CN114167054B - 一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条及其制备方法，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水纸，所述基膜覆盖于所述底板上，所述结合垫位于所述基膜的上样端，所述吸水纸位于所述基膜的吸附端，所述样品垫位于所述结合垫的上部，其中，所述结合垫上结合有量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，所述基膜上分别设有检测线和质控线，所述检测线包被有兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明检测试纸可以快速、灵敏、准确的检测非洲猪瘟病毒的感染，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。

Description

一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于量子点的高灵敏度检测非洲猪瘟病毒病原的试纸条及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒(Africa swine fevervirus，ASFV)是引起家猪和野猪发病的一种急性和高传染性的疾病，ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40％-85％之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90-100％；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20％-40％之间，在幼年动物的死亡率在70％-80％之间；低致病性毒株死亡率在10％-30％之间。
世界动物卫生组织主要采用分子生物学方法检测非洲猪瘟病毒，主要是各种PCR的方法，包括荧光PCR、等温介导的PCR等。PCR的方法灵敏度高，特异性好，但是需要专门的PCR仪、专业的实验人员以及专门的实验室。很多时候会因为气溶胶的污染导致全部待测样品假阳性结果的出现。许多检测方法主要是指基于抗原抗体反应的胶体金方法，该法灵敏度仅次于PCR方法，对操作人员、操作环境和仪器设备都没有要求，特别适合于现场或基层使用。
综上所述，现有技术检测非洲猪瘟病毒灵敏度低，特异性差，检测过程复杂，亟待研发一种可快速、准确、灵敏地检测非洲猪瘟病毒病原试纸条。
发明内容
为此，本发明提供一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水纸，所述基膜覆盖于所述底板上，所述结合垫位于所述基膜的上样端，所述吸水纸位于所述基膜的吸附端，所述样品垫位于所述结合垫的上部，其中，所述结合垫上结合有量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，所述基膜上分别设有检测线和质控线，所述检测线包被有兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
优选地，所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
优选地，所述量子点为为N，N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联羧酸化ZnSe核/CdS复合量子点。
优选地，所述基膜采用硝酸纤维素薄膜。
本发明还提供一种制备所述的基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条的方法，所述方法包括：
将量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体包被到结合垫上；
在基膜的检测线上包被抗非洲猪瘟病毒的多克隆抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG；
所述基膜覆盖于所述底板上，所述结合垫置于所述基膜的上样端，所述吸水纸置于所述基膜的吸附端，所述样品垫置于所述结合垫的上部，得到所述检测试纸条。
优选地，所述量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体制备过程为：
将羧酸化ZnSe核/CdS复合量子点和N-羟基琥珀酰亚胺混合，在室温下搅拌反应15-30min，然后加入N，N′-二环己基碳二亚胺和抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，室温下反应1-2h，离心弃掉上清，将沉淀用0.005-0.01MPBS溶解，PBS中含有2-10％牛血清蛋白、0.5-2％葡萄糖、0.01-0.1％NaN3，得到所述量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体。
优选地，所述样品垫处理过程为：
将样品垫浸泡在第二处理液2-10min取出，37℃烘干；
所述第二处理液为0.01M PBS、1％Triton X-100、1％BSA、0.05％NaN3，pH7.4。
优选地，所述结合垫的处理过程为：
将结合垫浸泡在第一处理液中2-10min，取出37℃烘干；
所述的第一处理液中各组分浓度为0.01M PBS、0.2％TritonX-100、0.5％丙氨酸，0.05％NaN3，pH7.4。
优选地，所述方法还包括样品稀释液的制备，所述样品稀释液的各组分组成为，按照质量百分数计，生理盐水溶液0.9％、牛血清白蛋白5％、吐温200.1％、NaN30.1％、丙氨酸0.5％。
本发明具有如下优点：
本发明采用双抗体夹心法的免疫层析定性检测方法，直接检测非洲猪瘟病毒病原本身，通过特定配对单克隆抗体的组合实现了非洲猪瘟病毒的高效和灵敏检测；本发明采用由保藏编号为CCTCC NO:C2021173的杂交瘤细胞株8G8分泌得到的单克隆抗体和兔抗非洲猪瘟病毒的多克隆抗体组合实现了高效灵敏检测。
