CN113736861B - 一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法，所述扩增方法是在核酸扩增方法的扩增体系中加入低熔点琼脂糖凝胶。本发明通过在反应体系中加入低熔点琼脂糖就可以实现提高反应效率和均一性的结果，方法简单而且成本较低，不需要昂贵的设备或者非常难的技术操作，在各个实验室都易实现且应用广泛。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法，具体涉及一种提高核酸扩增的灵敏度及均一性的改进方法，尤其涉及一种基于低熔点琼脂糖的空间限位效应及其应用的方法。
背景技术
PCR，全称为聚合酶链式反应，是一项非常强大的技术，在许多生物学领域中都是必不可少的工具。主要由变性，退火，延伸三个步骤组成一个循环，整个PCR反应包含20～40个循环能够将有限的核酸分子扩增约109倍。具有操作简单，灵敏度较高，重现性较好等优点。
然而，对于比较微量的核酸样本，PCR的反应敏感度还较低，不能够扩增出较低起始量的样本。灵敏度低是导致PCR结果较差的重要原因之一。另外，对于起始样本包含多种核酸样本的PCR扩增，其结果的均匀性较差，甚至无法将原始的比例进行还原，这也是导致PCR结果不佳的重要原因之一。这两者对于微量核酸样本的扩增都极其重要。
低熔点琼脂糖是经过化学修饰的琼脂糖，加水后在65℃左右熔化。低熔点琼脂糖凝胶具有较高的生物相容性。目前低熔点琼脂糖主要用在凝胶电泳或者生物材料方面，还没有人将低熔点琼脂糖用于核酸扩增的优化，低熔点琼脂糖的生物惰性，多孔性，以及DNA无损害特性使得它可以作为分子拥挤试剂加入核酸扩增体系之中发挥其空间限位效应。目前PEG作为常用的分子拥挤试剂加入扩增体系之中提高灵敏度，但是在均一性上尚无人研究。我们通过将PEG与低熔点琼脂糖的结果进行比较发现，PEG对于PCR扩增灵敏度的提高并不是通用的，所以我们提出利用低熔点琼脂糖作为分子拥挤试剂加入PCR扩增反应体系之中。
目前对于如何提高PCR扩增反应的灵敏度和均一性对于微量样本如单细胞转录组建库及后续分析应用至关重要，而开发出一种简单有效的核酸扩增改进方法对生物学领域具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对目前常规的核酸扩增方法的不足，本发明提供一种能够提高扩增效率，降低扩增偏性，在一定程度上降低优化成本，并实现更加有效及均匀的扩增方法，本发明所要解决的技术问题是提供一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法，所述扩增方法是在核酸扩增方法的扩增体系中加入低熔点琼脂糖凝胶，利用其空间限位效应，达到均匀扩增的目的。
其中，所述核酸扩增方法包括等温核酸扩增方法或变温核酸扩增方法。
其中，所述扩增体系中低熔点琼脂糖凝胶加入的比例是总体积的1/10～1/2。
其中，在加入扩增体系之中时为液态，然后室温放置凝固为固体凝胶后，再在冰上加入核酸扩增体系的其他试剂。
其中，所述低熔点琼脂糖在配置时，所述低熔点琼脂糖为液体时其中的低熔点琼脂糖的质量百分比为0.25％～5％。
其中，所述扩增体系的其他试剂还包括DNA扩增酶，引物和无酶水。
其中，当以DNA为模板进行PCR扩增时，具体包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取低熔点琼脂糖溶于无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)以DNA为模板进行PCR扩增：扩增体系包括DNA扩增酶、复合引物、DNA模版和低熔点琼脂糖凝胶溶液；
3)PCR扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，20-40个循环；72℃5min；
4)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征；
其中，所述模板可为DNA单模板或DNA混合模板。
所述单模板为小鼠DNA，所述引物序列为小鼠特定的GAPDH序列：上游引物为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’和下游引物为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。
其中，当所述模板为单模板时，具体包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取低熔点琼脂糖溶于无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)通过Trizol法提取小鼠RNA，再通过逆转录的方式合成所需的cDNA；
3)以cDNA为模板进行PCR扩增：扩增体系包括DNA扩增酶、复合引物、cDNA和低熔点琼脂糖凝胶溶液；
