinó la producción intracelular de IFN- γ por las células T CD4+ y CD8+. Para esto, se siguió el protocolo de 16 horas de incubación con los diferentes estímulos. Para estimular los linfocitos extraídos de bazo de ratón, se utilizó un péptido de OVA restricto a MHC clase II en BALB/c OVA323, células presentadoras A20J y OVA 500 g/ml. Los otros estímulos consistieron en medio completo (RPMI) como control negativo y Pma:ionomicina (un activador policlonal de células T) como control positivo. En la figura 6 se muestra la producción de IFN-γ en células T CD4+ por los grupos de ratones inmunizados con OVA, OVA+Omp19S y OVA+TC por vía oral.
La inmunización con Omp19S como adyuvante por vía oral indujo la producción de células T CD4+ productoras de IFN-γ antígeno especificas (2.13%) mientras que en el grupo inmunizado con TC como adyuvante no hubo una producción diferente al grupo inmunizado con OVA sin adyuvante (OVA+TC 0.45% vs OVA 0.41 %) (Figura 6 A). En cuanto a los linfocitos T CD8+ productores de IFN-γ, se puede observar un leve aumento en el grupo OVA+Omp19S (0.77%) pero significativo en relación al grupo inmunizado con OVA (0.37%) o con OVA+TC (0.55%) (Fig. 6B).
En resumen, el uso de Omp19S como adyuvante por vía oral, induce i) la migración de linfocitos T CD4+ y CD8+ a la mucosa gastrointestinal, ii) una respuesta celular T antígeno específica in vivo, iii) la liberación de citoquinas Th1 , Th17 como también la proliferación de los linfocitos en respuesta al Ag y iv) linfocitos T CD4+ y CD8+ productores de IFN-γ de memoria. Estas células productoras de IFN-γ son indispensables en la generación de respuestas inmunes eficientes contra infecciones por patógenos con algúna fase de su ciclo de vida intracelular como virus, bacterias, parásitos y hongos; o tumores, el hecho de que el adyuvante induzca la producción de esta citoquina por parte de los linfocitos T podría ser beneficioso para el desarrollo de vacunas contra este tipo de enfermedades. Todas estas son cualidades muy requeridas en el campo de los adyuvantes mucosales. Se estudió también la expresión de α4β7 en los linfocitos T CD4+ y CD8+ de ganglios mesentéricos obtenidos de animales inmunizados por vía oral con i) OVA, ii) OVA+Omp16S o iii) OVA+TC (Figura 7). Los resultados indican que hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD8+ que expresan el marcador de migración a mucosas α4β7 en los ganglios mesentéricos de aquellos animales inoculados por vía oral con OVA+Omp16S (4,35%) y OVA+TC (16,43%), en comparación con la administración del antígeno sin adyuvante (OVA, 1 ,64%). Estos resultados sugieren que Omp16S administrada por via oral induce la migración de los linfocitos T CD8+ efectores hacia la mucosa intestinal.
Para analizar la respuesta T in vivo se evaluó en los ratones inmunizados por via oral la respuesta de hipersensibilidad retardada inducida por la inyección de OVA. Aquellos animales inmunizados por via oral con OVA co-administrada con Omp16S como adyuvante presentaron un incremento en el pliegue cutáneo plantar con respecto a aquellos animales inmunizados con OVA sin adyuvante a las 48hs y a las 72hs post-inmunizacion de OVA (Figura 8 A y B). Este incremento fue levemente mayor al inducido por la toxina colérica como adyuvante administrada por la misma vía a las 48hs (Figura 8 A y B). Entonces, Omp16S como adyuvante de mucosas induce una respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH) anti-el antigeno (OVA). Omp16S administrado por vía oral es capaz de inducir una respuesta celular T in vivo similar a la generada con un adyuvante mucosal experimental conocido como es la toxina colérica.
El uso de Omp16S como adyuvante por vía oral, induciría i) la migración de linfocitos T CD8+ a la mucosa gastrointestinal, ii) una respuesta celular T antígeno específica in vivo.
La administración nasal de Omp19S genera la producción de citoquinas específicas para OVA en cultivos de esplenocitos de bazo. Los esplenocitos de los animales inmunizados por vía nasal con OVA+Omp19S produjeron niveles mayores de IFN-γ con respecto a los animales inmunizados con OVA sin adyuvante (Figura 9A) en respuesta al antigeno OVA. La administración de OVA+TC por via nasal indujo niveles superiores de IFN-γ en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados con OVA. Por el contrario la estimulación con OVA no indujo la secreción de IL-4 en los esplenocitos de ninguno de los grupos estudiados (Figura 9B). En cuanto a IL-10, se detectó un leve aumento respecto del control negativo, solo en el grupo inmunizado con OVA+TC (Figura 9C). Entonces, la administración de Omp19S como adyuvante por vía nasal induce una respuesta inmune celular Th1 con producción de IFN- Y-
Considerando el perfil de citoquinas liberado por los esplenocitos, se estudió si eran las células T CD4+ o las CD8+ las encargadas de dicha producción. Para esto se realizó una medición de IFN-γ intracelular luego de 3 semanas de la última inmunización.
La inmunización con Omp19S como adyuvante nasal indujo la producción de células T CD4+ productoras de IFN-γ antígeno especificas (0.43%) mientras que en el grupo inmunizado con TC como adyuvante no indujo una producción diferente al grupo inmunizado con OVA sin adyuvante (OVA+TC 0.28% vs OVA 0.23%) (Figura 10A). En cuanto a los linfocitos T CD8+ productores de IFN-γ, se puede observar un leve aumento en el grupo OVA+Omp19S (0.72%) pero significativo en relación al grupo inmunizado con OVA (0.47%) o con OVA+TC (0.22%) (Figura 10B).
Estos resultados en su conjunto demuestran que los ratones inmunizados con Omp19S+OVA por vía nasal mostraron un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD4+ pero mayormente de linfocitos T CD8+ que producen IFN-γ anti-OVA. Esta producción fue mayor al grupo control OVA inmunizado por la misma vía sin adyuvante e inclusive mayor al grupo control con un adyuvante conocido como es la toxina colérica.
La coadministración nasal de Omp16S induce la producción de citoquinas en respuesta al Ag en cultivos de esplenocitos de bazo. Los resultados indican que los esplenocitos de los animales inmunizados por vía nasal con OVA+Omp16S produjeron niveles mayores de IFN-γ con respecto a los animales control (OVA) en respuesta al antigeno OVA (Figura 1 1 A). La coadministración de TC por via nasal indujo niveles inferiores de IFN-γ en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados con OVA respecto al grupo inmunizado con OVA+Omp16S. Por el contrario la estimulación con OVA no indujo la secreción de IL-4 en los esplenocitos de ninguno de los grupos estudiados en respuesta al antígeno (Figura 1 1 B). En cuanto a IL-10 se detectó un leve aumento respecto del control negativo, solo en el grupo inmunizado con OVA+TC (Figura 1 1 C). Entonces, Omp16S como adyuvante administrado por via nasal genera una respuesta de tipo Th1 . En los ratones inmunizados con OVA+Omp16S por vía nasal hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD4+ pero también de linfocitos T CD8+ anti- OVA que producen IFN-γ a las 3 semanas post-ultima inmunización. Esta producción fue mayor al grupo control OVA inmunizado por la misma vía sin adyuvante e inclusive mayor al grupo control OVA+TC (Figuras 12 A y B).
La inmunización con Omp16S como adyuvante nasal indujo la producción de células T CD4+ productoras de IFN-γ antígeno especificas (0.97%) mientras que el grupo inmunizado con TC como adyuvante no indujo una producción diferente al grupo inmunizado con OVA sin adyuvante (OVA+TC 0.23% vs OVA 0.28%). Sin embargo, la inducción en los linfocitos T CD8+ fue aún mayor. Se puede observar un aumento en el grupo OVA+Omp16S (1 ,08%) significativo en relación al grupo inmunizado con OVA (0.47%) o con OVA+TC (0.22%) (Figuras 12 A y B). Finalmente, estos resultados indican que Omp16S como adyuvante por via nasal induce la producción de células T de memoria CD4+ y CD8+ anti-OVA productoras de IFN- γ.
El uso de Omp19S y Omp16S como adyuvantes por vía nasal, inducen i) la liberación de citoquinas Th1 en respuesta al antígeno y ii) inducen linfocitos T CD4+ y CD8+ productores de IFN- γ de memoria antígeno específicos.
Estas células T productoras de IFN-γ son indispensables en la generación de respuestas inmunes eficientes contra infecciones por patógenos con algúna fase de su ciclo de vida intracelular (o cuando el patógeno es internalizado por los macrófagos), como virus, bacterias, parásitos y hongos; o tumores, el hecho de que los adyuvantes de la invención induzcan la producción de esta citoquina por parte de los linfocitos T podría ser beneficioso para el desarrollo de vacunas contra este tipo de enfermedades.
Estos resultados en su conjunto demuestran que la administración de Omp19S u Omp16S como adyuvantes por vía oral o nasal induce la producción de linfocitos T CD4+ y CD8+ de memoria que al encuentro con su Ag específico producirían IFN-γ, cualidad muy relevante para un adyuvante o inmunomodulador mucosal.
