CN109593121A - 一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种I型牛疱疹病毒重组蛋白，涉及生物医药技术领域，一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法包括以下步骤:(1)查找I型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gD抗原；(2)优化I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；(3)构建针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；(4)重组优化的I型牛疱疹病毒gD抗原基因和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv的基因，并进行诱导表达；(5)纯化及复性I型牛疱疹病毒重组蛋白。本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种I型牛疱疹病毒重 组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(IBR)又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是 I型牛疱疹病毒(BHV-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。此病目 前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力均有较大影响。 1980年我国从新西兰进口奶牛中首次报道该病，并分离到一株牛传 染性鼻气管炎病毒，随后经血清学调查证实，我国广东、广西等省市 的黑白花乳牛、本地黄牛、水牛或牦牛均有IBR病毒存在。在一些交 通极不便利的地区，IBR病毒抗体阳性率极高。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发 出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。 因此,针对I型牛疱疹病毒抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂 的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低I型 牛疱疹病毒病蔓延的首要解决问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种I型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备 方法和应用。
本发明的技术方案:一种I型牛疱疹病毒重组蛋白，包括I型牛 疱疹病毒抗原和I型牛疱疹病毒单链抗体；
所述I型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gD抗原；
所述I型牛疱疹病毒单链抗体为scFv。
一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，包括以下步骤:
(1)查找I型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gD抗原；
(2)优化I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子，合成核酸序列 并进行表达；
(3)构建针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体，调取单链抗 体scFv的基因；
(4)重组优化的I型牛疱疹病毒gD抗原基因和针对I型牛疱疹 病毒gD抗原的单链抗体scFv的基因，并进行诱导表达；诱导之后, 将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体；
(5)纯化及复性I型牛疱疹病毒重组蛋白。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法中，所述步骤 (2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，所述步骤(2) 和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转 速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.5mM。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，所述步骤(2) 和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃或37℃。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法和应用中，所述 步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方中，所述步骤(5) 的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
前述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法中，所述步骤 (5)的纯化方式为亲和层析。
一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的应用，所述重组蛋白用于制备I 型牛疱疹病毒检测试剂盒。
与现有技术相比，(1)首次开发针对I型牛疱疹病毒主要抗原 gD的单链抗体scFv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单 链抗体,单链抗体具有以下优点:1)具有完整的抗原结合位点,不含抗 体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品 的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表 达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。
(2)国内外首次开发I型牛疱疹病毒主要抗原表位及针对gD 抗原的scFv重组蛋白。
由于感染I型牛疱疹病毒初期不产生抗体,致使在此段时间我们 检测不到相应的I型牛疱疹病毒抗体,从而导致漏检,为了解决此问 题必须在检测I型牛疱疹病毒抗体的同时增加对抗原的检测,开发针 对I型牛疱疹病毒gD抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合I型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高 灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的抗体开发出后, 利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(I型牛疱疹病毒gD抗 原的38-292aa)和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv (23-30aa)重组,制备成具有同时结合I型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优 点:1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种 原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产 工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生 产批间差；3)节省了开发I型牛疱疹病毒诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明 限制的依据。
实施例:一种I型牛疱疹病毒重组蛋白，包括I型牛疱疹病毒抗 原和I型牛疱疹病毒单链抗体；
所述I型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gD抗原；
所述I型牛疱疹病毒单链抗体为scFv。
其制备方法，包括如下步骤:
1.I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子优化及表达载体构建；
从NCBI查找gD抗原基因GenBank:AFB76672.1,其38-292aa蛋 白质序列如下:
