CN116554311B - 抗CD2v-N的特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗CD2v‑N蛋白的特异性抗体及其应用，所述抗体包括2B25和3J25抗体中的任意一个，所述2B25抗体和3J25抗体都具有特异性高以及亲和力高的特点，能够识别非洲猪瘟病毒的CD2v蛋白、编码基因或其功能片段，利用2B25和3J25抗体的双夹心ELISA方法可以简便、快速、准确地检测出CD2v‑N蛋白。

Description

抗CD2v-N的特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术、免疫学领域，涉及抗CD2v-N的特异性抗体及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(Infection with African swine fever virus，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒(ASFV,African swine fever virus)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)下仅有的种，具有传染性和极高的致病性，急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。
非洲猪瘟病毒是一种有包膜的、核衣壳呈二十面体对称形态的病毒。ASFV基因组由线性的双链DNA组成，大小为170-193kbp。其中包含150-167个开放阅读框，编码150-200种蛋白质，其中一种蛋白为CD2v。CD2v是有ASFV的EP402R基因编码的病毒外膜糖蛋白，也被称为pEP402R。它由402个氨基酸构成，预测的蛋白质大小为46.5kD。CD2v是一种病毒包膜蛋白，其结构被分为4个结构域：20个氨基酸构成的N端信号肽结构域；183个氨基酸构成的胞外结构域；25个氨基酸构成的疏水跨膜区域；174个氨基酸构成的胞内结构域。当ASFV入侵宿主细胞后，CD2v会在内质网或高尔基体中被切割，经切割后产生的63kD的N端以糖基化形式存在。因其氨基酸序列与T淋巴细胞表面黏附受体CD2具有很高的相似性，被认为是CD2的同源物。CD2v在促进病毒复制与传播、病毒免疫逃逸等方面发挥着重要作用，也是ASFV疫苗研究的热门靶标。
发明内容
为了解决上述的问题，本发明的目的在于提供抗CD2v-N蛋白的特异性抗体。
本发明的第一方面提供了一种抗CD2V-N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括单克隆抗体2B25、3J25任意一种；其中，
所述单克隆抗体2B25包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。
所述单克隆抗体3J25包含：SEQ ID NO：17所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：18所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：19所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：25所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：26所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：27所示的轻链可变区CDR3。
术语“抗体”包括是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的抗原结合部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与…免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd>10-6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
术语“特异性抗体”或“单克隆抗体”，是指仅含有一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，特异性抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。特异性抗体含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对抗原有独特的结合亲和力。
进一步，所述单克隆抗体2B25还包含具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
进一步，所述单克隆抗体3J25还包含具有与SEQ ID NO：20、21、22、23所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：28、29、30、31所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
进一步，所述单克隆抗体2B25重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的重链可变区，所述轻链可变区具有与SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的轻链可变区。
进一步，所述单克隆抗体3J25重链可变区具有与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的重链可变区，所述轻链可变区具有与SEQ IDNO：32所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的轻链可变区。
进一步，所述单克隆抗体2B25重链为IgG2b抗体，3J25重链为IgG1抗体，两者轻链均为kappa亚型。