4)PCR扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，20-40个循环；72℃5min。
5)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征；
6)由电泳获得的条带通过ImageJ软件转换成数据。
其中，当所述模板为混合模板时，具体包括以下步骤：
1)将两种混合模板按照不同比例进行混合；
2)以混合模板进行PCR扩增：扩增体系包括DNA扩增酶、混合模板对应的复合引物、cDNA和低熔点琼脂糖凝胶溶液；
3)PCR扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，20-40个循环；72℃5min。
4)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征。
5)由电泳获得的条带通过ImageJ软件转换成数据。
其中，所述混合模板分别为：
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACCAGCACCAGCACCACCGACCGTACTACCGCACGCACGCCTTACTGGCTGGCTGAAATGCATCGCACGCATAGTTTAACCAGTACT-3’；
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACTATATAATATAAAGTTTACTCACTTACTCACCTTAGCCGTTTTGCCGGACTAGCCTTCGTGCCTCGTTGGCTGCTGAACTCGCACGTCTAGAGACCCGTGGCAAGATAAGCTTA-3’。
其中，所述的基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法，所述扩增方法中采用的合成的两个模板的三种不同比例1:1，10:1，100:1。两个模板的对应引物，通用上游引物为5’至3’为TTACTGGGCATAAAGAGCAC，另外两个下游引物5’至3’分别为CTGGTTAAACTATGCGTGCATTTC和GGTTAACAGTGCGAGTCAGC。
其中，当利用该扩增方法进行建库及后续测序分析时，具体包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取低熔点琼脂糖溶于无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)通过Trizol法提取小鼠RNA，再通过逆转录的方式合成所需的cDNA；
3)以cDNA为模板进行PCR预扩增及利用定向RNA文库制备试剂盒(NEB kit,E7760)进行转录组建库，分为大样本组，普通PCR组，琼脂糖PCR组；
4)大样本组是以100ng起始量的cDNA进行建库，普通PCR及琼脂糖PCR组均为大样本稀释至10pg起始量进行建库；
5)大样本不进行预扩增仅作为对照；
6)普通PCR及琼脂糖PCR均经过预扩增步骤进行建库；
7)预扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min；
8)扩增产物通过磁珠纯化及定向RNA文库制备试剂盒(NEB kit,E7760)进行建库；
9)建库后通过Illumina二代测序方式获得每个文库的数据；
10)通过Hisat比对及R等进行数据分析获得三组均匀性比较的结果。
有益效果：与现有的核酸扩增降低偏性，提高均匀性的优化方法相比，本发明的优点在于：通过在反应体系中加入低熔点琼脂糖就可以实现提高反应效率和均一性的结果，方法简单而且成本较低，不需要昂贵的设备或者非常难的技术操作，在各个实验室都易实现且应用广泛。
附图说明
图1是本发明实施的流程示意图；
图2是通过电泳图表征加入低熔点琼脂糖后灵敏度有所提高的结果，A为加了低熔点琼脂糖的，B为普通PCR没有加入低熔点琼脂糖的。泳道M为2000bp长度的marker，泳道1-6分别是10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg的RNA起始量，泳道7为阴性对照；
图3是通过ImageJ计算各扩增产物条带与maker条带面积比的最终比率的结果，X轴1-6分别对应电泳图中的泳道1-6分别是10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg的RNA起始量；
图4是按照两个模板不同比例进行普通PCR和低熔点琼脂糖PCR扩增的电泳图结果，泳道M为50bp间隔长度marker，泳道1-6分别是混合模板1:1，10:1，100:1的普通PCR对照组结果和混合模板1:1，10:1，100:1的琼脂糖PCR的结果，泳道7是阴性对照；
图5是按照两个模板不同比例进行普通PCR和低熔点琼脂糖PCR扩增的最终扩增后比例的结果。