PRYNYTERWHTTGPIPSPFADGREQPVEVRYATSAAACDMLALIADPQVGRTLW EAVRRHARAYNATVIWYKIESGCARPLYYMEYTECEPRKHFGYCRYRTPPFWDSFLAG FAYPTDDELGLIMAAPARLVEGQYRRALYIDGTVAYTDFMVSLPAGDCWFSKLGAARG YTFGACFPARDYEQKKVLRLTYLTQYYPQEAHKAIVDYWFMRHGGVVPPYFEESKGYE PPPAADGGSPAPPGDDEAREDEGETED
经过密码子优化后序列如下:
CCTCGTTATAATTACACCGAACGCTGGCATACCACCGGTCCGATTCCGAGCCCG TTTGCCGATGGCCGCGAACAGCCGGTGGAAGTTCGTTATGCAACCAGTGCAGCCGCCT GCGATATGCTGGCCCTGATTGCCGATCCGCAGGTGGGTCGCACCCTGTGGGAAGCAGT GCGTCGTCATGCACGCGCCTATAATGCAACCGTTATTTGGTATAAAATCGAAAGTGGC TGTGCACGCCCGCTGTATTATATGGAATATACCGAATGTGAACCGCGCAAACATTTTG GTTATTGCCGTTATCGTACCCCGCCGTTTTGGGATAGCTTTCTGGCAGGCTTTGCCTA TCCGACCGATGATGAACTGGGTCTGATTATGGCCGCACCGGCCCGTCTGGTGGAAGGC CAATATCGTCGCGCACTGTATATTGATGGCACCGTTGCATATACCGATTTTATGGTTA GTCTGCCGGCCGGCGATTGCTGGTTTAGTAAACTGGGTGCCGCACGTGGTTATACCTT TGGCGCATGCTTTCCGGCCCGTGATTATGAACAGAAAAAAGTGCTGCGCCTGACCTAT CTGACCCAGTATTATCCGCAGGAAGCCCATAAAGCAATTGTGGATTATTGGTTTATGC GCCATGGCGGCGTTGTTCCGCCGTATTTTGAAGAAAGCAAAGGCTATGAACCGCCGCC GGCAGCAGATGGTGGTAGTCCGGCACCGCCGGGTGACGATGAAGCCCGTGAAGATGAA GGTGAAACCGAAGAT
设计引物如下:
P1u:GCCCATATGCCTCGTTATAATTACACCGAACGCTGGCATACCACCGGTCC GATTCCG
P1d:ATAACGAACTTCCACCGGCTGTTCGCGGCCATCGGCAAACGGGCTCGGAA TCGGACCGGT
P2u:GTGGAAGTTCGTTATGCAACCAGTGCAGCCGCCTGCGATATGCTGGCCCT GATTGCCG
P2d:GACGACGCACTGCTTCCCACAGGGTGCGACCCACCTGCGGATCGGCAATC AGGGCCA
P3u:AAGCAGTGCGTCGTCATGCACGCGCCTATAATGCAACCGTTATTTGGTAT AAAATC
P3d:GGTATATTCCATATAATACAGCGGGCGTGCACAGCCACTTTCGATTTTAT ACCAAAT
P4u:TATATGGAATATACCGAATGTGAACCGCGCAAACATTTTGGTTATTGCCG TTATCGTAC
P4d:CGGATAGGCAAAGCCTGCCAGAAAGCTATCCCAAAACGGCGGGGTACGAT AACGGCAA
P5u:AGGCTTTGCCTATCCGACCGATGATGAACTGGGTCTGATTATGGCCGCAC CGGCC
P5d:GCCATCAATATACAGTGCGCGACGATATTGGCCTTCCACCAGACGGGCCG GTGCGGCCAT
P6u:ACTGTATATTGATGGCACCGTTGCATATACCGATTTTATGGTTAGTCTGC CGGCCGGCG
P6d:AAAGGTATAACCACGTGCGGCACCCAGTTTACTAAACCAGCAATCGCCGG CCGGCAGAC
P7u:TTTGGCGCATGCTTTCCGGCCCGTGATTATGAACAGAAAAAAGTGCTGCG CCTGACCTAT
P7d:CCACAATTGCTTTATGGGCTTCCTGCGGATAATACTGGGTCAGATAGGTC AGGCGCAG
P8u:ATAAAGCAATTGTGGATTATTGGTTTATGCGCCATGGCGGCGTTGTTCCG CCGTATT
P8d:CCATCTGCTGCCGGCGGCGGTTCATAGCCTTTGCTTTCTTCAAAATACGG CGGAACAA
P9u:GCCGGCAGCAGATGGTGGTAGTCCGGCACCGCCGGGTGACGATGAAGCCC GT
P9d:GCCCTCGAGATCTTCGGTTTCACCTTCATCTTCACGGGCTTCATCGTC
实验方法如下:
将引物P1u,P1d,P2u,P2d,P3u,P3d混合,进行PCR反应,所得产物 命名为W1；将引物P4u,P4d,P5u,P5d,P6u,P6d混合,进行PCR反应, 所得产物命名为W2(以上两个PCR反应的条件均为：94℃,2分钟X 1 个循环)；将引物P7u,P7d,P8u,P8d,P9u,P9d混合,进行PCR反应，其条件为：(98℃,15秒,55℃,30秒,68℃,30秒)X30个循环,所得产 物命名为W3；然后将上述三个产物W1,W2,W3混合做为模板,用引物 P1u,P9d进行PCR反应即得到优化后I型牛疱疹病毒的gD基因，条 件为：72℃,7分钟X 1个循环。测序证明序列正确后,将此PCR产物 用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后,插 入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3) 载体中。
2.构建针对I型牛疱疹病毒核心蛋白I型牛疱疹病毒gD抗原的 单链抗体；
(1)单克隆抗体(只针对结合gD抗原蛋白23-30aa的抗体)细胞 株的获得；
a.将构建成功的pET30a-gD载体转化至BL21表达菌种表达纯化 后获得gD抗原蛋白；
b.用获得的gD抗原蛋白免疫小鼠；
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合gD抗原蛋白23-30aa的 抗体细胞株。
(2)细胞RNA的提取
用TRIzol LS(invitrogen产品,货号10296-010)试剂,按照说明 书操作步骤提取细胞总RNA。
cDNA第一链的合成
取1μg RNA做逆转录模板,Oligo(d)T 1μl做逆转录引物,
加DEPC水至总体积12μl,混匀；
接着，
70℃变性5min,迅速冰浴冷却；
接着，
依次加入5×缓冲液4μl,RNase抑制剂1μl,dNTP(10mM each)
2μl,混匀，
37℃孵育5min；
接着，
加入AMV逆转录酶1μl,
37℃反转录60min；
接着，
70℃10min终止反应；
最后，
冰上冷却。
(3)以逆转录cDNA为模板,按照以下引物,用RT-PCR扩增重链 轻链基因。
mHVu1:GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2:CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
mHVu3:CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC
mHVu4:CAGGTTACTCTGAAAGAGTC
mHVu5:AAGGTCCAGCTGCAACAATC
mHVu6:GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC
mHVu7:CAGGTCCAACTGCAGCAGCC
mHVu8:GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
mHVu9:GAGGTGAAGCTGGTGGAATC
mHVu10:GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVd1:TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3:TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4:TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVu1:GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2:GATATTGTGATGACGCAGGCT
mKVu3:GATATTGTGATAACCCAG
mKVu4:GACATTGTGCTGACCCAATCT
mKVu5:GACATTGTGATGACCCAGTCT
mKVu6:GATATTGTGCTAACTCAGTCT
mKVu7:GATATCCAGATGACACAGACT
mKVu8:GACATCCAGCTGACTCAGTCT
mKVu9:CAAATTGTTCTCACCCAGTCT