在某一具体的实施方式中，所述单克隆抗体2B25的重链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体2B25的轻链可变区具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
在某一具体的实施方式中，所述单克隆抗体3J25的重链可变区具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体3J25的轻链可变区具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段是由本发明提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。
进一步，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
在某些实施例中，本发明提供的单克隆抗体和其功能片段进一步包含免疫球蛋白(Ig)恒定区，其任选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施例中，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区(或任选地CH2-CH3-CH4区)。本发明提供的抗体和其功能片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一或多个突变。
在某些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段在CDR序列中的一或多个和/或FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段包含与本发明列出的那种(或那些)CDR序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持以类似于或甚至高于其亲本抗体的水平与CD2V-N蛋白特异性结合的1、2或3个CDR序列。
在某些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段包含与本发明中列出的那种(或那些)可变区序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持在类似于或甚至高于其亲本抗体对于CD2V-N蛋白的特异性结合亲和力的水平的一或多个可变区序列。在一些实施例中，突变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。
本发明第二方面提供了如下任一项所述的物质：
1)核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；
2)重组表达载体，所述重组表达载体包含1)中所述的核酸分子；
3)改造的宿主细胞，所述改造的宿主细胞包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，或1)中所述的核酸分子、2)中所述的重组表达载体；
4)抗体偶联物，所述抗体偶联物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物；
进一步，所述单克隆抗体的功能片段包括核酸功能片段或氨基酸功能片段。
在某些具体的实施方案中，所述单克隆抗体可以偶联其功能片段(如核酸功能片段)和可检测标记物，其中功能片段可以发挥结合抗原基因使其沉默、或剪切抗原基因等的功能。
5)一种检测CD2V-N蛋白的产品，所述产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、1)中所述的核酸分子、2)中所述的重组表达载体、3)中所述的改造的宿主细胞或4)中所述的抗体偶联物；
6)一种检测非洲猪瘟病毒感染的产品，所述产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、1)中所述的核酸分子、2)中所述的重组表达载体、3)中所述的改造的宿主细胞或4)中所述的抗体偶联物；
7)组合物，所述组合物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，1)中所述的核酸分子、2)中所述的重组表达载体、3)中所述的改造的宿主细胞。
在某些实施例中，本发明提供的抗体涵盖其任何功能片段。如本发明所用，术语“功能片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个CDR或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。功能片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFvdsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。功能片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。功能片段还包括抗体能够发挥功能的氨基酸片段的相对应核酸片段，包括RNA与DNA片段，包括但不限于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、hRNA、反义RNA、tCRNA、dsRNA、SCRNA、具有催化活性的RNA、各种病毒RNA、单链DNA、闭环DNA、连接DNA等。
进一步，所述重组表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体或人工染色体。
