CN101792741A - 表达jev免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备方法和应用。具体地说涉及一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒带有SEQ ID NO.1所示的序列，其表面展示JEV结构蛋白E。利用所述重组病毒接种Sf9昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml，制得一种安全、有效的基因工程亚单位疫苗，用于预防猪日本乙型脑炎。

Description

表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用。

背景技术

JE(乙型脑炎)也称日本脑炎(Japanese encephalitis)，是由JEV(日本脑炎病毒)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。主要引起母猪出现繁殖障碍如流产、早产、死胎、木乃伊胎)，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，从而给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

JEV属于黄病毒科，黄病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒。基因组长约11Kb，有单一开放的阅读框，能编码、翻释、加工成3种结构蛋白(囊膜蛋白E、膜蛋白M以及衣壳蛋白C)和7种非结构蛋白。E糖蛋白是JEV主要的免疫原，可诱发机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，保护机体免受病毒攻击，是乙脑病毒的基因工程疫苗研究首选蛋白。

JEV是目前严重威胁养猪业发展的一种重要的病毒，目前对这JE疾病的控制尚无切实有效的方法，防制JE的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等方面的问题受到限制。因此发展新型疫苗来控制JE已是当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组杆状病毒及可作为预防JE感染的亚单位疫苗。

本发明提供的一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒，带有SEQ IDNO.1所示的序列。所述重组杆状病毒表面展示JEV结构蛋白E。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备E基因。制备方法为：用PCR方法扩增了JEV陕西株E基因，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-E质粒；

b、将JEV的E基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含JEV的E基因的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E转入大肠杆菌内进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA。作为优选，所述大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH10Bac。

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。优选地，将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞Sf9中，包装出重组杆状病毒。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒在制备预防猪乙型脑炎的疫苗中的应用。

本发明提供一种制备预防猪乙型脑炎的亚单位疫苗的方法：重组病毒接种昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。上述昆虫细胞优选Sf9昆虫细胞。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的重组杆状病毒BacSC-E可表面展示JEV结构蛋白E，直接经过超速离心得到杆状病毒的同时也就得到了目的蛋白，可以避免现有技术中表达系统(包括传统的杆状病毒表达系统)表达目的蛋白分离纯化的繁琐过程。而，现有技术的表达系统中表达的目的蛋白是分泌到Sf9细胞的培养基中，需要通过蛋白纯化系统来纯化目的蛋白，这样费时费力，代价昂贵，不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产，这也是目前蛋白表达最令人头疼的地方。

2、转座载体中添加eGFP基因，可以通过荧光显微镜直接观察荧光的有无来检测重组病毒的产生情况，大大简化病毒滴度的测定。

3、该重组杆状病毒表面展示的蛋白可与JEV抗体发生特异性反应。

4、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-E可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫。

5、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-E对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。

6、本发明得到的一株重组杆状病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失。

7、本发明所使用的目的基因为JEV(自陕西分离)国内分离株，从而构建的重组杆状病毒可作为我国预防JE的亚单位疫苗。

附图说明

图1是重组转座质粒pBacSC-E构建流程图。

图2是重组病毒BacSC-E感染Sf9细胞绿色荧光蛋白的表达。

图3是共轭聚焦显微镜分析重组杆状病毒BacSC-E的E蛋白在Sf9细胞膜上的展示。

图4是重组杆状病毒BacSC-E的E蛋白的Western blot分析。

图5是免疫电镜分析E蛋白在重组杆状病毒BacSC-E囊膜上的展示。

图5中标号说明：A.重组杆状病毒BacSC-E；B.阴性对照组，重组杆状病毒BacSC。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明用PCR方法扩增了JEV陕西株E基因(具体序列见SEQ ID NO.1)，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-E质粒。酶切pMD18T-E质粒，回收E基因。将回收的结构蛋白基因E插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含JEV的E的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E；将构建的重组质粒转入杆状病毒/昆虫表达系统感受态大肠杆菌DH10Bac内，使其进行同源重组，并用卡那霉素、庆大霉素和四环素进行抗性筛选。重组病毒分别经聚合酶链式反应(PCR)、免疫蛋白印记(western blot)、激光共聚焦显微镜和免疫电子显微镜试验进行检测，筛选获得阳性重组杆状病毒；将筛选的阳性重组杆状病毒分别免疫BALB/c小鼠和猪并进行了免疫学指标的检测。