图6是将大样本(Bulk)组，普通PCR组(PCR)，琼脂糖PCR组(Gel)三组测序所得数据根据不同的bin大小计算所得的变异系数值。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
1、材料和试剂：
1)小鼠：SPF健康雄性C57BL/6J小鼠，12周龄，体重23-25克，购自上海南方模型生物技术有限公司；
2)低熔点琼脂糖：Yeasen#10214ES08；
3)DNA扩增酶：R045A,Takara；
4)复合引物：GAPDH序列，5’至3’分别为GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；
5)cDNA：由小鼠RNA逆转录而来；
6)混合模版序列为：
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACCAGCACCAGCACCACCGACCGTACTACCGCACGCACGCCTTACTGGCTGGCTGAAATGCATCGCACGCATAGTTTAACCAGTACT-3’；
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACTATATAATATAAAGTTTACTCACTTACTCACCTTAGCCGTTTTGCCGGACTAGCCTTCGTGCCTCGTTGGCTGCTGAACTCGCACGTCTAGAGACCCGTGGCAAGATAAGCTTA-3’。
7)混合模版的对应引物，通用引物为5’-TTACTGGGCATAAAGAGCAC-3’，另外两个引物分别为5’-CTGGTTAAACTATGCGTGCATTTC-3’和5’-GGTTAACAGTGCGAGTCAGC-3’。
8)定向RNA文库制备试剂盒：NEB kit，E7760。
2、具体方法：
本实施例共四个，都是先将低熔点琼脂糖加入体系之中，然后进行核酸扩增，最终将低熔点琼脂糖和反应体系进行分离，最终得到更加均匀的扩增结果。本发明所述的低熔点琼脂糖在配置时，称取0.2g低熔点琼脂糖溶于100ml无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液。所述的低熔点琼脂糖溶液需提前按比例加入扩增体系之中，并放置室温使其充分凝固成凝胶状。其中，将低熔点琼脂糖从体系之中进行分离的方式包括高速离心分离和DNA磁珠纯化分离两种方式。
实施例1
基于空间限位效应的以DNA为模板进行PCR扩增时，具体包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取低熔点琼脂糖溶于无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)以DNA为模板进行PCR扩增：扩增体系包括DNA扩增酶、复合引物、DNA模版和低熔点琼脂糖凝胶溶液；
3)PCR扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃5min；
4)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征；
所有DNA都可以作为模版进行低熔点琼脂糖PCR扩增。
实施例2
基于空间限位效应的单模版均匀扩增方法，包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取0.2g低熔点琼脂糖(Yeasen#10214ES08)溶于100ml无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)将低熔点琼脂糖溶液于65℃保存；
3)在200μlPCR管中加入相应体积的液态的低熔点琼脂糖，然后放入4℃保存；
4)通过Trizol法提取小鼠(SPF健康雄性C57BL/6J小鼠，12周龄，体重23-25克，购自上海南方模型生物技术有限公司)的RNA，再通过逆转录的方式合成所需的cDNA。
5)低熔点琼脂糖PCR核酸扩增：体系50μl总体积包括：25μlDNA扩增酶(R045A,Takara)，2μl复合引物(GAPDH序列，5’至3’分别为GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，2μlcDNA，21μl低熔点琼脂糖凝胶；同时将普通PCR核酸扩增作为对照，体系对照组50μl总体积包括：25μlDNA扩增酶(R045A,Takara)，2μl复合引物(GAPDH序列，5’至3’分别为GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，2μlcDNA,21μl无酶水。两种PCR扩增反应条件均为：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。
6)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征。
7)由电泳获得的条带通过ImageJ软件转换成数据。
