CN101818130A - 一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物病毒学和动物基因工程技术领域，具体涉及一种gG和TK基因缺失的重组牛传染性鼻气管炎病毒、基因工程疫苗及应用。本发明制备的重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株IBRVΔgG/ΔTK保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V200915，该毒株缺失了gG、TK基因，不含外源基因。本发明的中间毒株即重组牛传染性鼻气管炎病毒GAZH-2009-01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No：V200910，该毒株缺失了gG、TK基因并含有报告基因EGFP。本发明还公开了重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/ΔTK在牛传染性鼻气管炎的基因工程疫苗的制备上应用和防治牛传染性鼻气管炎病毒病上的应用。

Description

一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及双基因缺失的一种重组牛传染性鼻气管炎病毒，该病毒缺失了gG和TK基因，该毒株的毒力降低而免疫原性没有影响，本发明还包括利用该重组病毒制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗以及该疫苗的应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)，又称“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis viruses，IBRV)，引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，该病的危害性在于病毒侵入牛体后，可潜伏于一定部位，导致持续性感染，病牛长期乃至终生带毒，在机体抵抗力下降时，又向外排毒。该病对奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大的影响，而且急性呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎，是造成养牛业经济损失的主要原因之一。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失。目前只有少数欧洲国家已经根除了本病，其他一些国家正在实施扑灭计划，或使用标记疫苗区分自然感染和疫苗免疫的牛群，以便于更好的进行监控和防制。

IBRV为有囊膜的双股DNA病毒，病毒粒子呈圆球型，成熟病毒粒子直径约150-220nm，主要由核心、衣壳和囊膜组成。核心由双股DNA和蛋白质缠绕而成，其核衣壳为立体对称的二十面体，外观呈六角形，上面有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜。双股DNA分子量为84×10⁶，其中G+C含量为72％。

据测IBRV基因组可编码大约70个蛋白质，其结构和功能目前大部分已知(李继昌，牛传染性鼻气管炎病的研究进展，黑龙江畜牧兽医.2002，4：50)，其中含有25～33种结构蛋白。存在于病毒囊膜的gB、gC、gD和gE四个主要糖蛋白基因已经测序并在原核和哺乳动物中表达。IBRV糖蛋白能刺激机体产生中和抗体，并且在补体的存在下使感染细胞裂解。gB、gC、gD和gE四个基因主要负责病毒的吸附、渗透和在细胞之间扩散病毒(Belknap EB，Walters LM.，Kelling C，Ayers VK，NorrisJ，McMillen J，Hayhow C，Cochran M，Reddy DN，Wright J，Collins JK.Immunogenicity and protective effcacy of a gE，gG and US2 gene-deletedbovine herpesvirus-1(BHV-1)vaccine.Vaccine，1999，17(18)：2297-2305)，gB、gC、gD是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白(Tikoo SK，Campos M，Babiuk LA.Bovine herpesvirus 1(BHV-1)：biology，pathogenesis，andcontrol.Adv.Virus Res，1995，45：191-223)，gD能诱导产生最高水平的体液和细胞免疫(Babiuk LA，vanDrunen Littel-van den Hurk S，Tikoo SK，Lewis PJ，Liang X.Novel viral vaccines for livestock.Vet.ImmunolImmunopathol，1996，54(1-4)：355-363)。

gB：gB能引起细胞融合，在哺乳动物细胞中的表达显示出引起细胞融合和多核体的形成，对病毒复制是必需的，国内学对其实现了原核表达并对表达产物的抗原性进行了分析，在杆状病毒中表达的抗原性较gC、gD弱；细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，可能调控病毒的数个反式激活子的结合作用，但对病毒的感染并非必需；糖蛋白gB对于穿孔是必需的，并且已经证实侵袭神经和通过神经传播需要gB。

gC：gC是BHV-1表达最多的糖蛋白，并且在病毒粒子表面即体液中和抗体和细胞毒性T细胞反应的有效部位能够形成最清晰的影象。它对病毒吸附组织培养细胞是重要的，但它在牛细胞内的表达并不影响病毒蚀斑的数量和病毒的存在。此外，gC促进病毒的穿透即病毒进入细胞的第二过程，也可能参与病毒复制的其他过程。BHV-1、HSV-1和IBRV的gC蛋白与细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，还能够诱导细胞介导的免疫应答。

gD：gD与病毒穿透，进入宿主细胞有关，含有gD基因的质粒作为免疫原可能诱导细胞毒性淋巴细胞的反应(Muralidhar，2002)，被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子。与其它相关的几种糖蛋白比较，抗gD抗体的病毒中和效果最好，具有制备亚单位疫苗的前景。鼠和牛的免疫试验显示出gD能够引起比gB、gC更强而持久的细胞免疫。

gE：gE是IBR病毒粒子的主要成分之一，它能够在病毒粒子表面及病毒感染细胞表面高水平表达，以细胞特异的方式影响病毒从感染细胞的释放，而且是中和抗体的主要作用靶位，因此gE是牛传染性鼻气管炎鉴别诊断的可靠标记。gE基因缺失也影响到病毒在细胞间的传播。在动物，gE的存在对病毒有效地感染中枢神经系统方面有重要作用。gE是病毒复制非必需的，这使基因缺失苗的构建成功成为可能，缺失gE特定部位的编码区能降低疫苗的毒力且能充分抵抗病毒的入侵。研究表明，gE可用于ELISA诊断方法的建立。

