CN108977413A - 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒 - Google Patents

一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒 Download PDF

Info

Publication number
CN108977413A
CN108977413A CN201710415514.7A CN201710415514A CN108977413A CN 108977413 A CN108977413 A CN 108977413A CN 201710415514 A CN201710415514 A CN 201710415514A CN 108977413 A CN108977413 A CN 108977413A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
arg
gly
gene
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710415514.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108977413B (zh
Inventor
郭爱珍
刘瑞宁
邓明亮
李汉雄
陈颖钰
胡长敏
陈焕春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201710415514.7A priority Critical patent/CN108977413B/zh
Publication of CN108977413A publication Critical patent/CN108977413A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108977413B publication Critical patent/CN108977413B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明属于动物病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒。将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性gD基因胞外区插入到牛传染性鼻气管炎△gG/△TK双基因缺失毒株的TK基因位置，表达出双拷贝gD基因。该重组病毒的增殖没有改变，但其免疫原性得到提高。重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201552，本发明还公开了重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+在制备牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗中的应用。

Description

一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
技术领域
本发明属于动物病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒。本发明将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性最好的gD蛋白基因胞外区插入到牛传染性鼻气管炎△gG/△TK双基因缺失疫苗毒株的TK基因位置，表达出双拷贝gD基因。该重组病毒的增殖没有改变，但其免疫原性得到提高。本发明还包括利用该重组病毒制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗及其应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)又称“红鼻病”，“坏死性鼻炎”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis，IBRV)或称牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus 1，BoHV‐1)感染牛引起的一种急性、热性、接触性传染病，主要临床特征为上呼吸道及气管炎、黏膜炎、高热、流鼻汁、呼吸困难等，是引起牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的病原之一，给世界养牛业造成了巨大损失(Jones and Chowdhury,2007)。此外，IBRV感染机体后可潜伏感染于三叉神经节，当机体受到应激因素刺激时病毒被激活增殖，导致扩散和传播并致病，给该病的控制和消灭带来了极大困难(Nuotio et al.,2007)。目前只有少数欧洲国家已经根除了本病，其他一些国家正在实施扑灭计划，或使用标记疫苗区分自然感染和疫苗接种的牛群，以便于更好的进行监控和防制。此外，IBRV可作为活病毒载体表达其他重要病原的免疫原性基因研制重组多价疫苗，达到“一针防多病”的目的。
IBRV病毒有囊膜，球形，病毒粒子由核酸芯髓、衣壳和囊膜组成，核衣壳内含有双链DNA。病毒粒子的直径约120‐200nm。衣壳为正二十面体立体对称，外观呈六角形，有162个壳粒，其中包括150个六聚体和12个五聚体，壳粒互相连接呈放射状排列且有中空轴孔。IBRV的基因组约135kb，G+C含量为72％。IBRV的基因组结构中，两个反向重复序列(IRS和TRS，各为11kb)位于短独特区(US，13kb)的两侧，序列相同方向相反，因而短区能够反转方向，使病毒DNA具有两种异构体(Mittal and Field,1989)。IBRV基因组有73个编码框(Openreading frame，ORF)，编码73个蛋白质。按病毒在体外细胞培养增殖的重要性分类，属于复制增殖必需的蛋白有33个，包括糖蛋白gB、gD、gH、gL和gK等；非必需蛋白有36个，包括糖蛋白(gC、gE、gI、gG、gM)、胸苷激酶蛋白(TK)、脱氧尿苷三磷酸酶蛋白、包膜蛋白(UL49、US9)、膜蛋白(UL49.5)和调节蛋白(US3、bICP0、bICP22、Circ)等(Robinson et al.,2008)；按是否为病毒结构组分进行分类，可分为结构蛋白和非结构蛋白，结构蛋白有33个，其中13个为包膜蛋白，约10个为糖蛋白(Schwyzer and Ackermann,1996)。这10个糖蛋白中，6个位于UL区，为gK(UL53)、gC(UL44)、gB(UL27)、gH(UL22)、gM(UL10)和gL(UL1)，而另外4个糖蛋白位于US区，为gG(US4)、gD(US6)、gI(US7)和gE(US8)(Muylkens et al.，2007)。
gD基因是由US6基因编码，gD蛋白通过与细胞表面的连接蛋白受体结合，参与病毒感染早期的吸附过程，为必需蛋白。病毒在细胞之间扩散也需要gD的参与，因为gD缺失后病毒失去向周围细胞扩散的能力。尽管gD对于病毒侵入细胞过程是必需的，但当gH的450位氨基酸突变时，gD的这个功能得到补偿(Alves Dummer et al.,2014)。针对gD基因3’端氨基酸序列和核酸构建进化树，可区分IBRV(呼吸道型和生殖道型)和BoHV‐5(神经型)(Traeselet al.,2014)。gD是IBRV免疫原性最好的糖蛋白，能诱导体液免疫和细胞免疫应答，因此是制备亚单位疫苗的首选蛋白(Brownlie et al.,2015；Kumar et al.,2014；Ferrer etal.,2011；Khattar et al.,2010)。近年来，很多学者用病毒或细菌作为载体表达gD基因，如牛痘病毒(Ferrer et al.,2011)、腺病毒(Brownlie et al.,2015；Kumar et al.,2014)、HSV(Blanc et al.,2012)、沙门氏菌(Gnazzo et al.,2012)、新城疫病毒(Khattaret al.,2010)、BoHV‐4(Donofrio et al.,2008；Donofrio et al.,2006)、杆状病毒(Peralta et al.,2007)、烟草花叶病病毒(Perez Filgueira et al.,2003)等，都能诱导高水平的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，以及提供良好的保护力。此外，由于gD具有良好的免疫原性，也被用来制备各种DNA疫苗(Caselli et al.,2005；Castrucci et al.,2004；Alves Dummer et al.,2014)，能提供高于gC的保护力(Toussaint et al.,2005a)；IBRV gD的DNA疫苗还可作为IBRV灭活疫苗的增强剂，诱导高水平的Th2型免疫反应(Toussaint et al.,2005b)。
gG基因是由US4基因编码，在α‐疱疹病毒中高度保守，是病毒复制非必需的分泌型蛋白，gG经O和N糖基化后形成可形成两种形式的蛋白，为70kD的蜂窝状蛋白或65kD的分泌蛋白(Keil et al.,1996)。gG与病毒在细胞中间的扩散有关，当缺失gG时，病毒空斑变小，病毒生长受到抑制(Nakamichi et al.,2000)。这可能由于gG与gE在细胞结合的侧缘定位有关，因为gG缺失后影响gE或gE‐gI复合物的形成，最终影响病毒在细胞之间的传递(Nakamichi et al.,2002)。此外，gG在病毒感染过程中对维持细胞与细胞的结合与粘连有关(Nakamichi et al.,2002)。gG可通过阻止趋化因子与特异性受体的结合或高亲和力的直接与趋化因子结合(Bryant et al.,2003)，导致病毒感染机体后造成免疫抑制(Nandiet al.,2009)。gG蛋白具有很强的抗原性，已被广泛用于诊断抗原(Yan et al.,2008)。gG缺失后，在牛体上的毒力下降，而且具有良好的免疫原性(Zhang et al.,2011；Belknap etal.,1999；Kaashoek et al.,1998；Denis et al.,1996)。由于gG具有以上特性—病毒复制非必需、与毒力和免疫抑制有关以及可作为诊断抗原，因此本研究小组研制了新型基因缺失疫苗：IBRV△gG/△TK基因缺失疫苗(Zhang et al.,2011)。