参见图2是将起始cDNA样本进行了六个十倍梯度的稀释，分别进行普通PCR扩增和低熔点琼脂糖PCR扩增的结果。
参见图3为图2中的每一个扩增条带通过ImageJ计算图2的结果中各扩增产物条带与maker条带面积比的最终比率的结果。
由图2和图3结果可见，加入低熔点琼脂糖后，扩增反应的灵敏度显著提高。普通PCR与maker条带面积比的最终比率分别为6.85，4.25，3.93，0.53，0.10，0.008；而琼脂糖PCR与maker条带面积比的最终比率分别为15.45，14.18，7.98，1.25，0.57，0.15。可以看出，加入低熔点琼脂糖后，PCR扩增反应的灵敏度提高了一个数量级。
实施例3
基于空间限位效应的多模版均匀扩增方法，包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取0.2g低熔点琼脂糖(Yeasen#10214ES08)溶于100ml无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)将低熔点琼脂糖溶液于65℃保存；
3)在200μlPCR管中加入相应体积的液态的低熔点琼脂糖，然后放入4℃保存；
4)将两种模板
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACCAGCACCAGCACCACCGACCGTACTACCGCACGCACGCCTTACTGGCTGGCTGAAATGCATCGCACGCATAGTTTAACCAGTACT-3’和5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACTATATAATATAAAGTTTACTCACTTACTCACCTTAGCCGTTTTGCCGGACTAGCCTTCGTGCCTCGTTGGCTGCTGAACTCGCACGTCTAGAGACCCGTGGCAAGATAAGCTTA-3’按照三种不同质量比1:1，10:1，100:1进行混合。
5)混合模板的低熔点琼脂糖凝胶PCR核酸扩增体系50μl总体积包括：25μlDNA扩增酶(R045A,Takara)，2μl复合引物(两个模板的对应引物，通用引物为5’-TTACTGGGCATAAAGAGCAC-3’，另外两个引物分别为5’-CTGGTTAAACTATGCGTGCATTTC-3’和5’-GGTTAACAGTGCGAGTCAGC-3’)，2μl混合模版，21μl低熔点琼脂糖凝胶；同时将混合模板的普通PCR核酸扩增作为对照组的体系50μl总体积包括：25μlDNA扩增酶(R045A,Takara)，2μl复合引物(两个模板的对应引物包括通用引物(上游引物)和两个下游引物：通用引物为5’-TTACTGGGCATAAAGAGCAC-3’，另外两个引物分别为5’-CTGGTTAAACTATGCGTGCATTTC-3’和5’-GGTTAACAGTGCGAGTCAGC-3’)，2μl混合模版，21μl无酶水。两种PCR扩增反应条件均为：98℃2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。
6)利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征。
7)由电泳获得的条带通过ImageJ软件转换成数据。
参见图4是通过将三种不同质量比1:1，10:1，100:1混合两个模板进行普通PCR和加入了低熔点琼脂糖的PCR扩增的电泳图比较结果。
由图4结果可见，加入低熔点琼脂糖后，原始比例得到了更好的还原，最终的均匀性得到了提升。
参见图5是按照两个模板按照质量比1:1，10:1，100:1，混合后进行普通PCR和低熔点琼脂糖PCR扩增的最终扩增后比例的结果，能看到加了低熔点琼脂糖后更接近于原始比例。原始质量比分别是1:1，10:1，100:1；普通PCR两个模板按照1:1混合扩增后的模板比例为0.87；两个模板按照10:1混合扩增后的模板比例为3.03，两个模板按照100:1混合扩增后的模板比例为9.54；而低熔点琼脂糖PCR两个模板按照1:1混合扩增后的模板比例为0.88，两个模板按照10:1混合扩增后的模板比例为6.14，两个模板按照100:1混合扩增后的模板比例为17.89。可以看出，加了低熔点琼脂糖后更接近于原始比例，均匀性提高了2倍左右。
实施例4
利用基于空间限位效应的多模版均匀扩增方法进行建库及后续测序分析时，具体包括以下步骤：
1)低熔点琼脂糖的配置：称取低熔点琼脂糖溶于无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2)通过Trizol法提取小鼠RNA，再通过逆转录的方式合成所需的cDNA；
3)以cDNA为模板进行PCR预扩增及利用定向RNA文库制备试剂盒(NEB kit,E7760)进行转录组建库，分为大样本组，普通PCR组，琼脂糖PCR组。