术语“载体”是指可以被工程化的含有可以在宿主细胞中扩增克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或“重组载体”。重组载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本申请的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，可以根据待表达的核酸分子或目的链接的宿主细胞的需求进行选择。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体(例如表达载体)，其含有编码抗CD2V-N蛋白抗体的本发明提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
术语“可检测标记物”是指任何部分，该部分通过与该部分(moiety)偶联的分子状态的光学、电学或其它物理指标的改变生成可测定信号。此类物理指标包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学和化学手段，例如但不限于荧光、化学荧光和化学发光等。在关于经标记的检测剂使用时，“直接标记物”是通过任何手段附着至检测剂的可检测标记物。在关于经标记的检测剂使用时，“间接标记物”是特异性结合检测剂的可检测标记物。因此，间接标记物包括下述部分：其是检测剂部分的特异性结合伴侣。生物素和亲和素是所采用的此类部分的实例，其例如通过使生物素化抗体与经标记的亲和素接触以产生间接标记的抗体来应用
进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
更进一步，所述细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、除蓝藻外植物细胞、真菌细胞、酵母细胞。
更进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
进一步，所述宿主细胞包括杂交瘤细胞。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、或芯片。
术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“改造的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)、昆虫细胞、PER.C6细胞和CoS细胞，优选为CHO细胞。
本发明第三方面提供如下任一种方法，所述方法包括：
(1)一种生产本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供本发明第二方面中1)所述的核酸分子或2)所述的重组表达载体；
b)用步骤a)所述的物质转化宿主细胞；
c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；
d)在宿主细胞培养液中分离纯化获得本发明第一方面所述的单克隆抗体；
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD2V-N蛋白或编码其的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，或将待测样品与本发明第二方面中4)所述的抗体偶联物接触；检测CD2V-N蛋白或编码其的核酸分子与本发明第一方面所述的单克隆抗体，或本发明第二方面中4)所述的抗体偶联物的复合物的形成；
(3)一种制备本发明第二方面中3)所述的改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，本发明第二方面中1)所述的核酸分子，或本发明第二方面中2)所述的重组表达载体导入到宿主细胞中；
(4)一种特异性地抑制CD2V-N蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，或本发明第二方面中1)所述的核酸分子，或本发明第二方面中2)所述的重组表达载体导入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段抑制CD2V-N蛋白的活性。
本发明第四方面如下任一种应用，所述应用包括：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、本发明第二方面中1)所述的核酸分子、本发明第二方面中2)所述的重组表达载体、本发明第二方面3)所述的改造的宿主细胞，或本发明第二方面中4)所述的抗体偶联物在检测CD2V-N蛋白或其片段中的应用；
(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、本发明第二方面中1)所述的核酸分子、本发明第二方面中2)所述的重组表达载体、本发明第二方面中3)所述的改造的宿主细胞，或本发明第二方面中4)所述的抗体偶联物在制备检测非洲猪瘟病毒感染的产品中的应用；
术语“非洲猪瘟病毒感染”或“ASF感染”是指感染非洲猪瘟病毒。所述术语在临床表现的症状为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。ASF感染后发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。
(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、本发明第二方面中1)所述的核酸分子、本发明第二方面中2)所述的重组表达载体、本发明第二方面中3)所述的改造的宿主细胞在制备诊断非洲猪瘟病毒相关疾病的产品中的应用；
(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、本发明第二方面中1)所述的核酸分子、本发明第二方面中2)所述的重组表达载体、本发明第二方面中3)所述的改造的宿主细胞在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒相关疾病的药物中的应用；
(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段、本发明第二方面中1)所述的核酸分子、本发明第二方面中2)所述的重组表达载体、本发明第二方面中3)所述的改造的宿主细胞在制备调节CD2V-N蛋白活性或水平的药物中的应用。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测真核表达CD2V-N蛋白纯度实验结果图，其中，A为糖基化修饰CD2v蛋白，B为非糖基化CD2v蛋白；