Estudios utilizando Omp19S u Omp16S por via parenteral :
Se estudió la respuesta humoral determinando el título de inmunoglobulinas IgG totales y el perfil de isotipos inducidos (lgG1 e lgG2a) contra OVA cuando es coinmunizada con Omp19S en comparación con la inmunización de OVA en SF u OVA en CFA. A partir de un ELISA indirecto se determinaron los títulos de IgG total en los sueros de los animales obtenidos 3 semanas luego de la última inmunización en los distintos grupos. En los resultados obtenidos no se observa un aumento significativo de anticuerpos específicos respecto de la inmunización con OVA sin adyuvante (Figura 13), lo que indicaría que Omp19S no tiene un efecto sobre la magnitud de la respuesta humoral desencadenada. Mientras que, la inmunización con el control positivo Adyuvante de Freund Completo (CFA) genera un incremento en la producción de anticuerpos específicos como era esperable. Omp19S como adyuvante no tiene un efecto sobre la magnitud de la respuesta humoral.
Al analizar el perfil de isotipos IgG anti-OVA en los animales inmunizados se aprecia que la inoculación con OVA sola o utilizando CFA como adyuvante induce una clara predominancia de anticuerpos lgG1 , mientras que utilizando Omp19S como adyuvante esto no sucede (relación lgG1 /lgG2a cercana a uno) (Figura 14). Se sabe que una respuesta inmune de tipo Th1 está asociada con una predominancia de anticuerpos lgG2a sobre lgG1 , mientras que en el caso de una respuesta Th2 esta relación se invierte (Crameri and Rhyner. Novel vaccines and adjuvants for allergen-specific immunotherapy. Curr Opin Immunol. 18 (6):761 -8. 2006).
Por lo tanto, a pesar de que la inmunización con Omp19S como adyuvante no parece tener un efecto en la magnitud de la respuesta humoral, si se observa un efecto en el perfil de isotipos específicos inducidos observándose una baja en la relación lgG1 /lgG2a, la cual está asociada a una disminución de los anticuerpos lgG1 característicos de una respuesta Th2. Esta reversión en la predominancia lgG1 nos muestra que al utilizar Omp19S como adyuvante se disminuye la producción de anticuerpos de tipo Th2 generada por la inmunización con OVA, estos resultados nos indican que los adyuvantes de la invención pueden ser utilizados para reorientar respuestas linfocitarias de tipo Th2 hacia una de tipo Th1 , efecto que podría servir para revertir los cuadros asociados a procesos alérgicos re-direccionando una respuesta Th2 alérgeno- específica hacia una Th1 modulatoria.
Se analizó la reacción local que se genera cuando los ratones Balb/c son inoculados por vía subcutánea con OVA en conjunto con Omp19S o CFA. La toxicidad local fue determinada por alteraciones macroscópicas del tejido subcutáneo. En los animales inoculados con Omp19S junto al antígeno OVA no existen signos tisulares de toxicidad en el sitio de administración, ya que no se observaron alteraciones en el tejido comparado con una zona no inyectada. Mientras que en los animales inoculados con el adyuvante de Freund completo hubo una reacción granulomatosa en el sitio de inoculación, dada por la formación de granulomas macrofágicos característicos del empleo de este adyuvante (Figura 15). El CFA posee un mecanismo de acción tipo depósito, insolubilizando el antígeno en el sitio de inyección, lo cual propicia la acumulación de macrófagos junto con otras células, que forman los granulomas macrofágicos característicos evidenciando signos de toxicidad. La preparación de Omp19S con la que se realizan las inmunizaciones es soluble, por lo que no origina la formación de granulomas, lo cual sugiere un mecanismo de acción adyuvante distinto al del CFA. La inmunización con Omp19S como adyuvante no genera reacciones locales adversas en el tejido subcutáneo.
Para analizar la respuesta T in vivo se evaluó en los ratones inmunizados por vía subcutánea con : i) OVA, ii) OVA+Omp19S , iii) OVA+Omp16S, iv) OVA+CFA o v) solución fisiológica (SF) la respuesta DTH inducida por la inyección de OVA. Para ello se inyectó 20 g de OVA en la almohadilla plantar en una de las patas de los ratones inmunizados y en la otra se inyectó SF como control. Aquellos animales inmunizados con OVA co-inyectada con Omp19S u Omp16S presentaron un incremento en el pliegue cutáneo plantar con respecto a aquellos animales inmunizados con OVA sin adyuvante a las 48hs. y 72hs. post-inyección de OVA (Figura 16). En conjunto, estos resultados demuestran que Omp19S y Omp16S son capaces de inducir una respuesta celular T in vivo similar a la generada con un adyuvante experimental conocido como es el CFA pero sin los efectos adversos que tiene ese poderoso adyuvante.
Para evaluar la respuesta inmune celular inducida se determinó la capacidad de los esplenocitos de los animales inmunizados de proliferar in vitro en respuesta al antígeno. Se cultivaron los esplenocitos en presencia de distintas concentraciones de OVA o medio completo y luego de 5 días se les dio un pulso de 3H-timidina por 18 hs. y se midió la radioactividad incorporada. Los resultados obtenidos demuestran que la coadministración de OVA con Omp19S genera un aumento de la respuesta proliferativa en las células de estos ratones con respecto a las de los animales inmunizados solo con OVA (Figura 17). Tanto la estimulación con ConA (resultados no mostrados) como con el control positivo (CFA) produjeron un aumento significativo en la proliferación celular. Estos resultados indican que la utilización de Omp19S como adyuvante tiene un efecto sobre la generación de una eficiente respuesta adaptativa evidenciada por un incremento en la capacidad proliferativa de las células T específicas.
Para la determinación del tipo de respuesta T helper anti-OVA que se induce con Omp19S como adyuvante por via parenteral se cultivaron los esplenocitos de los ratones inmunizados en presencia de distintas concentraciones de OVA o medio completo durante 72 hs. y luego se analizó el patrón de citoquinas producidas en los sobrenadantes de estas células. Se realizó un ELISA de captura empleando anticuerpos monoclonales específicos para la detección de IFN-γ, IL-10, IL-4 e IL-17 en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados y control.
Los resultados indican que las células de los animales inmunizados con OVA+Omp19S produjeron niveles significativos de IFN-γ con respecto a los animales control (SF) y a los inmunizados con OVA sin adyuvante (Figura 18), y la secreción de esta citoquina fue antígeno especifica y dosis dependiente. El control positivo (CFA) también indujo la producción de niveles de esta citoquina. Omp19S como adyuvante parenteral genera una respuesta de tipo Th1 .
En contraposición a esto, los niveles de IL-4 producidos no presentaron diferencias significativas en los distintos grupos, si bien hubo un aumento de esta citoquina en respuesta al estímulo con OVA comparada con las células del grupo SF, los niveles fueron similares en los animales inoculados con OVA sola, OVA+Omp19S y OVA+CFA (Figura 19A). Del mismo modo, la producción de IL-10 en las células de bazo no presenta diferencias entre los diferentes grupos, si bien existe un incremento respecto del grupo SF en todos los casos (Figura 19B). Lo que nos indicaría que la producción antígeno especifica de IL- 4 e IL-10 no es un efecto de los adyuvantes sino que es característica de este antígeno. La estimulación con mitógeno control (ConA) produjo niveles significativos de todas las citoquinas analizadas. En vistas de estos resultados, el patrón de citoquinas presentado nos sugiere que la respuesta desencadenada con la inmunización con Omp19S como adyuvante se corresponde con un perfil Th1 , en la que existe un incremento de la producción de IFN-γ y no así de IL-4 e IL-10.
Estas células T productoras de IFN-γ son indispensables en la generación de respuestas inmunes eficientes contra infecciones por patógenos con algúna fase de su ciclo de vida intracelular (o cuando el patógeno es internalizado por los macrófagos), como virus, bacterias, parásitos y hongos; o tumores, el hecho de que el adyuvante induzca la producción de esta citoquina por parte de los linfocitos T podría ser beneficioso para el desarrollo de vacunas contra este tipo de enfermedades. Dado que los adyuvantes de la invención inducen respuestas Th1 podrían utilizarse en preparaciones vacunales contra dichos patógenos.
Luego de analizar la respuesta de los linfocitos Th1 y Th2 y para continuar caracterizando el tipo de respuesta inmune se evaluó la contribución de la población de células Th17 en la respuesta desencadenada. Para ello, se midió en los sobrenadantes de los cultivos los niveles de IL-17 producidos en respuesta al estímulo (Figura 20). Los resultados indicaron que luego de la inmunización conjunta de Omp19S y OVA se genera una respuesta Th17 dosis dependiente ante la estimulación con el antígeno.
El análisis de las respuestas inmunes de las células T CD8+ en animales normales está restringido por la baja frecuencia de estas células que responden a un epitope en particular. Los ratones transgénicos para el receptor T han sido usados experimentalmente como una fuente de células T con una especificidad definida. Uno de los modelos más ampliamente usados son los ratones transgénicos OT-1 , cuyas células T CD8+ expresan el receptor T específico para el péptido SIINFEKL de OVA presentado en el contexto de moléculas coestimulatorias MHC I (H-2Kb) (Harmala, Ingulli, Curtsinger, Lucido, Schmidt, Weigel, Blazar, Mescher and Pennell. The adjuvant effects of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 result from the rapid and prolonged activation of antigen-specific CD8+ T cells in vivo. J Immunol . 169 (10):5622-9. 2002).
Se utilizaron estos ratones para el análisis in vivo de la respuesta inmune adaptativa T CD8+ frente al antígeno.