gG：gG是IBRV的主要囊膜糖蛋白之一，具有很强的抗原性(Hartley CA，Drummer HE，Studdert MJ.The nucleotide sequence of the glycoprotein G homologue of equine herpesvirus 3(EHV3)indicates EHV3 is adistinct equid alphaherpesvirus.Arch Virol，1999，144(10)：2023-2033)，是许多疱疹病毒的诊断抗原，被广泛用于其它疱疹病毒感染性疾病的血清学诊断。同时，糖蛋白gG也是病毒复制非必需的分泌性蛋白，它在α疱疹病毒中相对保守(Nakamichi K，Ohara K，Kuroki D，Otsuka H.Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G isrequired for viral growth by cell-to-cell infection.virus reseach，2000，68：175-181)。可影响病毒在宿主细胞内有效增殖与细胞间扩散，与病毒毒力相关，已被广泛用作IBRV外的其它疱疹病毒的诊断抗原(Nakamichi K，Kuroki D，Matsumoto Y，Otsuka H.Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is required for prevention of apoptosisand efficient viral growth in rabbit kidney cells.Virology，2001，279(2)：488-498；Nakamichi K，Matsumoto Y，Otsuka H.Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is necessary for maintaining cell-to-cell junctional adherenceamong infected cells.Virology，2002，294(1)：22-30；Sascha Trapp，Nikolaus Osterrieder，Günther M.Keil，Martin Beer.Mutagenesis of a bovine herpesvirus type 1 genome cloned as an infectious bacterial artificialchromosome：analysis of glycoprotein E and G double deletion mutants.Virology，2003，84：301-306)。

TK：TK基因在核酸代谢中起重要作用，是α-疱疹病毒的毒力基因，对病毒的复制并非需要，但对病毒维持在神经组织的持续性感染十分重要。所以，TK基因一直是疱疹病毒分子生物学研究的热点之一。TK基因缺失后可使毒力降低，并且在非分裂细胞中的复制能力也很低，从而使潜伏的病毒不易激活，因此在研制基因缺失疫苗时，TK基因是常用的靶基因(Kit S，Oavi H，Gaines JD，Billingsley P，McConnell S.Thymidine kinase-negative bovine herpesvirus type 1 mutant is stable and highly attenuated in calves.Arch Virol，1985，86：63-83)。此外，病毒的TK基因比细胞的相应基因具有更广谱的磷酸化底物，在设计抗病毒治疗药物和治疗肿瘤药物时具有广泛的应用价值。

国外已经研制了TK/gE双基因缺失疫苗(Kaashoek MJ，van Engelenburg FA，Moerman A，Gielkens AL，Rijsewijk FA，van Oirschot JT.Vet Microbiol.1996 Jan；48(1-2)：143-53)。而我国的IBRV的血清学的阳性率很高(B.F.Yan，Serological survey of bovine herpesvirus type 1 infection in China，veterinary microbiogy，2007，127，136-141)牛传染性鼻气管炎是呈世界性广泛传播，严重危害养殖业的发展而我国尚无应对措施，所以能够研制出适合我国国情的疫苗是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于获得一种免疫原性好和安全性强的牛传染性鼻气管炎的基因工程毒株。

本发明的第二个目的是牛传染性鼻气管炎的基因工程毒株在制备牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人构建了一种重组牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)基因工程毒株IBRVΔgG/ΔTK，该基因工程毒株于2009年10月23日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC-V200915。

本发明的基本构建方法是：首先针对目的基因gG，TK构建四个转移质粒，将其分别命名为，pcDNA3.1-ZYP，pcDNA3.1-ZYP-1，pZF08-16和pZF08-16-1，其中pcDNA3.1-ZYP-1和pZF08-16都含有EGFP表达盒以便筛选，而pcDNA3.1-ZYP-2和pZF08-16-1不含EGFP表达盒以便反向筛选。将pcDNA3.1-ZYP-1和IBRV基因组共转染于MDBK(牛肾细胞)细胞，获得IBRVΔgG/EGFP+毒株，再用pcDNA3.1-ZYP-1和IBRV基因组共转染于MDBK细胞，获得BRVΔgG毒株，再以该毒株为基础用同样的操作过程获得最终要构建的疫苗株IBRVΔgG/ΔTK。

为深入评价用该重组牛传染性鼻气管炎病毒基因工程毒株制备的牛传染性鼻气管炎病毒疫苗在防制牛传染性鼻气管炎中的应用，用制备的疫苗在试验动物(日本大耳白兔，购自湖北省疾病预防控制中心)进行了免疫效果评价及安全评价。本发明的主要优点是：

1、本发明通过同源重组的方法将牛传染性鼻气管炎病毒gG，TK基因完整或部分缺失，从而使得重组病毒株不能表达牛传性染鼻气管炎病毒的gG蛋白和TK胸苷激酶，与针对gG蛋白的单克隆抗体配建立一种鉴别诊断方法，为牛传染性鼻气管炎的预防、净化奠定基础。

2、本发明构建的gG，TK基因缺失株不含报告基因，应用于疫苗更加安全。

3、本发明所缺失的TK基因是IBRV的毒力基因，缺失后该病毒的毒力明显降低，动物(兔)实验表明该病毒毒力大大降低，而对机体的免疫没有影响。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

1、序列表SEQ ID NO：1是gG基因上游同源臂(包含gG全长序列，gG下游同源臂)的核苷酸序列。

2、序列表SEQ ID NO：2是报告基因EGFP的核苷酸序列。

3、序列表SEQ ID NO：3是TK基因上游同源臂(包含TK全长序列，TK下游同源臂)的核苷酸序列。

图1：是本发明的基本流程示意图。

基本步骤是先将重组转移质粒和IBRV(牛传染性鼻气管炎病毒)基因组共转染于MDBK(牛肾传代细胞)，以报告基因为标识，挑取发绿色荧光的空斑；再把含有报告基因的病毒基因组与重组转移质粒共转染，将报告基因敲除，获得单基因缺失株，之后用同样的过程构建双基因缺失株。

图2：是重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP的构建流程图。

图3：是重组转移质粒zPF08-16的构建流程图

图4：是重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP-1的构建流程图。

图5：重组转移质粒zPF08-16-1的构建流程图。

图6gG基因上游同源臂PCR扩增结果。图中Lane M：DL2000 DNA Marker；Lane 1：gG基因上游同源臂，大小为1000bp。

图7：gG基因下游同源臂PCR扩增结果。图中Lane M：DL2000 DNA Marker；Lane 1：gG基因下游同源臂，大小为800bp。

图8：EGFP表达盒的PCR扩增结果。图中Lane M：DL2000 DNA Marker；Lane 1：由PCR扩增出的1.9kbEGFP表达盒。

图9：是本发明的重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP转移质粒酶切鉴定图。

M：DL15000 DNA Marker；1：用Hind III and EcoR I双酶切，结果可见两条带，大小分别为：5.5kb and 3.7kb；2：用Kpn I单酶切，结果可见一条9.2kb大小的DNA片段。