pBacSC载体的构建过程：

1.1引物的设计

根据发表的杆状病毒AcMNPV(GenBank：AY542374)的gp64基因组序列和绿色荧光蛋白(eGFP)基因(GenBank：EU048697)基因组序列，设计3对特异性引物(P1/P2、P3/P4、P5/P6)。

上游引物P1  5′-TCACCCGGGATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3′，5′端加上SmaI酶切位点；下游引物P2  5′-GTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGCACCACCACCACCACCACGCGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC-3′。上游引物P3  5′-GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCTAGTGTTTGGTCATGTA-3′；下游引物P4  5′-CCCGGTACCTTAATATTGTCTATTAC-3′，5′端加上Kpn I酶切位点。预期扩增片断为267bp，含有GP64信号肽(SP)序列，6个组氨酸(His6)标签，4个多克隆位点(BsshI、NcoI、NheI、SphI)，GP64跨膜区(TM)和GP64胞质区(CTD)基因。

上游引物P5  5′-GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3′，5′端加上BamHI酶切位点。下游引物P6  5′-AAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3′，5′端加上HindIII酶切位点。预期扩增片断为717bp，含有完整的绿色荧光蛋白基因(eGFP)基因。

1.2SP-His6-四个酶切位点-TM-CTD序列(具体序列见SEQ IDNO.2)的扩增

PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、P1/P2，P3/P4各1μL、Taq DNA多聚酶1μL、加水至50μL。反应程序：95℃变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃30sec，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取10μL PCR产物加入1μL 6×Loading Buffer于0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物。

1.3eGFP基因的扩增

PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、P5/P6各1μL、TaqDNA多聚酶1μL、pEGFP-C1质粒(BD Biosciences Clontech)1μL、加水至50μL。反应程序：95℃变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取10μL PCR产物加入1μL 6×Loading Buffer于0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物。

1.4PCR产物与pFastBacTM Dual载体的连接

参照上海生工UNIQ-10胶回收试剂盒说明书回收目的基因。将eGFP基因插入载体pFastBacTM Dual(Life Technologies)的Polyhedrin启动子下游的多克隆位点(MCS)的BamHI和HindIII酶切位点处。同样方法将SP-His6-四个酶切位点-TM-CTD基因插入到已经插入了eGFP基因的pFastBacTM Du al载体的另外一个p10启动子下游多克隆位点(MCS)的SmaI和KpnI酶切位点处，从而构建成功pBacSC载体。具体的操作方法、参数都是按照分子生物学常规方法进行。

下面叙述本发明的具体实施方法：

1.JEV陕西株E基因的克隆

1.1引物的设计

根据发表的JEV SA14标准株(GenBank：U14163)的基因组序列，设计1对特异性引物(P1/P2)。上游引物P1  5′-GCTTCTAGAATGGGGAATCGGGATTTCATAGA AG-3′，5′端加上X ba I酶切位点。下游引物P2  5′-GGG GAATTCGGCATGCACATTGGTCGCTAAAAAC-3′，5′端加上EcoR I酶切位点。预期扩增片断为1500bp，含有完整E基因。

1.2病毒基因组的提取

取出-80℃保存的JEV陕西分离株细胞毒，按照Trizol提取试剂盒提取病毒RNA。取RNA作模板3μL，加入E下游引物P21μL、dNTP 4μL、RNase-Inhibitor0.5μL、AMV 0.5μL、5×AMV Buffer 4μL，加DEPC H₂O至20μL，42℃1h，即得cDNA模板；

PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、P1/P2各1μL、TaqDNA多聚酶1μL、cDNA 6μL、加水至50μL。反应程序：95℃变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃2.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取10μL PCR产物加入1μL 6×Loading Buffer于0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物。