Para caracterizar la respuesta T CD8+ específica en presencia o ausencia de los adyuvantes de la invención, se realizó una transferencia adoptiva a ratones C57BL/6 por vía endovenosa con células de bazo y ganglios linfáticos de ratones OT-1 . Al día siguiente se los inoculó por vía s.c. con OVA con los adyuvantes (Omp19S, Omp19S PK (Omp19S tratado con proteinasa K), lipopolisacárido (LPS) o en SF. Cinco días después se midió en bazo y ganglios linfáticos drenantes el número de células OT-1 marcadas con CFSE por citometría de flujo.
En los animales control inoculados con SF se observaron porcentajes menores de división celular de las células CD8+ específicas marcadas con CFSE. En los animales inmunizados con OVA más el adyuvante Omp19S se observó una mayor proporción de células que sufrieron más de una división que en los ratones inmunizados con OVA sin adyuvante tanto en bazo (Figura 21 ) como en ganglios linfáticos (Figura 21 ).
En bazo, el grupo inmunizado con SF presentó un valor de proliferación de 21 .79%, mientras que en el grupo inmunizado con OVA sin adyuvante el porcentaje de células que se dividieron (75.01 %) fue menor que al ser inoculada con Omp19S como adyuvante (86.44%). Lo mismo ocurrió con las células de los ganglios linfáticos drenantes. Como control de que el efecto en la respuesta esta dado efectivamente por el adyuvante y no por algún contaminante no proteico como el LPS, se inmunizó a los animales con dicho adyuvante degradado. Se observó que la inmunización con el adyuvante degradado con proteinasa K indujo niveles de proliferación comparables a los de la inoculación de OVA sin adyuvante. Las células OT-1 de los animales inmunizados con el control positivo (LPS) presentaron niveles de proliferación comparables a los del grupo inmunizado con Omp19S como adyuvante.
Estos resultados indican que la inmunización con Omp19S como adyuvante induce una mayor activación de las células T CD8+ específicas para OVA aumentando la capacidad proliferativa de estas células, evidenciando la generación de una eficiente respuesta inmune adaptativa T CD8+ frente al antígeno.
Luego de observar que existía una eficiente respuesta celular T CD8+ antígeno específica inducida por el adyuvante de la invención se evaluó si las células CD8+ eran capaces de inducir niveles significativos de IFN-γ, característico de una respuesta de tipo T helper 1 . Para ello ratones C57BL/6 fueron inmunizados con: i) OVA ii) OVA+Omp19S, u iii) OVA+Omp19S PK por vía s.c. Siete días después se extrajeron los bazos de los animales, posteriormente los esplenocitos fueron estimulados con medio de cultivo, OVA 500 g/ml+Péptido SIINFEKL 5 g/ml+APC MO5 o Pma-lonomicina y se midió la producción de IFN-γ intracelular mediante citometria de flujo.
Las población de células CD8+ productora de IFN-γ es mayor en los ratones inmunizados utilizando Omp19S como adyuvante de OVA (0.73%) ante la estimulación in vitro con OVA en comparación a las células provenientes de los animales inmunizados con OVA sola, cuyo porcentaje (0.14%) es similar al isotipo, esto nos indica que el polipéptido utilizado como adyuvante induce la diferenciación de células T CD8+ capaces de producir IFN-γ en respuesta a la estimulación con el antígeno (Figura 22). Efectivamente, se observó que al inmunizar con la proteína degradada (Omp19S PK) la proporción de células que expresan esta citoquina es similar a la del grupo inmunizado con OVA sin adyuvante (0.15%), este resultado confirma que el efecto adyuvante se encuentra en el polipétido adyuvante. En todos los casos los isotipos presentaron valores similares.
Estos resultados indican que Omp19S es capaz de inducir la producción de linfocitos T CD8+ que secretan IFN-γ en respuesta al antígeno. Estas células CD8+ productoras de IFN-γ son indispensables en la generación de respuestas inmunes eficientes contra infecciones por patógenos con algúna fase de su ciclo de vida intracelular como virus, bacterias, parásitos y hongos; o tumores, el hecho de que el adyuvante induzca la producción de esta citoquina por parte de los linfocitos T podría ser beneficioso para el desarrollo de vacunas contra este tipo de enfermedades.
Dado que se detectó activación y producción de IFN-γ por parte de las células CD8+ en respuesta al antígeno OVA en los ratones inmunizados con los adyuvantes de la invención, se investigó también si luego de la inmunización de animales con los adyuvantes de la invención se inducían células citotóxicas Ag específicas. Para ello se inmunizaron ratones C57BL6 por vía s.c. y 3 semanas después se llevo a cabo un ensayo de citotoxicidad in vitro, en el cual las células blanco (MO5 que expresa OVA o B16 que no expresa OVA) fueron marcadas con 51 Cr y luego incubadas con los esplenocitos de los ratones inmunizados (células efectoras) y se midió en los sobrenadantes la liberación de 51Cr por parte de las células blanco. Se muestra en la figura 23 que los esplenocitos provenientes de los animales inmunizados con Omp19S u Omp16S como adyuvantes produjeron un mayor porcentaje de lisis respecto de aquellas células provenientes del grupo inmunizado con OVA sin adyuvante. Se utilizó el adyuvante de Freund completo (CFA) como control positivo. Omp19S y Omp16S como adyuvantes inducen una respuesta citotóxica en los esplenocitos de los ratones inmunizados mayor a la inducida por el adyuvante CFA y sin signos de alteraciones en el tejido inmunizado ni otros efectos adversos. Los polipéptidos Omp19S y Omp16S han mostrado ser formulaciones de vacunas que comprendan cualquier inmunogeno o antígeno cuyo adyuvante sea al menos Omp19S y/o Omp16S. Los polipéptidos de la invención son buenos adyuvantes para la generación de respuestas Th1 y citotóxicas en mucosas mediante su uso por vía nasal como oral y a nivel sistémico luego de la administración parenteral.
Las respuestas inmunes T son consideradas protectivas contra patógenos y tumores. Estos adyuvantes inducen respuestas T productoras de IFN-γ administrados por vía parenteral y de mucosas (nasal y oral) por lo que podrían ser útiles en preparaciones vacunales contra infecciones por patógenos con algúna fase de su ciclo de vida intracelular (o cuando el patógeno es internalizado por los macrófagos) como virus, bacterias, parásitos y hongos; o tumores. También inducen citotoxicidad contra una línea tumoral que expresa el antígeno (MO5), por lo cual podrían ser utilizados en vacunas contra tumores.
Además dado que por lo general las citoquinas Th1 inhiben a las Th2, en vacunas anti-alérgicas se pretende inducir respuestas Th1 contra el alérgeno de manera de re-direccionar una respuesta Th2 alérgeno-específica hacia una Th1 modulatoria. Los adyuvantes de la invención pueden ser de utilidad en la modulación de la respuesta a alérgenos.
Evidencia reciente ha demostrado un rol crítico de las células T productoras de IL-17 en la protección inducida por vacunas en infecciones por patógenos intra y extracelulares. Se ha reportado la generación de respuestas Th1 y Th17 en vacunas contra Bordetella pertusis, en donde la población de células Th17 es importante para la eficacia de la protección inducida. Así también, se ha demostrado que IL-17 posee un rol importante en la protección contra Streptococcus pneumonie y Mycobacterium tuberculosis. El mecanismo propuesto para la eficacia de las vacunas que inducen la activación de células Th17 es a través de la regulación de quemoquinas. En este sentido, el empleo de un adyuvante que sea capaz de inducir la producción de esta citoquina sería beneficioso en las vacunas contra este tipo de patógenos. Finalmente, los adyuvantes de la invención podrían utilizarse como inmunomoduladores o activadores de la respuesta inmune en diferentes patologías donde la respuesta inmune este involucrada.
Tal como se muestra en la Figura 24 y dado que la expresión de α4β7 dirije a los linfocitos a las mucosas efectoras (lámina propia del intestino), estos resultados muestran que Omp19S administrada por via oral como adyuvante del toxoide tetánico (TT) en una formulación de vacuna induce la migración de los linfocitos T CD4+ y CD8+ efectores hacia la mucosa intestinal (lámina propia del intestino delgado).
Los polipéptidos adyuvantes Omp16S y Omp19S también podrían expresarse in situ, siendo administrados como vectores a ADN o ARN. Tal como se muestra en la figura 25 las proteínas Omp16 y Omp19 se expresan correctamente luego de la transfección de células eucariotas con los plásmidos pCI-Omp16S o pCI-Omp19S respectivamente. Este resultado indica que es posible la producción de las proteínas por células eucariotas, pudiendo administrarse vectores de expresión a células eucariotas u a organismos superiores (vertebrados o mamíferos) de tal manera que el adyuvante se exprese in situ y ejerza su efecto.
Continuando con la caracterización del mecanismo por el cual se lleva acabo el efecto de los adyuvantes de la presente invención, se realizaron ensayos en los que se coincubaron sobrenadantes de extractos de estómago con polipéptidos Omp19S y luego se adicionó BODIPY FL caseína ó BODIPY FL OVA (antígenos que están marcados intramolecularmente de modo que no fluorecen cuando están íntegros, pero sí cuando son degradados) en 100 μΙ de un buffer de NaHCO3. Se observó que la presencia del polipéptido Omp19S reduce la degradación del antígeno, efecto similar al observado cuando se utiliza un cóctel inhibidor de proteasas de mamíferos (como control de que la actividad enzimática del estómago puede ser inhibida). Por lo antes mencionado, se observa que la acción de los adyuvante de la presente invención comprende, además, un mencanismo inhibitorio de la acción de proteasas, lo que llevaría a un aumento en la vida media del antígeno (Figura 26). Estos resultados indican que la inmunización utilizando Omp19S como adyuvante además de inducir una mayor respuesta inmunológica, disminuye la degradación del antigeno, de esta manera se podría disminuir la cantidad de Ag que se administran en vacunas para estimular y mantener la respuesta inmune.