TK基因是由UL23基因编码，在疱疹病毒科病毒均编码胸腺激酶，该酶在核酸代谢中期重要作用，但对病毒复制非必需(Liu and Manning,1986；Bello et al.,1987；Mittaland Field,1989)。TK是α‐疱疹病毒的毒力基因，对病毒的持续感染具有重要作用，TK缺失后毒力降低(Kit et al.,1985)，因此成为基因缺失疫苗研究的首选靶基因。
国外广泛使用的商品化基因缺失疫苗有gE缺失标记疫苗与gE/TK双基因缺失疫苗(Kaashoek et al.,1996)，我国尚无自主研发的商品化疫苗用于IBR防控，因此本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室前期成功研制了IBRV△gG/△TK双基因缺失疫苗，研究证实了该疫苗具有较好的安全性与保护力(Zhang et al.,2011)。本发明将gD基因胞外区插入IBRV△gG/△TK毒株的TK基因位置，获得了表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒，并对其同源gD基因的表达、生物学特性与免疫原性等进行了评价，证实重组病毒具有更好的免疫保护作用。经文献检索，目前没有同类重组病毒的报道。
发明内容
本发明的目的在于获得一种免疫原性更好、诱导机体免疫反应水平更高与保护持续期更长的牛传染性鼻气管炎重组病毒，为高效安全的基因工程弱毒疫苗研发提供侯选疫苗毒株。
本发明的主要技术路线包括：将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性最好的gD蛋白基因胞外区插入到IBRV△gG/△TK双基因缺失疫苗毒株的TK基因位置，表达出双拷贝gD基因。该重组病毒的增殖没有明显改变，但其免疫原性得到提高。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人所在的农业微生物学国家重点实验室前期构建了双基因缺失的一种重组牛传染性鼻气管炎基因工程毒株，该病毒被命名为重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK，于2009年10月23日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：V200915。该毒株已经记载在发明专利授权文献中(专利号ZL2009102733576，本申请不需要另外提供生物保藏证明)。
本发明是基于已构建的保藏编号为CCTCC NO：V200915的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK的基础上，将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性最好的gD蛋白基因胞外区插入该疫苗毒株的TK基因位置上，最终获得表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
首先构建含gD基因胞外区表达盒的重组质粒pcDNA3.1‐TK‐gD，该重组质粒的gD表达盒基因(gD表达盒基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)两侧为TK基因的上、下游同源臂基因(其中：上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)。将重组质粒pcDNA3.1‐TK‐gD和IBRV△gG/△TK/EGFP+基因组共转染于MDBK(牛肾细胞系)细胞，以报告基因为标识基因，通过反向挑取没有绿色荧光的空斑，经过5轮空斑纯化后再利用PCR、间接免疫荧光和Western blot方法对同源gD基因的插入和表达进行验证，将获得的重组病毒命名为重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，于2015年12月11日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201552。本发明对该毒株的生物学特性和兔体免疫原性进行了验证，证明该重组病毒的增殖没有改变，但其免疫原性得到提高。
本发明的主要优点是：
1.本发明通过同源重组的方法将同源gD基因胞外区插入IBRV△gG/△TK的TK基因位置，首次构建了含有表达双拷贝免疫原性最好的gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+毒株。
2.该重组病毒在兔体内的免疫原性进一步提高，诱导体液免疫和细胞免疫的能力更强，可作为安全有效的IBR基因缺失标记疫苗新一代产品，为IBR的预防、净化提供了技术支撑。
更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是gD基因胞外区表达盒基因核苷酸序列，其包括CMV启动子、gD胞外区基因、WPRE转录后调控元件和BGH polyA，序列的总长度为2897bp，其中1‐911位是启动子CMV的核苷酸序列(1‐911bp)。
序列表SEQ ID NO：2是TK基因的上游同源臂的核苷酸序列(1‐1128bp)和编码区序列，编码376个氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6是TK基因的上游同源臂的核苷酸序列编码的蛋白质序列，累计编码376个蛋白质序列。
序列表SEQ ID NO：7是TK基因的下游同源臂的核苷酸序列(1-840bp)和编码区序列，编码280个氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：13是gD基因胞外区的核苷酸序列(1077bp)。
图1：是本发明的基本流程示意图。
图2：是pcDNA3.1‐WPRE的质粒图谱
图3：是gD基因胞外区真核表达质粒pcDNA3.1‐gD‐WPRE的构建与鉴定图。附图标记说明：图3中的泳道说明：M1:DL 15kb marker；泳道M2:DL 2000marker；Lane 1:pcDNA3.1‐gD‐WPRE；Lane 2:pcDNA3.1–WPRE；泳道 3:pcDNA3.1。
图4：是pcDNA3.1‐gD‐WPRE真核表达质粒转染293T细胞的表达检测结果。附图标记说明：图4中为不同表达原件启动下的gD基因在293T细胞表达水平的比较。
图5：是重组转移质粒pcDNA3.1‐TK‐gD‐WPRE的构建流程图。
图6：gD基因胞外区表达盒PCR扩增结果。图6中的标记说明：泳道M:DL15000 DNAMarker；Lane 1，泳
道2:gD基因胞外区表达盒，为2897bp。
图7：本发明的重组转移质粒pcDNA3.1‐TK‐gD‐WPRE酶切鉴定图。附图标记说明：
在图7中Lane M:DL15000marker；Lane 1:用BglⅡ单酶切，结果可见一条带，大小为10295bp。Lane 2,5：pcDNA3.1‐TK；Lane 3,6:pcDNA3.1；Lane 4:pcDNA3.1‐TK‐gD5。
图8：本发明构建时共转染后荧光显微镜下观察结果和重组病毒空斑的筛选图。附图标记说明：图8中的A图中1为：病毒基因组和转移质粒pAZ1005共转染后空斑筛选时荧光显微镜自然光观察结果；2为荧光显微镜绿色荧光观察结果；3为自然光和绿色荧光叠加观察结果。
图9：本发明IBRV△gG/△TK/gD+鉴定PCR引物设计策略图。
图10：本发明IBRV△gG/△TK/gD+鉴定PCR扩增结果图。图10中泳道说明：M1:DL15k marker；泳道M2:DL 2000marker；泳道 1,6:IBRV△gG/△TK/gD+；Lane 3,8:IBRV△gG/△TK/EGFP+；泳道4,9:wt IBRV；Lane 5,10:negative control。
图11：本发明IBRV△gG/△TK/gD+间接免疫荧光鉴定图。附图标记说明：图中：1为:IBRV△gG/△TK/gD+重组病毒感染MDBK细胞48h后，荧光显微镜红色荧光观察结果；2为：荧光显微镜自然光观察结果。
图12：本发明中IBRV△gG/△TK/gD+western blot鉴定图。
图13：本发明IBRV△gG/△TK/gD+空斑直径大小比较图。附图标记说明：横坐标代表感染的不同的，纵坐标表示感染后形成空斑的直径(单位：μm)。
图14：本发明IBRV△gG/△TK/gD+一步生长曲线测定图。
图15：本发明IBRV△gG/△TK/gD+兔体接种后的中和抗体检测图。附图标记说明：图15中结果分别为接种28天后wt BoHV‐1攻毒21天后和接种28天后wt BoHV‐5攻毒21天后的中和抗体水平。
图16：本发明IBRV△gG/△TK/gD+兔体接种后的BoHV总抗体检测图。附图标记说明：图16中结果分别为接种28天后wt BoHV‐1攻毒21天后的BoHV‐1总抗体水平和接种28天后wt BoHV‐5攻毒21天后的BoHV‐5总抗体水平。
图17：本发明IBRV△gG/△TK/gD+兔体接种后的外周血单核细胞增殖水平的检测图。附图标记说明：图中分别为接种28天后wt BoHV‐1攻毒21天后和接种28天后wt BoHV‐5攻毒21天后的外周血单核细胞增殖水平。
图18：序列表SEQ ID NO：1所示的gD基因胞外区表达盒核苷酸序列，该全序列包括CMV启动子、gD胞外区基因、WPRE转录后调控元件、BGH polyA，该序列的总长度为2897bp。其中，在该全序列中的1‐911位，即图18中带有底纹的序列是启动子CMV(1‐911bp)。在全序列的912—2043位是gD胞外区基因(1132bp)，全序列的912‐917位，即黑色字体为BamHⅠ序列(6bp)；全序列的918‐924位，即小方框所示的序列是kozak序列(7bp)；全序列的925‐927位，即下划线斜体字所示的序列为起始密码子(3bp)；全序列的928‐2004位，即黑色字体为gD胞外区基因的编码区(1077bp)；在全序列的2005‐2031位，即下划线部分是HA标签序列(27bp)；在全序列的2032‐2037位，即粗体所示的序列是终止密码子(6bp)；在全序列的2038‐2043位，即下划线底纹部分所示的序列是EcoRⅠ(6bp)。在全序列的2044—2641位是WPRE转录后调控元件(598bp)；在全序列的2636‐2641位即粗斜体是XbaⅠ(6bp)。在全序列的2642‐2897位，即大方框表示的序列是BGH polyA序列(256bp)。
图19：序列表SEQ ID NO：2是TK基因上游同源臂的核苷酸序列(1‐1128bp)和编码区。其中1‐6位即粗斜体字所示的序列是HindⅢ(6bp)，7‐1122位即黑色字体为TK上游同源臂的编码区(该片段长度为1116bp)，该序列1123‐1128位即下划线粗体字所示的序列是KpnⅠ(6bp)。