mKVd1:CCGTTTCAGCTCCAGCTTG
mKVd2:CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT
mKVd3:CCGTTTTATTTCCAACTTTG
用引物mHVu1—mHVu10分别与mHVd1—mHVd4组合；mKVu1— mKVu9分别与mKVd1—mKVd4组合做PCR反应。
PCR反应体系25μl,其中cDNA 0.5μl,上游引物0.25μl下游引物 0.25μl,Taq酶0.2μl dNTP 2μl 10×buffer 2.5μl。
PCR(TOYOBO公司产品,货号：02510D1),PCR条件为：94℃,2 分钟X 1个循环；(98℃,5秒,55℃,30秒,68℃,25秒)X30个循环； 72℃,7分钟X 1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因,然后通过递归PCR将重链和 轻链基因连接起来,此重组基因为rscFv。
3.含有I型牛疱疹病毒gD抗原基因(38-292aa)和针对I型牛疱 疹病毒gD抗原的单链抗体基因(23-30aa)重组,并进行表达:
(1)通过递归PCR将有I型牛疱疹病毒gD抗原基因(38-292aa) 和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体基因(23-30aa)连接在一 起,用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后, 插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。
(2)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中, 涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司, 货号：KB0286)的LB平板上,37℃过夜培养,挑取单克隆菌落,用含有 相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达0.6 左右,用浓度为0.5mM的IPTG(生工,货号：IB0168)进行诱导表达, 诱导条件为：37℃,转速250rpm,5h。诱导之后,将培养液4℃5000rpm 离心20min收集菌体。
4.含有I型牛疱疹病毒重组蛋白的纯化及复性:
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mM Tris-HCl,0.5MUrea pH 7.5,0.5M NaCl,2％Triton X-100)重悬,然后超声破碎,条件为每次 超声3s,间隔6s,共180次,12000rpm,4℃离心收集包涵体沉淀。用上 样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris,8M Urea,0.5M Nacl,20mM咪 唑pH8.0)50ml破碎包涵体,上柱纯化,用洗脱缓冲液Elution Buffer (50mM Tris,8M Urea,0.5M Nacl,300mM咪唑pH8.0)洗脱目的蛋白。 将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mM氧化型谷胱甘肽GSSH,2mM 还原型谷胱甘肽GSH,2mMEDTA,20mM Tris,pH8.5)透析,每隔48h换 一次透析液。取出透析后的蛋白液,经据乙醇-20000进行浓缩,于 -20℃保存备用。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州亿米诺生物科技有限公司
<120> 一种I型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用
<130> 2
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 255
<212> PRT
<213> gD抗原基因GenBank：（AFB76672.1）的38-292aa蛋白质序列
<400> 1
Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly Pro Ile Pro
1 5 10 15
Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala
20 25 30
Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln
35 40 45
Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr
50 55 60
Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro
65 70 75 80
Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly
85 90 95
Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly
100 105 110
Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly
130 135 140
Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys
145 150 155 160
Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys
165 170 175
Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr
180 185 190
Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr
195 200 205
Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser
210 215 220
Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Pro Ala Pro
225 230 235 240
Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp
245 250 255
<210> 2
<211> 765
<212> PRT
<213> gD抗原基因GenBank：（AFB76672.1）的38-292aa蛋白质经过密码子优化后序列
<400> 2
Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Ala Cys
20 25 30
Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly
35 40 45
Ala Gly Cys Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly
50 55 60
Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Thr Gly Cys Ala
85 90 95
Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr
100 105 110
Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr
115 120 125
Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Thr Cys Gly
165 170 175
Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Cys Thr Ala Thr
180 185 190
Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr
195 200 205
Gly Gly Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Gly
210 215 220
Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly
225 230 235 240
Cys Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr
245 250 255
Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys
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Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr
275 280 285
Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Gly Thr Ala
290 295 300
Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala
305 310 315 320
Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys
325 330 335
Thr Thr Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly
340 345 350
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr
355 360 365
Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly
370 375 380
Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly
385 390 395 400
Gly Cys Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys
405 410 415
Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys
420 425 430
Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Gly
435 440 445
Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Cys Thr
450 455 460
Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Cys
465 470 475 480
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly
485 490 495
Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala
500 505 510
Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Thr Gly Cys
515 520 525
Thr Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr
530 535 540
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr
545 550 555 560
Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr
565 570 575
Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys
580 585 590
Cys Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Ala Ala
595 600 605
Ala Gly Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr
610 615 620
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly
625 630 635 640
Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys
645 650 655
Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys
660 665 670
Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys
675 680 685
Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
690 695 700
Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly
705 710 715 720
Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly
725 730 735
Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly
740 745 750
Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr
755 760 765
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P1u）
<400> 3
gcccatatgc ctcgttataa ttacaccgaa cgctggcata ccaccggtcc gattccg 57
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P1d）
<400> 4
ataacgaact tccaccggct gttcgcggcc atcggcaaac gggctcggaa tcggaccggt 60
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P2u）
<400> 5
gtggaagttc gttatgcaac cagtgcagcc gcctgcgata tgctggccct gattgccg 58
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P2d）
<400> 6
gacgacgcac tgcttcccac agggtgcgac ccacctgcgg atcggcaatc agggcca 57
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 设计引物（P3u）
<400> 7
aagcagtgcg tcgtcatgca cgcgcctata atgcaaccgt tatttggtat aaaatc 56
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P3d）
<400> 8
ggtatattcc atataataca gcgggcgtgc acagccactt tcgattttat accaaat 57
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P4u）
<400> 9
tatatggaat ataccgaatg tgaaccgcgc aaacattttg gttattgccg ttatcgtac 59
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P4d）
<400> 10
cggataggca aagcctgcca gaaagctatc ccaaaacggc ggggtacgat aacggcaa 58
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 设计引物（P5u）
<400> 11
aggctttgcc tatccgaccg atgatgaact gggtctgatt atggccgcac cggcc 55
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P5d）
<400> 12
gccatcaata tacagtgcgc gacgatattg gccttccacc agacgggccg gtgcggccat 60
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P6u）
<400> 13
actgtatatt gatggcaccg ttgcatatac cgattttatg gttagtctgc cggccggcg 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P6d）
<400> 14
aaaggtataa ccacgtgcgg cacccagttt actaaaccag caatcgccgg ccggcagac 59
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P7u）
<400> 15
tttggcgcat gctttccggc ccgtgattat gaacagaaaa aagtgctgcg cctgacctat 60
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P7d）
<400> 16