Ensayos adicionales con el fin de analizar la acción inhibitoria de las proteasas por parte de los polipéptidos adyuvantes de la presente invención, consitieron en evaluar si el polipéptido Omp19S es capaz de inhibir la degradación por proteasas del estómago de ratones Balb/c de diversos antígenos, tanto eucariotas (BSA, OVA), como bacterianos (BLS, SurA. DnaK), sin limitar el alcance de la presente invención. Cada antígeno se trató con: i) sobrenadante de extracto de estómago, ii) sobrenadante de extracto de estómago y Omp19S, iii) sobrenadante de extracto de estómago y cóctel inhibidor de proteasas de mamíferos (como control de que la actividad enzimática del estómago puede ser inhibida). Estas mezclas de reacción se sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y posterior tinción con Coomasie blue (Figura 27). Estos ensayos demuestran que los polipéptidos adyuvantes de la presente invención tienen actividad de inhibición de la degradación de antígenos, tanto de origen eucariota como bacteriano.
Con el objeto de ensayar la acción de inhibición de la degradación de los antígenos por parte de las proteasas del estómago se llevó adelante un ensayo in vivo, usando como modelo de antígeno a BODIPY FL caseína. Los ratones Balb/c fueron inoculados por vía oral con: i) buffer de NaHCO3 (1 M, pH8) (Vehículo), ii) BODIPY FL caseína con Omp19S, iii) BODIPY FL caseína con aprotinina (un inhibidor de proteasas conocido), iv) BODIPY FL caseína. Luego de un tiempo de reacción se sacrificaron los ratones y se analizaron los extractos por emisión de fluorescencia observándose una inhibición de la degradación de antígenos por proteasas del estomago in vivo (Figura 28).
A partir de los diferentes ensayos en los cuales se determinó el la capacidad de inhibición de la degradación de los antígenos por parte de las proteasas del estómago, se observa un efecto de inhibición de la acción de dichas proteasas de al menos un 30%, preferentemente de al menos un 50%. Entre las proteasas que son inhibidas por la acción de los adyuvantes de la presente invención se encuentran serin proteasas, aspartil proteasas, metaloproteasas y cistein proteasas.
Los polipéptidos adyuvantes de la presente invención resultan ser ideales dado que dicha capacidad de inhibir la destrucción del Ag por proteasas aumentado su vida media e induce una respuesta inmune. Esto podría significar que se requiera una menor cantidad de Ag para inducir la misma respuesta inmune lo que reduciría los costos de las vacunas.
Resulta por lo tanto sorprendente que Omp16S y Omp19S actúen como adyuvantes altamente eficiente para antígenos no relacionados con los antígenos de Brucella.
Esta invención se encuentra mejor ilustrada según los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como una limitación impuesta al alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que luego de leerse la presente descripción, puede sugerir a aquellos entendidos en el tema sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o alcance de las reivindicaciones anexas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Clonado, expresión v caracterización de los polipéptidos Omp19S v Omp16S de Brucella abortus
El polipéptido Omp19S fue clonado sin la secuencia consenso de lipidación en el vector pET22+ con el agregado de una cola de histidinas en el extremo carboxilo terminal (Novagen, Madison, Wl, USA), como fue descripto en (Giambartolomei, Zwerdling, Cassataro, Bruno, Fossati and Philipp. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7):4635-42. 2004). Mas detalladamente, se diseñaron oligonucleótidos específicos conteniendo los sitios de restricción para las enzimas Ndel y Xhol en el extremo 5', y región 3' del gen de Omp19 sin el extremo aminoterminal correspondiente a la secuencia del péptido señal y la cisteína aminoterminal : Omp19
Sentido: 5 TGGCCATATGCAGAGCTCCCG3' (SEQ ID N° 3)
Antisentido: 5'AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3'(SEQ ID N° 4)
En la reacción de PCR se utilizó como templado el ADN genómico de B. abortus 544. El producto de la reacción de ligación se utilizó para transformar bacterias competentes de la cepa JM109 y se purificó el ADN plasmídico con un kit comercial (Promega).
Con esta construcción se transformaron células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) y se indujo la expresión de la proteína con isopropil- -D-thiogalactopiranosido (IPTG). El extracto bacteriano se sónico y la proteína se purificó por cromatografía de afinidad utilizando columnas de níquel (Quiagen, Alemania). Así se obtuvo el polipéptido no lipidado (Omp19S) purificado (SEQ ID N° 1 ).
El polipéptido Omp16S fue clonado sin la secuencia consenso de lipidación en el vector pET22+ con el agregado de una cola de histidinas en el extremo carboxilo terminal (Novagen, Madison, Wl, USA), como fue descripto en (Giambartolomei et al. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7):4635-42. 2004). Mas detalladamente, se diseñaron oligonucleótidos específicos conteniendo los sitios de restricción para las enzimas Ndel y Xhol en el extremo 5', y región 3' del gen de Omp16 sin el extremo aminoterminal correspondiente a la secuencia del péptido señal y la cisteína aminoterminal:
Omp16
Sentido: 5'GTTGCCATATGGCGTCAAAGAA3' (SEQ ID N° 5)
Antisentido: 5TTGCCGCTCGAGCCGTCCGGCCCC3' (SEQ ID N° 6)
En la reacción de PCR se utilizó como templado el ADN genómico de B. abortus 544. El producto de la reacción de ligación se utilizó para transformar bacterias competentes de la cepa JM109 y se purificó el ADN plasmídico con un kit comercial (Promega).
Con esta construcción se transformaron células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) y se indujo la expresión de la proteína con isopropil- -D-thiogalactopiranosido (IPTG). El extracto bacteriano se sónico y la proteína se purificó por cromatografía de afinidad utilizando columnas de níquel (Quiagen, Alemania). Así se obtuvo el polipéptido no lipidado (Omp16S) purificado (SEQ ID N° 2).
Los polipéptidos no lipidados Omp19S y Omp16S fueron sometidos a una electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS- PAGE), seguido de una tinción con Coomasie blue para monitorear las distintas etapas de purificación. La identidad de los mismos se confirmó mediante un Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Omp19 y otro anti-Omp16.
Las posibles trazas de LPS que pudieran contaminar a los polipéptidos purificados se eliminaron utilizando una resina de Polimixina B sepharosa (Sigma-Aldrich). Luego se realizó un ensayo de Limulus Amebocyte Kit (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA) para determinar la cantidad de LPS presente. En todos los experimentos descriptos en esta solicitud se utilizaron preparaciones de los polipéptidos recombinantes purificados que contienen <0.25 U de endotoxina/ g de polipéptido.
La concentración de Omp19S y Omp16S se evaluó mediante el método de ácido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL) usando seroálbumina bovina (BSA) como estándar. Los poléptidos purificados fueron alicuotados y almacenados a - 70°C hasta su uso.
Ejemplo 2: Ensayos de inmunización de animales empleando como adyuvante a Omp19S v Omp16S:
Se utilizó como antígeno modelo Ovoalbúmina bovina (OVA) purificada y libre de LPS (Sigma-Aldrich).
Se emplearon ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad de la cepa Balb/c (H-2d) o de la cepa C57BL/6 (H-2b). Los mismos fueron adquiridos en el bioterio de la Universidad Nacional de La Plata y fueron mantenidos en el bioterio del Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Recibieron agua y alimento ad libitum.
Se realizaron dos tipos de inmunizaciones: oral y parenteral.
- Inmunización por vía oral:
Para la inmunización por vía oral se siguieron dos protocolos, en los cuales se varió la rutina de inyección de los diferentes grupos de ratones. Las dos rutinas de inmunización ensayadas dieron resultados similares. Rutina 1
r inmuniz. 2 y 3o Inmuniz. 4 y 5o Inmuniz. fi0 Tnmuniz Sacrificio
0 7 8 14 15 21
I I I I I I
En esta primera rutina los ratones BALB/c fueron inmunizados por vía oral seis veces en los días 0, 7, 8, 14, 15 y 21 con i) Ι ΟΟμς de OVA, ii) Ι ΟΟμς de OVA + Ι ΟΟμς de Omp19S, iii) Ι ΟΟμς de OVA+ Ι ΟΟμς de Omp16S, iv) Ι ΟΟμς de OVA + 10^g de toxina colérica (CT, Sigma) embebidos en un buffer de NaHCO3 (1 M, pH8). Dos semanas después (día 35) de la última inmunización los ratones fueron sacrificados para evaluar la respuesta celular.
Rutina 2:
Figure imgf000037_0001
Dia 34 (Sacrificio)
Los animales Balb/c fueron inmunizados por vía oral seis veces en los días 1 , 2, 3, 8, 9 y 10 con i) Ι ΟΟμς de OVA, ii) Ι ΟΟμς de OVA + ^ 50μg de Omp19S, iii) Ι ΟΟμς de OVA+ ^ 50μg de Omp16S, iv) Ι ΟΟμς de OVA + 5μg de toxina colérica (TC, Sigma) embebidos en un buffer de NaHCO3 (1 M, pH8). Una semana después de la última inmunización se les realizó un estudio de respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH) (día 17), y tres semanas después de la última inmunización (día 34) los animales fueron sacrificados para evaluar la respuesta celular. - Inmunización por vía nasal:
Día 42 (Sacrificio)
Día i Día 14 Día 21
Los animales C57BL/6 fueron inmunizados por vía nasal en tres ocasiones cada 7 días con i) 50μς de OVA, ii) 50μς de OVA + ^ 0μg de Omp19S, iii) 50μς de OVA+ ^ 0μg de Omp16S, iv) 50μg de OVA + 1 μς de toxina colérica (TC, Sigma). Se inyectaron 12.5 μΙ por fosa nasal. Tres semanas después de la última inmunización los animales fueron sacrificados para evaluar la respuesta celular.