图2是ELISA检测单克隆抗体与CD2v-N的结合特性的实验结果图；
图3是分子互作系统检测单克隆抗体与CD2v-N抗原亲和力的实验结果图，其中，A为单克隆抗体2B25与CD2v-N抗原亲和力的实验结果图，B为单克隆抗体3J25与CD2v-N抗原亲和力的实验结果图；
图4是单克隆抗体重链与轻链构成分析结果图，其中，A为单克隆抗体2B25重链与轻链构成分析结果图，B为单克隆抗体3J25重链与轻链构成分析结果图；
图5是单克隆抗体与CD2v-N的结合位点的ELISA检测实验结果图，其中，A为单克隆抗体2B25与CD2v-N的结合位点的ELISA检测实验结果图，B为单克隆抗体3J25与CD2v-N的结合位点的ELISA检测实验结果图；
图6是双夹心ELISA检测抗体之间相互作用的实验结果图。
具体实施方式
在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
除非另外定义，否则本发明所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本发明所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本发明所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本发明中。
实施例1CD2v-N融合蛋白真核表达与纯化
1、CD2v-N蛋白表达载体的构建
根据GenBank:QGM12912.2 CD2v蛋白序列，将信号肽、CD2v蛋白胞外区序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示)以及6×His标签克隆pCDNA3.1真核表达载体中，构建真核重组表达pCDNA3.1-CD2v-N-His，简称pCD2v-N-His载体。将293T细胞置于Opti-MEM完全培养基中，37℃培养2h，将pCD2v-N-His1μg加入到200μL jet-pRIME buffer中，涡旋5s，在超净台中放置10min，加入293T细胞并轻轻混匀；在转染后6h，用Opti-MEM培养基取代转染复合物，放置37℃继续培养72-96h，收集细胞上清备用。
2、CD2v-N融合蛋白真核表达与纯化
1)将上述收集表达的CD2v蛋白的培养上清，12000r/min离心15min。上清用0.45μm滤头过滤后，放入冰盒中备用；
2)用移液器吸取2mL Ni-NTA填料加入安装好的蛋白纯化柱上，待Ni填料沉降后，小心加入上垫片；打开控制阀，使20％乙醇流出，并继续用10mL去离子水清洗柱子；
3)调节流速，用10mL及以上体积的平衡缓冲液以1mL/min的速度冲洗柱子；
4)将滤膜过滤的细胞培养上清分批次滴加到上述平衡好的柱中，每次5mL，调节控制阀使流速不超过1mL/min，迅速收集穿出液并重复上样2～3次，收集最后一次穿出液，放置-20℃备用；
5)用洗涤缓冲液冲洗柱子，除去杂蛋白；
6)向柱子中加入10mL洗脱缓冲液，洗脱目的蛋白；降低流速；收集洗脱的液到EP管中，每管1mL，用酶标仪测出每管蛋白的浓度并做好标记，放置-20℃备用；
7)向纯化前细胞培养上清液与纯化后收集的穿出液、洗杂液、洗脱液中加入5×Loading Buffer(含或不含巯基乙醇)，并煮沸10min，经12％ SDS-PAGE分析纯化结果；
洗脱获得的CD2v-N蛋白，在还原(reducing)和还是非还原(Non-reducing)条件下经SDS-PAGE电泳分析。结果显示在55-110kDa左右处出现弥散的目的条带，结果如图1A所示；
8)将纯化的CD2v-N蛋白在变性条件下，用糖苷酶PNGase F(NEB BioLabs，#P0711S)或Endo H(NEB BioLabs，#P0702S)，酶切去糖基化，糖苷酶PNGase F去糖基化修饰反应体系如表1所示，Endo H酶去糖基化修饰反应体系如表2、表3所示。SDS-PAGE分析结果显示CD2v蛋白具有不同程度的糖基化，经去糖后，其分子量明显变小，而且条带较为单一，结果如图1B所示。说明之前55-110kDa左右处出现弥散的目的条带均为CD2v蛋白，其纯度较高。
表1蛋白去糖反应体系-PNGase F酶
注：50℃孵育10min。
表2蛋白变性反应体系-Endo H酶
注：100℃加热反应10min。
表3蛋白去糖反应体系-Endo H酶
注：37℃孵育1h。
实施例2单克隆抗体的筛选与制备
1、CD2v-N蛋白免疫Balb/c小鼠
首次免疫：将0.25mL弗氏完全佐剂和100μg CD2v-N蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：1月龄。
加强免疫：将0.25mL弗氏不完全佐剂和100μg CD2v-N蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：首次免疫后15天。
第二次加强免疫：将0.25mL弗氏不完全佐剂和100μg CD2v-N蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：加强免疫后15天。
Balb/c小鼠血清效价测定：
1)包被：抗原用包被液稀释横向包被，每孔加入100μL抗原进行包被，4℃包被过夜；洗板：用全自动洗板机洗板，3次洗液为1×PBST；
2)封闭：每孔加入200μL用PBS配制4％脱脂牛奶进行封闭，37℃封闭1h；
3)洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
4)加样：血清样品用稀释，竖向加入血清稀释样品，每孔加入100μL稀释好的血清样品，空白对照孔加入100μL PBS，37℃孵育1h；
5)洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