1.3PCR产物的纯化与回收

参照上海生工UNIQ-10胶回收试剂盒说明书回收目的基因。

2.大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取单一菌落，接种到100mlLB培养基中，37℃、250r/min振摇培养到OD600＝0.4～0.6，在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃；4℃、2000r/min离心10min，弃上清，以10ml用冰预冷的75mmol/L CaCl₂、10mmol/L(pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min离心10min，弃上清，以2ml用冰预冷的，含15％v/v、)甘油的75mmol/L CaCl₂、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重悬每管沉淀，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl；标明菌株、体积和日期，置-70℃冰箱冻存备用。

3.E基因片段与pMD18-T载体的连接反应

取0.5μg pMD18-T载体，加3～5倍摩尔量的E DNA片段，2μl 5×连接缓冲液加水定容至10μl，最后加入1Weiss单位T4DNA连接酶，混匀并离心，16℃连接1～4h，取7μl连接反应液转化上述E co.li感受态细胞。

4.转化

将适量连接产物DNA(体积：质粒＜1μl，连接产物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl上述感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90s，冰浴冷却2min；加入200μl 37℃预热的LB培养基，37℃150r/min振摇培养50min；取培养液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14h～16h后，得到转化菌落。

5.质粒的提取(碱裂解法)

挑取单个上述转化菌落，接种到2ml含50μg/ml Amp的LB培养液(下同)中，37℃250r/min振摇培养12～16h；将1.5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30s，弃上清。以200μl冰预冷的溶液I(50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重悬沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀，加入200μl用冰预冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，颠倒混匀，4℃12000r/min离心10min，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均匀，置-20℃30min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤抽干。以20μl含终浓度20μg/ml RNA酶(无DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s·HCl，pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20℃保存。

6.重组质粒pMD18T-E的酶切鉴定

将1.0μg质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18μl，分别加入2～3单位EcoR I和Xba I限制性内切酶及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，琼脂糖凝胶电泳检查。酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。完全酶切后，-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。

7.携带JEV E基因重组杆状病毒转座载体质粒的构建

用Xba和EcoRI双酶切pMD18T-E质粒，回收E基因，将其插入到同样经过Xba I和EcoRI双酶切的杆状病毒转座载体pBacSC，进行连接反应，构建含有E基因的杆状病毒转座载体pBacSC-E。具体试验操作过程与pMD18T-E重组质粒构建相同。

8.同源重组

8.1制备“三抗”LB平板

将高压蒸汽灭菌后的LB液体培养基(含1.5％琼脂粉)置超净台内，待其温度冷却至50℃左右时加入以下三种抗生素至终浓度为：卡那霉素(Kan)50μg/mL、庆大霉素(Gm)7μg/ml和四环素(Tet)10μg/ml，并加入X-gal(终浓度为150μg/mL和IPTG(终浓度为40μg/mL)混匀后立即铺制平板。

8.2转化过程

取重组质粒pBacSC-E 10μL(4μg)加入100mL制备好的感受态大肠杆菌DH10Bac管内，轻轻混匀，将离心管放入冰水混合物中冰浴30min，将离心管放入42℃热休克2min，再迅速移至冰水中放置5min。加入灭菌的LB液体培养基900mL，37℃摇床200rpm/min振荡培养1h，加入卡那霉素(终浓度为50μg/mL)、庆大霉素(终浓度为7μg/ml)后继续摇床200rpm/min振荡培养4h。6000rpm/min离心10min，保留细菌沉淀及LB液体约300μL，用新鲜的LB液体培养基将其以10^-1，10^-2和10^-3不同的稀释度稀释。然后各取100μL分别均匀涂布于“三抗”LB平板，将平皿于37℃倒置培养24～48h，观察蓝白菌落的生长情况。