图10：zPF08-16酶切鉴定图。

图11：是本发明构建的IBRV ΔgG/EGFP⁺ PCR扩增鉴定图。图中Line1：2号空斑(IBRVΔgG/EGFP⁺)Line2：1号空斑(IBRVΔgG/EGFP⁺)Line3：阳性对照，Line4：阴性对照Line M：DL25000 DNA Marker，Line5：阴性对照Line 6：阳性对照，Line7：2号空斑(IBRV ΔgG/EGFP⁺)，Line8：1号空斑(IBRVΔgG/EGFP⁺)。

图12：是本发明构建的IBRVΔgG/EGFP⁺ western blot图。图中Line1：对照，Line2：ΔgG/EGFP⁺，Line3：IBRV，Line4：Marker。

图13：是本发明构建的IBRVΔgG去掉了EGFP后荧光显微镜下空斑图。

图14：是本发明构建的IBRVΔgGK PCR扩增鉴定图。Line1：DL2000，Line2：对照，Line3：IBRV，Line4-7：IBRVΔgG。

图15：是本发明IBRVΔgG基因组与zPF08-16成功共转染后图片。

图16：是本发明构建的IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺PCR鉴定图。图Line1：DL2000，Line 2：阴性对照，Line3：阳性对照，Line4-6：三对不同引物扩增IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺。

图17：是构建的IBRVΔgG/ΔTK的PCR鉴定图。图中，Line1-2：IBRVΔgG/ΔTK，Line3-4：IBRV野生型。M：LD2000

图18：是构建的IBRVΔgG/ΔTK western blot图。图中Line1：Marker，Line 2：IBRV，Line3：IBRVΔgG/ΔTK，Line4：阴性对照(MDBK细胞总蛋白)。

图19：是本发明构建的IBRVΔgG/ΔTK株用于兔体试验后，在急性感染期，潜伏期以及再激活期间分毒情况。

图20：是是本发明构建的IBRVΔgG/ΔTK免疫实验动物兔子后，中和抗体产生情况。

具体实施方式

实施例1

1.引物设计

将质粒pEGFP-C1(购自Becton，Dickison and Company)用Bam H I和Bgl II双酶切，T4连接酶连接后作为模板，扩增标记基因EGFP，并引入酶切位点为Kpn I、Bam H I，片段大小约为1900bp；根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号：AJ004801)，设计两对引物，以IBRV precipitation DNA为模板，分别扩增gG基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为HindIII、Kpn I，片段大小约为800bp，1000以及本发明的中间产物PCR鉴定引物(引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)分别如下(以下引物都可以在上述《附图说明》中所述的SEQ ID NO：1-3的序列中识别，可得知本发明及其中间产物中所缺失基因的大小及PCR鉴定时所扩增出的片段大小)：

SEQ ID NO：4  P₁：5’cgt gcg cta agc ttt cgc att atc cgg c 3’(Hind III)(gG上游同源臂上游引物)

SEQ ID NO：5  P₂：5’tg tgg tac cgc ttg cgc tcg cgt tc 3’(KpnI)(gG上游同源臂下游引物)

SEQ ID NO：6  P₃：5’cga act gag gta cct aca gcg tga gc 3’(KpnI)(报告基因上游引物)

SEQ ID NO：7  P₄：5’cgc gtt agg atc cat tga tga gtt tgg 3’(BamHI)(报告基因下游引物)

SEQ ID NO：8  P₅：5’atc gcc gga tcc cca cgc cgc ccc gac 3’(Bam HI)(gG下游同源臂上游引物)

SEQ ID NO：9  P₆：5’tgc tcg gaa ttc cgg gcc ggg aag cac gcg 3’(EcoR I)(gG下游同源臂下游引物)

SEQ ID NO：10  P₇：5’aaac tctagacgcccgagcgccatgg3’(TK上游同源臂上游引物)XbaI

SEQ ID NO：11  P₈：5’cgagaattccacttaaggcgtccgt3’(TK上游同源臂下游引物)EcoR I

SEQ ID NO：12  P₉：gacgcgaattcacgcgttaagataca EcoR I(报告基因上游同源臂上游引物)

SEQ ID NO：13  P₁₀：agggtagaattcagaatacctacagcgt EcoR I(报告基因下游引物)

SEQ ID NO：14  P₁₁：tgccggaattctacccgggcggcg(TK下游同源臂上游引物)

SEQ ID NO：15  P₁₂：aggaagcttagccccaccgccagccgag(TK下游同源臂下游引物)

以下引物为鉴定缺失基因的引物

SEQ ID NO：16  P₁₃：5‘acgccgaccgcctcctacaccagat3’(鉴定gG)

SEQ ID NO：17  P₁₄：5′aatcgacgctcaagtcagaggtggcg3’(鉴定gG)

SEQ ID NO：18  P₁₅：5’acgccgaccgcctcctacaccagat3’(鉴定gG)

SEQ ID NO：19  P₁₆：5′atcacatggtcctgctggagttcgtg 3’(鉴定gG)

SEQ ID NO：20  P₁₇：5‘acgccgaccgcctcctacaccagat3’(鉴定gG，完整缺失的)

SEQ ID NO：21  P₁₈：5′atcacatggtcctgctggagttcgtg 3”(鉴定gG，完整缺失的)

SEQ ID NO：22  P₁₉：5’acgggctgggaaagacaacaacgg 3’(鉴定TK)

SEQ ID NO：23  P₂₀：5‘ccggatctagataactgatcataatcagc3’(鉴定TK)

