CN112941073A - 一种单链dna接头及其制备和应用 - Google Patents

一种单链dna接头及其制备和应用 Download PDF

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明公开了一种单链DNA接头及其制备和应用，属于分子生物学技术领；所述单链DNA接头包括一对完全互补的引物，所述引物的末端连接有简并碱基N，所述简并碱基N的数量为6～7个；本发明中所述单链DNA接头的连接是将所述的单链DNA接头的接头Mix与单链DNA，在冰上等体积混合，然后在37℃水浴中孵育15～20min，即可得到连接产物；本发明提供了一种单链DNA接头，通过一个6～7bp随机引物组成的粘性末端，能够与任何序列组合互补，该单链DNA接头能够在单链DNA的3'末端添加已知序列，不但适用于已知序列的单链DNA加接头，还能用于含未知序列的单链DNA加接头，因此在第二代测序技术中有很大的应用潜力。

Description

一种单链DNA接头及其制备和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种单链DNA接头及其制备和应用。
背景技术
二代测序(second generation sequencing)也称为下一代测序(nextgeneration sequencing，NGS)或大规模平行测序(massively parallel sequencing)，是一类测序技术的统称。二代测序技术主要由三个流程组成，包括建库、测序和数据处理。建库根据不同样本或检测目的分为全基因组建库、目标区段捕获建库、转录组建库等。测序又分为边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)和边连接边测序(sequencing byligation，SBL)两种策略。数据处理是将测序仪记录的碱基信号通过序列比对、局部比对和碱基质量校正等生物信息学处理后，用于进一步发现SNP、拷贝数变化CNV以及大片段的插入和缺失(insertion-deletion，indel)等结构突变(structural variation，SV)的过程。
在二代测序中，DNA加接头技术是一个非常重要的步骤。DNA加接头技术是指将一段已知序列DNA加到另一个DNA末端的过程，常用加接头的方法有扩增法和接头连接法，前者是将已知序列添加在上下游引物的5’端，然后通过PCR的方法引入接头序列，但该方法需要知道目标DNA两端的序列，这有很大局限性；后者依赖聚合酶类末端转移活性添加的A尾巴，通常需要先对DNA先进行末端修复，然后利用T4 DNA连接酶将含有突出的粘性末端与Y型引物接头连接。这是目前使用最广泛的连接头方法，但其并不适合单链DNA加接头。
T4 DNALigase是分子生物学工具酶的主力军之一，它以高效的双链DNA粘性末端或平末端连接活性著称。虽然T4 DNA Ligase也具有连接单链DNA-单链DNA连接活性，但连接效率比连接双链DNA低2个数量级(Kuhn H,Frank-Kamenetskii MD.Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase.FEBS J.2005Dec；272(23):5991-6000.)，这极大限制了其在单链DNA加接头中的应用。
单链DNA加接头研究不如双链DNA加接头广泛，但对于特殊DNA测序和研究是十分重要的，比如单链噬菌体DNA测序、单链环状病毒解析，RNA链被降解的cDNA分析等。T4 RNA连接酶能够直接连接单链DNA间的磷酸二酯键，但效率较低，应用不多。因此，单链DNA加接头还面临效率低、操作繁琐等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种单链DNA接头及其制备和应用，解决现有的单链DNA加接头面临效率低、操作繁琐等问题。
本发明的一个目的在于提供一种单链DNA接头。
所述单链DNA接头包括一对完全互补的引物，所述引物的GC含量在50～60％之间，所述简并碱基N的数量为6～7个。
进一步地，所述引物中的一条链的3’末端连接有简并碱基N，所述简并碱基中的最后一个碱基使用C3 Spacer修饰；所述引物中的另外一条链的3’末端和5’末端进行磷酸化修饰。
进一步地，所述引物中的一条链的5’末端连接有简并碱基N且3’末端使用C3Spacer修饰，所述引物中的另外一条链的3’末端和5’末端不进行修饰。