Los animales fueron sangrados por vía retroorbital y los sueros fueron guardados a -20 °C para la detección de Acs específicos.
-Inmunización parenteral
Los animales fueron inmunizados por vía subcutánea (s.c.) en tres ocasiones cada 7 días con i) KX^g de OVA, ii) KX^g de OVA + KX^g de Omp19S, iii) KX^g de OVA+ 100μΙ de CFA (Sigma-Aldrich) o iv) SF. Tres semanas después de la última inmunización los animales fueron sangrados para obtener los sueros, algunos (5 por grupo) fueron sacrificados para evaluar la respuesta celular y a otros se les realizó DTH (5 por grupo).
Ejemplo 3: ensayo de evaluación de la actividad de Omp19S y Omp16S:
Respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH):
Siete días después de la última inmunización los animales fueron inoculados por vía intradérmica en la almohadilla plantar derecha con 20 g de OVA y con solución fisiológica (SF) en la almohadilla plantar izquierda. Se evaluó la respuesta midiendo el incremento en el pliegue cutáneo plantar derecho respecto al izquierdo, utilizando un calibre digital de 0,01 mm de precisión a las 48 hs y 72 hs luego de la inoculación.
Obtención de esplenocitos de ratones:
Los ratones anestesiados con éter se sangraron a blanco por el plexo retroorbital y fueron sacrificados por dislocación cervical. Se practicó una incisión adecuada, abriendo la cavidad peritoneal, para poner en descubierto el bazo, el cual se extrajo con pinzas y tijeras en condiciones asépticas. Se trituró el bazo en fragmentos pequeños usando una tijera de punta curva. Se agregaron 3 mi de RPMI 1640 (Gibco) y se homogeneizó. La suspensión se llevó a 8 mi y se filtró en malla de acero para retener los detritos celulares y restos de tejidos. Luego se realizó un lavado con RPMI 1640, y las células se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con el agregado de 10 % de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 2mM de L-glutamina y piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina y 100 μg ml de estreptomicina).
Obtención de linfocitos de ganglios mesentéricos de ratones:
Los ratones anestesiados con éter se sangraron a blanco por el plexo retroorbital y fueron sacrificados por dislocación cervical. Se practicó una incisión adecuada, abriendo la cavidad peritoneal, para poner en descubierto los ganglios mesentéricos, los cuales se extrajeron con pinzas y tijeras en condiciones asépticas. Luego se incubaron con colagenasa (2.5mg/ml) durante 30 minutos. A continuación se retiró la colagenasa y se trituraron los ganglios en fragmentos pequeños usando una tijera de punta curva. Se agregaron 3 mi de RPMI 1640 (Gibco) y se homogeneizó. La suspensión se llevó a 8 mi y se filtró en malla de acero para retener los detritos celulares y restos de tejidos. Luego se realizó un lavado con RPMI 1640, y las células se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con el agregado de 10 % de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 2mM de L-glutamina y piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina y 100 μg ml de estreptomicina).
Recuento de células viables:
Para determinar el número de células viables se utilizó el método de exclusión de Azul de Tripán. Se preparó una solución de Azul de Tripán 0.2% en PBS. Se tomaron 50 μΙ de la suspensión a contar y se agregaron 50 μΙ de Azul de Tripán. Se cargó en una cámara de Neubauer y se determinó el número de células viables al microscopio óptico.
Estimulación celular:
Se cultivaron esplenocitos (4 x106 células/ml) de los ratones inmunizados en presencia de OVA (100 y 1000 g /mi), medio completo, o mitógeno control (Concanavalina A, 5 g /mi) en placas de 48 pocilios. Los cultivos se realizaron en una estufa a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 72hs para los ratones Balb/c y 5 días para los C57BL/6. Los sobrenadantes de estas células fueron utilizados para determinación de citoquinas secretadas por ELISA. . ELISA de captura para la detección de citoquinas:
Se realizó un ELISA de captura empleando Acs monoclonales específicos para la detección de IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-4 (OptEIA™, PharMingen, San Diego, USA) e IL-17 (Mouse IL-17 Quantikine, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados y control. El protocolo se realizó según las instrucciones del fabricante.
Ensayo de proliferación in vitro:
Los esplenocitos de los ratones inmunizados (2x105 células/ml) fueron cultivados por triplicado en presencia de OVA (100 y 1000 g /mi), medio completo o mitógeno control (Concanavalina A, 5 g /mi) en placas de 96 pocilios. Los cultivos se realizaron en una estufa a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2. A los 5 días se les dio un pulso de timidina tritiada (1 Ci/well) y 18 hs. después se cosecharon las células y se midió la incorporación de timidina radioactiva con un contador beta expresada en cuentas por minuto. Los resultados fueron expresados en índice de estimulación SI (cpmOVA/cpmRPMI). Se considera significativo un SI >2.
Determinación de IFN-rintracelular en linfocitos T CD4+ y CD8+:
- Células presentadoras de antíqeno (APC) A20J y MQ5
Se crecieron células A20J (linfoma B de ratón, singénico con BALB/c, ATCC
TIB208) en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con el agregado de 10 % de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 2mM de L-glutamina y piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina) durante dos días. Estas células fueron estimuladas con OVA 10 g/ml un día antes del ensayo, las llamaremos A20JOVA. De la misma manera se crecieron células MO5 (células de melanoma B16 singeneicas con C57BL6 y transfectadas en forma estable con un plásmido que expresa OVA) para ser utilizadas como células presentadoras de OVA, en medio completo suplementado con 1 mg/ml de geneticina. Mediante microscopía se observó que el estado y el número de las células sea óptimo para su utilización. Estas células fueron tratadas con Mitomicina C (25 μς/ηηΙ, Sigma) a 37°C durante 30 min., lavadas con RPMI en 3 ocasiones y resuspendidas en medio de cultivo completo.
- Esplenocitos de bazo de ratón
Se cultivaron en botellas T25 pooles de esplenocitos de ratón correspondientes a cada grupo de inmunización, en medio de cultivo completo. Al día siguiente se cultivaron en una placa de 6 wells 8x106 células/ml, en 1 ml medio completo suplementado con IL-2 recombinante (10 U/ml). Posteriormente, fueron agregados los estímulos enumerados a continuación.
- Estímulos
Para cada grupo de ratones inmunizados, se realizaron los siguientes estímulos:
a) Control negativo: medio de cultivo completo con el agregado de IL-2 de ratón recombinante (10 U/ml) (PeproTech. Inc., Rocky Hill, USA)
b) Estímulo antigénico
i- En el caso de los animales BALB/c se utilizó OVA 500μg ml + péptido de OVA 323-339 KISQAVH AAH AE I N EAGOVA restricto a MHC-II (I pg/ml) + células A20JOVA tratadas con mitomicina en relación 25 esplenocitos:1 APC, todo resuspendido en 1 ml de medio de cultivo completo suplementado con IL-2 recombinante.
ii- En el caso de los animales C57BL/6 se utilizó OVA 500μg ml + péptido de OVA 257-264 SIINFEKL restricto a MHC-I (0.5ug/ml) + células presentadoras MO5 en relación 25 esplenocitos:1 APC, todo resuspendido en 1 ml de medio de cultivo completo suplementado con IL-2 recombinante.
c) Control positivo, estímulo mitogénico. PMA 20ng/ml + lono 0.75 g/ml, ambos resuspendidos en 1 ml de medio de cultivo completo suplementado con IL-2 recombinante.
Luego de incubar 18hs con los diferentes estímulos, se agregó a cada uno de los estímulos 10 μg ml de Brefeldina A (Sigma) y se incubaron 6 hs. Luego del período de incubación se levantaron los esplenocitos y se separaron en dos tubos (uno para isotipo y otro para la marcación con IFN-γ) para la posterior marcación con anticuerpos para realizar estudios de citometría.
- Marcación de subtipos celulares e IFN-v
Los esplenocitos estimulados y control fueron incubados durante 30 min. a 4 °C con Acs monoclonales específicos anti-CD4 de ratón marcado con PE-Cy5.5 y anti-CD8 de ratón marcado con Alexa flúor 647 (BD Biosciences, San José, CA). Luego fueron lavados con PBS y seguidamente fijados mediante el tratamiento durante 20 min. a temperatura ambiente con una solución de paraformaldehido al 4%. Luego de un lavado con PBS fueron permeabilizados por tratamiento con buffer de permeabilización (saponina 2%, SFB 10% en PBS) durante 30 min. Las células así permeabilizadas, fueron centrifugadas a 600g por 5 min., y tratadas con un Ac específico anti-IFN-γ de ratón marcado con PE durante 30 min. Para todos los tratamientos se realizaron marcaciones en paralelo con Acs marcados con los mismos fluorocromos pero de especificidad irrelevante como controles de isotipo. Luego de lavadas, las células fueron resuspendidas en PBS y finalmente analizadas mediante un citómetro de flujo (BD FACSCalibur) y los resultados se analizaron utilizando el programa FlowJo (Versión 5.7.2)
Determinación del marcador α4β7 en linfocitos de ganglios mesentéricos:
Luego de obtener las células de este órgano según el protocolo comentado anteriormente, se armaron pooles según el grupo de inmunización. De cada uno de ellos, se tomaron 2x106 células, y se marcaron con anti-CD4 de ratón marcado con FITC, anti-CD8 de ratón marcado con PE-Cy5.5 y anti-a4 7 de ratón marcado con PE (BD Biosciences, San José, CA). Posteriormente, las células fueron fijadas con 100 μΙ de paraformaldehido al 4%, y seguidamente fueron analizadas por citómetro de flujo (BD FACSCalibur) y los resultados se analizaron utilizando el programa FlowJo (Versión 5.7.2).