SEQ ID NO：24  P₂₁：5’ctcaagtcagaggtggcgaaacccg3’(鉴定TK)

SEQ ID NO：25  P₂₂：5′gcggacacgtccagcacgaaca3′(鉴定TK)

SEQ ID NO：26  P₂₃：5‘acgggctgggaaagacaacaacgg3’(鉴定TK)

SEQ ID NO：27  P₂₄：5‘gcggacacgtccagcacgaaca3′(鉴定TK)

2.DNA3.1-ZYP质粒的构建(见附图2、6、7、8、9)

根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号：AJ004801)，设计两对引物，以IBRV的DNA为模板，分别扩增gG基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为Hind III、Kpn I，用p1、p2，p5、p6引物分别扩增出约1050bp和887bp的特异性片断，与预期大小相符，如箭头所示(图6、7)，上游同源臂扩增反应条件为95℃ 5min，94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 90s，35cycles，72℃ 10min，hold in 4℃。反应体系：Template 1.0μL，5mmol/LP₁ 5.0μL，5mmol/LP₂ 5.0μL，Taq1.0μL，DMSO 2.0μL，H₂O 29μL；下游同源臂扩增反应条件为95℃4min，94℃ 45s，60℃1min，72℃100s，35cycles，72℃ 10min，hold in 4℃。Template 1.0μL，10×buffer 5.0μL，1mmol/L dNTP 2.0μL，5mmol/L P₅ 5.0μL，5mmol/L P₆ 5.0μL，Taq 1.0μL，DMSO 2.0μL，H₂O 29μL。回收之后连接到pMD18-T载体，测序结果显示，上下游同源臂分别为1050bp和887bp，与GenBank登录序列IBRV(登录号：AJ004801)的同源性分别为98％和99％。将质粒pEGFP-C1用Bam H I和Bgl II双酶切，T4连接酶连接后作为模板，扩增标记基因EGFP，并引入酶切位点为Kpn I、Bam H I，片段大小约为1900bp；将质粒pEGFP-C1用BamH I和Bgl II双酶切修饰，T4连接酶连接后作为模板，扩增报告基因EGFP表达盒，扩增出约1939bp的片段，与预期大小相符，如图8箭头所示。PCR反应条件为：95℃ 5min，94℃ 30s，40℃ 45s，72℃ 90s，35循环，72℃ 10min保存在4℃中，Template 1.0μL，10×buffer 5.0μL；1mmol/L dNTP2.0μL，5mmol/L；P₃ 5.0μL，5mmol/L P₄ 5.0Ml；Taq 1.0μL，DMSO 2.0μL，H₂O 29μL。

将扩增出的上游同源臂及载体pcDNA3.1酶切后用T4连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)16℃连接过夜，同理，下游同源臂及报告基因EGFP也连接到pcDNA3.1中，最终构建成转移载体DNA3.1-ZYP，其质粒的酶切鉴定见图9。

3.重组质粒zPF08-16的构建。(见附图3、10)

根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号：AJ004801)，设计两对引物，以IBRV precipitation DNA为模板，分别扩增TK基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为Xba I、Hind III，用p7、p8，p11、p12引物分别扩增出约1070bp和1150bp的特异性片断，与预期大小相符，如箭头所示(图10)，上游同源臂扩增反应条件为95℃ 5min，94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 90s，35循环，72℃ 10min，保存在4℃中。反应体系：Template 1.0μL，5mmol/L P₇ 5.0μL，5mmol/L P₈5.0μL，Taq 1.0μL，DMSO 2.0μL，H₂O 29μL；下游同源臂扩增反应条件为95℃4min，94℃45s，60℃1min，72℃100s，35循环，72℃10min，保存在4℃中。Template 1.0μL，10×buffer 5.0μL，1mmol/LdNTP 2.0μL，5mmol/L P₁₁ 5.0μL，5mmol/L P₁₂ 5.0μL，Taq 1.0μL，DMSO 2.0μL，H₂O 29μL。回收之后连接到pMD18-T载体，测序结果显示，上下游同源臂分别为1050bp和1150bp，与GenBank登录序列IBRV(登录号：AJ004801)的同源性分别为98％和97％。

4.重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP-1的构建(见附图4)

将重组质粒pcDNA3.1-ZYP进行双酶切，反应体系分别为：限制性内切酶HindIII，KpnI各3μL，重组质粒pcDNA3.1-ZYP 5μL，M buffer，3μL，dH₂O 19μL；限制性内切酶HindIII，KpnI各3μL，重组质粒pcDNA3.14μL，M buffer，3μL，dH₂O 20μL。跑胶分别回收gG上游同源臂1000bp，载体5400bp。再将回收的片段放于反应体系为：T4 DNA ligase(购自宝生物工程(大连)有限公司)0.5μL，T4 DNA ligaseBuffer(购自宝生物工程(大连)有限公司)1μL，回收产物gG上游同源臂5μL，载体3.5μL，16℃连接过夜。再将重组质粒pcDNA3.1-ZYP进行双酶切，反应体系分别为：限制性内切酶BamHI，EcoRI各3μL，重组质粒pcDNA3.1-ZYP 5μL，10x K buffer，3μL，dH₂O 19μL；限制性内切酶BamHI，EcoRI各3μL，含有gG上游同源臂的pcDNA3.1载体4μL，10x K buffer，3μL，dH₂O 20μL。跑胶分别回收gG下游同源臂860bp，载体6400bp。16℃连接过夜，反应体系为：T4 DNA ligase 0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 1μL，回收产物gG下游同源臂5μL，载体3.5μL。

5.zPF08-16-1的构建流程(见附图5)