进一步地，所述单链DNA接头序列如SEQ ID NO.1～2所示；或如SEQ ID NO.3～4所示；或如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明的另外一个目的在于提供一种单链DNA接头的制备方法。
所述单链DNA接头的制备方法是将上述两条互补的单链混合，经变性、降温和保温等步骤后，即可制得单链DNA接头。
进一步地，将两条所述单链按摩尔浓度比为1:1进行混合，使混合后的引物浓度在20～100μM之间；将混合液经85℃变性5min，然后以-0.1℃/s的速度缓慢降温到45℃，在45℃继续保温5min后，即可制得所述单链DNA接头。
本发明还提供了一种单链DNA接头的应用。
所述单链DNA接头的连接是将包括上述单链DNA接头的接头Mix与单链DNA，在冰上等体积混合，然后在37℃水浴中孵育15～20min，即可得到连接产物。
进一步地，所述接头Mix包括如下组分：10-20pmol权利要求1～5任一项所述的单链DNA接头、20-40U的T4 DNALigase、1×T4 DNA Ligase Buffer。
本发明的技术原理：
现有的单链DNA的连接方式是设计一段带有磷酸集团的已知序列单链引物，通过T4 DNA连接酶将已知序列单链引物连接到目标序列上去，这样的连接效率会很低；因此，本发明一种单链DNA接头，通过一个6～7bp随机引物组成的粘性末端，能够与任何序列组合互补，该单链DNA接头能够在单链DNA的3'末端添加已知序列，不但适用于已知序列的单链DNA加接头，还能用于含未知序列的单链DNA加接头，进一步地，由于单链DNA接头有一段互补的双链结构，这些双链结构作为T4 DNA连接酶的活性位点，显著的增加T4 DNA连接酶的活性，从而提高了连接效率。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明提供了一种单链DNA接头，通过一个6～7bp随机引物组成的粘性末端，能够与任何序列组合互补，该单链DNA接头能够在单链DNA的3'末端添加已知序列，不但适用于已知序列的单链DNA加接头，还能用于含未知序列的单链DNA加接头，进一步地，由于单链DNA接头有一段互补的双链结构，这些双链结构作为T4 DNA连接酶的活性位点，显著的增加T4 DNA连接酶的活性，从而提高了连接效率；
2)本发明设计的单链DNA接头封闭了一些可能的干扰扩增，而且定点将单链DNA接头连接在目标DNA的3’末端，并且无需对中间产物进行纯化回收，极大的简化了操作步骤；
3)本发明的单链DNA接头主要用于单链DNA加接头，而且本技术不需要对DNA进行末端修复，因此在第二代测序技术中有很大的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明单链DNA接头结构图；其中，图(A)结构用于锚定目标DNA的3’末端，由上下两条19～22bp反向互补的引物构成，上链引物3’末端含有6-7个简并碱基，最后一个简并碱基使用C3 Spacer封闭，下链引物5’和3’末端分别被磷酸化修饰，可防止接头残留导致的非特异性扩增；图(B)结构用于锚定目标DNA的5’末端，碱基分布同A结构相似，其特点是简并碱基位于5’末端，上链引物3’末端使用C3 Spacer封闭，下链无需修饰。
图2为本发明单链DNA接头定点连接目标序列的原理图；本接头与底物序列进行退火时，可能形成A、B、C所示的三种结构，其中，图(A)结构是目标结构，在热力学上是最容易形成的，该结构经T4 DNA Ligase连接后，接头序列连接在目标序列3’末端；B、C是干扰结构，图(B)结构产物因C3 Spacer的存在无法自连，不干扰连接反应；图(C)结构在热力学上不易形成且无法连接，5’端接头定点连接目标序列的原理与3’端接头相同，不再赘述。
图3为未知序列DNA加本发明单链DNA接头原理示意图；目标DNA经过淬火过程形成单链，然后在DMSO存在下保持单链状态，随后加入本发明单链DNA接头，在T4连接酶体系中进行连接反应，加上接头后即成为一端或两端序列已知DNA，通过PCR很容易获得目标基因。
图4为实施例2中退火速率对单链DNA接头制备效果影响的鉴定结果图；以10ng单链DNA(250bp)为模板，连接经不同退火程序制备的接头，结果-0.1℃/s的降温速率效果最好；图中ntc代表无退火过程的阴性对照(直接在连接体系中添加两条接头oligo)，数值代表退火温度变化速率。