图20：序列表SEQ ID NO：3是TK基因下游同源臂的核苷酸序列(1‐840bp)，其中1‐6位即粗斜体字部分是EcoRⅠ(6bp)，7‐834位即黑色字体部分是TK下游同源臂的编码区(该片段长度为828bp)，其中835‐840位即下划线部分是XbaⅠ(6bp)。
具体实施方式
实施例1重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+的构建和鉴定
1.引物设计
根据参考文献(Khattar et al.,2010；Peralta et al.,2007)及IBRV全基因组序列(GenBank登录号：AJ004801)，设计引物PCR扩增gD基因的胞外区(1‐360aa，118896‐119975nt)，酶切位点为BamHⅠ、EcoRⅠ，片段大小约为1100bp。引物序列如下：
P1:5’‐CG CGCCACCATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTGCTGGGCGCGCTGCTCGCCGTTGCG‐3’(粗体为BamHⅠ，下划线为kozak序列，斜体为起始密码子),
P2:5‐CG TCATTA GGCGTCGGGGGCCGCGGGC GTA‐3’(粗体为EcoRⅠ，下划线为终止密码子，粗斜体为HA标签序列)。
根据IBRV全基因组序列(GenBank登录号：AJ004801)设计引物PCR扩增TK基因上游、下游同源臂基因，大小分别为1130bp、841bp。
上游同源臂引物序列为
P3:5’‐GGCGCTATGCTCGTCCG‐3’(粗体字为HindⅢ)，
P4:5’‐CAGCGTCCGTACCAAACATC‐3’(粗体字为KpnⅠ)；
下游同源臂引物序列为
P5:5’‐GCTACCCGGGCGGCG‐3’(粗体字为EcoRⅠ)，
P6:5’‐GGCGGCGACCAGGTCGTAGTC‐3’(粗体字为XbaⅠ)。
根据pcDNA3.1(+)载体序列设计引物扩增gD胞外区表达盒基因，引物序列为：
P7:5’‐gtttggtacggacgcggtaccCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCA‐3’，
P8:5’‐cccgccgcccgggtagaattcCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC‐3’。
以下引物为鉴定缺失基因的特异引物：
P9:5’‐CCGACCGCCTCCTACACCAGATGCT‐3’(鉴定gG基因用)，
P10:5’‐GGGTGTAGGCAAGCTCACCGCAACG‐3’(鉴定gG基因用)，
P11:5’‐ACGGGCTGGGAAAGACAACAACGG‐3’(鉴定TK基因用)，
P12:5’‐GCGGACACGTCCAGCACGAACA‐3’(鉴定TK基因用)。
2.pcDNA3.1‐gD质粒的构建
以IBRV病毒基因组为模板，P1/P2引物扩增IBRV gD基因胞外区(gD)，PCR产物包括BamHⅠ、kozak序列、起始密码子、HA标签序列、终止密码子和EcoRⅠ。PCR反应体系为：模板1.0μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，上下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，补ddH2O至50μL。按以下反应循环参数进行反应：预变性95℃4min；94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，10个循环；94℃30sec，64℃30sec，72℃1min，25个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收。通过BamHⅠ和EcoRⅠ将gD基因克隆至pcDNA3.1‐WPRE载体(质粒图谱见图2)上，构建得到含有HA标签的质粒pcDNA3.1‐gD‐WPRE(构建策略见图3)。
3.真核表达质粒pcDNA3.1‐gD‐WPRE转染293T细胞的表达检测
转染的前一天，将293T细胞(购自中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心)传代，铺在六孔板中，细胞量以第二日转染时能长满每孔的80％为宜。配制A液：取250μL的无血清OPTi‐MEM+4μL的脂质体，混匀后静置10min。配制B液：取250μL无血清OPTi‐MEM+4μg质粒pcDNA3.1‐gD‐WPRE。将B液缓缓滴加到A液里，边加边用手指轻弹管壁，使两者混合均匀，在室温下孵育20min。与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基(购自美国犹他州洛根市的HyClone公司)冲洗细胞两遍后，加入2mL无血清培养基。将混合液逐滴加入6孔板中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，5％CO2中保温。6h后，更换细胞维持液培养基。在不同时间点取上清50μL以及转染后48h提取细胞总蛋白，进行western blot检测基因的表达(见图4)。
4.pcDNA3.1‐TK‐gD‐WPRE质粒的构建
以IBRV病毒基因组为模板，使用引物P3/P4、P5/P6分别扩增TK基因上游、下游同源臂基因。上游、下游同源臂基因PCR反应体系均为：模板IBRV基因组1.0μL，2×GC buffer II25μL，10mmol/L dNTP(2.5mmol/L)4μL，引物(10μmol/μL)各0.5μL，LA Taq 0.5μL，补ddH2O至50μL。按以下反应循环参数进行反应：预变性95℃5min；94℃1min，60℃45sec，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收。将TK基因上游、下游同源臂基因先后克隆至pcDNA3.1(+)载体上，构建pcDNA3.1‐TK同源臂载体。以pcDNA3.1‐gD‐WPRE质粒为模板，使用引物P7/P8扩增gD表达盒基因。PCR反应体系为：模板1.0μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，上下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，补ddH2O至50μL。按以下反应循环参数进行反应：预变性95℃4min；94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，10个循环；94℃30sec，64℃30sec，72℃1min，25个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收(见图6)。使用KpnⅠ和EcoRⅠ线性化pcDNA3.1‐TK同源臂载体，琼脂糖凝胶电泳回收。使用一步法无缝克隆试剂盒将gD表达盒基因克隆至pcDNA3.1‐TK同源臂载体上，连接体系：5×CEⅡBuffer 4μL，线性化pcDNA3.1‐TK同源臂载体200ng，gD表达盒基因PCR产物200ng，ExnaseⅡ2μL，补ddH2O至20μL。置37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管至冰中冷却5min，之后，反应产物直接进行转化DH5α菌。挑取单克隆菌落进行鉴定，经验证正确后命名为pcDNA3.1‐TK‐gD‐WPRE(见图7)。5.重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+的构建与鉴定
在MDBK细胞(购自中国兽药监察所)上增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/EGFP+，提取其基因组DNA，具体如下：待MDBK细胞病变达80％以上，收集病毒，用蔗糖梯度离心，106812g，处理2h。用TE溶解，加十二烷基磺酸钠(SDS)裂解液裂解及用RNA酶水浴30min，再加蛋白酶K水浴作用30min；然后用苯酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)抽提四次，用无水乙醚去除苯酚、氯仿和异戊醇，最后用无水乙醇将病毒基因组沉淀出来。
将制备好的病毒基因组与线性化的pcDNA3.1‐TK‐gD‐WPRE质粒(BglⅡ酶切线性化)共转染于MDBK细胞，挑取不发绿色荧光的空斑并将其纯化(见图8)。用鉴定引物p9/p10、p11/p12(引物设计策略见图9)进行PCR扩增，其片段大小分别为524bp、2935bp(见图10)。以0.1MOI IBRV△gG/△TK/gD+重组病毒感染MDBK细胞48h后，使用间接免疫荧光试验方法检测基因的表达，一抗为鼠源HA抗体(购自上海碧云天生物技术公司)，二抗为Cy3标记山羊抗鼠IgG(购自上海碧云天生物技术公司)。结果显示IBRV△gG/△TK/gD+重组毒感染的细胞有特异性红色荧光，而亲本病毒和空白细胞未检测到红色荧光(见图11)。为了进一步验证gD基因在重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+中得到表达，以5MOI病毒感染MDBK细胞24h后，提取细胞总蛋白进行western blot检测，一抗为鼠源HA抗体，二抗为HRP标记山羊抗鼠IgG。结果显示重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+有一条约55kD的特异性带，而亲本病毒和空白细胞未检测到(见图12)。
实施例2重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+的生物学特性研究
将本发明与本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室分离的牛传染性鼻气管炎病毒IBRV HB06(于2010年10月29日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：V201024)与重组牛传染性鼻气管炎病毒，IBRV△gG/△TK(于2010年10月23日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：V200915)进行空斑大小与一步法生长曲线比较。
空斑的比较：将病毒液连续10倍稀释，取适当稀释度(一般为10‐5‐10‐6)的病毒液500μL/孔接于6孔板中长满的单层MDBK细胞上，吸附2h，弃掉没有吸附病毒，覆盖2％低熔点琼脂糖(含2％新生牛血清)，48h后，各孔补满10％中性甲醛(4h以上即可)，弃孔中液体，侧板冲洗数次，各孔加结晶紫(0.35％、w/v)，染色10‐15min，弃染液，侧板冲洗数次，温箱敞口烘干，显微镜下观察。荧光显微镜下随即选取30个及以上数目的单个的空斑进行测量，空斑测量3次，以最大值为准。