将重组质粒zPF08-16进行双酶切，反应体系分别为：限制性内切酶XbaI，EcoRI各3μL，重组质粒zPF08-16 5μL，10x M buffer，3μL，dH₂O 19μL；限制性内切酶XbaI，EcoRI各3μL，重组质粒pBSK 4μL，10x M buffer，3μL，dH₂O 20μL。跑胶分别回收TK上游同源臂约1060bp，载体3000bp。再将回收的片段放于反应体系为：T4 DNA ligase()0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 1μL，回收产物TK上游同源臂5μL，载体3.5μL，16℃连接过夜。再将重组质粒zPF08-16进行双酶切，反应体系分别为：限制性内切酶HindIII，EcoRI各3μL，重组质粒zPF08-165μL，10xM buffer，3μL，dH₂O 19μL；限制性内切酶HindIII，EcoRI各3μL，含有TK上游同源臂的pBSK载体4μL，10xM buffer，3μL，dH₂O 20μL。跑胶分别回收TK下游同源臂1130bp，载体4060bp。将回收的片段放于反应体系为：T4 DNA ligase 0.5μL，T4 DNA ligase Buffer1μL，回收产物TK下游同源臂5μL，载体3.5μL。16℃，连接过夜。

6.重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP⁺缺失株的构建及鉴定(见图11)

①在MDBK细胞(购自中国兽药监察所，北京)上增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRV亲本株(株号：Bartha Nu/67株，购自中国兽药监察所)提取牛传染性鼻气管炎病毒基因组DNA，方法如下：待MDBK细胞病变达80％以上，收集病毒，蔗糖梯度离心，25000rpm，处理2h。用TE溶解，加十二烷基磺酸钠(SDS)裂解液裂解及RNA酶水浴30mins，再加蛋白酶K水浴作用30mins；然后用苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)抽提四次，用无水乙醚去除苯酚、氯仿和异戊醇，最后用无水乙醇将病毒基因组沉淀出来。

②将制备好的病毒基因组与线性化(将上下游同源臂从DNA3.1-ZYP转移质粒酶切下来)共转染于MDBK细胞，挑取发绿色荧光的空斑，将其纯化引物，p13、p14，p15、p16 PCR检测，大小约为380bp和480bp结果如图11所示，Line7、8用的引物为p13、p14；Line1、2用的引物为p15、p16.

③Western-blotting鉴定：将.重组ΔgG/EGFP⁺缺失株接种于刚长成单层的MDBK细胞，16小时后收集病变细胞。按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T著，分子克隆实验指南，第二版，金冬雁等译校，科学出版社，1998年)制备样品，进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，结果如图8所示。经过Western-blotting分析，感染重组ΔgG/EGFP⁺缺失株的MDBK细胞泳道，发现其不可以与牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清在约65KD处发生反应，而感染野生型IBRV的MDBK细胞可以反应，如图12所示，说明已将gG基因成功敲除掉。

7.重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG缺失株的构建及鉴定

将纯化好的重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP⁺缺失株作为亲本，进行扩增，提取重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP⁺缺失株基因组DNA，方法同①。将转移质粒DNA3.1-ZYP-1将其线性化，与所述的牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP⁺基因组共转染，操作方法同上述②，挑取不发绿色荧光的空斑，纯化(如图13所示)。通过PCR检测，获得结果如图14所示，片段大小为330bp，与预期的片段大小相符。

8.重组IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺的构建及鉴定

先增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG，然后提取牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG基因组DNA，再与zPF08-16共转染，操作方法同上述①②，进而成功构建了牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺，将该毒株命名为重组牛传染性鼻气管炎病毒GAZH-2009-01，得到如图15所示的结果。通过PCR检测，其鉴定结果如图16所示。由图16，自左至右分别为部分的gG上游同源臂及基因全长加上部分gG的下游同源臂长度为1680bp左右，部分TK上游同源臂及TK基因全长加上部分TK下游同源臂的长度为887bp左右，以牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺为模板，分别用引物p17、p18，p19、p20，p21、p22，分别扩增出330bp，300bp，360bp大小的带。PCR反应条件为95℃ 5min，94℃ 1min 62℃ 1min，72℃min，30个循环，72℃10min，保持4℃中。

该牛传染性鼻气管炎病毒缺失株GAZH-2009-01已于2009年7月3日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：V200910

9.重组IBRVΔgG/ΔTK的构建及鉴定

将质粒zPF08-16中的EGFP报告基因切除，即只含上下游同源臂，将其线性化，与IBRVΔgG/ΔTK/EGFP⁺基因组共转，方法同①，挑取不发绿色荧光的空斑，纯化，通过PCR检测，结果如图13所示。方法如下：Line1：以IBRVΔgG/ΔTK为模板，p23、p24为引物，扩增出约230bp的片段，Line2：同样以IBRVΔgG/ΔTK为模板，p17、p18为引物，扩增出约330bp大小的片段，与预期大小相符，Line 3、4是以IBRV为模板，分别用p17、p18，p23、p24为引物，扩增出部分gG上下游同源臂及gG全长基因序列和部分TK上下游同源臂及TK基因全长，片段大小为分别1670bp，870bp左右。PCR反应条件为：95℃ 5min，94℃1min62℃ 1min，72℃min，30循环，72℃ 10min，保存在4℃中。

Western-blotting鉴定：方法同前③，但不同的是一抗为gG蛋白多抗。经过Western-blotting分析，感染重组IBRVΔgG/ΔTK缺失株的MDBK细胞泳道，发现其不可以与牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清在约65KD处发生反应，而感染野生型IBRV的MDBK细胞可以反应，如图14所示，说明gG基因仍然被敲除掉了。

7.重组IBRVΔgG/ΔTK缺失株的兔体实验

将重组IBRVΔgG/ΔTK双基因缺失株在长满的单层MDBK细胞上增殖，于-80冰箱冻融三次，收毒，测出毒价为5×10⁷PFU/ml，以每只日本大耳兔(购于湖北省疾病预防控制中心)鼻腔内滴灌3×10⁷PFU个病毒，同时以IBRVΔgG及野生型IBRV为对照，攻毒途径及剂量同IBRVΔgG/ΔTK组。定期采集鼻拭子和血液分离血清，并且在第21天打地塞米松。鼻拭子分度结果证明，IBRVΔgG/ΔTK缺失株感染兔子后，急性感染期的时间与IBRVΔgG和野毒比，明显缩短，并且当打地塞米松(3.8mg/kg体重)后，IBRVΔgG和野毒组的病毒都能被再次激活，而本发明制备的IBRVΔgG/ΔTK毒株组则不能被再激活。发明效果见图19所示。