6)二抗：用PBS按1:5000稀释二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP，赛默飞，#A16072)，每孔加入100μL稀释好的二抗，37℃孵育40min；
7)洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；
8)显色：配置好TMB显色液，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光显色90s；
9)终止：每孔加入100μL终止液进行终止，并用酶标仪检测每孔在OD450处的吸光值。
2、杂交瘤细胞融合
加强免疫：融合前三天对Balb/c小鼠进行加强免疫，腹腔注射0.5mL 100μg/只CD2v-N蛋白。
制备滋养层细胞：脱颈处死正常Balb/c小鼠，75％酒精浸泡皮肤进行消毒，无菌剥离皮肤，注射器抽取6mL 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，计数，调整细胞浓度至2×105个/mL，加入96孔板，0.1mL/孔，置37℃，5.0％CO2孵箱备用。
50％ PEG制备：取10mL试管，称取PEG 0.7g溶于0.7mL无血清1640培养液中，加盖，白胶布密封，插入注射器针头，放入加有100mL烧杯中。利用电磁炉煮沸，计时30min，拔出针头再煮2min，置室温备用
细胞融合：
取已免疫Balb/c小鼠，摘眼球放血(取血清留作阳性对照)后，脱颈处死小鼠，75％酒精浸泡皮肤消毒，无菌取脾，挤压出脾细胞，加入20mL 1640培养液于平皿，10mL吸管吹散脾细胞团块，将细胞悬液移至50mL离心管，洗一遍。
取骨髓瘤细胞于另一离心管，1200rpm/min离心4min弃上清，分别加入40mL 1640培养液进行计数，根据计数结果调整细胞比例为脾细胞∶骨髓瘤细胞＝6∶1。混合两种细胞后，1200rpm/min离心4min弃上清，弹散管底细胞，离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入50％ PEG 1mL(边加边轻轻搅动)，静置40s，1min内加入1mL 1640培养液(边加边轻轻搅动)，随后以相同的方法在2min内加入5mL 1640培养液，2min内加入10mL 1640培养液。将上述细胞悬液800rpm/min离心5min，弃上清，轻轻弹散管底细胞，加入含20％ FBS的1640培养液，混匀后加入已铺滋养层的96孔板中(2×106个/mL)，置于37℃，5.0％CO2孵箱中培养。
换液：5天换液，20％ FBS 1640培养液+HT，筛选前每天换液一次，共换3次，第8天进行筛选。
3、抗原阳性细胞的筛选
取单克隆细胞株上清，利用ELISA的方法进行阳性克隆筛选，具体操作步骤同血清效价测定。首轮筛选的阳性克隆转入24孔板进行培养，复测后挑选阳性克隆进行亚克隆。
4、杂交瘤细胞克隆化
制备滋养层细胞：具体操作与步骤2中细胞融合一致。
将24孔板中待做克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打混匀后，取少数细胞悬液至另一无菌试管中，进行准确计数。取200个细胞悬浮于10mL培养液中(约2个细胞/0.1mL)接种96孔培养板0.1mL每孔，共1块。取100个细胞悬浮于10mL培养液中(约1个细胞/0.1mL)接种96孔培养板0.1mL每孔，共2块。将培养板置于37℃，5.5％ CO2孵箱中培养，5天左右在显微镜下观察到细胞克隆。确定单克隆细胞株，适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株转入24孔板扩大培养。重复操作至克隆达到100％阳性率即为克隆化。
细胞换液原则：
15天，20％FBS 1640培养液+HAT；
15天，20％FBS 1640培养液+HT；
之后，10％FBS 1640培养液。
5、单克隆抗体大量制备
于Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，注射后一周可使用。
收取对数生长期的杂交瘤细胞，用生理盐水洗涤两次，1500rpm/min离心5min。台盼蓝染色计数，重新用生理盐水配成3×106个/mL的细胞悬液。
给注射了石蜡油的Balb/c小鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射0.5mL上述杂交瘤细胞。接种后7-12天可见小鼠腹部明显膨大，此时可由腹腔抽取腹水。抽取的腹水3000rpm/min离心30min，收集上清，后经Protein A色谱柱纯化，获得后续实验用抗体2B25和3J25，序列如表4所示。
表4抗体序列
实施例3候选抗体亚型鉴定
包被：捕获抗体(250×)使用包被缓冲液稀释成1×，酶联免疫板中每孔加入100μL进行包被，4℃包被过夜；
洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
封闭：每孔加入250μL封闭缓冲液，室温封闭2h；
洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
加样：每孔加入50μL分析缓冲液，然后加入50μL样品，室温孵育1h；
洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
二抗：用分析缓冲液将检测抗体(250×)稀释至1×，每孔加入100μL检测抗体，室温孵育1h；
洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；
显色：每孔加入100μL显色液，室温孵育15min；
终止：每孔加入100μL终止液进行终止，用酶标仪检测各孔在OD450处的吸光值。
利用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(赛默飞，#A38550)测定两株候选抗体的亚型。结果显示：2B25重链为IgG2b抗体，3J25重链为IgG1抗体，两者轻链为kappa亚型。
