CN103146651A

CN103146651A - 单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测ibrv的试纸条

Info

Publication number: CN103146651A
Application number: CN2013100291695A
Authority: CN
Inventors: 孟日增; 石建平; 宋战昀; 孟庆峰; 肖成蕊; 蔡阳
Original assignee: JILIN BUREAU OF EMIGRATION AND INGRESSION EXAMINATION AND QUARATINE
Current assignee: JILIN BUREAU OF EMIGRATION AND INGRESSION EXAMINATION AND QUARATINE
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-01-25
Also published as: CN103146651B

Abstract

本发明公开了单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测IBRV的试纸条，它是用抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为金标抗体、兔抗鼠二抗作为检测的质控孔、兔抗IBRV的抗体检测孔组成的单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条，检测下限为100TCID₅₀左右，与病毒分离相当，具有较高敏感性；与PCR方法检测的阴性检出符合率为99.17%，和BVDV、牛赤羽病(BAD)、牛流行热(BEV)、茨城病(IDV)病毒样品无交叉反应；重复检测50次，结果均一致，表明重复性强；操作时不需要特殊试验条件，肉眼易于判断结果，适合在广大基层单位推广和应用。

Description

单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测IBRV的试纸条

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是一种抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体及单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条。

背景技术

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-I）引起的一种病毒性传染病。BHV-I属疱疹病毒科，目前已知的有3个亚型：BHV1型、BHV2a、BHV2b型，但大多数学者认为只有一个血清型。该病最初在欧洲发生，20世纪30年代随着牛的输出而传到美国，Mille（1955）在美国首次报道了该病，Madin等（1956）分离到了该病病毒，1964年Hurk首先确认引起本病的病毒归属于疱疹病毒。目前该病广泛分布于世界各地，对肥育率、产奶量和繁殖影响极大，是引起养牛业重大经济损失的疾病之一。

目前IBR诊断分为二大类，病原学检测和血清学检测。

病原学诊断包括：

1、病原分离鉴定；主要是分离培养病毒，将细胞培养的上清液与IBRV阳性血清或单克隆抗体（McAb）进行中和试验。也可采用免疫荧光或免疫过氧化物酶试验测定IBRV抗原。

2、直接免疫荧光试验：将从鼻、眼或生殖道采集的棉拭子直接涂抹于盖玻片上，或者离心取细胞沉淀滴在载玻片上，病理组织样品可做冰冻切片，进行免疫荧光直接法检测。该方法优点是较为快速，缺点是敏感性不高，非特异性反应相对较多。

3．核酸检测：a.聚合酶链式反应（PCR），常用于PCR扩增的目的片段有TK、gB、gC和gD等基因；b.实时荧光PCR诊断，敏感性比常规PCR高10³～10⁴倍，适用于进出境牛传染性鼻气管炎感染的快速病原检测。c.核酸探针杂交技术：Southern Blot杂交试验是一种比较敏感的检测IBRV DNA的方法，Pandita （1995）和Xia等（1995）报道了用斑点杂交法检测IBRV。吴时友等（1998）报道的资料认为该方法的检测敏感性达到了可检出10pg的IBRV DNA，具有相当高的灵敏度和特异性。据报道，用生物素制备的改良型探针，代替了³²P，弥补放射性同位素探针半衰期短、对人体健康有害的弊端，可应用于检测牛精液中IBRV DNA，也取得了很好的结果，探针可在-20℃保存一年以上，有利于推广使用。

血清学诊断：

IBRV感染后常呈隐性感染，鉴定动物的感染状态采用血清学检查是非常实用且十分有价值的方法。抗体阳性动物除体内保有从初乳中获得母源抗体的犊牛和灭活疫苗免疫的牛之外均可认为是病毒携带者和潜在的间歇性排毒者，是重要的传染源。

1．病毒中和试验（国际贸易指定实验）：病毒中和试验被OIE指定为国际贸易试验方法之一，该方法是测定免疫血清是否具有中和病毒的能力。以病毒经不同稀释度的免疫血清中和后对细胞的感染力强弱为特征，得出该待检血清的中和效价。该方法被认为是血清抗体检测最经典、最标准的方法。通常的做法是固定病毒稀释血清法，用100 TCID₅₀测定倍比稀释的血清中和指数，血清（阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清）均须56℃，30min灭活，用于国际贸易检疫时病毒血清孵育时间采用24h来提高敏感性。由于IBRV目前认为只有1个血清型，用1个已知标准毒株进行血清中和试验就可以做出确诊。但该方法存在操作复杂、试验周期长缺点，另外，对操作人员的操作熟练程度要求较高。