"Enzvme-Linked ImmunoSorbent Assav" (ELISA) indirecto para la detección de Acs específicos:
Para realizar el ELISA se utilizaron placas de poliestireno (Maxisorp, NUNC, Dinamarca). Las placas fueron sensibilizadas con 1 g de OVA por pocilio y bloqueadas con 200 mi de leche descremada (Molico) al 3% en buffer PBS. Luego las placas se incubaron con diluciones seriadas de los sueros y se revelaron con anticuerpos anti-lgG de ratón conjugados a HRP. Para la determinación de los isotipos específicos se incubaron las placas con anticuerpos específicos para los isotipos de Ig de ratón, lgG1 e lgG2a, conjugados a HRP (Santa Cruz). Las incubaciones se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Como diluyente de sueros y conjugados se empleó leche descremada en polvo al 1 %, Tween 0.05% en PBS. Luego de cada incubación la placa fue lavada 3 veces con PBS-Tween 0.05%. El ELISA se reveló con 2 mg/ml de orto fenilendiamina y 0.03% de H2O2 en buffer fosfato/citrato 0.1 M. La reacción se detuvo entre los 15 y 30 minutos de incubación con 50 mi de H2SO4 4N. Las densidades ópticas desarrolladas se determinaron a 492 nm en un lector de microplacas Metertech ∑ 960. Para determinar el título de anticuerpos se ensayaron 20 sueros de ratones normales a una dilución 1 /100, determinándose el valor de corte (cut-off) como el valor promedio de sus absorbancias más tres desvíos estándar. El título de anticuerpos se calculó como la última dilución que resultó ser mayor que el valor de "cut-off'.
Ensayo de Citotoxicidad
Células blanco:
Se utilizaron como blanco células MO5 (células de melanoma B16 singeneicas con C57BL6 y transfectadas en forma estable con un plásmido que expresa OVA) cultivadas en medio completo + suplementado con 1 mg/ml de geneticina. Como control se usaron células B16 (células de melanoma no transfectadas con plásmido de OVA).
Células estimuladoras:
Se utilizaron como estimulo células MO5 cultivadas en medio completo + suplementado con 1 mg/ml de geneticina, las cuales fueron preincubadas con 10 g de OVA durante 18 hs y luego tratadas con mitomicina C (25 μg/ml) a 37°C durante 30 min, lavadas con RPMI en 23 ocasiones y resuspendidas en medio completo.
Células efectoras: Las células efectoras fueron los esplenocitos de los ratones inmunizados y control (2.5x 107 células totales) previamente estimulados durante 5 días con las células estimuladoras descriptas (0.5x 106 células) en medio completo + 10U/ml de IL-2 recombinante.
Marcación de las células blanco:
Se incubaron las células blanco con cromato de sodio radioactivo en solución acuosa (Cr51 , Amersham Biosciences) a razón de 0.1 mCi/1 x 1 06 células, durante 1 h en baño de agua a 37°C y luego se lavaron 3 veces con RPMI. Ensayo:
Se incubaron las células blanco con distintas cantidades de células efectoras (relación 100:1 , 50:1 ) durante 6 hs en estufa a 37°C. Posteriormente se cosecharon 100 μΙ de los sobrenadantes de cultivo y se cuantifico la radiación en un contador γ (Clinigamma, LKB, Wallac, Turku, Finland). Los resultados obtenidos fueron transformados en % lisis utilizando la formula:
% de lisis = cPm* + cPm^ x 1 00
cpmmax - c niLE
Donde:
χ : muestra
LE: liberación espontánea de las células blanco al ser incubadas sin células efectoras
max: liberación máxima, que se determinó incubando las céluals blanco con Tritón X-100 1 %.
Ejemplo 4: Experimentos que muestran la actividad adyuvante de Omp19S realizados en ratones transqénicos:
Ratones de las cepas OT-1 , cuyas células T CD8+ expresan el receptor T específico para el péptido SIINFEKL de Ovoalbúmina bovina (OVA), fueron utilizados como donantes de células T CD8+antígeno especificas. Estos ratones fueron comprados al Jackson Laboratory y traídos al país por el Dr. Fernando Goldbaum, quien gentilmente nos ha ofrecido esta cepa. Ratones C57 singeneicos adquiridos en el bioterio de la Universidad Nacional de La Plata fueron utilizados como receptores de las células provenientes de los animales OT-1 . Todos los ratones recibieron agua y alimento ad libitum y fueron mantenidos bajo condiciones libres de patógenos.
Se utilizó como antígeno modelo Ovoalbúmina bovina (OVA) purificada y libre de LPS (Sigma-Aldrich) tal como se describió en el Ejemplo 1 . En todos los experimentos descriptos se utilizaron preparaciones de los polipéptidos recombinantes purificados que contienen <0.25 U de endotoxina/ g de polipéptido.
En algunos experimentos se digirió el polipéptido con proteinasa K como control. Para ello Omp19S fue tratada con proteinasa K-agarosa de tricirachium álbum (Sigma Aldrich) durante 2hs a 37°C siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, la resina fue centrifugada y los sobrenadantes fueron incubados por 1 h a 60°C con el fin de inactivar cualquier traza de enzima que se pudiera haber solubilizado. Luego se chequeó la digestión por SDS-PAGE y posterior tinción con Coomasie blue. El polipéptido así tratado (Omp19S PK) se utilizó como control de que el efecto adyuvante es inducido por dicho polipéptido.
Transferencia adoptiva de células de ratones 07/ e inmunización:
Se obtuvieron células CD8+ específicas para OVA a partir de bazo y ganglios linfáticos de los ratones OT-1 las cuales fueron purificadas por selección negativa utilizando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ de ratón (BD Imag) y luego marcadas con 5μΜ de CFSE a 37°C durante 15 minutos. El carboxifluoresceina succinimidil ester (CFSE) (Molecular Probes) libre fue templado adicionando buffer fosfato salino (PBS)10% SFB. Posteriormente las células marcadas fueron lavadas con PBS y resuspendidas en un volumen de 0.1 mi. Luego las células fueron inyectadas vía intravenosa (i.v.) en las venas laterales de la cola de los animales. Un día después los animales fueron inoculados por vía subcutánea (s.c.) con: i) OVA 60 g, ii) OVA 60 g + Omp19S l OOpg, iii) OVA 60 pg + Omp19S PK l OOpg, iv) OVA + LPS (Sigma Aldrich) 10 g como control, o v) PBS. Ensayo de proliferación in vivo:
Cinco días después de la inmunización los animales que recibieron las células provenientes de los OT-1 fueron sacrificados. Se extrajeron los bazos y ganglios linfáticos drenantes (inguinales y axilares) y se determinó el número de células T CD8+ antigéno específicas marcadas con CFSE por citometría de flujo (BD FACSAriall). Los resultados se analizaron utilizando el programa FlowJow (Versión 5.7.2).
Ejemplo 5: Omp19S como adyuvante en formulaciones de vacunas:
Se realizaron 6 inmunizaciones por vía oral con i) TT (toxoide tetánico) 100 Lf, ii) TT 100 Lf +Omp19S 150Mg, o iii) TT 100 Lf.+TC 5pg según el siguiente esquema:
Dfia l DTía 2 DTía 3 DTía 8 DTía 9 D†ía 10
Los ratones fueron sacrificados a las tres semanas luego de la última inmunización y se analizó en ganglios mesentéricos el porcentaje de células T que expresan el marcador α4β7. Ejemplo 6: Clonado de los genes codificantes para Omp16S y Omp19S en un vector de expresión eucariota:
Diseño de los cebadores:
Los oligonucleótidos cebadores fueron diseñados a partir de la secuencia nucleotídica de Omp16 y Omp19 (Genbank Omp16: ACCESSION L27996. Omp19: ACCESSION L27997). Los cebadores contienen sitios de restricción Xhol y Xbal (en negrita). A todos los "primers" se les agregó la secuencia Kozak de conocida eficacia para la transcripción en eucariotas (subrayado en la secuencia).
Omp16S: "Sentido": 5' CTC CTC GAG ACC ACC ATG GCG TCA AAG AA 3' (SEQ ID N° 7) "Antisentido": 5' TTG TCT AGA TTA CCG TCC GGC CCC GTT GA 3 ' (SEQ ID N° 8)
Omp19S:
"Sentido": 5' GGC ATT CTC GAG ACC ACC ATG CAG AGC TCC 3' (SEQ ID N° 9).
"Antisentido": 5' TTT TCT AGA TCA GCG CGA CAG CGT CAC 3' (SEQ ID N° 10).