图5为实施例2中单链DNA模板量对接头连接效率影响的电泳图；在实施例中，分为本发明接头+T4 DNALigase(实验组)和单链引物+T4 DNA ligase(对照组)两组，实验组以-0.1℃/s退火程序制备的接头连接不同质量单链DNA(520bp)模板，对照组以相同摩尔量的单链接头连接不同质量单链DNA(520bp)模板，结果发现对照组使用10ng以下的单链DNA模板无法检出目标基因，实验组可检测出低至0.01ng的模板，但条带极弱，因此本发明适用于0.1ng及以上的单链DNA加接头；图中ntc代表仅加入接头和单链DNA而无连接酶的阴性对照，数值代表目标单链DNA的质量。
图6为实施例3中利用T4 RNA Ligase对单链DNA加接头的效果鉴定图；实验分为T4RNA Ligase组和T4 DNA Ligase组(本发明)，分别使用3’磷酸化的单链引物接头和本发明设计的接头连接目标DNA(650bp)的3’端，结果表明本发明的效率显著高于T4 RNA Ligase，而且T4 RNA Ligase应用本发明的接头，效率也有所提高；图中ntc代表无连接酶的阴性对照。
图7为实施例4中双链DNA加接头的鉴定结果图；本实施例用于验证本发明提供的单链加接头技术同样可用于双链DNA，并与传统TA接头方法做了对比，结果7N接头完全可用于双链DNA加接头，且对低模板量双链DNA加接头有显著的效果；图中ntc代表无连接酶对照，数值代表双链DNA模板的质量(ng)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，接下来结合实施例，对本发明的技术方案做进一步地详细描述，应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明中所使用的TaqPCRMix、T4 DNA Ligase均是武汉伯远生物科技有限公司自研产品；T4 RNA Ligase购自NEB公司；引物合成、DNA测序、DNA回收试剂盒均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；DMSO购自Sigma公司，其他常规试剂和设备，如无特别说明，均可市售获得。
本发明使用的DNA片段1的大小为250bp、DNA片段2的大小为520bp、DNA片段3的大小为650bp，上述片段均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明的一个目的在于提供一种单链DNA接头。
如图1所示，其中，图(A)结构用于锚定目标DNA的3’末端，由上下两条19～22bp反向互补的引物构成，上链引物3’末端含有6-7个简并碱基，最后一个简并碱基使用C3Spacer封闭，下链引物5’和3’末端分别被磷酸化修饰，可防止接头残留导致的非特异性扩增；图(B)结构用于锚定目标DNA的5’末端，碱基分布同A结构相似，其特点是简并碱基位于5’末端，上链引物3’末端使用C3 Spacer封闭，下链无需修饰。
上述单链DNA接头能锚定在目标DNA的3’末端或目标DNA的5’末端，其具体连接原理图见图2：由图2可知，其中，图(A)结构是目标结构，在热力学上是最容易形成的，该结构经T4 DNALigase连接后，接头序列连接在目标序列3’末端；B、C是干扰结构，图(B)结构产物因C3 Spacer的存在无法自连，不干扰连接反应；图(C)结构在热力学上不易形成且无法连接，5’端接头定点连接目标序列的原理与3’端接头相同，不再赘述。
本发明的单链DNA接头同样也适用于未知DNA序列，具体原理如图3所示，目标DNA经过淬火过程形成单链，然后在DMSO存在下保持单链状态，随后加入本发明单链DNA接头，在T4连接酶体系中进行连接反应，加上接头后即成为一端或两端序列已知DNA，通过PCR很容易获得目标基因。
接下来，针对具体实施例对本发明进行进一步地描述。
实施例1单链DNA的制备
1.1将反向引物作梯度稀释，分别稀释至10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍，然后按1:1的体积比加入PCR体系。
1.2按下表配制PCR反应体系：
组分 体积
2×BioRun Taq PCR Mix 25μL
引物F(10μM) 2μL
引物R(0.1-10μM) 2μL
模板DNA(1-20ng/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 20μL
合计 50μL