2．酶联免疫吸附试验（国际贸易指定实验）：目前在大批量动物进出境检疫时首选的方法是ELISA，被推广使用主要包括间接ELISA和阻断ELISA。

ELISA方法因具有简便、快速、准确优点，为目前检测IBRV主要选取方法之一，而且市场上已有多种商品化ELISA试剂盒，还可适用于检测牛奶中的gE糖蛋白抗体，但是，由于ELISA标准程序尚未建立，目前使用的ELISA试剂盒，多数为各自实验室自行建立自行使用，普遍尚未在国家参考实验室进行质量评估，缺乏足够的数据支持。霍烽等（2006）对国产试剂盒与中和试验的对比试验，发现主要存在有重复性差、敏感性不一致、与中和试验结果符合率变化大等问题。由此可见，出现假阳性或假阴性的几率较大，很难确保检疫质量，若使用进口的试剂盒价格高，检疫成本相应增高。

3．间接血凝试验：常采用微量凝集法来检测被检血清中的抗体，是一种较为简便、快速、实用的实验室诊断方法。程国富（1996）成功地利用间接血凝试验对IBR单克隆抗体进行筛选。但该方法受诸多客观因素限制，如最佳致敏抗原的选择、浓度要求，绵羊红细胞的致敏、pH值、温度和抗原抗体作用时间等，这些因素不够恒定，均对检测结果准确性有较大影响。

4.琼脂免疫扩散试验：可用已知的IBR抗原检查被检血清中的沉淀抗体的存在，该方法简单适用，成本较低，但由于其敏感性较低，只有当感染牛抗体呈现很高滴度才能检出，应用价值受到限制。

5．间接免疫荧光试验：建立间接免疫荧光试验可检查流产胎儿牛体内的特异性抗体，而且与血清中和试验进行比较。但是检测对象与范围有限，未能得到推广应用。

此外还有对流免疫电泳、微量补体结合试验等报道。

单抗介导的斑点纳米金渗滤法是80年代发展起来的固相标记免疫检测法，最初以酶作为标记物，1989年发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病病毒抗体的渗滤试验，确立了DIGFA的基本技术。其原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细虹吸作用使标本中的抗体（或抗原）与膜上包被的抗原（或抗体）结合，再通过与胶体金结合形成复合物而出现肉眼可见的粉红色斑点。胶体金金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可与毒素、糖蛋白、酶、抗生素等多种物质共价结合，使其成为免疫反应的优良标记物。目前已广泛应用于医学临床诊断。此法简便快速、特异敏感，可在现场应用，几分钟或十几分钟就可用肉眼观察到结果。

由于IBRV具有潜伏感染性，自然感染牛的中和抗体在感染后15d左右滴度达到高峰，可持续1个～2个月，随后逐渐下降，有些牛最低值可能降到零，此时转变在潜伏期感染，此后，一旦受到应激因素刺激，体内的病毒量又增殖，抗体滴度再度上升，并向外排毒，如此反复呈现波浪式起伏，因此，即便通过中和试验或ELISA法检测牛群IBR抗体呈阴性反应结果，仍难以确认牛群的IBRV感染状态。

发明内容

本发明的目的是，提供一种抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。

抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为：CGMCC No.6253；

抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体，它是由上述的杂交瘤细胞株分泌的。

本发明的另一个目的是提供一种单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条。

单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条，它包括：金标抗体、兔抗鼠二抗、兔抗IBRV多克隆抗体，所述的金标抗体为胶体金标记前述的抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体

所述的兔抗IBRV多克隆抗体的浓度为15μg/mL。

本发明提供了抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，用其分泌的单克隆抗体作为金标抗体，兔抗鼠二抗作为检测的质控孔、兔抗IBRV 的抗体检测孔组成的单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条，检测下限为100TCID₅₀左右，与病毒分离相当，具有较高敏感性；用试纸条方法和PCR方法共同检测已知的246份样品，结果试纸条阳性检出率为2.44%，PCR阳性检出率为3.25%，两者阴性检出符合率为99.17%，说明自制试纸条与PCR有较高的符合率；与BVDV、牛赤羽病(BAD)、牛流行热(BEV)、茨城病(IDV)等四种病毒样品无交叉反应。用本明的试纸条重复检测5次同一样品，5次检测结果均一致，表明重复性强；操作时不需要特殊试验条件，肉眼易于判断结果，适宜在广大基层单位推广和应用。

具体实施方式

实施例1

1、用MDBK细胞增殖牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株（本室保存），蔗糖梯度离心法纯化浓缩后的病毒。取少量经磷钨酸负染后，在电镜下观察到具有典型疱疹病毒特征的牛传染性鼻气管炎病毒。测定蛋白含量后，最终稀释成200μg/100mL，加入等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂制成免疫抗原；