8.3白斑鉴定

用灭菌的牙签挑取5～10个分隔良好的白色菌落，再次接种于含“三抗”的平板上，37℃倒置培养24h，观察菌落表型的变化，进一步证实为白色菌落。再用灭菌牙签挑取6个白色菌落和2个蓝色菌落，分别放入装有6ml LB培养基的试管中，再加入卡那霉素(Kan)50μg/mL、庆大霉素(Gm)7μg/ml和四环素(Tet)10μg/ml，三种抗生素，37℃摇床200rpm/min振荡培养过夜。

8.4重组杆状病毒DNA的提取与制备

将上述培养菌液分装至1.5mL的Eppendorf管中，12000rpm/min离心1min。弃净上清，加入300μL溶液I(50mmol/L Tris-HCL pH8.0，10mmol/L EDTA，灭菌备用)，重悬沉淀。加入300μL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，温和颠倒混匀，置冰水浴中5min，使细菌裂解。缓慢逐滴加入300μL溶液III(5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml，pH5.5)，加入过程中轻微摇动，置于冰上10min。12000r/min离心10min，同时标好另一干净的Eppendorf管，加入800μL异丙醇。轻轻将上清转移至已加好异丙醇的新管中，注意不要吸入蛋白沉淀，将离心管颠倒数次混匀，置于室温15min，12000r/min离心10min，弃上清。分别用75％和100％的乙醇各洗涤一次，14000r/min离心5min，弃上清，风干(无菌条件下)1h，溶于40μL TE缓冲液。

9.重组杆状病毒DNA转染Sf9细胞

在6孔板中每个孔中加入Sf9昆虫细胞9×10⁵ cells，培养基用2mL Sf900IISFM，含有双抗浓度为0.5×终浓度(50units/ml penicillin，50μg/ml streptomycin)。细胞来自培养3～4天的处于对数生长期的，活力大于97％细胞，并置于27℃培养箱中1h；在这1h中准备下列实验。取2支1.5ml Eppendorf管标为A、B，分别加入100μL无抗生素的Sf900II SFM培养液，A管中加入5μL的上述重组杆状病毒DNA，混匀。B管中加入6μL脂质体转染试剂Cellfectin，混匀(注意脂质体是一个油脂的悬浮物，可能会沉淀，使用前颠倒管子5～10次，将其混均匀)。混合A管和B管，轻轻混匀，置室温45min，使其形成Cellfectin-DNA混合物。取已经贴壁生长良好的Sf9单层细胞，弃旧培养液，用无抗生素的Sf900II SFM培养液洗涤1遍。取上述Cellfectin-DNA混合物，加入0.8ml不含抗生素的Sf900II SFM混合均匀。从细胞中吸弃清洗用的培养基，将混合均匀的脂质体和重组DNA混合物铺到细胞上，覆盖细胞，放置28℃培养6h后。吸弃混合物，加入含抗生素的Sf900II SFM培养液继续培养，每天观察细胞形态表现。收集细胞用于表达蛋白的分析，同时收集培养上清作为原毒种，分小管贮存于-20℃，用于重新感染Sf9细胞。

10重组杆状病毒BacSC-E的PCR鉴定

取病毒的细胞培养物2mL，反复冻融3次，12000r/min离心15min，取上清437.5μL，加入12.5μL蛋白酶K(20mg/mL)和50μL SDS液(10％)，37℃水浴30min；等体积酚/氯仿抽提一次，取上清；等体积氯仿复提，取上清；加入1/10体积NaAc(2mol/L)和2倍体积无水乙醇，-20℃放置2h；4℃15000r/min离心15min，取沉淀；70％乙醇洗涤一次，沉淀用30μL TE溶液溶解，即为提取的DNA，-70℃保存备用。PCR时取5μL即可。PCR反应条件为95℃预变性5min后，按95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min共30个循环，最后72℃延伸10min。

11.重组杆状病毒量的放大与浓缩

悬浮培养昆虫细胞待细胞浓度达1×10⁶cell/ml，以MOI＝1(Multiplicity ofinfection，MOI)的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒会在宿主昆虫细胞中复制达到病毒量放大的目的。感染3～4天后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液即完成病毒量的放大。