1.3将上述反应体系按如下条件进行扩增：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，33cycles；72℃5min；然后进行凝胶电泳纯化。
1.4上述PCR产物经过电泳一般会出现两条带，切迁移速率较快的条带进行胶回收。
上述反应中，所述模板DNA为DNA片段1(250bp)、DNA片段2(520bp)、DNA片段3(650bp)；
所述引物序列具体如下：
250_F:TGGCCCACCAGCGCACCTT(SEQ ID NO.7)
250_R:CCGCTTATCGGCTGGCCG(SEQ ID NO.8)
520_F:TATCAGGTGCATCTCGATTATTTCAAC(SEQ ID NO.9)
520_R:TCGCCAGCACCTGCGGAT(SEQ ID NO.10)
650_F:ATCGGCGGCTGTTGCCGCA(SEQ ID NO.11)
650_R:CAGGTAAAGAAAATGACTACGATTAGC(SEQ ID NO.12)
实施例2单链DNA加接头
2.1引物合成：由生工生物工程(上海)股份有限公司按如下序列合成引物：
Figure BDA0002997051690000081
2.2制备7N_50接头：将接头引物(20μM)按照1:1的比例混合，85℃预变性5min，然后分别按-0.1℃/s、-0.2℃/s、-0.5℃/s、-1.5℃/s、-3.0℃/s的速率逐渐冷却至45℃，45℃继续孵育5min，置于冰上备用或者冻存；
2.3取1μL上述7N_5接头加入20-40U的T4 DNA Ligase、2μL的10×T4DNALigaseBuffer、ddH2O，混合均匀制成接头Mix，置于冰上备用；
2.4取0.01-10ng实施例1中制备的单链DNA，95℃预变性5min，立即转移到液氮中冷却1-2min，冰水浴中解冻，然后与接头Mix混合均匀，37℃连接15-20min。
2.5取1μL上述连接产物做模板，使用特异性引物和接头引物扩增目标基因，所得PCR产物纯化后可用于电泳分析或测序。
其中，步骤2.2中退火速率对单链DNA接头连接效率结果见图4，以10ng DNA片段1(250bp)为模板，连接经不同退火程序制备的接头，结果-0.1℃/s的降温速率效果最好；图中ntc代表无退火过程的阴性对照(直接在连接体系中添加两条接头oligo)，数值代表退火温度变化速率。
进一步地，探究单链DNA模板量对接头连接效率的影响；在实施例2中，分为本发明接头+T4 DNALigase(实验组)和单链引物+T4 DNAligase(对照组)两组，实验组以-0.1℃/s退火程序制备的接头连接不同质量DNA片段1(250bp)模板，对照组以相同摩尔量的单链接头连接不同质量DNA片段1(250bp)模板，结果发现对照组使用10ng以下的单链DNA模板无法检出目标基因，实验组可检测出低至0.01ng的模板，但条带极弱，因此本发明适用于0.1ng及以上的单链DNA加接头；图中ntc代表仅加入接头和单链DNA而无连接酶的阴性对照，数值代表目标单链DNA的质量。
由于单链DNA接头有一段互补的双链结构，这些双链结构作为T4 DNA连接酶的活性位点，显著的增加T4 DNA连接酶的活性，从而提高了连接效率。实施例3使用T4 RNALigase加接头
3.1取10-20pmol单链引物(7N_50_R)与20U的T4 RNA Ligase、2μL的10×T4 RNALigase Buffer、ddH2O，混合均匀制成接头Mix。
3.2取10ng实施例1中制备的单链DNA，95℃预变性5min，立即转移到液氮中冷却1-2min，冰水浴中解冻，然后与步骤1中的接头Mix混合均匀，37℃连接15-20min。
3.3取1μL上述连接产物做模板，使用特异性引物和接头引物扩增目标基因，所得PCR产物纯化后可用于电泳分析或测序。
其中，使用T4 RNA Ligase加接头的效果见图6，实验分为T4 RNA Ligase组和T4DNALigase组(本发明)，分别使用3’磷酸化的单链引物接头和本发明设计的接头连接目标DNA片段3(650bp)的3’端，结果表明本发明的效率显著高于T4 RNA Ligase，而且T4 RNALigase应用本发明的接头，效率也有所提高；图中ntc代表无连接酶的阴性对照。
实施例4双链DNA加接头
4.1引物合成：由生工生物工程(上海)股份有限公司按如下序列合成引物：
名称 序列(5’→3’) 名陈 GC含量
TA_F TGGTTATAGGAGGTGGGTTGT SEQ ID NO.13 50％