选择4-6周龄雌性Balb/c小鼠16只（购自长春生物制品有限公司），分成免疫组与对照组两组，8只/组，用免疫抗原进行首免，二免、三免使用弗氏不完全佐剂制备的疫苗进行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天进行加强，具体免疫程序如表1；每次免疫前进行剪尾采血，分离血清并用ELISA方法监测小鼠的免疫抗体水平。测定的OD值，选择平均值最高的小鼠进行融合。I组第3只、第6只小鼠适合用于融合；

表1 免疫程序

免疫次数	免疫时间表	疫苗成份	免疫剂量	免疫途径
					首次免疫	第1天	IBRV液+弗氏完全佐剂	1mL/只	腹腔和背部皮下多点注射
第二次免疫	第15天	IBRV液+弗氏不完全佐剂	1mL/只	腹腔和背部皮下多点注射
					第三次免疫	第30天	IBRV液+弗氏不完全佐剂	1mL/只	腹腔和背部皮下多点注射
加强免疫	融合前3天	IBRV液	1mL/只	尾静脉注射

融合前一周左右，进行SP2/0细胞复苏；取免疫效果最佳的Balb/c小鼠，眼球采血，分离血清，脱颈处死，研磨脾脏，用RPMI-1640培养液少量多次冲洗铜网，收集细胞悬液。血球计数板计数，稀释至10⁷/ml作为待融合的脾淋巴细胞；将用IBRV全病毒疫苗免疫鼠的脾细胞与复苏后的SP2/0细胞用45%PEG方法进行细胞融合；

经间接ELISA抗体检测筛选，多次亚克隆，筛选出C5F4和3D5两株三次检测均呈阳性，而且细胞培养上清的IBRV抗体OD₄₉₀值逐步升高，到第3次克隆时最终达到稳定。C5F4三次克隆的OD490值分别为0.673、0.856、1.148；3D5三次克隆的OD490值分别为0.829、0.817、1.035。

用PEG6000浓缩纯化后的病毒稀释至最佳包被浓度包被96孔酶标板进行间接ELISA试验，测定一株单抗3次克隆后的细胞培养上清和腹水的抗体效价，以平行稀释的单抗OD₄₉₀值/对照OD₄₉₀值比值大于2的最高稀释倍数为单抗的效价。杂交瘤细胞系C5F4和3D5细胞培养上清和腹水效价，如表2。抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3D5，已于2012年06月20日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.6253。

表2纯化单抗ELISA效价比较

Figure 2013100291695100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例2 胶体金免疫层析试纸条的制备

本实施例使用的材料，氯金酸：购自Sigma公司；柠檬酸三钠：分析纯，上海新高化学试剂有限公司；碳二亚胺：购自Sigma公司；BSA：第Ⅴ部分，上海惠世有限公司；兔抗鼠二抗：A9044，Sigma公司。硝酸纤维素膜、玻璃纤维、玻璃棉、吸水纸、支持板德国S.S公司产品。实验用水均为经超纯水装置净化的二次去离子水,电阻率≥18.2 MΩ。

）胶体金标记抗IBRV单克隆抗体及提纯

按柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，将约95mL去离子水置于洁净的锥形瓶中，加入1%的氯金酸1mL，加热煮沸，迅速加入4mL新鲜配制的1% 柠檬酸三钠，颜色变为紫红色后，继续煮沸1min～2min，直至溶液呈透亮的红色，自然冷却至室温，用双蒸水定容至100 mL，置4℃冰箱中避光保存。

0.01%氯金酸水溶液在200r/min的搅拌速度下加热沸腾1min，立即加入适量的柠檬酸三钠还原剂,作用10min后停止搅拌，室温冷却，并定容至100mL。

IBRV单克隆抗体（3D5分泌的）用0.05mol/L，pH9.0的硼酸盐缓冲液进行稀释，调pH值为7.5。

取30μg/mL单克隆抗体1mL与等量的胶体金溶液，在搅拌下混合，10min后，再加终浓度为1%的BSA防止抗体蛋白和胶体金聚集沉淀，制成金标蛋白溶液；按下述方法进行提纯；

将金标蛋白溶液以3000r/min离心20min，弃去金胶颗粒沉淀物；再以15000r/min离心1h，用吸管轻轻吸弃上清，沉淀物用含0.01mol/L、pH7.6 PBS（含1% BSA）吹吸混悬至原体积；静置过夜后，同上方法重复离心两次；最后一次将沉淀物用含1% BSA的PBS（含0.02%NaN₃）混悬至原体积的1/10，4℃保存。

）兔抗IBRV血清的制备及兔抗IBRV IgG的提取

在IBR阴性家兔背部皮内多点接种IBRV弗氏完全左剂苗，2周后再接种弗氏不完全左剂苗，然后2周后静脉注射2mg IBRV，一周后检测抗体，琼扩效价≥32 时，采血，分离血清，置-20℃下保存备用；

兔抗IBRV血清经饱和硫酸铵盐粗提，透析，再依次过SephadexG25和DEAE纤维素柱进一步提纯，并将收集的蛋白质于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中浓缩，紫外分光光度计测其280nm、260nm波长处OD值，以公式计算蛋白含量后-20℃保存备用。

）试纸条的制备

a.硝酸纤维素（NC）膜的活化

裁取20mm×3-4mm的NC膜，于0.1mol/L的碳二亚胺溶液中浸泡，15 min后取出，室温风干8min。用洁净的钢笔帽分别在NC膜上印上两个空孔，然后分别吸取兔抗鼠二抗、以浓度为1.34 mg/mL兔抗IBRV多克隆抗体滴加NC膜的孔上，并且分别标记孔1(质控点)、孔2 (检测点)，两点间距为7mm；

b.金标抗体的喷涂

裁取20mm×4mm的玻璃纤维，同上述方法也制成孔，分别取50μL的金标IBRV单克隆抗体喷涂在玻璃纤维的孔上，标记为孔3，37℃干燥1h。

c.试纸条的组装

免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸NC纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻璃纤维，吸收垫用吸水滤纸。裁成宽度为 3 mm 的检测试纸条。

实施例3 胶体金免疫层析试纸条敏感性试验

检测方法将试纸条插入待检测样品中，插入深度要低于标记物，反应10min。

判断标准若只在孔1出现红色，则表示为阴性；若在试纸条的孔1、孔2和出现红色，则判定为IBRV阳性。

对TCID₅₀为10^-7的IBRV从10^-1进行10倍递进稀释至10^-8后，将各稀释度的病毒稀释液各100μL滴加于试纸条加样孔中,反应10min。滴加10^-1～10^-5、病毒稀释的测试条在检测区和质控区各出现一条红色反应带,均呈阳性反应,检测区中红色反应带的颜色随稀释倍数的增加而逐渐变淡；滴加10^-6、10^-7、10^-8病毒稀释液的测试条仅在质控区出现条红色反应带,呈阴性。这表明所研制试纸条的感性为10^-5,即100 TCID₅₀。

表3敏感性试验结果

实施例4 胶体金免疫层析试纸条敏感性试验

（1）阻断试验将上述已知的IBRV阳性细胞培养上清与IBRV阳性血清等量混合，感作1h后，试纸条检测只在孔1（质控点）出现阳性反应。

（2）交叉试验将试纸条插入到BVDV、牛赤羽病(BAD)、牛流行热(BEV)、茨城病(IDV)等几种病毒样品中，检测其特异性等几种病毒样品中，试纸条检测只有孔1（质控点）出现阳性反应。

表 4 特异性试验结果

毒株	BVDV	BAD	BEV	IDV
					试纸条检测结果	-	-	-	-

实施例5试纸条的重复性试验

分别对10份已知阳性样品和10份已知阴性样品用该试纸条进行检测，每份样品进行重复50次，50次检测结果均一致。

实施例6 试纸条的稳定性试验

从表5中可以看出所制备的试纸条在 4℃ 下可保存 2 个月其检测性能没有太大的变化，反应的敏感性无变化。在室温及 37℃中只能保存一周，在二周时敏感性就出现稳定。可见，该试纸条在 4℃ 保存两个月具有良好的性能稳定性。

表5　稳定性试验

实施例7试纸条的应用试验

将临床上采集的246份鼻腔棉拭子用试纸条进行检测，并用PCR检测方法进行比较，这两种方法的阴性符合率在99.17%。结果见表6。

表6 临床样品检测结果

	数量	试纸条检测阳性数	PCR阳性数
				样品数	246	6	8
阳性检出率		2.44%	3.25%
				阴性数		240	238
符合率		99.17%

Claims

1.抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为：CGMCC No.6253。

2.抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体，它是由保藏编号为：CGMCC No.6253的杂交瘤细胞株分泌的。

3.单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条，它包括：金标抗体、兔抗鼠二抗、兔抗IBRV多克隆抗体，所述的金标抗体为胶体金标记保藏编号为：CGMCC No.6253的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条，其特征在于：所述的兔抗IBRV多克隆抗体的浓度为15μg/mL。