12.重组病毒表达产物的检测

12.1荧光显微镜观察鉴定重组病毒

重组pBacSC-E转座载体上带有eGFP基因，可以表达绿色荧光蛋白，可以通过荧光显微镜观察发出荧光的细胞数量来确认转染阳性细胞。转染后48h后细胞呈现明显的CPE变化，转染细胞出现荧光(见附图2)，产生了具有感染活性的重组杆状病毒BacSC-E。

12.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将扩增后的纯化重组病毒BacSC-E，以10MOI分别接种于10ml培养瓶1×10⁶个/ml Sf9细胞中，同时设杆状病毒阴性对照组和细胞对照，至75％细胞出现明显病变时，弃培养液，用1ml的TEN(40mmol/L Tris·Cl pH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱细胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗3次，加60μl裂解缓冲液(10mmol/LTris·Cl，pH7.4，lmmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min离心5min，-20℃冻存。

取30μl细胞裂解液与等量2×样品缓冲液(100mmol/L Tris Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，使用前加入2.5％β-巯基乙醇)混匀，于10％凝胶进行SDS-PAGE电泳。

12.3免疫印迹(Western blot)

经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tri s Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5～10min，将猪抗JEV阳性血清用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3～5次，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(1∶4000)室温感作2h，洗涤3～5次后，每次5～10min，最后用蒸馏水清洗一次，夹出硝酸纤维素膜稍晾干，配制ECL(enhancedchemiluminescence)工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟，显影定影后蛋白质条带可清晰显示在X光胶片上。

12.4激光共轭聚焦显微镜分析

在6孔培养板中放入无菌载玻片，Sf9细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1×10⁶。细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组杆状病毒BacSC-E在MOI＝10下感染。2天后吸弃培养基，再添加1ml甲醇∶丙酮(1∶1)混合液于-20℃冰箱下固定5分钟，之后再加入1ml PBS(phosphate-bufferedsaline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。接着以1ml的2％BSA(bovineserum 26 albumin)在37℃下反应30min。之后再加入1mlPBS(phosphate-buffered saline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。接下来分别加入猪抗JEV阳性血清(1∶100)在37℃下反应1h。以1ml的PBS清洗3次后，再加入FITC标记的羊抗猪IgG(1∶100)37℃下反应1h。最后再以1ml的PBS清洗3次。在激光共轭焦显微镜(confocal microscope，TCS SP2，Leica，Germany)下观察，带有E重组蛋白质细胞膜会被FITC染色而呈现绿色荧光。

12.5免疫电子显微镜检测

取15μl纯化的昆虫杆状病毒液滴于蜡板上，将封有炭膜的铜网有炭膜的一面向下悬浮在昆虫杆状病毒液面上，吸附30min。滴入含有1％BSA的PBS液1滴于蜡板上，将铜网有炭膜的一面轻浮于液滴上室温封阻20min，然后用PBS液洗涤3次，每次5min。洗涤的方法和封阻的方法相同，用滤纸在网缘将水吸干。将铜网分别浮于猪抗JEV阳性血清(1∶50)液滴上(大约15μl)，室温30～60min.同时设立阴性对照组，不加第一抗体，用PBS代替。PBS漂洗洗3次，每次5min，滤纸吸干。将铜网悬浮于胶体金标记的羊抗猪IgG第二抗体液滴上(1∶50倍稀释)，室温孵育30～60min。PBS漂洗洗3次，每次5min，滤纸吸干。将铜网悬浮在2％的磷钨酸液滴上负染2min，在室温干燥，电镜观察。

13.重组病毒BacSC-E表达产物的检测结果

筛选获得的重组杆状病毒BacSC-E接种Sf9昆虫细胞后，在感染细胞的细胞膜处，可观察到特异的一圈黄绿色荧光，说明表达产物是特异的而且表达产物展示在Sf-9昆虫细胞的细胞膜上(见附图3)。经Western blot分析，重组毒接种的细胞培养物出现了与猪抗JEV阳性血清结合的大小为53kD的特异带(见附图4)，证明了E蛋白在Sf9昆虫细胞中得到了表达。重组毒pBacSC-E免疫电子显微镜检测到与猪抗JEV阳性血清结合的金粒子，并且金粒子位置在重组病毒膨大的囊膜蛋白处，表明E蛋白被展示在杆状病毒的囊膜上(见附图5)。

14.重组病毒的免疫原性研究

14.1重组病毒免疫小鼠

重组病毒接种Sf9昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞。-40℃/37℃反复冻融3次，3000r/min离心10min，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。

BALB/c雌性小鼠12只，体重18～20g，随机分2组，采取腹腔注射方式，分别注射重组杆状病毒BacSC-E和不含E基因的杆状病毒BacSC 0.5ml。上述2组均免疫二次，间隔14天，最后一次免疫后的第14天摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测抗JEV抗原的IgG抗体以及进行中和试验检测免疫小鼠的血清中和抗体滴度。无菌取其脾脏分别进行T淋巴细胞增值试验和用流式细胞仪分析检测T淋巴细胞亚类的数量。

14.2脾脏免疫学指标的检测

14.2.1脾脏单淋巴细胞悬液制备

颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×10⁷个/ml备用。

14.2.2脾T淋巴细胞亚类数量的检测

取脾细胞悬液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，离心10min，洗细胞两次，在0.5ml PBS细胞悬浮液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD4+和CD8+单克隆抗体(此抗体用PBS按1∶10稀释)室温避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200μl PBS悬浮，待上流式细胞仪检测。FACS检测10000个细胞，所得数据进行统计学处理。

14.2.3T淋巴细胞增值试验

(1)脾细胞的制备：将小鼠捕杀、采血、取脾、研磨、过滤，最后一次用Hank’s液洗涤，弃上清，再用含有10％犊牛血清的1640培养液1ml重悬脾细胞，调整细胞浓度至2×10⁶个/ml。

(2)在96孔板中每孔加入淋巴细胞悬液100μl，对应孔中分别加入特异性刺激原ConA(10μg/ml)100μl作为阳性对照组、20μg/ml重组杆状病毒特异性刺激原100μl为试验组以及1640培养基100μl为非刺激抗原孔，不同刺激原重复3个孔；以只加200μl 1640培养基无淋巴细胞的孔作为本底。

(3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，避光培养4h；每孔吸弃100μl培养液，再加入DMSO 100μl，10min内用酶联免疫检测仪630nm测定个孔OD值。

(4)结果计算：SI＝(特异刺激原的平均OD值-本底值)/(非刺激原的平均OD值-本底值)

14.3ELISA测定免疫小鼠血清中抗JEV抗体

ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。在酶联免疫仪450nm测量各孔OD值。

14.4重组病毒在本体动物猪的免疫学研究

同小鼠的免疫学和检测方法。

检测结果：

获得的重组杆状病毒BacSC-E提取基因组后进行PCR扩增，得预期大小的目的片段。激光共聚焦显微镜观察试验、免疫金电子显微镜观察和Westernblot检测均为阳性结果，说明构建的重组杆状病毒BacSC-E可分别表达JEV糖蛋白E囊膜蛋白。重组杆状病毒BacSC-E可在昆虫细胞中表达，且重组病毒具有良好的遗传稳定性。将重组杆状病毒BacSC-E大量扩增后进行小鼠免疫实验，可在免疫小鼠血清中检测到抗JEV的抗体，表明重组病毒BacSC-E刺激小鼠机体产生了特异性体液免疫。免疫小鼠脾T细胞亚类数量的检测及淋巴细胞增殖试验结果均显示小鼠产生了特异性细胞免疫。

研究结果表明，本发明所构建的重组杆状病毒是一种安全、有效的基因工程亚单位疫苗，具有开发成为用于预防JE的疫苗的良好前景。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1485

<212>DNA

<213>猪乙型脑炎病毒E基因(Japanese encephalitis virus E gene)

 