实施例4候选抗体2B25和3J25与抗原的结合检测
包被：包被液稀释抗原至2μg/mL，酶联板中每孔加入100μL稀释后抗原，4℃包被过夜；
洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
封闭：每孔加入200μL PBS配制的4％脱脂牛奶进行封闭，37℃封闭1h；
洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；
加样：用PBS稀释样品，每孔加入100μL样品，空白对照孔加100μL PBS，37℃孵育1h；洗板3次；
二抗：用PBS按稀释100μL/孔加入到酶联板中，37℃孵育40min；
洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；
显色：配置好的TMB显色液，每孔加入100μL TMB，室温避光显色1min；
终止：每孔加入100μL终止液进行终止，用酶标仪检测各孔在OD450处的吸光值。
利用ELISA检测候选抗体2B25和3J25与非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的结合特性，抗体2B25和3J25与抗原CD2v的结合特性如图2所示。结果显示，2B25和3J25抗体均能识别并结合CD2v，且具有浓度依赖性，EC50值如表5所示，2B25的EC50(mg/mL)值为0.03371，3J25的EC50(mg/mL)值为0.05632，其中，EC50(mg/mL)值越低说明与抗原的结合能力越强。
表5候选抗体与CD2v的结合能力检测(EC50值)
注：EC50(mg/mL)值越低说明与抗原的结合能力越强
实施例5ELISA实验分析2B25和3J25抗体特异性
文献显示CD2V与CD2分子结构上高度同源，因此发明人选用hCD2分子，检测筛选获得的两株单克隆抗体与CD2分子结合情况。包被人hCD2(His标签)蛋白(购自北京义翘神州股份有限公司，#10982-H08H)2g/mL，加入分别加入0.1g/mL 2B25和3J25，二抗用Goatanti-mouse IgG-HRP(赛默飞，#A16072)(1:5000)，结果如表6所示。结果表明，两个抗体仅与CD2V分子有特异的结合，而与hCD2分子没有结合，表明筛选的抗体具有较好特异性。
表6ELISA分析单抗2B25、3J25与Hcd2结合情况(OD450)
实施例6利用Octet分子互作系统测定候选抗体2B25和3J25的亲和力
设定样品板分布，其中候选抗体的浓度为200nM，抗原浓度从800nM开始倍比稀释至12.5nM；
设定程序，如表7所示：
表7Octet分子互作系统设定程序
选择探针的类型及位置，启动程序进行分析。
单克隆抗体与抗原CD2v的亲和力测定结果如图3所示，2B25的KD值为1.54×10-8M，3J25的KD值为9.94×10-9M，如表8所示，结果表明，单克隆抗体2B25和3J25与CD2v亲和力好。
表8 2B25和3J25分别与CD2v蛋白结合的动力学常数
注：KD值表示相互作用亲和能力的大小，KD值越小说明与抗原的亲和力越好。
实施例7抗体2B25和3J25的结构分析与抗原结合位点分析
对抗体2B25和3J25的重链与轻链进行分析，结果如图4所示，结果显示，2B25、3J25所含的轻重链结构不同。
将抗体2B25和3J25与抗原进行结合分析，结果如图5所示，结果表明，2B25和3J25的抗原结合位点不同，相互之间没有竞争。
实施例8双夹心ELISA检测分析
使用双夹心ELISA法，测试抗体2B25和3J25的使用方式，结果如图6所示，结果显示，3J25抗体作为固定抗体，同时使用生物素标记的2B25抗体作为检测抗体，检测效果最好，相关统计结果见表9。
表9双夹心ELISA检测结果
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (17)

1.一种抗CD2V-N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单克隆抗体2B25、3J25任意一种；其中，
所述单克隆抗体2B25包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3；
所述单克隆抗体3J25包含：SEQ ID NO：17所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：18所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：19所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：25所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：26所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：27所示的轻链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体2B25还包含具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
所述单克隆抗体3J25还包含具有与SEQ ID NO：20、21、22、23所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：28、29、30、31所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体2B25重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90%序列一致性， 所述轻链可变区具有与SEQID NO：16所示的氨基酸序列至少90%序列一致性；