一步法生长曲线：传代MDBK细胞至T25的细胞瓶中，以第二日试验时细胞铺满瓶底80％‐90％为宜。用5MOI的病毒分别来感染MDBK细胞，在4℃温箱中感作1h后，将没有吸附的病毒液弃去，用Hank’s溶液洗一遍，之后补加5mL培养基放于37℃细胞培养箱中，分别在0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h和56h收获细胞培养物至‐80℃冰箱中，反复冻融两次后，按照以下方法进行病毒毒价的测定，最终绘制生长曲线：
将病毒用含1％新生牛血清的DMEM做10倍递增稀释，取10‐3，10‐4，10‐5，10‐6和10‐75个稀释度，接种24孔板MDBK细胞(细胞为试验前一天预接种，试验时以长满每孔的90％为宜，并用无血清培养基洗两遍后加入各稀释度的病毒)，每个稀释度接种3个孔，每孔0.2mL，置37℃5％CO2培养箱中感作，2h后将病毒液吸弃，每孔加入1mL琼脂糖覆盖液(2倍含1％血清和2％双抗无酚红DMEM：2％琼脂糖＝1:1)覆盖。室温静置15min，待培养基凝固后，放入37℃温箱中培养，48h后，用10％的中性甲醛固定24h，用水冲洗细胞板孔，除去琼脂糖。用结晶紫(0.35％、w/v)对细胞进行染色，20min后，用水冲洗掉结晶紫，在烘箱内烘干后计算空斑数量，按照公式计算病毒毒价(Plaque Forming Unit，PFU)。病毒毒价计算公式为：每毫升病毒含量＝同一稀释度三次重复的空斑数平均数×稀释倍数×5
结果表明IBRV△gG/△TK/gD+形成空斑的大小与直径与亲本病毒IBRV△gG/△TK无明显差异(p>0.05)(见图13)。IBRV△gG/△TK/gD+的生长曲线与亲本毒株IBRV△gG/△TK相似(见图14)。
实施例3重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+在兔体内免疫原性的研究
重组病毒IBRV△gG/△TK/gD+在兔体内免疫原性研究的试验设计如表1，其中接种和攻毒均采用鼻腔接种。接种后，定期测量体温、采集鼻拭子和血液分离血清。将采集血液分离的血清进行中和抗体的检测，结果表明：在接种和攻毒后，双拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK/gD+)的BoHV中和抗体水平显著高于单拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK)(p<0.001)(见图15)。将血清进行BoHV总抗体的检测，结果表明：在接种和wt BoHV‐5攻毒后，双拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK/gD+)的BoHV‐5总抗体水平显著高于单拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK)(p<0.001)(见图16)。
表1兔体内免疫原性研究的试验设计
将采集的全血进行外周血单核细胞分离，外周血单核细胞用灭活wt BoHV‐1病毒粒子刺激，并使用XTT细胞增殖检测试剂盒对外周血单核细胞的增殖情况，结果表明：在接种和攻毒后，双拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK/gD+)的外周血单核细胞增殖水平较单拷贝gD接种组(IBRV△gG/△TK)均显著提高(p<0.001)，见图17。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
<130>
<141> 2017-06-05
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2897
<212> DNA
<213> 牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2897)
<223>
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(911)
<223>
<400> 1
cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 60
tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct 120
acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt 180
gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat 240
taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 300
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 360
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 420
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 480
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 540
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 600
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 660
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 720
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 780
gaggtctata taagcagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc 840
gaaattaata cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cttaagcttg 900
gtaccgagct cggatcccgc caccatgcaa gggccgacat tggccgtgct gggcgcgctg 960
ctcgccgttg cggtgagctt gcctacaccc gcgccgcggg tgacggtata cgtcgacccg 1020
ccggcgtacc cgatgccgcg atacaactac actgaacgct ggcacactac cgggcccata 1080
ccgtcgccct tcgcagacgg ccgcgagcag cccgtcgagg tgcgctacgc gacgagcgcg 1140
gcggcgtgcg acatgctggc gctgatcgca gacccgcagg tggggcgcac gctgtgggaa 1200
gcggtacgcc ggcacgcgcg cgcgtacaac gccacggtca tatggtacaa gatcgagagc 1260
gggtgcgccc ggccgctgta ctacatggag tacaccgagt gcgagcccag gaagcacttt 1320
gggtactgcc gctaccgcac acccccgttt tgggacagct tcctggcggg cttcgcctac 1380
cccacggacg acgagctggg actgattatg gcggcgcccg cgcggctcgt cgagggccag 1440
taccgacgcg cgctgtacat cgacggcacg gtcgcctata cagatttcat ggtttcgctg 1500
ccggccgggg actgctggtt ctcgaaactc ggcgcggctc gcgggtacac ctttggcgcg 1560
tgcttcccgg cccgggatta cgagcaaaag aaggttctgc gcctgacgta tctcacgcag 1620
tactacccgc aggaggcaca caaggccata gtcgactact ggttcatgcg ccacgggggc 1680
gtcgttccgc cgtattttga ggagtcgaag ggctacgagc cgccgcctgc cgccgatggg 1740
ggttcccccg cgccacccgg cgacgacgag gcccgcgagg atgaagggga gaccgaggac 1800
ggggcagccg ggcgggaggg caacggcggc cccccaggac ccgaaggcga cggcgagagt 1860
cagacccccg aagccaacgg aggcgccgag ggcgagccga aacccggccc cagccccgac 1920
gccgaccgcc ccgaaggctg gccgagcctc gaagccatca cgcacccccc gcccgccccc 1980
gctacgcccg cggcccccga cgcctaccca tacgacgtcc cagactacgc ttaatgagaa 2040
ttcaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 2100
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 2160
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 2220
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 2280
actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 2340
cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 2400
ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg 2460
ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 2520