采集血液分离的血清测得各组攻毒后的中和抗体效价结果显示了各个组的中和抗体水平比较接近，其中IBRVΔgG/ΔTK组的中和抗体水平并没有因gG和TK两个基因的缺失而降低(参见图20)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种缺失gG和TK 基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用

<130>

<141>2009-12-17

<160>27

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3215

<212>DNA

<213>牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3215)

<223>

<400>1

aagctttcgc attatccggc ggttgacccc cggctcggag ggacgcgtgt ttgaggcaac  60

ggggcctgct cccgcgcagg agcacgtggt gctcaagatc ggggcctcgg cctctacgct  120

ggccgaggct atgctactgc gaaccttgga ccacgccaac gtggtcaagc tgaaggccgt  180

gctcttccac ggggagctgg tgtgcgtggt gctggcgcgc taccgcgagg acctgcacac  240

gcacctctgg agaatcaacc gcccgctggc gctccccgcg gcgctggcgg tgacgcgggc  300

cgtgctgcgg ggcctcgcgt acctgcactc ccgccggatc gctcaccggg acgtcaaaac  360

ggaaaacgtc ttcctcaacg gcccaggcga cgtgtgcctg ggcgactttg gcgcggcaca  420

cgggccggtc accgagcccc gctactacgg cctggccggc accctggaga cgaactcgcc  480

agagctgctg gcgcgcgcgc gctacgactg ccgcacggac gtgtggagcg cgggcgtcgt  540

cgcgtacgag atgctggcat acccgcgcgc gctgttcgac agccccgcgg gcccgcaggg  600

cgaggacgcc gaggcatcgg gcccgccgac gatcttgggc gaccgcgact gcgcccggca  660

gctgctccgc gtgattcgcc ggctggccgt gcacgccgaa gagtttccac ccagccccac  720

tgaccggctg acccgcaact tcaagcgcca cgcgagcacg cgccgagagc cgcacagccc  780

gtaccgctgc ctggcggtgc tccggctgcc ctgcgacgcc gaccgcctcc tacaccagat  840

gctgaccttt gactttcgcg cgcgccccac cgccgcggag ctgctggagc accccgtctt  900

cggtgcggcc tcggggtagc cccgggggtt tcccgcaaaa ctgaggcata taaggcgcgg  960

gcaccggcaa gtttggcatc cacacttcgc gctgtggaca cgagagcgaa cgcgagcttg  1020

gccgccgtcg ccctaatcct gctctgcggg gccgccgttt tggggcgccc cgcgcccgac  1080

gacctctgtt tcgccgacgt gcgccgcact ggcatggcgc cctcccgccc gctggggccc  1140

gtcctgaacc tagcggcctc ggatttgacc tcgcgggttt cggtgcgcgc ggtggacgct  1200

tcgcgcggct gcgccctggc cctcttggac atggcggaga cggtggtgcc cggcggaccg  1260

cgagccgccg acgtcgtcga cgtcggctgg gcttaccaag acggggactg catggtgcct  1320

ctggcatatc gccagtactt taactgcacg gggggcgcgc tgcccggcca aaacgtctgc  1380

gccgggctct ctgagacccg catccgcggt ggctttggaa cctccgacta cgcgctctac  1440

gggacgtcgc tagtactgcg ccccggcctg tacgaccgcg ggacctacat ctacttcctt  1500

ggatacggcc cagacgacat ctacgtgggc agcgtcacgc tcatggtggg cgccgacatc  1560

cacaaatacc cctgcgggct ggaccgaggg ctcggtgtgg ccctgcacca caagagcgga  1620

ccggcccgac ctctgacaga ggacgacgcc accggcgact gggcctgcgg ctgcttcccc  1680

gcccttgttg aggttgacgc ggtgtggggc aacgtaagcg ccgcagagct gggcctggcc  1740

gacccgatcg actacgccga cgaagggggt gaggtcgaag tgctcgagga cgaagccggg  1800

agcgccagcg gaaacctgcc gcaggacgac cccgaccccg acctcgcaga ttgccggacc  1860

gtcgggctct ttagcgaaag cgacatgttc cggaccgcca gcgggcccga atcgctgctg  1920

atcggcgccg ttgccaagga cgtcctgacg gtgcccctca atctgccgcc cggccgctct  1980

tacgaggccc tgcgaaacgc atcgctggag tgcaactccc gcccgcgcga gaccggcgac  2040

gcagcggtgg tggtgatgtc tctccaggag cccgctcgcc tcgagcgccg ccccgatgcc  2100

cgcgccaccg atccggagtt tgggctcttt ggcctgcccg atgaccccgc cgtgcggcgc  2160

ggcattctca tcggcctcgc gatcgctctg ctggtgctgc tgttttcgct ggtgatcgtg  2220

ctcgtctgcg cctgccggct cgcccgcgca gccaaggctg cgcgacgcgc ccgcgccgcc  2280

acgttcgcca agagcaaccc cgcgtacgag ccgatgctca gcgtctgatc gccggcaccc  2340

cacgccgccc cgaccccgct gtcccgcgtt tacaataaac agttattctt accaacgttg  2400

gtgcgcctgt cgcgtgtcta ttgcgagtta aaccgagtgc cccacccagg cagggcgggg  2460

gttgggccgg gccgcagccc cggctgggta tatatccccg acgggcgact agagatacac  2520

tcgccccgcg cggctgctgc gagcgggcga acatgcaagg gccgacattg gccgtgctgg  2580

gcgcgctgct cgccgttgcg gtgagcttgc ctacacccgc gccgcgggtg acggtatacg  2640

tcgacccgcc ggcgtacccg atgccgcgat acaactacac tgaacgctgg cacactaccg  2700

ggcccatacc gtcgcccttc gcagacggcc gcgagcagcc cgtcgaggtg cgctacgcga  2760

cgagcgcggc ggcgtgcgac atgctggcgc tgatcgcaga cccgcaggtg gggcgcacgc  2820

tgtgggaagc ggtacgccgg cacgcgcgcg cgtacaacgc cacggtcata tggtacaaga  2880

tcgagagcgg gtgcgcccgg ccgctgtact acatggagta caccgagtgc gagcccagga  2940

agcactttgg gtactgccgc taccgcacac ccccgttttg ggacagcttc ctggcgggct  3000

tcgcctaccc cacggacgac gagctgggac tgattatggc ggcgcccgcg cggctcgtcg  3060

agggccagta ccgacgcgcg ctgtacatcg acggcacggt cgcctataca gatttcatgg  3120

tttcgctgcc ggccggggac tgctggttct cgaaactcgg cgcggctcgc gggtacacct  3180

ttggcgcgtg cttcccggcc cgggattacg agcaa                             3215

<210>2

<211>1941

<212>DNA

<213>牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1941)