4.2制备TA接头：将TA_F与7N_50_R接头引物(20μM)按照1:1的比例混合，85℃预变性5min，然后按-0.1℃/s的速率逐渐冷却至45℃，45℃继续孵育5min，置于冰上备用或者冻存；
4.3取1μL上述TA接头加入20-40U的T4 DNA Ligase、2μL的10×T4 DNA LigaseBuffer、ddH2O，混合均匀制成接头Mix，置于冰上备用；
4.4使用平末端DNA聚合酶(如Pfu、KOD)扩增双链DNA片段2(520bp)，纯化回收后备用。
4.5取0.01-10ng上述双链DNA，分为两组，对照组使用TA接头，模板经大肠杆菌DNA聚合酶Mix添加A尾，然后与TA接头Mix混合均匀，37℃连接15-30min；实验组模板，经95℃预变性5min，立即转移到液氮中冷却2-3min，冰水浴中解冻，解冻后立即与实施例2中的7N_50接头Mix混合均匀，37℃连接15-30min。
4.6取1μL连接产物做模板，使用接头引物和特异性引物扩增目标基因，所得PCR产物纯化后可用于电泳分析或测序。
其中，双链DNA加接头的鉴定结果见图7，本实施例用于验证本发明提供的单链加接头技术同样可用于双链DNA，并与传统TA接头方法做了对比，结果7N接头完全可用于双链DNA加接头，且对低模板量双链DNA加接头有显著的效果；图中ntc代表无连接酶对照，数值代表双链DNA模板的质量(ng)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 武汉伯远生物科技有限公司
<120> 一种单链DNA接头及其制备和连接方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggttatagg aggtgggttg nnnnnnn 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacccacct cctataacca 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggcccacca gcgcaccttg ccggcctact tcgcccgcgt caatgcgcgc ggcattccga 60
tcaacgccct gaccttcagc atgctcggcg gcgtgctggc gctgctgacc agcgtgatcg 120
cgccggacac ggtgttcgtc gccctgtcgg cgatctccgg ctttgcggta gtggcggtgt 180
ggctgagcat ctgcgcggcc cactatgctt tccgccgcgc ctacctgcgc agcggccagc 240
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<210> 14
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tatcaggtgc atctcgatta tttcaacgcc ggcgcccagt gcgccatcac cgccagctat 60
caggccacac cgcagggctt cttgcgccgc ggcctggatc aggatcagtc gctggcgctg 120
atcgccaaaa gcgtgcagct ggcgcagcgg gcgcgccgcg attatctggc cgcgcacccg 180
caagcggcgc cgctgctgat cgccggctcg gtaggcccgt acggcgccta tctggccgac 240
ggctcggaat accgcggcga ctatcggctg gcgcaggatg acttcattgc cttccaccgc 300
cctcgcctcg ccgcgctggc cgccgccggc gtcgatctgc tggcctgcga aacgctgccg 360
tcgttcgctg aactacaggc gctgctgacg ctgttgcagg agttcccgac gctcggcgcc 420
tggttcgcct tcaccctgcg cgacagccaa cacctcagcg acggcacgcc gctgacggag 480
gtcatgtccg cgctgcgcgg caatccgcag gtgctggcga 520
<210> 15
