TWI711628B - 重組桿狀病毒及其用於偵測節肢動物媒介病毒的用途 - Google Patents

Abstract

在此揭示一種適合用於偵測受測個體之生物樣本內是否存在有節肢動物媒介病毒的重組桿狀病毒。由偵測所得到的資訊能夠用於診斷受測個體是否被節肢動物媒介病毒感染，致使個體能得到適當的治療。

Description

重組桿狀病毒及其用於偵測節肢動物媒介病毒的用途

本揭示內容是關於重組桿狀病毒。具體而言，本揭示內容是關於具有一節肢動物媒介病毒之至少一病毒蛋白的重組桿狀病毒，且該病毒蛋白表現在所述重組桿狀病毒上，以及利用所述重組桿狀病毒偵測生物樣本中節肢動物媒介病毒的用途。

多種由有機體引起的疾病是藉由昆蟲或其他節肢動物(例如，蜘蛛(spider)、蟎(mites)、蜱(tick)和多足動物(myriapod))所攜帶或於其體內繁殖後而傳播。由於上述多種昆蟲或節肢動物會叮咬人類和牲畜，以及破壞植物，使其能夠傳播各式各樣的疾病，導致傷亡及經濟損失。節肢動物媒介的傳染病，包含瘧疾(malaria)、登革熱(dengue fever)、日本腦炎(Japanese encephalitis)、屈公熱(Chikungunya fever)等皆由蚊子傳播，其造成高發病率及高死亡率。

目前主要偵測節肢動物傳播病原的方法，包含先從宿主中分離出病原，再定序其DNA後，以進行鑑定。由於這些病原具有高傳染力和高致死性，為了保護第一線操作者，分離和鑑定的過程需在至少符合生物安全第二級規範之設備下操作。再者，培養及分離病原的過程耗時，並且DNA定序分析鑑定需受特別訓練且合格的技術人員及精密儀器設備方能執行，使得目前偵測方法於臨床上或本領域操作上具有其困難。

在某些實例中，經純化的節肢動物媒介病毒蛋白是作為抗原，用以偵測節肢動物媒介病毒。與上述偵測方法的步驟類似，製備純化後的病毒蛋白不僅耗時，且需消耗大量人力，對於本技術領域而言不符經濟效益。

有鑑於此，目前本技術領域中亟需一種安全且容易操作的試劑和/或方法，用以偵測節肢動物媒介病毒，特別是高危險性和高致死性的節肢動物媒介病毒，所述試劑和/或方法不需生物安全第二級設備和進行DNA定序分析之精密設備，且成本不高，同時能夠在更短的時間內提供結果，使得受感染的個體可即時接受治療和/或進行管控，以避免疾病和/或病原擴散。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容係關於管控藉由接觸節肢動物傳播的人類疾病。當節肢動物（例如，昆蟲和蜱）與病原物理接觸或受病原生物性感染時，所述節肢動物可作為傳播人類疾病的媒介。本揭示內容是基於發現一種重組桿狀病毒，其套膜上表現有節肢動物媒介病原之至少一病毒蛋白，所述重組桿狀病毒可以作為抗原偵測致死性高的病原，其特別是指需要採取至少第二級生物安全防護措施等級的病原。因此，本揭示內容重組桿狀病毒提供一快速、安全、容易操作且經濟實惠的工具，能夠使前線操作人員不用暴露在高危險性病原下進行偵測。再者，所述偵測方法亦可用於早期診斷一受測個體是否被病原所感染，以即時採取治療所述個體的必要處置（即，藥物和檢疫等），並避免疾病或病源散佈。

因此，本揭示內容是關於一種重組桿狀病毒，其特徵在於其具有節肢動物媒介病毒之至少一病毒蛋白，並表現於重組桿狀病毒的套膜上。

依據本揭示內容之實施方式，所述節肢動物媒介病毒可以是來自於非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae )、彈狀病毒科(Rhabdoviridae )、布尼亞病毒科(Bunyaviridae )、黃病毒科(Flaviviridae )、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae )、呼腸弧病毒科(Reoviridae )或披膜病毒科(Togaviridae family) 之病毒種(specie)。

在一實施方式中，所述節肢動物媒介病毒是非洲豬瘟病毒科之非洲豬瘟病毒(Asfivirus)。

在部份實施方式中，該節肢動物媒介病毒是來自於黃病毒科之病毒種，且選自於以下所組成之群組：登革熱病毒(dengue virus, DENV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、趨肝性病毒(pegivirus)、西尼羅病毒(West Nile virus)、黃熱病毒 (yellow fever virus, YFV)和茲卡病毒 (Zika virus, ZIKV)。

依據本揭示內容某些較佳的實施方式，所述黃病毒科之病毒蛋白，包含但不限於Pre-M、E及其組合。

在具體的實施方式中，所述重組桿狀病毒套膜上表現至少一JEV病毒蛋白。在其他實施方式中，重組桿狀病毒套膜上表現至少一DENV病毒蛋白。在其他實施方式中，所述重組桿狀病毒套膜上表現至少一ZIKV病毒蛋白。

在某些實施方式中，所述節肢動物媒介病毒是來自於披膜病毒科之病毒種，且選自於以下所組成之群組：巴馬森林病毒(Barmah Forest virus)、屈公病毒(Chikungunya virus, CHIKV)、東部馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、奧絨絨病毒(O’nyong-nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)、德國麻疹病毒(Rubella virus)、生里基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、西部馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus)和委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezulean equine encephalitis virus)。

依據本揭示內容某些實施方式，披膜病毒科之病毒蛋白是選自以下所組成之群組：E、E1、E2、E3和其組合。

在一較佳的實施方式，所述節肢動物媒介病毒是CHIKV；且本揭示內容重組桿狀病毒的套膜上表現有CHIKV病毒蛋白E1和E2，其可用以捕捉生物樣本內CHIKV之抗體，所述生物樣本是經CHIKV感染個體的血清。

依據本揭示內容其他實施方式，黃病毒科之病毒蛋白包含但不限於，Pre-M、E及其組合。

在其他較佳實施方式中，所述節肢動物媒介病毒是JEV；且本重組桿狀病毒的套膜上表現有JEV病毒蛋白Pre-M和E，因此，使其能夠用於捕捉生物樣本（如，經JEV感染個體的血清）內所存在的JEV之抗體。

本揭示內容第二態樣是關偵測生物樣本內節肢動物媒介病毒的方法。所述方法包含以下步驟：混合所述生物樣本和本重組桿狀病毒；在一免疫分析中，偵測存在於生物樣本內節肢動物媒介病毒之抗體與本重組桿狀病毒所形成的複合物。

依據本揭示內容之實施方式，所述抗體可以是IgM或IgG。

依據本揭示內容之實施方式，所述免疫分析可以是酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)。

舉例而言，適用於本揭示內容方法的生物樣本，包含但不限於，全血樣本、 血漿樣本、血清樣本、尿液樣本、黏液樣本及其純化或過濾之形式。在較佳的實施方式中，所述生物樣本是血清樣本。

依據本揭示內容之實施方式，所述節肢動物媒介病毒可以是非洲豬瘟病毒科、彈狀病毒科、布尼亞病毒科、黃病毒科、正黏液病毒科、呼腸弧病毒科或披膜病毒科之病毒種。

在某些實施方式中，所述節肢動物媒介病毒是來自於黃病毒科之病毒種，且選自於以下所組成之群組：登革熱病毒、C型肝炎病毒、日本腦炎病毒、趨肝性病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒和茲卡病毒。在特定的實施方式中，所述重組桿狀病毒的套膜上表現有至少一DENV病毒蛋白。在其他實施方式，所述重組桿狀病毒的套膜上表現有至少一JEV病毒蛋白。

在其他實施方式，所述節肢動物媒介病毒是來自於披膜病毒科，且選自於以下所組成之群組：巴馬森林病毒、屈公病毒、東部馬腦炎病毒、奧絨絨病毒、羅斯河病毒、德國麻疹病毒、生里基森林病毒、辛德畢斯病毒、西部馬腦炎病毒和 委內瑞拉馬腦炎病毒。

在一較佳實施方式，所述方法包含以下步驟：混合受測個體的血清樣本和重組桿狀病毒，其中所述重組桿狀病毒的套膜上表現有CHIKV之病毒蛋白E1和E2；以及利用免疫分析法(例如，ELISA)偵測存在於血清樣本內的CHIKV 抗體和重組桿狀病毒所形成的複合物。