4)大样本组是以100ng起始量的cDNA进行建库，普通PCR及琼脂糖PCR组均为大样本稀释至10pg起始量进行建库。
5)大样本不进行预扩增仅作为对照。
6)普通PCR及琼脂糖PCR均经过预扩增步骤进行建库。
7)预扩增反应：98℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 30s，20-30个循环；72℃5min。
8)扩增产物通过磁珠纯化及定向RNA文库制备试剂盒(NEB kit,E7760)进行建库。
9)建库后通过Illumina二代测序方式获得每个文库的数据。
10)通过Hisat比对及R等进行数据分析获得三组均匀性比较的结果。
参见图6是将大样本(Bulk)组，普通PCR组(PCR)，琼脂糖PCR组(Gel)三组测序所得数据根据不同的bin大小计算所得的变异系数值。通常变异系数越小说明扩增结果的均匀性越佳，从结果来看，琼脂糖PCR组的均匀性比普通PCR组更佳，且更接近于大样本组，说明其扩增后的偏性更小。所以说，经过建库及测序后数据分析，基于空间限位的方法可以改善扩增偏性的问题，提高均匀性，可以在建库中进行应用。
综上所述，本发明利用了低熔点琼脂糖凝胶的空间限位效应，将它放入PCR扩增体系之中，最后再从体系之中进行分离，保留原始的PCR扩增体系，最终达到提高反应的灵敏度和均一性的目的，是一种简单易操作的核酸扩增改进方法。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttttactg ggcataaaga gcaccagcac cagcaccacc gaccgtacta ccgcacgcac 60
gccttactgg ctggctgaaa tgcatcgcac gcatagttta accagtact 109
<210> 2
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttttactg ggcataaaga gcactatata atataaagtt tactcactta ctcaccttag 60
ccgttttgcc ggactagcct tcgtgcctcg ttggctgctg aactcgcacg tctagagacc 120
cgtggcaaga taagctta 138
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttactgggca taaagagcac 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggttaaac tatgcgtgca tttc 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggttaacagt gcgagtcagc 20
Claims (1)
1.一种基于空间限位效应的核酸均匀扩增方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）低熔点琼脂糖的配置：称取0.2g低熔点琼脂糖溶于100ml无酶水中加热摇匀使得低熔点琼脂糖充分溶解得到低熔点琼脂糖溶液；
2）将低熔点琼脂糖溶液于65°C保存；
3）在200μlPCR管中加入相应体积的液态的低熔点琼脂糖，然后放入4°C保存；
4）将两种模板
5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACCAGCACCAGCACCACCGACCGTACTACCGCACGCACGCCTTACTGGCTGGCTGAAATGCATCGCACGCATAGTTTAACCAGTACT-3’和5’-TTTTTTACTGGGCATAAAGAGCACTATATAATATAAAGTTTACTCACTTACTCACCTTAGCCGTTTTGCCGGACTAGCCTTCGTGCCTCGTTGGCTGCTGAACTCGCACGTCTAGAGACCCGTGGCAAGATAAGCTTA-3’按照三种不同质量比1:1，10:1，100:1进行混合；
5）混合模板的低熔点琼脂糖凝胶PCR核酸扩增体系50μl总体积包括：25μlDNA扩增酶，2μl复合引物， 2μl混合模板，21μl低熔点琼脂糖凝胶； PCR扩增反应条件均为：98°C 2min；98 °C 10s，58°C 20s，72°C 30s，30个循环；72°C 5min；所述复合引物包括两个模板的对应引物，通用引物为5’ -TTACTGGGCATAAAGAGCAC-3’，另外两个引物分别为5’ -CTGGTTAAACTATGCGTGCATTTC-3’和5’-GGTTAACAGTGCGAGTCAGC-3’；
6）利用磁珠纯化PCR反应体系，通过Qubit测量浓度及电泳方式进行表征；
7）由电泳获得的条带通过ImageJ软件转换成数据。
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