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 2580
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctgtctag 2640
agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 2700
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 2760
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 2820
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 2880
tgcggtgggc tctatgg 2897
<210> 2
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1128)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1128)
<223>
<400> 2
aag ctt gct cgt ccg gta caa aga cgc ggt ccg cga ctg cgt gga tgt 48
Lys Leu Ala Arg Pro Val Gln Arg Arg Gly Pro Arg Leu Arg Gly Cys
1 5 10 15
cca cgc cca ggc aag caa act cta aac gcc cga gcg cca tgg ccc cga 96
Pro Arg Pro Gly Lys Gln Thr Leu Asn Ala Arg Ala Pro Trp Pro Arg
20 25 30
tgc cgc cac aaa gag cgc cga aat ttc gcc cag gca cgc cgc gcc gcc 144
Cys Arg His Lys Glu Arg Arg Asn Phe Ala Gln Ala Arg Arg Ala Ala
35 40 45
cga cgc gtc ttt agc gca ccc gcc ggc gct gtt gcc cgc gtg cct gct 192
Arg Arg Val Phe Ser Ala Pro Ala Gly Ala Val Ala Arg Val Pro Ala
50 55 60
gcc gcc cac cgg gcg gcc gct ctc ccc ggc ctc agc agg gcc ggg gtc 240
Ala Ala His Arg Ala Ala Ala Leu Pro Gly Leu Ser Arg Ala Gly Val
65 70 75 80
gcc ggc ggg cgg ccg cgg ggt ggc ggc cac agc cgc cct ttt gcc cgt 288
Ala Gly Gly Arg Pro Arg Gly Gly Gly His Ser Arg Pro Phe Ala Arg
85 90 95
agc cag ggg aag cgg ctg ccc ctt ctg ccg ccg cgg ccg cgg ttg ctc 336
Ser Gln Gly Lys Arg Leu Pro Leu Leu Pro Pro Arg Pro Arg Leu Leu
100 105 110
ggc ttt gcg ttt gcc ccg cgg cga tcg ccc cgc tcg ccg cga acg cgc 384
Gly Phe Ala Phe Ala Pro Arg Arg Ser Pro Arg Ser Pro Arg Thr Arg
115 120 125
gcg cgc gaa tgg ggc gta ctc ggc gag ccc ggc tat tat agc ctc aag 432
Ala Arg Glu Trp Gly Val Leu Gly Glu Pro Gly Tyr Tyr Ser Leu Lys
130 135 140
gcg cgc cgc gtt gct agc gat cgt ctg ggc cgg cag gcg cgt cac tct 480
Ala Arg Arg Val Ala Ser Asp Arg Leu Gly Arg Gln Ala Arg His Ser
145 150 155 160
gag cac gcg cat gcc ccg ctg gga gac gaa cac cag cac cgg cgc tag 528
Glu His Ala His Ala Pro Leu Gly Asp Glu His Gln His Arg Arg
165 170 175
gac cac cgg gtc tgg gcc cgg ggg ggc gag atc gcg cac aag ccg ggc 576
Asp His Arg Val Trp Ala Arg Gly Gly Glu Ile Ala His Lys Pro Gly
180 185 190
cga gtc gcg cag ctg ccg cag ccc ccc gag gcg ctg gtc cat ctt gct 624
Arg Val Ala Gln Leu Pro Gln Pro Pro Glu Ala Leu Val His Leu Ala
195 200 205
ggg cgt gtt cat gtt cgt tga aaa acg gca cgt ctt cag ctc cac gat 672
Gly Arg Val His Val Arg Lys Thr Ala Arg Leu Gln Leu His Asp
210 215 220
aag aca gac ggc ccg ggc gtg ccc tgc ctc cgc gac ccg gag tag gca 720
Lys Thr Asp Gly Pro Gly Val Pro Cys Leu Arg Asp Pro Glu Ala
225 230 235
cac gca atc ggg ccg ccg gct ttg cag gtt tac ctc aaa gct cag aga 768
His Ala Ile Gly Pro Pro Ala Leu Gln Val Tyr Leu Lys Ala Gln Arg
240 245 250
cac gcc cac gac ctg ctt aaa aac ctc cgg ggc gcc aaa ctt gcc caa 816
His Ala His Asp Leu Leu Lys Asn Leu Arg Gly Ala Lys Leu Ala Gln
255 260 265
aag ctg ggc gag gcg cgg gcg cag ctt ctg cgc gcc aac cgc cgc gcg 864
Lys Leu Gly Glu Ala Arg Ala Gln Leu Leu Arg Ala Asn Arg Arg Ala
270 275 280 285
tgc gtc gca agc cag cgc ctc gta aaa gcg gct gtg gca ccg gat ccc 912
Cys Val Ala Ser Gln Arg Leu Val Lys Ala Ala Val Ala Pro Asp Pro
290 295 300
ggc gcg cag gcg cgc acg tcg gtc gcg gtc gcg cgc cat ggc cga gcc 960
Gly Ala Gln Ala Arg Thr Ser Val Ala Val Ala Arg His Gly Arg Ala
305 310 315
cgc gcg cgc tct ccg cgt cgt gcg tat cta cct gga cgg cgc gca cgg 1008
Arg Ala Arg Ser Pro Arg Arg Ala Tyr Leu Pro Gly Arg Arg Ala Arg
320 325 330
gct ggg aaa gac aac aac ggg ccg cgc gct cgc ggc cgc ttc cac cgc 1056
Ala Gly Lys Asp Asn Asn Gly Pro Arg Ala Arg Gly Arg Phe His Arg
335 340 345
tgg gga ggg cgt gct ctt ttt ccc gga gcc gat ggc gta ctg gcg cac 1104
Trp Gly Gly Arg Ala Leu Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Leu Ala His
350 355 360 365
gat gtt tgg tac gga cgc ggt acc 1128
Asp Val Trp Tyr Gly Arg Gly Thr
370
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Lys Leu Ala Arg Pro Val Gln Arg Arg Gly Pro Arg Leu Arg Gly Cys
1 5 10 15
Pro Arg Pro Gly Lys Gln Thr Leu Asn Ala Arg Ala Pro Trp Pro Arg
20 25 30
Cys Arg His Lys Glu Arg Arg Asn Phe Ala Gln Ala Arg Arg Ala Ala
35 40 45
Arg Arg Val Phe Ser Ala Pro Ala Gly Ala Val Ala Arg Val Pro Ala
50 55 60
Ala Ala His Arg Ala Ala Ala Leu Pro Gly Leu Ser Arg Ala Gly Val
65 70 75 80
Ala Gly Gly Arg Pro Arg Gly Gly Gly His Ser Arg Pro Phe Ala Arg
85 90 95
Ser Gln Gly Lys Arg Leu Pro Leu Leu Pro Pro Arg Pro Arg Leu Leu
100 105 110
Gly Phe Ala Phe Ala Pro Arg Arg Ser Pro Arg Ser Pro Arg Thr Arg
115 120 125