本发明采用量子点标记单克隆抗体，尤其是采用特定的量子点包裹材料和核材料的组合有效保证了荧光检测的灵敏度。本发明采用ZeSe核上包裹CdS组成复合量子点，能大大提高荧光检测的灵敏度。
本发明的试验结果证明：基于本发明的快速检测非洲猪瘟病毒病原的试纸条，还对与之配套的样品稀释液进行了优化，尽管从检测结果可知，常规的生理盐水溶液(样品稀释液3)、不添加丙氨酸的样品稀释液2以及试纸条制备时不添加丙氨酸配合使用不添加丙氨酸的样品稀释液2和样品稀释液3也能实现非洲猪瘟病毒的准确检测，但是，本发明的样品稀释液1，在添加了丙氨酸后配合试纸条结合垫浸泡液以及检测线包被时的缓冲液中添加丙氨酸的方式，能够显著提高病原检测的灵敏度。
本发明量子点标记的试纸条配合使用样品稀释液2和样品稀释液3、试纸条制备时不添加丙氨酸配合使用样品稀释液2和样品稀释液3均能够检测到32倍稀释度下的阳性样品，以及结合垫浸泡液和检测线包被时的缓冲液中不添加丙氨酸的试纸条配合使用添加丙氨酸的样品稀释液1时反而能够检测到64倍稀释度下的阳性样品，本发明的量子点标记试纸条配合样品稀释液1更能检测到128倍稀释度下的阳性样品，而普通的单一单克隆胶体金试纸条使用本发明的样品稀释液1、样品稀释液2、样品稀释液3仅能检测到16、8、4倍稀释度下的阳性样品。样品稀释液中丙氨酸的加入以及量子点标记下结合垫浸泡液以及检测线包被时的缓冲液中丙氨酸的使用共同提高了试纸条检测的灵敏度，且量子点标记以及稀释液中的丙氨酸起到相应主要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条的测试20份盲样检测结果一；
图3为本发明实施例提供的基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条的测试20份盲样检测结果二；
图4为本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒杂交瘤细胞亚克隆生长趋势图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，羧酸化ZnSe核/CdS量子点购自海博纳新材料科技(苏州)有限公司。
实施例1、基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条
如图1所示，本发明的基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条，其包括：底板500、样品垫100、结合垫200、吸水纸400和基膜300，基膜300覆盖于基板500上，结合垫200位于基膜300的上样端，吸水纸400位于基膜的吸附端，样品垫100位于结合垫200的上部，其中，结合垫200上结合有量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，基膜300上分别设有检测线310和质控线320，检测线310包被有兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体，质控线320包被有羊抗鼠IgG。本发明的检测试纸条采用量子点标记单克隆抗体，尤其是使用特定的量子点包裹材料和核材料的组合有效保证了荧光检测的灵敏度。
实施例2、基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条的制备
本实施例提供一种基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体和多克隆抗体的制备过程，包括以下步骤：
1、免疫程序
将杆状病毒真核表达蛋白p72免疫原(山东绿都生物科技有限公司，货号LD-1072)与501水溶性免疫佐剂(山东绿都生物科技有限公司，货号LD003)按体积比10:1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)和2-3斤新西兰白兔(滨州利民兔场赠送)进行免疫，腿部肌肉注射，小鼠剂量50μg/只，100μL/只，兔子剂量500μg/只，1000μL/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍。
2、细胞融合
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20：1的比例混合，800rpm离心7min，弃去上清，于30S内加入1mL50％PEG(W/W)，静置1min，在第一个1min内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基(购自Gibico公司，货号H390)，在第二个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个1min内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个1min内缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心10min，弃上清，用含20％小牛血清(购自Gibico公司，货号H1565)的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6×105个/mL铺于含饲养细胞(2-6×104个/mL)的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
3、分泌非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，如图4所示，非洲猪瘟病毒杂交瘤细胞亚克隆生长趋势图，亚克隆细胞生长旺盛，生长到第6天时，细胞团叠层显著，取细胞上清检测，得到分泌非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10，该抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
4、非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体制备
单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法。