<223>

<400>2

ggtacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca    60

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa    120

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc    180

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt    240

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg    300

cattagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt    360

ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc    420

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg    480

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat    540

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca    600

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat    660

taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg    720

gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca    780

acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg    840

tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg    900

ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc    960

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag    1020

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc    1080

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac    1140

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag    1200

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc    1260

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc    1320

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc    1380

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc    1440

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg    1500

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag    1560

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac    1620

gagctgtaca agtccggact cagatctcga gctcaagctt cgaattctgc agtcgacggt    1680

accgcgggcc cgggatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca taccacattt    1740

gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa    1800

atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc    1860

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg    1920

tccaaactca tcaatggatc c                                              1941

<210>3

<211>4620

<212>DNA

<213>牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(4620)

<223>

<400>3

ccgcgactgc gtggatgtcc acgcccaggc aagcaaactc taaacgcccg agcgccatgg    60

ccccgatgcc gccacaaaga gcgccgaaat ttcgcccagg cacgccgcgc cgcccgacgc    120

gtctttagcg cacccgccgg cgctgttgcc cgcgtgcctg ctgccgccca ccgggcggcc    180

gctctccccg gcctcagcag ggccggggtc gccggcgggc ggccgcgggg tggcggccac    240

agccgccctt ttgcccgtag ccaggggaag cggctgcccc ttctgccgcc gcggccgcgg    300

ttgctcggct ttgcgtttgc cccgcggcga tcgccccgct cgccgcgaac gcgcgcgcgc    360

gaatggggcg tactcggcga gcccggctat tatagcctca aggcgcgccg cgttgctagc    420

gatcgtctgg gccggcaggc gcgtcactct gagcacgcgc atgccccgct gggagacgaa    480

caccagcacc ggcgctagga ccaccgggtc tgggcccggg ggggcgagat cgcgcacaag    540

ccgggccgag tcgcgcagct gccgcagccc cccgaggcgc tggtccatct tgctgggcgt    600

gttcatgttc gttgaaaaac ggcacgtctt cagctccacg ataagacaga cggcccgggc    660

gtgccctgcc tccgcgaccc ggagtaggca cacgcaatcg ggccgccggc tttgcaggtt    720

tacctcaaag ctcagagaca cgcccacgac ctgcttaaaa acctccgggg cgccaaactt    780

gcccaaaagc tgggcgaggc gcgggcgcag cttctgcgcg ccaaccgccg cgcgtgcgtc    840

gcaagccagc gcctcgtaaa agcggctgtg gcaccggatc ccggcgcgca ggcgcgcacg    900

tcggtcgcgg tcgcgcgcca tggccgagcc cgcgcgcgct ctccgcgtcg tgcgtatcta    960

cctggacggc gcgcacgggc tgggaaagac aacaacgggc cgcgcgctcg cggccgcttc    1020

caccgctggg gagggcgtgc tctttttccc ggagccgatg gcgtactggc gcacgatgtt    1080

tggtacggac gccttaagtg ggatcctcgc ggcgtctgcg cgatgcgccg cagcctcgca    1140

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ggcgccggcg ccggcgctgc gcgacaccct gttcgcggcg ctcaagtgcc gcgagctcta    1740

cccgggcggc gggacgggct tgcccgcggt tcacgcctgg gcgctggacg ccctggccgg    1800

ccgcctcgcc gccctcgagg tgttcgtgct ggacgtgtcc gcggcgccag acgcgtgcgc    1860

ggccgccgta ctggacatgc ggcccgccat gcaggccgct tgcgcggacg gggcggcggg    1920

cgcgacgctg gcgaccctgg cgcgtcagtt cgcgctagag atggcggggg aggccacggc    1980

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cgccagacaa aaaaatgcgg cgcccgctct gcgcggcgct attggcagcg gctgtcctcg    2160

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acagagacgc ccgatacgaa atcgaagagt gggaaatggt ggtcggagcc gggccggccg    2280