ccacaattgc tttatgggct tcctgcggat aatactgggt cagataggtc aggcgcag 58
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P8u）
<400> 17
ataaagcaat tgtggattat tggtttatgc gccatggcgg cgttgttccg ccgtatt 57
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P8d）
<400> 18
ccatctgctg ccggcggcgg ttcatagcct ttgctttctt caaaatacgg cggaacaa 58
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 设计引物（P9u）
<400> 19
gccggcagca gatggtggta gtccggcacc gccgggtgac gatgaagccc gt 52
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 设计引物（P9d）
<400> 20
gccctcgaga tcttcggttt caccttcatc ttcacgggct tcatcgtc 48
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu1）
<400> 21
gatgtgaagc ttcaggagtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu2）
<400> 22
caggtgcagc tgaaggagtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu3）
<400> 23
caggtgcagc tgaagcagtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu4）
<400> 24
caggttactc tgaaagagtc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu5）
<400> 25
aaggtccagc tgcaacaatc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu6）
<400> 26
gaggtccagc tgcagcagtc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu7）
<400> 27
caggtccaac tgcagcagcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu8）
<400> 28
gaggtgaagc tggtggagtc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu9）
<400> 29
gaggtgaagc tggtggaatc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu10）
<400> 30
gatgtgaact tggaagtgtc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd1）
<400> 31
tgcagagaca gtgaccagag t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd2）
<400> 32
tgaggagact gtgagagtgg t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd3）
<400> 33
tgaggagacg gtgactgagg t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物(9mHVd4)
<400> 34
tgaggagacg gtgaccgtgg t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu1）
<400> 35
gatgttttga tgacccaaac t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu2）
<400> 36
gatattgtga tgacgcaggc t 21
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu3）
<400> 37
gatattgtga taacccag 18
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu4）
<400> 38
gacattgtgc tgacccaatc t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu5）
<400> 39
gacattgtga tgacccagtc t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu6）
<400> 40
gatattgtgc taactcagtc t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu7）
<400> 41
gatatccaga tgacacagac t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu8）
<400> 42
gacatccagc tgactcagtc t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu9）
<400> 43
caaattgttc tcacccagtc t 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd1）
<400> 44
ccgtttcagc tccagcttg 19
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd2）
<400> 45
ccgttttatt tccagcttgg t 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd3）
<400> 46
ccgttttatt tccaactttg 20
Claims (9)
1.一种I型牛疱疹病毒重组蛋白，其特征在于:包括I型牛疱疹病毒抗原和I型牛疱疹病毒单链抗体；
所述I型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gD抗原；
所述I型牛疱疹病毒单链抗体为scFv。
2.一种基于权利要求1所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)查找I型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gD抗原；
(2)优化I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的I型牛疱疹病毒gD抗原基因和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv的基因，并进行诱导表达；诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体；
(5)纯化及复性I型牛疱疹病毒重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
4.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.5mM。
5.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃或37℃。
6.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃。
7.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
8.根据权利要求2所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法，其特征在于:所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
9.一种基于权利要求1所述的一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的应用，其特征在于:所述重组蛋白用于制备I型牛疱疹病毒检测试剂盒。
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