多克隆抗体直接白兔免疫结束后，颈动脉取全血，分离血清获得多克隆抗体。
本步骤中，单克隆抗体和多克隆抗体的纯化均采用SPA柱法对腹水和多抗血清进行纯化，即得抗非洲猪瘟p72单克隆抗体和兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体。
步骤二、抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的标记
将羧酸化ZnSe核/CdS量子点和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，在室温下搅拌反应20min，然后加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DDC)和抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，室温下反应1.5h，离心弃掉上清，将沉淀用0.01M PBS溶解，PBS中含有1％牛血清蛋白、0.05％NaN3，即得到标记好的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体；
量子点标记的抗非洲猪瘟病毒抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的悬浮保存液配方组成为的0.01MTris缓冲液，2％酪蛋白、1％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％NaN3，pH 8.5。
步骤三、结合垫处理
选择聚酯纤维6613作为结合垫，将结合垫浸泡在第一处理液中5min，第一处理液为0.01M PBS，pH7.4，0.2％Triton X-100，0.5％丙氨酸，0.05％NaN3，取出37℃烘干，备用；将步骤二标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体标记物用划膜仪以0.5μL/cm的浓度喷涂在处理好的结合垫上，室温自然晾干或者37℃烘干，得到含有抗非洲猪瘟病毒抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体标记物的结合垫。
步骤四、样品垫
本实施例采用DL42(上海金标)为样品垫，将样品垫浸泡在第二处理液中5min，第二处理液中各组分组成为0.01M PBS，pH7.4，1％TritonX-100，1％BSA，0.05％NaN3，取出37℃烘干，备用。
步骤五、质控线和检测线包被
分别将抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体和羊抗鼠IgG的抗体作为检测线和质控线划包被在硝酸纤维薄膜(NC膜)上，用划膜仪依次以0.5μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，37℃包被2h后，室温自然晾干，制成基膜；
检测线包被时的缓冲液配方成分为0.01M PBS缓冲液，10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％NaN3、1％丙氨酸，pH 8.5；
质控线包被时的缓冲液配方成分为0.01M PBS缓冲液，10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％NaN3，pH 8.5。
步骤六、检测试纸条的组装
将样品垫、结合垫、基膜和吸水垫依次连接并固定于底板上，得到本发明的基于量子点的检测非洲猪瘟病毒病原的试纸条。
本发明的试纸条还包括样品稀释液，样品稀释液的配方为0.9％生理盐水溶液，内含5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN3，0.5％丙氨酸。
实施例3、试纸条检测的特异性和符合率
1、基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条的特异性检测
特异性通常用交叉反应率来表示，交叉反应指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应，交叉反应率越低表明特异性越强。
为了测试本发明所述的非洲猪瘟试纸条的特异性，选取了非洲猪瘟病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、狂犬病毒作为对照，采用本发明的非洲猪瘟试纸条分别进行检测。结果表明，本发明的实施例1制备的非洲猪瘟试纸条仅能检测出非洲猪瘟病毒，而对于犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、狂犬病毒等犬类常见病毒均表现为阴性，表明本发明所述的非洲猪瘟试纸条具有良好的特异性，能够特异性的检测非洲猪瘟病毒。
2、本发明的检测试纸条与非洲猪瘟病原荧光PCR检测方法进行盲样对比
本实施例采用实施例1制备的检测试纸条与世界动物卫生组织用于非洲猪瘟病原检测的PCR方法进行比较，以对本发明的非洲猪瘟病毒抗原的检测试纸条的灵敏度和特异性进行说明，具体包括以下步骤：
(1)、采集待测20份盲样样品：山东某屠宰场采集血槽血液组织样品8份，屠宰场污水样品4份，屠宰场地面拭子4份，屠宰场工具刮取物4份。
(2)、分别以实施例1提供的检测试纸和山东绿都生物科技有限公司生产的非洲猪瘟荧光PCR试剂对以上20份待测样品进行检测，其中，该PCR方法作为参考方法。两种方法的检测结果见图2和图3所示，PCR方法测试样品2、5、6、7、20为阳性，测试其他样品为阴性；
本发明的检测试纸测试样品2、5、6、7、20也为阳性，测试其他样品也为阴性，可见两种检测方法总符合率达到100％，表明本发明实施例1提供的检测试纸用于检测非洲猪瘟病原具有很高的灵敏度和特异性。
3、与非洲猪瘟病原荧光PCR检测方法进行100份样品对比
利用本发明实施例1制备的检测试纸与世界动物卫生组织用于非洲猪瘟病原检测的荧光PCR方法进行比较，检测100份样品，以检验本发明的检测非洲猪瘟病毒抗原的检测试纸的灵敏度和特异性，其包括以下步骤：