tgcacacgtt caccatccgc tgcctcgggc cgcggggcat tgagcgcgtg gcccacattg    2340

caaacctcag ccggctgctg gacgggtaca tagcggtcca cgttgacgtt gcgcgcacct    2400

ctggcctgcg ggacaccatg tttttcctgc cgcgcgcggc cgtcgacaac gcttcggccg    2460

ctgacattcc ggacaccccg gccgtacagt cgcacccggg gctcttcggg gcggcctttt    2520

cctggagcta cttgcaaacg cgccacctcg tagactacga cctggtgccg agccgccccc    2580

tgcaggactg gtacttttcg caggcgcgcg ccgagagcaa cgccgcgcgc ccgccgcccg    2640

ccccgcgcgt cacaccaacg ccggcggggc gggtggccgc ttttgacatc aacgacgtgc    2700

tggccagcgg cccggagcac ttctttgtgc ctgtgcgagc ggaccgcaag cggcgcgagc    2760

gccacgtggc ggattttgcc gcggtgtggc ccgtgtccta catccccgca ggacgggcag    2820

tgctaagctg cgagcgagcc gcggctcggc tggcggtggg gctcggcttc ctgagcgtct    2880

cggtgacgtc gcgggacctc ctgcctctgg agtttatggt cgcgcccgcg gacgccaacg    2940

tgcgcatgat taccgccttt aacgggggcg gcgcttttcc gccacccggg cccgcggccg    3000

gtccgcagcg gcgggcctac gtaatcggct acgggaactc gcggctggac agccatatgt    3060

atctgaccat gcgcgaggtg gcgtcgtacg cgaacgagcc cgctgacttt cgcgcgcact    3120

tgaccgccgc gcaccgggag gcttttttga tgctccggga ggcggcagcc gcgcgccgcg    3180

gaccgagcgc cggccccgcg cccaacgctg cctaccacgc gtaccgggtc gcggcgcggc    3240

tgggactcgc gctctccgcg ctcaccgagg gggcgctcgc ggacggctac gtgctcgcgg    3300

aggagctagt cgaccttgac taccacctca agctgctgtc gcgcgtgctg ctcggcgcag    3360

ggcttggctg cgccgccaac ggccgcgtgc gcgcccgcac catcgcgcag ctggccgtgc    3420

cccgcgagct acgcccggac gcgttcatcc cagagcccgc cggggcggcg ctcgagagcg    3480

tggtggcccg cgggcgcaag ctgcgcgccg tgtacgcttt ttcgggtccg gacgctccgc    3540

tagctgcgcg gctgctggcc cacggcgtgg tgtcggacct ctacgacgcc ttcctgcgcg    3600

gcgagctgac gtgggggccg cccatgcgcc acgcgctttt tttcgccgtc gcggcgtcgg    3660

cgttccccgc ggacgcccag gcgctggagc tcgcgcggga cgtgacgcgc aagtgcacgg    3720

ctatgtgcac cgccgggcac gccacggcgg ccgcgctgga cctggaggag gtatacgcgc    3780

acgtcggcgg cggcgccggg ggcgacgcgg gctttgagct gctggatgcc ttctcgccgt    3840

gcatggcctc tttccgcctg gacttgctcg aggaggcgca cgtgctggac gtgctctcgg    3900

ccgtgcccgc gcgggccgcg ctggacgcct ggctggaggc gcagcccgcg gccgccgcgc    3960

cgaacctcag cgcggcggcg ctcggcatgc tgggccgggg aggcctcttc ggcccggcgc    4020

acgccgccgc gctcgcgccc gagctcttcg cggcgccctg cggcgggtgg ggcgcgggcg    4080

ccgccgtggc gatcgtcccc gtggcgccga acgctagcta tgtcatcacg cgcgcacatc    4140

cgcggcgcgg gctgacgtac accctccagg gaattgacgt cgctaacccc ctgctggtga    4200

cttttgtgcg cggcacgtcg tgcgtgtcgg ccagcggcgc ggtggaggcg cgccgccttg    4260

cggtccccgg cccgctggac gcgtgcgcct actgcggcag cgtgttcgtg cgatacttgc    4320

cctcgggcgc ggttatggac atcgtgctca ttgcggacaa gcgcaccgag gttgagttct    4380

cgcgcggcgc caactctagc atgcccgtct tcaaccctcg cctccacagc gggcgctccc    4440

gcgccatgct gctgttcccc aacgggacgg tcgtaagcgt cctggccttc gccgggcacg    4500

aagcgccgac gttttcgccg gcgtacgtct gggcgtcggt aggcggggcg ctggtcgcgg    4560

gtaccacgat atacgccatc gcgaagatgc tgtgcagctc ggtcccgctc gcgcgcgggt    4620

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tgtggtaccg cttgcgctcg cgttc         25

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cgaactgagg tacctacagc gtgagc       26

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cgcgttagga tccattgatg agtttgg    27

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atcgccggat ccccacgccg ccccgac       27

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cgagaattcc acttaaggcg tccgt    25

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gacgcgaatt cacgcgttaa gataca    26

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agggtagaat tcagaatacc tacagcgt  28

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tgccggaatt ctacccgggc ggcg     24

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aggaagctta gccccaccgc cagccgag    28

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acgccgaccg cctcctacac cagat      25

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aatcgacgct caagtcagag gtggcg    26

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acgccgaccg cctcctacac cagat                  25

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atcacatggt cctgctggag ttcgtg                  26

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acgccgaccg cctcctacac cagat                   25

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atcacatggt cctgctggag ttcgtg                  26

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acgggctggg aaagacaaca acgg    24

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ccggatctag ataactgatc ataatcagc    29

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ctcaagtcag aggtggcgaa accc        24

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gcggacacgt ccagcacgaa ca          22

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acgggctggg aaagacaaca acgg        24

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gcggacacgt ccagcacgaa ca          22

Claims (8)

1.一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV ΔgG/ΔTK，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V200915。

2.权利要求1所述的重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株，其特征在于：

(1)所述的毒株缺失了gG、TK基因；

(2)所述的毒株不含外源基因。

3.权利要求1或2所述的重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株，其特征在于：所述的毒株不含报告基因EGFP。

4.包含权利要求1、2或3所述的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV ΔgG/ΔTK的基因缺失疫苗。

5.权利要求1、2或3所述的重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV ΔgG/ΔTK为载体制备的基因工程疫苗。

6.一种重组牛传染性鼻气管炎病毒GAZH-2009-01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V200910，其特征在于：

(1)所述的毒株缺失了gG、TK基因；

(2)所述的毒株含有报告基因EGFP。

7.权利要求1、2或3所述的保藏编号为CCTCC N0：V200915的重组牛传染性鼻气管炎病毒在制备基因缺失疫苗中的应用。

8.权利要求5所述的保藏编号为CCTCC NO：V200910的重组牛传染性鼻气管炎病毒在重组病毒的应用。

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