Ala Arg Glu Trp Gly Val Leu Gly Glu Pro Gly Tyr Tyr Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Arg Val Ala Ser Asp Arg Leu Gly Arg Gln Ala Arg His Ser
145 150 155 160
Glu His Ala His Ala Pro Leu Gly Asp Glu His Gln His Arg Arg
165 170 175
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp His Arg Val Trp Ala Arg Gly Gly Glu Ile Ala His Lys Pro Gly
1 5 10 15
Arg Val Ala Gln Leu Pro Gln Pro Pro Glu Ala Leu Val His Leu Ala
20 25 30
Gly Arg Val His Val Arg
35
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Thr Ala Arg Leu Gln Leu His Asp Lys Thr Asp Gly Pro Gly Val
1 5 10 15
Pro Cys Leu Arg Asp Pro Glu
20
<210> 6
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala His Ala Ile Gly Pro Pro Ala Leu Gln Val Tyr Leu Lys Ala Gln
1 5 10 15
Arg His Ala His Asp Leu Leu Lys Asn Leu Arg Gly Ala Lys Leu Ala
20 25 30
Gln Lys Leu Gly Glu Ala Arg Ala Gln Leu Leu Arg Ala Asn Arg Arg
35 40 45
Ala Cys Val Ala Ser Gln Arg Leu Val Lys Ala Ala Val Ala Pro Asp
50 55 60
Pro Gly Ala Gln Ala Arg Thr Ser Val Ala Val Ala Arg His Gly Arg
65 70 75 80
Ala Arg Ala Arg Ser Pro Arg Arg Ala Tyr Leu Pro Gly Arg Arg Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Lys Asp Asn Asn Gly Pro Arg Ala Arg Gly Arg Phe His
100 105 110
Arg Trp Gly Gly Arg Ala Leu Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Leu Ala
115 120 125
His Asp Val Trp Tyr Gly Arg Gly Thr
130 135
<210> 7
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)..(840)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(840)
<223>
<400> 7
gaa ttc tac ccg ggc ggc ggg acg ggc ttg ccc gcg gtt cac gcc tgg 48
Glu Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Thr Gly Leu Pro Ala Val His Ala Trp
1 5 10 15
gcg ctg gac gcc ctg gcc ggc cgc ctc gcc gcc ctc gag gtg ttc gtg 96
Ala Leu Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Leu Glu Val Phe Val
20 25 30
ctg gac gtg tcc gcg gcg cca gac gcg tgc gcg gcc gcc gta ctg gac 144
Leu Asp Val Ser Ala Ala Pro Asp Ala Cys Ala Ala Ala Val Leu Asp
35 40 45
atg cgg ccc gcc atg cag gcc gct tgc gcg gac ggg gcg gcg ggc gcg 192
Met Arg Pro Ala Met Gln Ala Ala Cys Ala Asp Gly Ala Ala Gly Ala
50 55 60
acg ctg gcg acc ctg gcg cgt cag ttc gcg cta gag atg gcg ggg gag 240
Thr Leu Ala Thr Leu Ala Arg Gln Phe Ala Leu Glu Met Ala Gly Glu
65 70 75 80
gcc acg gcg ggc cct agg gga cta taa agc tgc ccc tgc gct cgc tcg 288
Ala Thr Ala Gly Pro Arg Gly Leu Ser Cys Pro Cys Ala Arg Ser
85 90 95
ctc gct gca ttt gcg ccc cga tcg cct tac ggg gac tcg gcg ctc ggc 336
Leu Ala Ala Phe Ala Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Asp Ser Ala Leu Gly
100 105 110
gga tcc cct ccc ggc ccc gcc gcg aag cga gcc gcc aga caa aaa aat 384
Gly Ser Pro Pro Gly Pro Ala Ala Lys Arg Ala Ala Arg Gln Lys Asn
115 120 125
gcg gcg ccc gct ctg cgc ggc gct att ggc agc ggc tgt cct cgc gct 432
Ala Ala Pro Ala Leu Arg Gly Ala Ile Gly Ser Gly Cys Pro Arg Ala
130 135 140
cgc cgc ggg cgc ccc cgc cgc cgc ccg cgg cgg cgc ggg ggg ccg aag 480
Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Arg Arg Gly Gly Pro Lys
145 150 155
cag gga gca cag aga cgc ccg ata cga aat cga aga gtg gga aat ggt 528
Gln Gly Ala Gln Arg Arg Pro Ile Arg Asn Arg Arg Val Gly Asn Gly
160 165 170 175
ggt cgg agc cgg gcc ggc cgt gca cac gtt cac cat ccg ctg cct cgg 576
Gly Arg Ser Arg Ala Gly Arg Ala His Val His His Pro Leu Pro Arg
180 185 190
gcc gcg ggg cat tga gcg cgt ggc cca cat tgc aaa cct cag ccg gct 624
Ala Ala Gly His Ala Arg Gly Pro His Cys Lys Pro Gln Pro Ala
195 200 205
gct gga cgg gta cat agc ggt cca cgt tga cgt tgc gcg cac ctc tgg 672
Ala Gly Arg Val His Ser Gly Pro Arg Arg Cys Ala His Leu Trp
210 215 220
cct gcg gga cac cat gtt ttt cct gcc gcg cgc ggc cgt cga caa cgc 720
Pro Ala Gly His His Val Phe Pro Ala Ala Arg Gly Arg Arg Gln Arg
225 230 235
ttc ggc cgc tga cat tcc gga cac ccc ggc cgt aca gtc gca ccc ggg 768
Phe Gly Arg His Ser Gly His Pro Gly Arg Thr Val Ala Pro Gly
240 245 250
gct ctt cgg ggc ggc ctt ttc ctg gag cta ctt gca aac gcg cca cct 816
Ala Leu Arg Gly Gly Leu Phe Leu Glu Leu Leu Ala Asn Ala Pro Pro
255 260 265
cgt aga cta cga cct ggt tct aga 840
Arg Arg Leu Arg Pro Gly Ser Arg
270 275
<210> 8
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Thr Gly Leu Pro Ala Val His Ala Trp
1 5 10 15
Ala Leu Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Leu Glu Val Phe Val
20 25 30
Leu Asp Val Ser Ala Ala Pro Asp Ala Cys Ala Ala Ala Val Leu Asp
35 40 45
Met Arg Pro Ala Met Gln Ala Ala Cys Ala Asp Gly Ala Ala Gly Ala
50 55 60
Thr Leu Ala Thr Leu Ala Arg Gln Phe Ala Leu Glu Met Ala Gly Glu
65 70 75 80
Ala Thr Ala Gly Pro Arg Gly Leu
85
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ser Cys Pro Cys Ala Arg Ser Leu Ala Ala Phe Ala Pro Arg Ser Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Asp Ser Ala Leu Gly Gly Ser Pro Pro Gly Pro Ala Ala Lys