(1)、采集待测已知阳性30份，阴性70份样品：经临床观察验证及荧光PCR确证的非洲猪瘟发病猪(来源于河南某猪场)血液样品30份，其中，CT值15-28的强阳性有10份，CT值28-35的阳性有14份，CT值35-45的弱阳性有6份；健康猪(山东猪场)阴性血液样品70份。
(2)、以实施例1制备的检测试纸对待测100份样品进行检测，其中，该PCR方法作为参考方法。两种方法的检测结果如表1所示，本发明的检测试纸测试已知的10强阳性和14份阳性血液样品也为阳性，测试6份弱阳性样本仅有1例检测不到，检测70份阴性样品也为阴性，可见两种检测方法总符合率达到99％，说明本发明的检测试纸用于检测非洲猪瘟病原具有非常高的灵敏度和特异性，灵敏度和特异性检测结果如表1所示。
表1本发明的检测试纸的灵敏度和特异性
项目 强阳性样本 阳性样本 弱阳性样本 阴性样本
实施例1试纸检测 10份 14 5 70份
荧光PCR方法 10份 14 6 70份
实施例4、本发明的检测试纸条检测灵敏度
1、量子点材料对灵敏性的影响
按照实施例1的步骤制备的试纸条作为检测试纸条1，另外分别制备检测试纸条2、检测试纸条3、检测试纸条4，检测试纸条2采用CdSe核/CdS、检测试纸条3采用CdSe核/ZnS和检测试纸条4采用ZnSe核/ZnS，其余制备步骤同试纸条1。使用以上稀释浓度进行试纸条的测试，检测结果如表2所示。
表2量子点材料对灵敏性检测的影响
抗原浓度(μg/mL) 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125
检测试纸条1 543 495 352 241 105 56 12
检测试纸条2 340 276 168 87 34 6 0
检测试纸条3 320 250 142 48 13 0 0
检测试纸条4 284 156 102 42 10 0 0
根据以上灵敏性检测结果可知，本发明实施例1检测试纸条1采用ZeSe核包裹CdS组成复合量子点具有最高的检测灵敏度，能检测到稀释浓度0.3125μg/mL的非洲猪瘟病毒细胞毒样品。CdSe核包裹CdS组成的复合量子点材料次之，CdSe核和ZnSe核分别包裹ZnS组成的复合量子点材料最差，仅能检测到稀释浓度1.56μg/mL的非洲猪瘟病毒细胞毒样品，这可能与包裹材料及其与核材料元素的搭配有关。
(2)抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体和抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体的灵敏性测定
按照实施例1制备试的试纸条，同时设置对照实施例1，其是在实施例1的基础上，采用抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体作为检测线T的抗体，而抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体与胶体金结合后包被到结合垫上，其余制备步骤同实施例1。检测结果如表3所示。
表3单克隆抗体位置对灵敏性的检测结果
抗原浓度(μg/mL) 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125
实施例1 532 485 341 254 115 57 13
对比实施例1 287 146 112 49 12 0 0
基于以上灵敏性检测结果可知，抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体和兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体的标记方式对试纸条的灵敏性测定具有十分显著的影响，当将实施例1结合垫上的抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体和T线的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体交换后得到的对比例1，其对比例1的检测灵敏度明显低于本发明实施例1。
实施例5、非洲猪瘟病毒病原检测试验
选择经鉴定为非洲猪瘟病毒感染阳性的狗2只，用棉签收集狗鼻液，打开样本收集试管，插入棉签，充分搅动棉签直至棉签上的样本溶入稀释液(2mL)，然后丢弃棉签，振荡、混匀后，垂直样品管，吸取上清液，即制备得到样品原液。
按照实施例1的制备方法制备得到检测试纸条A；
制备试纸条B，在制备试纸条B时，去掉结合垫浸泡液和检测线包被时的缓冲液中的丙氨酸，其余制备步骤同实施例1；
胶体金试纸条为检测试纸条C为单一单克隆胶体金试纸条，制备方法按照本领域常规方法制备。
检测过程中，分别采用了三种不同的样品稀释液进行比较，其中，
样品稀释液1为：0.9％生理盐水溶液，内含5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN3，0.5％丙氨酸。
样品稀释液2为：0.9％生理盐水溶液，内含5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％NaN3。
样品稀释液3为：0.9％生理盐水溶液。
并且对采样的样品原液采用相应稀释液进行稀释，分别是样品原液(1倍稀释)、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍稀释、32倍稀释、64倍稀释，128倍稀释，滴加100微升滴到检测试纸条A、检测试纸条B和检测试纸条C中的样品孔中进行检测。检测结果如表4所示：
表4病原检测试验结果
稀释倍数 1:0 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
试纸条A样品稀释液1 432 378 342 301 256 178 120 66
试纸条A样品稀释液2 321 256 203 154 97 35 0 0
试纸条A样品稀释液3 332 251 193 134 91 31 0 0
试纸条B样品稀释液1 354 276 226 165 103 87 43 0
试纸条B样品稀释液2 301 223 178 132 89 39 0 0
试纸条B样品稀释液3 290 230 176 134 102 44 0 0
试纸条C样品稀释液1 +++ +++ ++ ++ + - - -
试纸条C样品稀释液2 +++ ++ + + - - - -
试纸条C样品稀释液3 +++ ++ + - - - - -
+代表阳性；-代表阴性
结合表4的猪瘟病毒病原检测试验结果，相对于实施例1制备的基于量子点的非洲猪瘟病毒病原试纸条A配合使用稀释液2和稀释液3均能够检测到32倍稀释度下的阳性样品，以及结合垫浸泡液和检测线包被时的缓冲液中不添加丙氨酸的试纸条B配合使用添加丙氨酸的稀释液1时反而能够检测到64倍稀释度下的阳性样品。
本发明的试纸条A配合稀释液1更能检测到128倍稀释度下的阳性样品，而普通的单一单克隆胶体金试纸条C使用本发明的稀释液1、2、3仅能检测到16、8、4倍稀释度下的阳性样品。尽管试纸条B与不添加丙氨酸的稀释液2、3也能检测到32倍稀释度下的阳性样品，但相比于试纸条A与不添加丙氨酸的稀释液2、3的组合在8和16倍稀释度下的阳性样品检测强度有所降低。
因此，样品稀释液中丙氨酸的加入以及量子点标记下结合垫浸泡液以及检测线包被时的缓冲液中丙氨酸的使用共同提高了试纸条检测的灵敏度，且量子点标记以及稀释液中的丙氨酸起到相应主要的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条，其特征在于，
所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水纸，所述基膜覆盖于所述底板上，所述结合垫位于所述基膜的上样端，所述吸水纸位于所述基膜的吸附端，所述样品垫位于所述结合垫的上部，其中，所述结合垫上喷涂有量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，所述基膜上分别设有检测线和质控线，所述检测线包被有兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；
所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173；
所述量子点为N，N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联羧酸化ZnSe核/CdS复合量子点；
在结合垫上喷涂量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体之前，使用第一处理液对所述结合垫进行处理，处理过程为：将结合垫浸泡在第一处理液中2-10min，取出，37℃烘干；
所述的第一处理液中各组分浓度为0.01M PBS、0.2％Triton X-100、0.5％丙氨酸，0.05％NaN3，pH7.4；
所述检测线包被时的缓冲液配方成分为0.01M PBS、10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％NaN3、1％丙氨酸，pH 8.5。
2.如权利要求1所述的基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条，其特征在于，
所述基膜采用硝酸纤维素薄膜。
3.一种制备权利要求1所述的基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条的方法，其特征在于，所述方法包括：
将量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体喷涂到结合垫上；
在基膜的检测线上包被兔抗非洲猪瘟病毒蛋白p72多克隆抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG；
所述基膜覆盖于底板上，所述结合垫置于所述基膜的上样端，吸水纸置于所述基膜的吸附端，样品垫置于所述结合垫的上部，得到所述基于量子点检测非洲猪瘟病毒的试纸条；
其中，所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173；
所述量子点为N，N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联羧酸化ZnSe核/CdS复合量子点；
在结合垫上喷涂量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体之前，使用第一处理液对所述结合垫进行处理，处理过程为：将结合垫浸泡在第一处理液中2-10min，取出，37℃烘干；
所述的第一处理液中各组分浓度为0.01M PBS、0.2％Triton X-100、0.5％丙氨酸，0.05％NaN3，pH7.4；
所述检测线包被时的缓冲液配方成分为0.01M PBS、10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％NaN3、1％丙氨酸，pH 8.5。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体制备过程为：
将羧酸化ZnSe核/CdS复合量子点和N-羟基琥珀酰亚胺混合，在室温下搅拌反应15-30min，然后加入N，N′-二环己基碳二亚胺和抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体，室温下反应1-2h，离心弃掉上清，将沉淀用0.005-0.01M PBS溶解，PBS中含有2-10％牛血清白蛋白、0.5-2％葡萄糖、0.01-0.1％NaN3，得到所述量子点标记的抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述样品垫处理过程为：
将样品垫浸泡在第二处理液中2-10min，取出，37℃烘干；
所述第二处理液为0.01M PBS、1％Triton X-100、1％牛血清白蛋白、0.05％NaN3，pH7.4。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述方法还包括样品稀释液的制备，所述样品稀释液的各组分组成为，按照质量百分数计，生理盐水溶液0.9％、牛血清白蛋白5％、吐温20 0.1％、NaN3 0.1％、丙氨酸0.5％。
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