Clonado:
Se amplificaron los genes de interés por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los "primers" correspondientes con una temperatura de "anneling" de 55° C y usando como templado el ADN genómico de Brucella. Para clonar Omp16S y Omp19S se utilizó el vector pCI-Neo (Promega). Este vector fue digerido con Xhol y Xbal y luego repurificado por el método de fenol: cloroformo. Los productos de amplificación de las PCRs fueron digeridos con las enzimas de restricción correspondientes. Todos los productos de amplificación de las PCRs fueron repurificados por Wizard PCR Preps (Promega, Madison, WI.USA). Las reacciones de ligación fueron realizadas a 4°C durante toda la noche en presencia de la enzima ligasa de DNA T4 (Promega), 1 μΙ del plásmido digerido (pCI) y 2 μΙ del inserto correspondiente digerido. Luego se transformaron células competentes E. coli JM109 (Promega), empleando el método de C^Ca con 5 μΙ de la reacción de ligación. Las bacterias transformadas se seleccionaron, creciéndolas a 37°C en placas de LB con ampicilina (25 μg ml). Para determinar que colonias contenían el plásmido con el inserto adecuado, se realizó un "screening" por el método de "colony PCR".
Expresión in vitro:
Transfección transciente de células COS-7
Para evaluar la expresión in vitro de los plásmidos en células eucariontes se transfectaron células COS-7 (ATCC, CRL1651 , Rockville, MD, USA) por el método de liposomas con 2 μg de las siguientes construcciones: pCI-Omp16S, pCI-Omp19S, o el vector pCI (como control) y 20 μΙ de Lipofectamina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD. USA) siguiendo el protocolo del proveedor.
Expresión de Omp16S v Omp19S en células COS-7
La expresión de los plásmidos fue estudiada a las 24 y 48 horas luego de la transfección (expresión transitoria) en extractos proteicos totales. Se analizó por Western Blot, utilizando distintos anticuerpos monoclonales: anti-Omp16 o anti-Omp19 y se reveló empleando un kit de quimioluminiscencia ECL (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia). Ejemplo 7: Inhibición de la actividad enzimática del estómago in vitro.
Ensayo fluorométrico:
Sustratos
Se utilizaron como antígenos modelo BODIPY FL Ovoalbúmina bovina (OVA) y BODIPY FL Caseína. Ambos antígenos están marcados intramolecularmente de modo que no fluorecen cuando están íntegros, pero sí cuando son degradados (EnzChek® Protease Assay Kit *green fluorescence*, Molecular probes).
Se emplearon ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad de la cepa Balb/c (H-2d). Los mismos fueron adquiridos en el bioterio de la Universidad Nacional de La Plata y fueron mantenidos en el bioterio del Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Recibieron agua y alimento ad libitum. Obtención de los estómagos de ratón
Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se practicó una incisión adecuada, abriendo la cavidad peritoneal, para poner en descubierto el estómago que se extrajo con pinzas y tijeras en condiciones asépticas Procesamiento de los estómagos de ratón
Los estómagos fueron disgregados primero con pinzas y tijeras y los trozos obtenidos se transfirieron a un poter y se embebieron en un buffer de NaHCO3 (1 M, pH8) para completar la disgregación. Los extractos obtenidos fueron centrifugados a 10.000xg y los sobrenadantes utilizados para realizar el ensayo.
Ensayo:
Control negativo: BODIPY FL Caseína o BODIPY FL OVA (10ug/ml) en un buffer de NaHCO3 (1 M, pH8)
Evaluación de la actividad inhibitoria de Omp19S: se coincubaron los estómagos con Omp19S (100ug/ml) durante 30 min y luego con BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA en 100 μΙ de un buffer de NaHCO3.
Otros controles:
Autofluorescencia del estómago: estómago en 100 μΙ de un buffer de NaHCO3.
Determinación de que la actividad enzimática del estómago puede degradar Caseína o OVA: se coincubaron los estómagos con BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA (10ug/ml) en 100 μΙ de un buffer de NaHCO3
Determinación de que la actividad enzimática del estómago puede ser inhibida: se coincubaron los estómagos con un cóctel inhibidor de proteasas de mamíferos (Sigma) durante 30 min y luego con BODIPY FL caseína o BODIPY FL OVA (1 Oug/rnl) en 100 μΙ de un buffer de NaHCO3.
Control positivo: BODIPY FLCaseína o BODIPY FL OVA (10ug/ml) en un buffer de NaHCO3 (1 M, pH8) tratadas con proteinasa K (Sigma). Para evaluar los niveles de fluorescencia las mezclas de reacción fueron transferidas a placas de 96 pocilios opacas negras (baja autofluorescencia) (Costar). La emisión de fluorescencia fue realizada en un lector de placas Victor3, Perkin Elmer, Waltham, MA
Ejemplo 8: Inhibición de la degradación de diferentes antíqenos eucariotas o bacterianos por enzimas del estómago. Antígenos eucariotas: Ovoalbúmina bovina (OVA), Albúmina bovina sérica (BSA)
Antígenos bacterianos: Lumazina sintetasa de Brucella recombinante (BLS), Chaperona de Brucella recombinante (DnaK ) y la peptidil prolil cis trans isomerasa de Brucella recombinante (SurA).
Ensayo:
Se realizaron las siguientes mezclas de reacción y se incubaron durante 1 hora a 37°C:
i) 5 pg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK o SurA)
ii) 5 pg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK o SurA) con 0,1 pg de sobrenadante de extracto de estómago.
iii) 5 pg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK o SurA) con 0,1 pg de sobrenadante de extracto de estómago y 0,3 g de Omp19S.
iv) 5 pg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK o SurA) con 0,1 pg de sobrenadante de extracto de estómago y cóctel inhibidor de proteasas de mamífero (Sigma).
Luego de la incubación, cada mezcla de reacción fue sometida a una electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y posterior tinción con Coomasie blue.
Ejemplo 9: La coadministración de Omp19S inhibe la degradación de antígenos por proteasas del estómago in vivo.
Se utilizó como antígeno modelo BODIPY FL Caseína (EnzChek® Protease Assay Kit *green fluorescence*, Molecular probes).
Se emplearon ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad de la cepa Balb/c (H-2d). Los mismos fueron adquiridos en el bioterio de la Universidad Nacional de La Plata y fueron mantenidos en el bioterio del Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Recibieron agua y alimento ad libitum.
Se realizaron las siguientes inoculaciones por vía oral. ¡) Vehículo: 200 μΙ buffer de NaHCO3 (1 M, pH8).
¡i) 100 pg de BODIPY FL Caseína con 100 pg de Omp19S.
iii) 100 g de BODIPY FL Caseína con 100 g de aprotinina.
iv) BODIPY FL Caseína.
Transcurridos 15 min. de la inoculación los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y se extrajeron y procesaron los estómagos.
Los sobrenadantes de los extractos de los estómagos obtenidos fueron transferidos a placas de 96 pocilios opacas negras (baja autofluorescencia) (costar). La emisión de fluorescencia fue realizada en un lector de placas Victor3, Perkin Elmer, Waltham, MA.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CON ICET
CONICET, CONICET
<120> Adyuvante para vacunas, vacunas que lo comprenden y usos <130> CONICET
<160> 10
<170> Patentln versión 3.5 <210> 1
<211 > 157
<212> PRT
<213> Brucella abortus
<400> 1
Met GIn Ser Ser Arg Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15
Pro Pro Ala Pro Val Asn Ala Val Pro Ala Gly Thr Val GIn Lys Gly
20 25 30
Asn Leu Asp Ser Pro Thr GIn Phe Pro Asn Ala Pro Ser Thr Asp Met 35 40 45
Ser Ala GIn Ser Gly Thr GIn Val Ala Ser Leu Pro Pro Ala Ser Ala
50 55 60
Pro Asp Leu Thr Pro Gly Ala Val Ala Gly Val Trp Asn Ala Ser Leu 65 70 75 80 Gly Gly GIn Ser Cys Lys lie Ala Thr Pro GIn Thr Lys Tyr Gly GIn
85 90 95 Gly Tyr Arg Ala Gly Pro Leu Arg Cys Pro Gly Glu Leu Ala Asn Leu 100 105 110
Ala Ser Trp Ala Val Asn Gly Lys GIn Leu Val Leu Tyr Asp Ala Asn 115 120 125
Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Gly GIn Gly Arg Phe Asp 130 135 140
Gly GIn Thr Thr Gly Gly GIn Ala Val Thr Leu Ser Arg
145 150 155
<210> 2
<211 > 144
<212> PRT
<213> Brucella abortus
<400> 2
Met Ala Ser Lys Lys Asn Leu Pro Asn Asn Ala Gly Asp Leu Gly Leu 1 5 10 15
Gly Ala Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ser Ser GIn Asp Phe Thr Val Asn 20 25 30 Val Gly Asp Arg lie Phe Phe Asp Leu Asp Ser Ser Leu lie Arg Ala 35 40 45
Asp Ala GIn GIn Thr Leu Ser Lys GIn Ala GIn Trp Leu GIn Arg Tyr 50 55 60
Pro GIn Tyr Ser lie Thr lie Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly GIn Arg Arg Ala Ala Ala Thr Arg 85 90 95 Asp Phe Leu Ala Ser Arg Gly Val Pro Thr Asn Arg Met Arg Thr lie 100 105 110
Ser Tyr Gly Asn Glu Arg Pro Val Ala Val Cys Asp Ala Asp Thr Cys 115 120 125
Trp Ser GIn Asn Arg Arg Ala Val Thr Val Leu Asn Gly Ala Gly Arg 130 135 140 <210> 3
<211 > 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador sentido Omp19
<400> 3
ctggccatat gcagagctcc cg 22
<210> 4
<211 > 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador antisentido Omp19
<400> 4
aaactcgagg cgcgacagcg tcac 24 <210> 5
<211 > 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador sentido Omp16
<400> 5
gttgccatat ggcgtcaaag aa 22 <210> 6
<211 > 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador antisentido Omp16
<400> 6
ttgccgctcg agccgtccgg cccc 24
<210> 7
<211 > 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador sentido clonado eucariotas Omp16 <400> 7
ctcctcgaga ccaccatggc gtcaaagaa 29
<210> 8
<211 > 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> <223> cebador antisentido de clonado en eucariotas Omp16 <400> 8
ttgtctagat taccgtccgg ccccgttga 29 <210> 9
<211 > 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador sentido de clonado en eucariotas Omp19 <400> 9
ggcattctcg agaccaccat gcagagctcc 30
<210> 10
<211 > 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cebador antisentido de clonado en eucariotas Omp19 <400> 10
ttttctagat cagcgcgaca gcgtcac 27

Claims

REIVINDICACIONES
I . Adyuvante para vacunas, caracterizado porque comprende un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias.
2. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque la bacteria es del género Brucella.
3. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido no lipidado modificado.
4. El adyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido no lipidado comprende al polipéptido
Omp19S o partes del mismo.
5. El adyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido no lipidado comprende al polipéptido Omp16S o partes del mismo.
6. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido no lipidado comprende la SEQ ID N° 1 o partes de la misma.
7. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido no lipidado comprende la SEQ ID N° 2 o partes de la misma.
8. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque la vacuna es una vacuna seleccionada del grupo comprendido por vacunas mucosales y parenterales.
9. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque inhibe la actividad de proteasas en al menos un 30%.
10. El adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque inhibe la actividad de proteasas en al menos un 45%.
I I . Una vacuna, caracterizada porque comprende como adyuvante al menos un polipéptido no lipidado de la membrana externa (Omp) de bacterias y al menos un antígeno.
12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque la bacteria es del género Brucella.
13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque el polipéptido es un polipéptido modificado.
14. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque el polipéptido no lipidado comprende al polipéptido Omp19S o partes del mismo.
15. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque el polipéptido no lipidado comprende al polipéptido Omp16S o partes del mismo.
16. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque el polipéptido no lipidado comprende la SEQ ID N° 1 o partes de la misma.
17. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque el polipéptido no lipidado comprende la SEQ ID N° 2 o parte de la misma.
18. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque el antígeno es un antígeno mucosal.
19. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque es seleccionada del grupo comprendido por vacunas mucosales y parenterales.
20. El uso del adyuvante de la reivindicación 1 para preparar una vacuna contra un patógeno.
21 . El uso de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque el patógeno tiene al menos una fase de su ciclo de vida intracelular.
22. El uso del adyuvante de la reivindicación 1 para preparar una vacuna antitumoral.
23. El uso del adyuvante de la reivindicación 1 para preparar una composición inmunomoduladora.
24. Vectores de expresión en eucariotas caracterizados porque comprenden las secuencias seleccionadas de SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2.
25. Células eucariotas modificadas, caracterizadas porque expresan las secuencias seleccionadas de SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2.
26. Las células de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizadas porque son células de mamíferos.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106117365B (zh) * 2016-06-23 2018-07-27 湖南农业大学 抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和应用
CN106188307B (zh) * 2016-07-06 2019-01-04 长沙爱科博生物科技有限公司 一种融合蛋白、其制备方法及一种猪用口服疫苗或药物
CN107375922B (zh) * 2017-07-20 2020-06-09 南京农业大学 一种水溶性复合免疫佐剂及猪圆环病毒病疫苗
WO2019155415A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Conicet) Immunomodulating and immunostimulating polypeptides for drug-delivery
CN109486846B (zh) * 2018-12-29 2021-08-20 山东农业大学 一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用
CN114073762B (zh) * 2020-08-12 2023-07-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种含有Omp19和VirB8蛋白的布鲁氏菌病双组分疫苗
CN115267204A (zh) * 2022-08-02 2022-11-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种评估羊群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2190350A1 (es) * 2001-07-31 2003-07-16 Inst Tecnologico De Navarra S Composicion de vacuna frente a la brucelosis que comprende microparticulas de poli (e-caprolactona) como adyuvante.

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2816844A1 (fr) * 2000-11-17 2002-05-24 Pf Medicament Domaine periplasmique d'une proteine omp d'enterobacterie et son utilisation comme porteur et/ou adjuvant

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2190350A1 (es) * 2001-07-31 2003-07-16 Inst Tecnologico De Navarra S Composicion de vacuna frente a la brucelosis que comprende microparticulas de poli (e-caprolactona) como adyuvante.

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUCOUTURIER; DUPUIS; GANNE: "Adjuvants designed for veterinary and human vaccines", VACCINE, vol. 19, no. 17-19, 2001, pages 2666 - 72, XP004231095, DOI: doi:10.1016/S0264-410X(00)00498-9
CRAMERI; RHYNER: "Novel vaccines and adjuvants for allergen-specific immunotherapy", CURR OPIN IMMUNOL., vol. 18, no. 6, 2006, pages 761 - 8, XP025078999, DOI: doi:10.1016/j.coi.2006.09.001
FUJIHASHI; KOGA; VAN GINKEL; HAGIWARA; MCGHEE: "A dilemma for mucosal vaccination: efficacy versus toxicity using enterotoxin-based adjuvants", VACCINE, vol. 20, no. 19-20, 2002, pages 2431 - 8, XP004359672, DOI: doi:10.1016/S0264-410X(02)00155-X
GIAMBARTOLOMEI ET AL.: "Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus", J IMMUNOL., vol. 173, no. 7, 2004, pages 4635 - 42, XP008156271, DOI: doi:10.4049/jimmunol.173.7.4635
GIAMBARTOLOMEI G. H. ET AL.: "Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus.", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 173, 2004, pages 4635 - 4642, XP008156271 *
GIAMBARTOLOMEI; ZWERDLING; CASSATARO; BRUNO; FOSSATI; PHILIPP: "Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus", J IMMUNOL., vol. 173, no. 7, 2004, pages 4635 - 42, XP008156271, DOI: doi:10.4049/jimmunol.173.7.4635
HARMALA, INGULLI; CURTSINGER, LUCIDO; SCHMIDT, WEIGEL; BLAZAR, MESCHER; PENNELL: "The adjuvant effects of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 result from the rapid and prolonged activation of antigen-specific CD8+ T cells in vivo", J IMMUNOL., vol. 169, no. 10, 2002, pages 5622 - 9, XP001176699
LILJEQVIST; STAHL: "Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines", J BIOTECHNOL., vol. 73, no. 1, 1999, pages 1 - 33, XP004180163, DOI: doi:10.1016/S0168-1656(99)00107-8
MOYLE ET AL.: "Mucosal immunization: adjuvants and delivery systems", CURR DRUG DELIV., vol. 1, no. 4, 2004, pages 385 - 96
MOYLE; MCGEARY; BLANCHFIELD; TOTH: "Mucosal immunization: adjuvants and delivery systems", CURR DRUG DELIV., vol. 1, no. 4, 2004, pages 385 - 96
MURILLO M. ET AL.: "A Brucella ovis antigenic complex bearing poly-s-caprolactone microparticles confer protection against experimental brucellosis in mice.", VACCINE, vol. 19, 2001, pages 4099 - 4106, XP008156273 *
PASQUEVICH ET AL.: "Immunization with recombinant Brucella species outer membrane protein Ompl6 or Ompl9 in adjuvant induces specific CD4+ and CD8+ T cells as well as systemic and oral protection against Brucedda abortus infection.", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 77, no. 1, January 2009 (2009-01-01), pages 436 - 445, XP008156270 *
PETROVSKY ET AL.: "Vaccine adjuvants: current state and future trends", IMMUNOL CELL BIOL., vol. 82, no. 5, 2004, pages 488 - 96, XP009078668, DOI: doi:10.1111/j.0818-9641.2004.01272.x
PETROVSKY; AGUILAR: "Vaccine adjuvants: current state and future trends", IMMUNOL CELL BIOL., vol. 82, no. 5, 2004, pages 488 - 96, XP009078668, DOI: doi:10.1111/j.0818-9641.2004.01272.x
REED; BERTHOLET; COLER; FRIEDE: "New horizons in adjuvants for vaccine development", TRENDS IMMUNOL., vol. 30, no. 1, 2009, pages 23 - 32, XP025768338, DOI: doi:10.1016/j.it.2008.09.006
SAN GIL F. ET AL.: "Contribution of adjuvant to adaptative immune responses in mice against Actinobacillus pleuropneumoniae.", MICROBIOLOGY, vol. 145, 1999, pages 2595 - 2603, XP008156277 *
SEDER; HILL: "Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity", NATURE, vol. 406, no. 6797, 2000, pages 793 - 8, XP001008813, DOI: doi:10.1038/35021239
See also references of EP2491946A4
SESARDIC: "Regulatory considerations on new adjuvants and delivery systems", VACCINE, vol. 24, no. 2, 2006, pages S2 - 86,7
SINGH; O'HAGAN: "Advances in vaccine adjuvants", NAT BIOTECHNOL., vol. 17, no. 11, 1999, pages 1075 - 81
VICTORATOS; YIANGOU; AVRAMIDIS; HADJIPETROU: "Regulation of cytokine gene expression by adjuvants in vivo", CLIN EXP IMMUNOL., vol. 109, no. 3, 1997, pages 569 - 78

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