在其他較佳實施方式，所述方法包含以下步驟：混合受測個體的血清樣本和重組桿狀病毒，其中所述重組桿狀病毒的套膜上表現有JEV之病毒蛋白Pre-M和E；以及利用免疫分析法(例如，ELISA)偵測存在於血清樣本內的JEV抗體和重組桿狀病毒所形成的複合物。

本揭示內容第三態樣是關於一種生物樣本內節肢動物媒介病毒的套組。所述套組包含至少一試劑，用以偵測存在於生物樣本內的節肢動物媒介病毒之抗體，其中所述試劑包含本重組桿狀病毒；一容器，用以容置所述試劑；以及一說明，其與所述容器相關，並指示如何使用本重組桿狀病毒偵測存在於生物樣本內的抗體。

依據本揭示內容較佳之實施方式，所述抗體是IgM或IgG。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

在此揭示用以偵測節肢動物媒介病原的重組桿狀病毒，方法及套組，所述節肢動物媒介病原如披膜病毒科，其包含屈公病毒(CHIKV)，東部馬腦炎病毒，奧絨絨病毒，羅斯河病毒，德國麻疹病毒，辛德畢斯病毒等；以及黃病毒科包含日本腦炎病毒(JEV)，黃熱病毒 (YFV)，茲卡病毒(ZIKV)等。

1. 名詞定義

在此所述「節肢動物媒介病毒(anthropod-born virus)」一詞是指藉由直接或間接接觸與病原物理接觸或經由病原生物性感染的節肢動物，所述病毒能夠直接或間接引起人類疾病。

所述「桿狀病毒」一詞是指節肢動物專一性，雙股DNA病毒，其可用以控制蟲害。所述核多角病毒(nuclear polyhedrosis viruses, NPV)屬於桿狀病毒次群。多種能夠感染棉鈴蟲 (cotton bollworm)、玉米夜蛾 (Helicoverpa zea)、煙夜蛾(tobacco budworm)、菸芽夜蛾(Heliothis virescens)、道格拉斯冷杉草蛾(Douglas fir tussock moth)、花旗松毒蛾(Orygia pseudotsugata)、吉普賽蛾(gypsy moth)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、苜蓿蛾(alfalfa looper)、加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)、歐洲松葉蛾(European pine sawfly)、松黃葉蜂(Neodiiprion sertifer)和蘋果蠹蛾(codling moth; Cydia pomonella)之桿狀病毒皆適用於作為表現其他節肢動物媒介病毒之病毒蛋白的載體，所述節肢動物媒介病毒是指除了桿狀病毒本身之外的病毒，較佳是指危險且具有致命性的節肢動物媒介病毒。原則上，具有廣泛宿主的桿狀病毒較佳，例如，加州苜蓿夜蛾核多角病毒(multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)。舉例而言，適用於本發明的桿狀病毒包含，但不限於， AcMNPV、芹菜夜蛾(Anagrapha falclfera) MNPV (AfMNPV)、藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis) MNPV (AgMNPV)、家蠶蛾 (Bombyx mori) MNPV (BmMNPV)、油桐尺蛾單一核多角病毒(Buzura suppressaria single nucleopolyhedrovirus, BsSNPV)、番茄夜蛾 (Helicoverpa armigera) SNPV (HaSNPV)、棉蛉蟲 (Helicoverpa zea) SNPV (HzSNPV)、舞毒蛾(Lymantria dispar) MNPV (LdMNPV)、花旗松毒蛾核(Orgyia pseudotsugata) MNPV (OpMNPV)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) MNPV (SfMNPV)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) MNPV (SeMNPV)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) MNPV(TnMNPV)。

在此所述「抗原(antigen)」一詞，是指本技術領域已知具有免疫原性的物質(即，免疫原(mmunogens)，以及不會誘導免疫反應的物質，即，身體的防禦機制不會對外來物質產生反應。 在此所述「抗原」是指全長蛋白，及包含抗原決定位的胜肽片段。

所述「個體(subject)」或「患者(patient)」一詞可交互使用，且在此係指易受節肢動物媒介病毒感染的哺乳類(mammal)(包含，人類)。所述「哺乳類」一詞涵蓋哺乳綱的所有成員，包含：人類、靈長類動物、家畜和農畜。舉例而言，所述家畜或農畜可以是兔子、豬、羊和牛。所述哺乳類亦可涵蓋動物園或競賽用動物、寵物，以及齧齒類(如，小鼠和大鼠)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。再者，所述「個體」或「患者」包含可從本揭示內容的處置方法得到益處的動物。舉例而言，所述「個體」或「患者」包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竹鼠、豬、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。

所述「生物樣本」一詞是指取自於疑似受節肢動物媒介病毒感染或受節肢動物媒介病毒感染哺乳類（包含，人類）的全血樣本、血漿樣本、血清樣本、 尿液樣本和黏液樣本。在經由本重組桿狀病毒、套組和/或方法偵測前，所述所述生物樣本可以不經稀釋或被稀釋。當對抗節肢動物媒介病毒的抗體存在於生物樣本中時，本發明套組和/或方法中的重組桿狀病毒能夠專一性結合至所述抗體以形成 複合物，且其可藉由免疫分析偵測(如，ELISA)。相反地，若對抗節肢動物媒介病毒的抗體不存在於生物樣本中，本發明套組和/或方法中的重組桿狀病毒則不會結合到所述抗體，亦不會有免疫複合物形成。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有數值參數皆經「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。

2. 所述重組桿狀病毒

本揭示內容主要提供一種重組桿狀病毒，其作為抗原用以捕捉樣本內致死性病原(lethal pathogen)的抗體，所述致死性病原特別是指需要至少生物安全第二級防制感染的病原。利用本揭示內容之重組桿狀病毒可以排除使用昂貴的需符合生物安全第二級規範的操作設備及鑑定病原的精密儀器，亦不需要合格的操作人員所進行且耗時的定序分析（如，RT-PCT）。最重要的是本揭示內容之重組桿狀病毒能夠確保第一線操作人員避免其如同以往操作習知偵測所述病原的方法，需暴露於高危險性病原中。因此，本重組桿狀病毒提供一種安全、快速、容易操作，且符合經濟效益的工具，其用以偵測高危險性病原，特別是高危險性節肢動物媒介病毒。此外，本發明的偵測方法另一目的在於提供早診斷受測個體是否感染致死性病原，因此能夠對於個體即時採取必要措施（例如，藥物，檢疫等），並防止疾病或病原擴散。

再者，本揭示內容第一態樣是關於一種重組桿狀病毒，其特徵在於所述重組桿狀病毒的套膜上表現有至少一節肢動物媒介病毒之病毒蛋白(如，結構蛋白或膜蛋白)。

為了生產本發明重組桿狀病毒，獨立建構攜帶特定節肢動物媒介病毒之病毒蛋白的基因卡匣(cassettes)，並將其與合適的啟動子連接，以產生桿狀病毒轉移載體；接著，利用桿狀病毒DNA使轉移載體共同轉染(co-transfect)至宿主細胞(如，昆蟲細胞)，以產生本揭示內容之重組桿狀病毒。

依據本揭示內容之實施方式，所述節肢動物媒介病毒可以是來自非洲豬瘟病毒科、彈狀病毒科、布尼亞病毒科、黃病毒科、正黏液病毒科、呼腸弧病毒科或披膜病毒科之病毒種。舉例而言，節肢動物媒介病毒之病毒種可以是非洲豬瘟病毒科中的非洲豬瘟病毒；黃病毒科中的登革熱病毒(DENV)、C型肝炎病毒、日本腦炎病毒(JEV)、趨肝性病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒 (YFV)、或茲卡病毒 (ZIKV)；或者是披膜病毒科中的巴馬森林病毒、屈公病毒(CHIKV)、東部馬腦炎病毒、奧絨絨病毒、羅斯河病毒、德國麻疹病毒、生里基森林病毒、辛德畢斯病毒、西部馬腦炎病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒。

依據本揭示內容之實施方式，所述病毒蛋白可以是節肢動物媒介病毒之結構蛋白或膜蛋白。舉例而言，適合應用於本發明之披膜病毒科的病毒蛋白包含但不限於E、E1、E2、E3及其組合。再者，適合應用於本發明之黃病毒科的病毒蛋白包含但不限於Pre-M、E及其組合。

在一較佳的實施方式中，分別建構攜帶有CHIKV之病毒蛋白E1、E2和E3核苷酸序列(即，26S次基因組RNA之cDNA)之基因卡匣，並與啟動子可操作性連結，以產生重組桿狀病毒轉移載體。適合用於建構重組桿狀病毒轉移載體的啟動子包含，但不限於，多角體蛋白(polyhedrin,polh)啟動子、源自桿狀病毒的啟動子(baculovirus-derived promoters)、源自家蠶肌動蛋白的啟動子(Bombyx mori-derived actin)、細胞巨大病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子或由雞的β-肌動蛋白啟動子(chicken 1-actin promoters)及CMV強化子(enhancer)所組成的CAG啟動子。所述源自桿狀病毒的啟動子可以是IE1啟動子、IE2啟動子、p6.9 啟動子、VP39啟動子或 p10啟動子。在本揭示內容一較佳實施方式中，是利用polh啟動子建構重組桿狀病毒轉移載體。

依據本揭示內容較佳之實施方式，所產生的重組桿狀病毒轉移載體接著與Bac-N-Blue病毒DNA共同轉染至昆蟲宿主細胞中。所述Bac-N-Blue病毒DNA提供必要的病毒骨架，其包含繁殖必須基因(propagation-essential genes)。昆蟲宿主細胞中重組桿狀病毒轉移載體和Bac-N-Blue病毒DNA間發生同源重組，產生一重組桿狀病毒，且其能夠於宿主細胞內繁殖，藉使產生由表現基因卡匣分別編碼的外源性蛋白(例如，CHIKV之病毒蛋白E1、E2和/或E3)。所述重組桿狀病毒可被選取和純化，例如，透過報導多肽的表現。適合用於本揭示內容的昆蟲宿主細胞包含但不限於， S. furgiperda IPBL-9 (Sf9)細胞、Sf21細胞、High Five細胞，以及Minic Sf9細胞。依據本揭示內容較佳之實施方式，所述昆蟲宿主細胞是Sf21細胞。在可任選的實施方式中，所述狀病毒載體包含報導多肽。報導多肽的實例包含但不限於，藍螢光蛋白(blue fluorescence protein, BFP)、青色螢光蛋白(cyan fluorescence protein, CFP)、圓盤海葵紅色螢光蛋白(Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed)、綠螢光蛋白(green fluorescence protein, GFP)、增強型綠螢光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)，以及增強型黃螢光蛋白(enhanced yellow fluorescence protein, EYFP)等。在本揭示內容部份較佳之實施方式中，所述報導多肽是EGFP。可以理解的是所述報導多肽(如，EGFP)非本發明於生物樣本內捕捉抗節肢動物媒介病毒抗體之必要特徵

因此，所產生的重組桿狀病毒帶有至少一節肢動物媒介病毒之病毒蛋白(即，結構蛋白)，並被表現在重組桿狀病毒的套膜上。在一較佳實施方式中，所述重組桿狀病毒上表現至少一CHIKV之病毒蛋白(即，CHIKV之E1和E2)。在其他較佳實施方式，所述重組桿狀病毒上表現至少一DENV之病毒蛋白(即，DENV之pre-M和E)。在又一較佳實施方式中，所述重組桿狀病毒上表現至少一JEV之病毒蛋白(即，JEV之pre-M和E)。在又一較佳實施方式中，所述重組桿狀病毒上表現至少一ZIKV之病毒蛋白(即，ZIKV之pre-M和E)。

3. 本發明重組桿狀病毒偵測節肢動物媒介病毒之應用

依據上述方法所建構出的重組桿狀病毒上表現有至少一節肢動物媒介病毒之病毒蛋白，因此，所述重組桿狀病毒整體能夠作為抗原，用以在生物樣本內捕捉特定節肢動物媒介病毒之抗體。

再者，本揭示內容另一態樣是關於提供偵測生物樣本內的節肢動物媒介病毒。所述方法包含以下步驟： 混合生物樣本和本發明重組桿狀病毒；以及 在一免疫分析中，偵測生物樣本內對抗該節肢動物媒介病毒之一抗體與所述重組桿狀病毒所形成的複合物。

在一較佳的實施方式中，人類個體的血清樣本是與套膜上表現有CHIKV之病毒蛋白E1和E2之重組桿狀病毒混合。再者，若人類個體被CHIKV感染，接著所述血清中的抗體將與重組桿狀病毒套膜上所表現的CHIKV之病毒蛋白E1和E2結合，並形成複合物。

舉例而言，適合用以偵測本方法所形成的抗原-抗體複合物的方法包含，但不限於，放射免疫分析法(radioimmunoassay)、酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、三明治免疫分析法(“sandwich” immunoassay)、原位免疫分析法(in situ immunoassays)(如、利用膠體金、酵素或放射性同位素標記)、點漬法(dot blot)、凝集分析法(agglutination assay)(如、膠體凝集分析和血球凝集分析等、補體結合分析法(complement fixation assay)、免疫螢光分析法(immunofluorescence assay)以及免疫電泳分析法 (immunoelectrophoresis assay)等。在一實施方式中，利用ELISA偵測抗體結合。在一實施方式中，所述抗體包含一免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)。在其他實施方式中，所述抗體包含一免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)。

依據本揭示內容之實施方式，可從體液偵測到抗體，包含但不限於，全血、血清、血漿、黏液、尿液及其經純化或過濾之形式。在一較佳的實施例中，可從血漿樣本中偵測抗體。在其他實施方式中，可從血清樣本中偵測抗體。

4. 偵測節肢動物媒介病毒套組

為了提供本技術領域中具有通常知識者工具以使用本發明，本揭示內容之重組桿狀病毒可被包裝成用以診動偵測確認特定節肢動物媒介病毒的套組。在較佳的實施方式中，抗體與本揭示內容重組桿狀病毒反應，可用以提供個體預後。舉例而言，相較於控制組，在樣本內偵測到大量與本揭示內容重組桿狀病毒反應的抗體時，此可作為被特定節肢動物媒介病毒感染的指標。在此所提供的資訊也可以直接應用在治療上，或者是應用於防止疾病或病源擴散的必要防疫措施。 舉例而言，若在個體中發現具有對抗本揭示內容重組桿狀病毒之抗體，早期治療由節肢動物媒介病毒所引起的疾病能夠達到較好的療效，且同時能夠採取防止病原擴散的必要防疫措施。

在一實施方式中，本發明提供一種利用本發明重組桿狀病毒偵測和/或診斷特定節肢動物媒介病毒 (如，CHIKV、JEV、ZIKV等)之套組。所述套組所包含的組成物為容器、用以偵測生物樣本內抗體之試劑，其中所述試劑包含依據本發明實施例製備而成的重組桿狀病毒，且所述重組桿狀病毒的套膜上表現有特定節肢動物媒介病毒之至少一病毒蛋白；以及與容器相關的說明，其揭示如何使用所述重組桿狀病毒偵測生物樣本內的抗體。所述說明可以是以手冊、錄音帶、CD、VCD或DVD等型式來提供。所述套組可更包含陰性控制組，用以作為健康個體與重組桿狀病毒形成複合物的正常抗體含量指標。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

實施例 1 利用表現 CHIKV 病毒蛋白之重組桿狀病毒偵測抗 CHIKV 抗體

1.1建構vAc-CHIKV26S-Rhir-EGFP

依據郭等人(J Virol Methods 2011，175:206-215)所揭示的方法，以桿狀病毒轉殖載體之骨架(pBac-Rhir-E)和pBac-CHIKV-26S-Rhir-E質體 （含CHIKV 26S次基因組RNA之全長）進行建構。

將IPBL-Sf21 (Sf21)細胞株接種至24孔盤中（接種密度為每孔2 × 10⁵ 細胞），以Sf-900 II昆蟲培養基（含8%熱不活化胎牛血清），並置於溫度27 °C培養。於轉染的操作步驟上，將轉染溶液（含1 μg之pBac-CHIKV-26S-Rhir-E質體、2.5 μL之線性病毒DNA Bac-N-Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、4μL之Cellfectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和350 μL之游離血清TNM-FH培養基）添加至每一孔洞中。於溫度27°C的環境下，培養5小時後，每孔洞以350 μL之TNM-FH培養基(添加0% FCS)置換轉染溶液，再將其置於溫度27°C的環境下，培養72小時。

從Sf21細胞培養液收集重組桿狀病毒，其中該細胞培養物於螢光顯微鏡下會發出綠色螢光 (Nikon, Tokyo, Japan)。重組桿狀病毒(即，vAc-CHIKV26S-Rhir-EGFP，第1圖(A)) 以終點稀釋法純化。病毒力價(titer)之測定，於96孔盤以終點稀釋法稀釋並以螢光偵測測定，以及利用50%組織培養感染劑量(tissue culture infectious dose, TCID₅₀ )法計算。以病毒 DNA定序分析確認重組病毒的序列。

1.2 實施例1.1 vAc-CHIKV26S-Rhir-EGFP之特性

為了證實實施例1之重組桿狀病毒可於其套膜上表現CHIKV結構蛋白，特別是E1和E2，所述抗E1抗體和抗E2抗體分別與來自於宿主Sf21細胞所萃取的蛋白混合，並且其結合係以西方墨點分析確認(第1圖(B))。

類似地，當抗E1抗體和抗E2抗體分別添加經vAc-CHIKV26S-Rhir-EGFP感染之Sf21細胞的培養基，所述Sf21細胞產生實施例1.1之重組桿狀病毒，以及CHIKV之E1和E2蛋白，其可與抗E1抗體或抗E2抗體結合，接著測定其所發出的免疫螢光訊號(第1圖(C))。

1.3 偵測血清樣本中抗CHIKV抗體

在此實施例中，從經CHIKV或DENV感染的人類個體蒐集血清樣本，樣本收集皆經測試者書面聲明同意。接著，每一血清樣本與實施例1.1之重組桿狀病毒混合，並以ELISA分析。 結果如第2圖所示。

結果顯示，在經CHIKV感染之個體血清中，其與CHIKV（第2圖中以「CV」表示）或與實施例1.1重組桿狀病毒（第2圖中以「BV-26S」表示）呈現陽性結合，而與未表現CHIKV套膜蛋白的重組桿狀病毒則呈現輕微結合或陰性結合（第2圖中以「BV」表示）。

在經DENV感染之個體血清中，與DEVN呈現陽性結合（第2圖中以「DV」表示），但未與實施例1.1之重組桿狀病毒結合。結果顯示實施例1.1的重組桿狀病毒可專一性辨識經CHIKV感染之個體中血清的抗體。

實施例 2 利用表現 JEV 病毒蛋白之重組桿狀病毒偵測抗 JEV 抗體

2.1 vAc-JEV-preM-E-Lir-EGFP之建構及特性

本實施例中的重組桿狀病毒是以實施例1.1所述類似的步驟建構，除了其中以JEV病毒E RNA之cDNA取代原CHIKV 26S次基因組RNA全長cDNA(第3圖(A))。接著，收集重組病毒並以病毒DNA定序分析確認。

2.2 偵測經JEV感染個體血清樣本中的抗JEV 抗體

類似於實施例1.3的步驟，結果顯示，實施例2.1之重組桿狀病毒會與從二個經JEV感染之個體血清樣本中的抗體結合，但不會與另二個經CHIKV感染個體血清樣本中的抗體結合(第3圖(B))。

實施例 3 利用表現 ZIKV 病毒蛋白之重組桿狀病毒偵測抗 ZIKV 抗體

3.1 vAc-ZIKV-C-preM-E-Lir-EGFP之建構及特性

本實施例中的重組桿狀病毒是以實施例1.1所述類似的步驟建構，除了其中以茲卡病毒E RNA之cDNA取代原CHIKV 26S次基因組RNA全長cDNA(第3圖(A))。 接著，收集重組病毒並以病毒DNA定序分析確認。可以預期的是所述建構而成的重組桿狀病毒可以被ZIKV之抗E抗體所辨識。

3.2 偵測血清樣本中的抗ZIKV抗體

以類似於實施例1.3的步驟，可以預期的是實施例3.1之重組桿狀病毒可以與從經ZIKV感染之個體血清樣本中的抗體結合，但不會與經其他節肢動物媒介病毒（即，ZIKV以外的病毒）感染個體血清樣本中的抗體結合。

實施例 4 利用表現 DENV 病毒蛋白之重組桿狀病毒偵測抗 DENV 抗體

4.1 vAc-DENV1-C-preM-E-Lir-EGFP和vAc-DENV2-preM-E-Lir-EGFP之建構及特性

本實施例中的重組桿狀病毒是以實施例1.1所述類似的步驟建構，除了其中以第一型或第二型DENV病毒E RNA 之cDNA(第4圖(B))取代原CHIKV 26S 次基因組RNA全長cDNA(第3圖(A))。接著，收集重組病毒並以病毒DNA定序分析確認。可以預期的是實施例3.1之重組桿狀病毒能夠被第一型或第二型DENV之抗E抗體所辨識。

4.2 偵測血清樣本中的抗DENV抗體

類似於實施例1.3的步驟，可以預期的是實施例4.1之重組桿狀病毒可以與從經第一型或第二型DENV感染之個體血清樣本中的抗體結合，但不會與經其他節肢動物媒介病毒（即，第一型或第二型DENV以外的病毒）感染個體血清樣本中的抗體結合。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的，特徵，優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖繪示實施例1之重組桿狀病毒的建構和特性，其中(A)是實施例1.1所示重組桿狀病毒載體的示意圖，(B)是經實施例1.1重組桿狀病毒載體感染的Sf21細胞中所分離出的蛋白與抗E1和抗E2抗體(道1)或mock控制組 (道2)於西方墨點法分析的結果，以及(C)是經實施例1.1重組桿狀病毒載體感染的Sf21細胞與抗E1和抗E2抗體或mock控制組的螢光免疫分析影像； 第2圖繪示CHIKV(以CV表示)、實施例1.1重組桿狀病毒(以BV-26S表示)，以及未攜帶CHIKV套膜蛋白基因之重組桿狀病毒(以BV表示)之間分別與經CHIKV感染個體的血清中的抗體結合強度之直條圖，以及DENV(以DV表示)和實施例1.1重組桿狀病毒(以BV-26S表示)之間分別與經DENV感染個體的血清中的抗體結合強度之直條圖； 第3圖繪示實施例2之重組桿狀病毒的建構和特性，其中(A)是實施例2.1所示重組桿狀病毒載體的示意圖，(B)顯示JEV(以JEV表示)和實施例2.1重組桿狀病毒(以BV-JEV-PrME表示)與二經DENV感染個體血清中的抗JEV 抗體之間的結合強度直條圖；以及實施例2.1重組桿狀病毒(以BV-JEV-PrME表示)與經CHIKV感染個體血清中抗CHIKV抗體之間的結合強度直條圖；以及 第4圖分別繪示(A)實施例3.1之重組桿狀病毒載體，以及(B)實施例4.1之重組桿狀病毒載體。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

Claims (5)

1. 一種偵測一生物樣本內一對抗節肢動物媒介病毒之抗體的方法，包含：混合該生物樣本和一重組桿狀病毒，其中該重組桿狀病毒具有一節肢動物媒介病毒之病毒蛋白，且該病毒蛋白表現在該重組桿狀病毒上，其中該節肢動物媒介病毒是屈公病毒(Chikungunya virus，CHIKV)，且該病毒蛋白包含E1、E2和E3；以及在一免疫分析中，偵測該生物樣本內由一可對抗該節肢動物媒介病毒之抗體與該重組桿狀病毒所形成的一複合物。
2. 如請求項1所述之方法，其中該抗體是IgM或IgG。
3. 如請求項2所述之方法，其中該免疫分析是一酵素連結免疫吸附分析法。
4. 如請求項3所述之方法，其中該生物樣本是選自於以下所組成之群組：全血樣本、血漿樣本、血清樣本、尿液樣本、黏液樣本，及其純化或過濾的樣本形式。
5. 一種重組桿狀病毒，具有一節肢動物媒介病毒之病毒蛋白，且該病毒蛋白表現在該重組桿狀病毒上，其中該節肢動物媒介病毒是CHIKV；以及該重組桿狀病毒上表現有CHIKV之醣蛋白E1、E2和E3。

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