所述单克隆抗体3J25重链可变区具有与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列至少90%序列一致性，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90%序列一致性。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体2B25重链为IgG2b抗体，3J25重链为IgG1抗体，两者轻链均为kappa亚型。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
6.如下任一项所述的物质：
1）核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段；
2）重组表达载体，所述重组表达载体包含1）中所述的核酸分子；
3）改造的宿主细胞，所述改造的宿主细胞包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段，或1）中所述的核酸分子、2）中所述的重组表达载体，所述宿主细胞不包括植物细胞；
4）抗体偶联物，所述抗体偶联物包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物；
5）一种检测CD2V-N蛋白的产品，所述产品包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、1）中所述的核酸分子、2）中所述的重组表达载体、3）中所述的改造的宿主细胞或4）中所述的抗体偶联物；
6）一种检测非洲猪瘟病毒感染的产品，所述产品包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、1）中所述的核酸分子、2）中所述的重组表达载体、3）中所述的改造的宿主细胞或4）中所述的抗体偶联物；
7）组合物，所述组合物包括权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段，1）中所述的核酸分子、2）中所述的重组表达载体、3）中所述的改造的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的物质，其特征在于，所述重组表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、质粒、基于转座子的载体或人工染色体。
8.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，所述质粒包括真核细胞表达载体。
9.根据权利要求6所述的物质，其特征在于，所述改造的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
10.根据权利要求9所述的物质，其特征在于，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
11.根据权利要求10所述的物质，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
12.根据权利要求9所述的物质，其特征在于，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞。
13.根据权利要求12所述的物质，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
14.根据权利要求13所述的物质，其特征在于，所述宿主细胞包括杂交瘤细胞。
15.根据权利要求6所述的物质，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、或芯片。
16.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）一种生产权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a）提供权利要求6中1）所述的核酸分子或2）所述的重组表达载体；
b）用步骤a）所述的物质转化宿主细胞；
c）在适合条件下培养步骤b）所得的宿主细胞；
d）在宿主细胞培养液中分离纯化获得权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体；
（2）一种制备权利要求6中3）所述的改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段，权利要求6中1）所述的核酸分子，或权利要求6中2）所述的重组表达载体导入到宿主细胞中。
17.如下任一种应用，其特征在于，所述应用包括：
（1）权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、权利要求6中1）所述的核酸分子、权利要求6中2）所述的重组表达载体、权利要求6中3）所述的改造的宿主细胞，或权利要求6中4）所述的抗体偶联物在制备检测非洲猪瘟病毒感染的产品中的应用；
（2）权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、权利要求6中1）所述的核酸分子、权利要求6中2）所述的重组表达载体、权利要求6中3）所述的改造的宿主细胞在制备诊断非洲猪瘟病毒相关疾病的产品中的应用；
（3）权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、权利要求6中1）所述的核酸分子、权利要求6中2）所述的重组表达载体、权利要求6中3）所述的改造的宿主细胞在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒相关疾病的药物中的应用；
（4）权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其功能片段、权利要求6中1）所述的核酸分子、权利要求6中2）所述的重组表达载体、权利要求6中3）所述的改造的宿主细胞在制备调节CD2V-N蛋白活性或水平的药物中的应用。
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