<211> 650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcggcggct gttgccgcac cacaccgcag gatattcgcg ccatcgccgc gcgctgcaag 60
aaatgagcag gggggttatt cggttagccg gcgtaagtgt tcagcggctt gttctacgtt 120
gaggcggcct tgagctgctt caaccgtaat ttcgaccagt tctgcgtctt cccgcagtgc 180
aatgccatta ataccgagaa atagcgccat gctttggaag gccgtacgtt tgttgccatc 240
aagaaaaatg tgaccgtggc tgatggcgat gagatagagc gcggccaagc ggtatacgtc 300
tgtgacgttc tcgtagtggt aagcattgag cacgcggttg gctacagcct caactttgct 360
gccttcctgg cggccgtgag gcacaatttc agcattgaac tccgcaatat cctctgcggt 420
caaaaagatc atctattcgc cagcgcctta atcgtatccg cgtgtttagc ctgaatgcgc 480
gctttcactt tggctttgac caaaacctca tagtcggcct tactgatgat gtaaacctca 540
tcgtgtccgc ggcgcgtcac ttccaccggc tgtttttgcg cttccaaaag cacctcggcc 600
aaattgtttc tcgccgccgt atagctaatc gtagtcattt tctttacctg 650

Claims (8)

1.一种单链DNA接头，其特征在于，所述单链DNA接头包括一对完全互补的引物，所述引物的末端连接有简并碱基N，所述简并碱基N的数量为6～7个。
2.如权利要求1所述的单链DNA接头，其特征在于，所述引物中的一条链的3’末端连接有简并碱基N，所述简并碱基中的最后一个碱基使用C3 Spacer修饰；所述引物中的另外一条链的3’末端和5’末端进行磷酸化修饰。
3.如权利要求1所述的单链DNA接头，其特征在于，所述引物中的一条链的5’末端连接有简并碱基N且3’末端使用C3 Spacer修饰，所述引物中的另外一条链的3’末端和5’末端不进行修饰。
4.如权利要求1所述的单链DNA接头，其特征在于，所述单链DNA接头序列如SEQ IDNO.1～2所示；或如SEQ ID NO.3～4所示；或如SEQ ID NO.5～6所示。
5.一种单链DNA接头的制备方法，其特征在于，将权利要求1～4任一项所述两条互补的单链混合，经变性、降温和保温等步骤后，即可制得。
6.如权利要求5所述的单链DNA接头的制备方法，其特征在于，将两条所述单链按摩尔浓度比为1:1进行混合，使混合后的引物浓度在20～100μM之间；将混合液经85℃变性5min，然后以-0.1℃/s的速度缓慢降温到45℃，在45℃继续保温5min后，即可制得所述单链DNA接头。
7.一种单链DNA接头的应用，其特征在于，将包括权利要求1～4任一项所述的单链DNA接头的接头Mix与单链DNA，在冰上等体积混合，然后在37℃水浴中孵育15～20min，即可得到连接产物。
8.如权利要求7所述的单链DNA接头的应用，其特征在于，所述接头Mix包括如下组分：10-20pmol单链DNA接头、20-40U的T4 DNA Ligase、1×T4DNALigase Buffer。
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Denomination of invention: A single stranded DNA connector and its preparation and application

Granted publication date: 20230314

Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: WUHAN BIORUN BIOTECHNOLOGY LLC

Registration number: Y2024980010183

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