<400>1

atggggaatc gggatttcat agaaggagcc agaggagcca cttgggtgga tctggtgttg    60

gaaggagata gctgtttgac aatcatggca aacgacaaac caacactaga tgtccgcatg    120

atcaacattg aagctagcca acttgctgaa gtcaggagtt actgctatca cgcttcagtc    180

actgacattt caacggtggc tcgatgcccc acgactggag aagcccacaa cgaaaaacgt    240

gctgacagca gctacgtgtg caaacaaggc tttactgatc gtggatgggg aaatggatgt    300

ggactcttcg ggaaaggaag cattgacaca tgcgcaaaat tttcttgtac cagtaaggcc    360

attggaagaa tgatccaacc agagaacatc aagtacgagg ttggcatatt cgtgcacgga    420

accaccacct cggaaaacca tgggaattac tcagcgcaag taggagcgtc tcaagcagca    480

aagtttactg taaccccaaa tgctccttca ataaccctca agcttggtga ttatggagaa    540

gtcacactgg attgtgaacc aaggagtgga ctgaacactg aagcgttcta tgtcatgacc    600

gtgggttcga agtcattttt agtccatagg gaatggttcc atgacctttc tcttccctgg    660

acgtccccct caagcacggc atggagaaac agagaactcc tcatggaatt tgaagaggca    720

catgccacaa aacaatccgt cgtagctctt gggtcacagg agggaggcct ccatcaagcg    780

ttggcaggag ccatcgtggt ggagtactcg agctcagtga agttgacatc aggtcacctg    840

aaatgcaggc taaaaatgga caaactggct ctgaagggca cgacttatgg catgtgtaca    900

gaaaaattct cgttcgcgaa gaatccagcg gacacaggcc atggaacagt tgtcattgag    960

ctcacatatt ctggaagtga tggtccctgt aaaattccga ttgtctcagt cgcgagttta   1020

aacgacatga cccctgtggg gaggctggta acagtaaacc ccttcgtcgc gacatctagc   1080

tccaactcaa aggtgctggt tgagatggaa cctccctttg gagactctta tatcgtggtt   1140

gggagagggg acaagcagat taaccatcac tggcacaaag ctggcagcac gctgggcaaa   1200

gctttctcaa caactttgaa aggggctcag agactagcag cgctaggtga cacagcctgg   1260

gacttcggct ccattggagg ggtgttcaac tccataggga aagctgttca ccaagtattt   1320

ggcggtgcat tcagaacgct ctttggggga atgtcttgga tcacacaagg actaatgggg   1380

gccttacttc tttggatggg tgtcaatgca cgagatcggt caatcgccct ggcttttctg   1440

gccacgggag gtgtgctctg gtttttagcg accaatgtgc atgcc                   1485

 

<210>2

<211>252

<212>DNA

<213>SP-His6-四个酶切位点-TM-CTD基因(signal peptide sequence，sex histidine tag，fourrestriction site，transmembrane domain，cytomere domain gene)

 

<400>2

atgctactag taaatccacc agtcaaaggc ttcaataagg agcaagatgg taagtgtttt    60

caacacacag ctatatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcgcac    120

caccaccacc accacgcgcg cccatgggct agcgcatgct gtagttaact tcatgtttgg    180

tcatattaat tgttttgtaa ttagatttta tttttgtact gtatgattag aaaccgtaat    240

agacaatatt aa                                                        252

Claims (9)

1.一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒带有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒表面展示JEV结构蛋白E。

3.一种权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤包括：

a、制备E基因；

b、将上述的E基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含JEV的E基因的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E转入大肠杆菌内进行同源重组，得重组杆状病毒DNA；

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。

4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述E基因的制备方法为：用PCR方法扩增了JEV陕西株E基因，并将其克隆到pMDl8-T载体，构建了pMDl8T-E质粒，酶切pMDl8T-E质粒，回收E基因。

5.根据权利要求3所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤d所述重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞的方法为：将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞中。

6.根据权利要求3所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤c所述大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH10Bac。

7.如权利要求1或2所述的重组杆状病毒在制备预防猪乙型脑炎的疫苗中的应用。

8.一种制备预防猪乙型脑炎的亚单位疫苗的方法，其特征在于，重组病毒接种昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞。

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