20 25 30
Arg Ala Ala Arg Gln Lys Asn Ala Ala Pro Ala Leu Arg Gly Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Gly Cys Pro Arg Ala Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro
50 55 60
Arg Arg Arg Gly Gly Pro Lys Gln Gly Ala Gln Arg Arg Pro Ile Arg
65 70 75 80
Asn Arg Arg Val Gly Asn Gly Gly Arg Ser Arg Ala Gly Arg Ala His
85 90 95
Val His His Pro Leu Pro Arg Ala Ala Gly His
100 105
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Arg Gly Pro His Cys Lys Pro Gln Pro Ala Ala Gly Arg Val His
1 5 10 15
Ser Gly Pro Arg
20
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Arg Cys Ala His Leu Trp Pro Ala Gly His His Val Phe Pro Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gly Arg Arg Gln Arg Phe Gly Arg
20 25
<210> 12
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
His Ser Gly His Pro Gly Arg Thr Val Ala Pro Gly Ala Leu Arg Gly
1 5 10 15
Gly Leu Phe Leu Glu Leu Leu Ala Asn Ala Pro Pro Arg Arg Leu Arg
20 25 30
Pro Gly Ser Arg
35
<210> 13
<211> 1077
<212> DNA
<213> 牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1077)
<223>
<400> 13
caagggccga cattggccgt gctgggcgcg ctgctcgccg ttgcggtgag cttgcctaca 60
cccgcgccgc gggtgacggt atacgtcgac ccgccggcgt acccgatgcc gcgatacaac 120
tacactgaac gctggcacac taccgggccc ataccgtcgc ccttcgcaga cggccgcgag 180
cagcccgtcg aggtgcgcta cgcgacgagc gcggcggcgt gcgacatgct ggcgctgatc 240
gcagacccgc aggtggggcg cacgctgtgg gaagcggtac gccggcacgc gcgcgcgtac 300
aacgccacgg tcatatggta caagatcgag agcgggtgcg cccggccgct gtactacatg 360
gagtacaccg agtgcgagcc caggaagcac tttgggtact gccgctaccg cacacccccg 420
ttttgggaca gcttcctggc gggcttcgcc taccccacgg acgacgagct gggactgatt 480
atggcggcgc ccgcgcggct cgtcgagggc cagtaccgac gcgcgctgta catcgacggc 540
acggtcgcct atacagattt catggtttcg ctgccggccg gggactgctg gttctcgaaa 600
ctcggcgcgg ctcgcgggta cacctttggc gcgtgcttcc cggcccggga ttacgagcaa 660
aagaaggttc tgcgcctgac gtatctcacg cagtactacc cgcaggaggc acacaaggcc 720
atagtcgact actggttcat gcgccacggg ggcgtcgttc cgccgtattt tgaggagtcg 780
aagggctacg agccgccgcc tgccgccgat gggggttccc ccgcgccacc cggcgacgac 840
gaggcccgcg aggatgaagg ggagaccgag gacggggcag ccgggcggga gggcaacggc 900
ggccccccag gacccgaagg cgacggcgag agtcagaccc ccgaagccaa cggaggcgcc 960
gagggcgagc cgaaacccgg ccccagcccc gacgccgacc gccccgaagg ctggccgagc 1020
ctcgaagcca tcacgcaccc cccgcccgcc cccgctacgc ccgcggcccc cgacgcc 1077

Claims (3)

1.一株重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，其特征在于，该病毒含有双拷贝的gD基因，即在缺失的TK基因位置上插入一拷贝gD基因胞外区，该病毒保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201552；所述的gD基因胞外区的核苷酸序列如下所示。
CAAGGGCCGACATTGGCCGTGCTGGGCGCGCTGCTCGCCGTTGCGGTGAGCTTGCCTACACCCGCGCCGCGGGTGACGGTATACGTCGACCCGCCGGCGTACCCGATGCCGCGATACAACTACACTGAACGCTGGCACACTACCGGGCCCATACCGTCGCCCTTCGCAGACGGCCGCGAGCAGCCCGTCGAGGTGCGCTACGCGACGAGCGCGGCGGCGTGCGACATGCTGGCGCTGATCGCAGACCCGCAGGTGGGGCGCACGCTGTGGGAAGCGGTACGCCGGCACGCGCGCGCGTACAACGCCACGGTCATATGGTACAAGATCGAGAGCGGGTGCGCCCGGCCGCTGTACTACATGGAGTACACCGAGTGCGAGCCCAGGAAGCACTTTGGGTACTGCCGCTACCGCACACCCCCGTTTTGGGACAGCTTCCTGGCGGGCTTCGCCTACCCCACGGACGACGAGCTGGGACTGATTATGGCGGCGCCCGCGCGGCTCGTCGAGGGCCAGTACCGACGCGCGCTGTACATCGACGGCACGGTCGCCTATACAGATTTCATGGTTTCGCTGCCGGCCGGGGACTGCTGGTTCTCGAAACTCGGCGCGGCTCGCGGGTACACCTTTGGCGCGTGCTTCCCGGCCCGGGATTACGAGCAAAAGAAGGTTCTGCGCCTGACGTATCTCACGCAGTACTACCCGCAGGAGGCACACAAGGCCATAGTCGACTACTGGTTCATGCGCCACGGGGGCGTCGTTCCGCCGTATTTTGAGGAGTCGAAGGGCTACGAGCCGCCGCCTGCCGCCGATGGGGGTTCCCCCGCGCCACCCGGCGACGACGAGGCCCGCGAGGATGAAGGGGAGACCGAGGACGGGGCAGCCGGGCGGGAGGGCAACGGCGGCCCCCCAGGACCCGAAGGCGACGGCGAGAGTCAGACCCCCGAAGCCAACGGAGGCGCCGAGGGCGAGCCGAAACCCGGCCCCAGCCCCGACGCCGACCGCCCCGAAGGCTGGCCGAGCCTCGAAGCCATCACGCACCCCCCGCCCGCCCCCGCTACGCCCGCGGCCCCCGACGCC。
2.权利要求1所述的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+在制备牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗中的应用。
3.权利要求2所述的一株重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+毒株在制备牛传染性鼻气管炎病毒基因工程重组病毒中的应用。
CN201710415514.7A 2017-06-05 2017-06-05 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒 Active CN108977413B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710415514.7A CN108977413B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710415514.7A CN108977413B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108977413A true CN108977413A (zh) 2018-12-11
CN108977413B CN108977413B (zh) 2021-02-23

Family

ID=64502271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710415514.7A Active CN108977413B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108977413B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0693551A1 (en) * 1994-07-18 1996-01-24 Akzo Nobel N.V. gD-negative bovine herpesvirus mutant, capable of direct cell-to-cell transmission
WO1999063063A1 (en) * 1998-06-03 1999-12-09 Northwestern University Cellular proteins which mediate herpesvirus entry
WO2009050474A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 The University Court Of The University Of Edinburgh Immunogenic ompositions containing escherichia coli h7 flagella and methods of use thereof
CN101818130A (zh) * 2009-12-24 2010-09-01 华中农业大学 一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用
CN102649948A (zh) * 2011-02-23 2012-08-29 华中农业大学 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志活疫苗及制备方法
CN102653731A (zh) * 2011-03-02 2012-09-05 华中农业大学 一种缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
CN105753947A (zh) * 2016-04-12 2016-07-13 北京纳百景弈生物科技有限公司 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0693551A1 (en) * 1994-07-18 1996-01-24 Akzo Nobel N.V. gD-negative bovine herpesvirus mutant, capable of direct cell-to-cell transmission
WO1999063063A1 (en) * 1998-06-03 1999-12-09 Northwestern University Cellular proteins which mediate herpesvirus entry
WO2009050474A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 The University Court Of The University Of Edinburgh Immunogenic ompositions containing escherichia coli h7 flagella and methods of use thereof
CN101818130A (zh) * 2009-12-24 2010-09-01 华中农业大学 一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用
CN102649948A (zh) * 2011-02-23 2012-08-29 华中农业大学 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志活疫苗及制备方法
CN102653731A (zh) * 2011-03-02 2012-09-05 华中农业大学 一种缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
CN105753947A (zh) * 2016-04-12 2016-07-13 北京纳百景弈生物科技有限公司 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDRE N. ZAKHARTCHOUK等: "Construction and characterization of E3-deleted bovine adenovirus type 3 expressing full-length and truncated form of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD", 《VIROLOGY》 *
GOLTZ,M.等: "Bovine herpesvirus type 1.1 complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
MINMIN ZHANG等: "Attenuation of bovine herpesvirus type 1 by deletion of its glycoprotein G and tk genes and protection against virulent viral challenge", 《VACCINE》 *
庄东明等: "牛疱疹病毒1型Bartha Nu/67株GD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达", 《西北农业学报》 *
李汉雄等: "重组病毒BoHV-1 gG−/tk−/gD+和BoHV-1 gG−/tk−/gD5+的兔体内安全性和免疫原性", 《微生物学通报》 *
纪素坤: "BHV-1gG~-/tk~-/GM-CSF~+重组病毒的构建及其免疫效果的评价", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
谭业平等: "狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒的构建", 《中国兽医学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108977413B (zh) 2021-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Newcastle disease virus (NDV) recombinants expressing infectious laryngotracheitis virus (ILTV) glycoproteins gB and gD protect chickens against ILTV and NDV challenges
RU2692013C2 (ru) Улучшенная вакцина против nd-ibd на основе вектора hvt
Lüschow et al. Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene
JP5508252B2 (ja) 鳥インフルエンザ遺伝子を含有する組み換え七面鳥ヘルペスウイルス
KR101432840B1 (ko) 돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자
CN108611328B (zh) 一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
CN110759973B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
US10626414B2 (en) Swine influenza vaccine
CN109536461B (zh) 一种o型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用
CN110283794A (zh) 重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物
CN114958783B (zh) 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法
CN102321639A (zh) 基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法和应用
CA2182880A1 (en) Recombinant equine herpesviruses
CN116217678B (zh) 一种抗h5n1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN101376027A (zh) 表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株
CN102154229A (zh) 一种ev71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗
Rosas et al. Evaluation of a vectored equine herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine expressing H3 haemagglutinin in the protection of dogs against canine influenza
CN111647087A (zh) 一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN101818130B (zh) 一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用
CN106085970B (zh) 表达信号肽替换的h5亚型禽流感ha蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
CN108977413A (zh) 一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
CN110423779A (zh) 同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用
CN109943576A (zh) 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
RU2751485C1 (ru) Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19
CN113827714B (zh) 一种h7n9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant