CN105648049A - 琼脂糖在pcr扩增中的应用、pcr扩增试剂盒及pcr扩增方法 - Google Patents

琼脂糖在pcr扩增中的应用、pcr扩增试剂盒及pcr扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了琼脂糖在PCR扩增中的应用,在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖。进一步的,本发明还提供了相应的PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法,PCR扩增试剂盒包括盒体及盒体中单独存放的试剂,所述试剂包括琼脂糖。所述PCR扩增方法,包括在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖的步骤。本发明通过实验证明了在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖,可以提高PCR扩增反应敏感度,使反应更加充分,提高微量DNA的PCR扩增效果,最终获得完整STR分型结果。并且,由于PCR扩增反应敏感度的提高,PCR扩增过程中试剂的使用量可明显降低,从而降低实验成本。

Description

琼脂糖在PCR扩增中的应用、PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及琼脂糖在PCR扩增中的应用、PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法。
背景技术
PCR是聚合酶链式反应的简称,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其研究对生物学各个领域有着深刻的影响,与医、农业、生物工程等的关系十分密切,例如PCR技术涉及在农业上育种的新途径,涉及在医学上检测、治疗遗传疾病,涉及以基因工程为基础的新兴工业,涉及法医物证鉴定、亲子鉴定等。
然而,对于极其微量DNA样本,由于PCR扩增反应敏感度低,很难捕捉到有效的DNA信息。对于微量的DNA样本,常规的PCR扩增方法的反应敏感度低是导致后续PCR扩增效果差的主要原因。例如,在法医侦检工作中,犯罪现场的法医学物证的鉴定和检出,对于及时有效地指证犯罪分子,打击犯罪起到至关重要的作用。犯罪现场中指纹、烟蒂、指甲等都含有微量的DNA信息,可为找出或指证犯罪嫌疑人提供科学依据。但由于犯罪现场的DNA残留甚微,采集到的痕迹法医物证DNA极其微量,常规PCR扩增方法的反应敏感度低,难以捕捉到有效DNA信息从而扩增效果较差,直接导致后续的DNA检出率低,STR分型失败,不能指认犯罪个体。
因此,如何提高PCR扩增的反应敏感度,从而提高微量DNA的PCR扩增效果,对最终获得完整STR分型结果具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明有必要提供一种能提高PCR扩增的反应敏感度,从而提高微量DNA的PCR扩增效果的琼脂糖在PCR扩增中的应用、PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法。
一种琼脂糖在PCR扩增中的应用,在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖。
一种PCR扩增试剂盒,包括盒体及盒体中单独存放的试剂,所述试剂包括琼脂糖。
一种PCR扩增方法,所述方法包括在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖的步骤。
本发明提供的琼脂糖在PCR扩增中的应用、PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法的有益效果是:在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖,由于琼脂糖对DNA具有极强的吸附力,并提高反应体系的沸点使体系缓冲液不易蒸发,同时琼脂糖流体是由许多微小球体组成,可以包裹反应体系,使整个PCR扩增反应在一个微小空间完成,从而提高PCR扩增的反应敏感度,使反应更加充分,提高微量DNA的PCR扩增效果,最终获得完整STR分型结果。
附图说明
图1是实验组一的STR图谱,即采用常规的STR荧光检测试剂盒在10μlPCR扩增反应体系下对志愿者一使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增后的STR分型结果。
图2是实验组二的STR图谱,即采用本发明实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒在10μlPCR扩增反应体系下对志愿者一使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增后的STR分型结果。
图3是实验组三的STR图谱,即采用常规的STR荧光检测试剂盒在10μlPCR扩增反应体系下对志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增后的STR分型结果。
图4是实验组四的STR图谱,即采用常规的STR荧光检测试剂盒在5μlPCR扩增反应体系下对志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增后的STR分型结果。
图5是实验组五的STR图谱,即采用本发明实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒在5μlPCR扩增反应体系下对志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增后的STR分型结果。
图6是采用本发明实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒在3μlPCR扩增反应体系下进行PCR扩增后的STR分型结果示例1。
图7是采用本发明实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒在3μlPCR扩增反应体系下进行PCR扩增后的STR分型结果示例2。
具体实施方式
本发明提供了一种琼脂糖在PCR扩增中的应用。琼脂糖在生物学领域主要用于PCR扩增后的产物检测阶段进行琼脂糖凝胶电泳,并未用于PCR扩增阶段。
本发明提供的琼脂糖在PCR扩增中的应用,为在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖。
所述琼脂糖溶解于一溶剂后配置为琼脂糖流体使用。所述溶剂为水或缓冲液。所述琼脂糖流体中,琼脂糖的质量百分比为0.01%~0.5%。
所述琼脂糖在PCR扩增中的应用包括向PCR扩增反应体系中加入琼脂糖后进行变性、退火及延伸。
本发明还提供了一种PCR扩增试剂盒,该试剂盒包括盒体及盒体中单独存放的试剂,所述试剂包括琼脂糖。
所述琼脂糖为质量浓度为0.01%~0.5%的流体。所述试剂还包括PCRmix、Taq酶、引物。
本发明还提供了一种PCR扩增方法,该方法包括在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖的步骤。
所述PCR扩增方法还包括琼脂糖溶解于一溶剂后配置为琼脂糖流体。所述溶剂为水或缓冲液。所述琼脂糖流体中,琼脂糖的质量百分比为0.01%~0.5%。
所述PCR扩增方法包括向PCR扩增反应体系中加入琼脂糖后进行变性、退火及延伸。
下面将结合具体实施例对本发明提供的琼脂糖在PCR扩增中的应用、PCR扩增试剂盒及PCR扩增方法予以进一步说明。
实施例一
将琼脂糖应用于从志愿者一使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA的PCR扩增。
称取0.03g琼脂糖加入100g水中加热混合均匀使其溶解,得琼脂糖流体待用。
一种PCR扩增试剂盒,包括盒体及盒体内单独存放的试剂,所述试剂包括:琼脂糖,PCRmix,HotStartTaq酶,复合引物。
所述琼脂糖为0.03g琼脂糖溶解于100g水中得到的琼脂糖流体。
将上述PCR扩增试剂盒用于从志愿者一使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA的PCR扩增。
向志愿者一提供一支牙刷,由志愿者洗漱一次后提供给研究人员,提取牙刷中口腔脱落细胞DNA以备后续PCR扩增。
设置实验组一、实验组二,对牙刷中提取的相同口腔脱落细胞DNA样本进行PCR扩增,实验组一采用常规STR荧光检测试剂盒进行PCR扩增,实验组二采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增。
实验组一的PCR扩增体系配制为:按常规STR荧光检测试剂盒中10μl反应体系的配比,量取4μlPCRmix,0.4μlHotStartTaq酶,2μl复合引物,3.6μlsdH2O混合均匀。
实验组二的PCR扩增体系配制为:量取本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒中4μlPCRmix,0.4μlHotStartTaq酶,2μl复合引物,3.6μl琼脂糖流体混合均匀。所述PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物与常规STR荧光检测试剂盒的PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物相同。
向实验组一、实验组二的PCR扩增体系中分别加入1μlDNA模板进行PCR扩增反应,所述实验组一、实验组二反应条件相同。
所述反应条件为:一步反应,95℃2min;94℃45s,60℃1min,72℃1min,10个循环;二步反应,90℃45s,58℃1min,72℃1min,20个循环。
将实验组一、实验组二扩增所得PCR产物分别进行STR分型检测,实验组一所得STR图谱见附图1,实验组二所得STR图谱见附图2。
实施例二
将琼脂糖应用于从志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA的PCR扩增。
称取0.3g琼脂糖加入100g水中混合均匀加热使其溶解,得琼脂糖流体待用。
一种PCR扩增试剂盒,包括盒体及盒体内单独存放的试剂,所述试剂包括:琼脂糖,PCRmix,HotStartTaq酶,复合引物。
所述琼脂糖为0.3g琼脂糖溶解于100g水中得到的琼脂糖流体。
将上述PCR扩增试剂盒用于从志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA的PCR扩增。
向志愿者二提供一支牙刷,由志愿者洗漱一次后提供给研究人员,提取牙刷中口腔脱落细胞DNA以备后续PCR扩增。
设置实验组三、实验组四、实验组五,对牙刷中提取的相同口腔脱落细胞DNA样本进行PCR扩增。实验组三采用常规STR荧光检测试剂盒进行PCR扩增,PCR扩增体系为10μlPCR扩增体系;实验组四采用常规STR荧光检测试剂盒进行PCR扩增,PCR扩增体系为5μlPCR扩增体系;实验组五采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增,PCR扩增体系为5μlPCR扩增体系。
实验组三的PCR扩增体系配制为:按常规STR荧光检测试剂盒中10μl反应体系的配比,量取4μlPCRmix,0.4μlHotStartTaq酶,2μl复合引物,3.6μlsdH2O混合均匀。
实验组四的PCR扩增体系配制为:将常规STR荧光检测试剂盒中10μl反应体系减至5μl,量取2μlPCRmix,0.2μlHotStartTaq酶,1μl复合引物,1.8μlsdH2O混合均匀。
实验组五的PCR扩增体系配制为:按本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒中5μl反应体系的配比,量取2μlPCRmix,0.2μlHotStartTaq酶,1μl复合引物,1.8μl琼脂糖流体混合均匀。所述PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物与STR荧光检测试剂盒的PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物相同。
向实验组三的PCR扩增体系中加入1μlDNA模板进行PCR扩增反应,向实验组四、实验组五的PCR扩增体系中加入0.5μlDNA模板进行PCR扩增反应,所述实验组三、实验组四、实验组五反应条件相同。
所述反应条件为:一步反应,95℃2min;94℃45s,60℃1min,72℃1min,10个循环;二步反应,90℃45s,58℃1min,72℃1min,20个循环。
将实验组三、实验组四、实验组五扩增所得PCR产物分别进行STR分型检测,实验组三所得STR图谱见附图3,实验组四所得STR图谱见附图4,实验组五所得STR图谱见附图5。
实施例三
将琼脂糖应用于微量DNA的PCR扩增中,长期使用。
称取0.3g琼脂糖加入100g水中混合均匀加热使其溶解,完全溶解后得琼脂糖流体待用。
一种PCR扩增试剂盒,包括盒体及盒体内单独存放的试剂,所述试剂包括:琼脂糖,PCRmix,HotStartTaq酶,复合引物。
所述琼脂糖为0.3g琼脂糖溶解于100g水中得到的琼脂糖流体。
将上述PCR扩增试剂盒用于微量DNA的PCR扩增,采用3μlPCR扩增体系,并在本公司科研中心进行大量实验以验证琼脂糖在3μlPCR扩增体系中作用效果的稳定性及琼脂糖对PCR扩增的提升效果。
所述3μlPCR扩增体系配制如下:1.2μlPCRmix,0.12μlHotStartTaq酶,0.6μl复合引物,1.08μl琼脂糖流体。所述PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物与常规STR荧光检测试剂盒的PCRmix、HotStartTaq酶、复合引物相同。
PCR扩增反应条件为:一步反应,95℃2min;94℃45s,60℃1min,72℃1min,10个循环;二步反应,90℃45s,58℃1min,72℃1min,20个循环。
在上述PCR扩增体系及PCR扩增反应条件下扩增所得产物的STR图谱示例1、示例2分别见附图6、附图7。
由实施例一、实施例二、实施例三的实验结果可见,对于从志愿者一使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA在10μlPCR扩增体系下进行PCR扩增的结果,对比附图1、附图2可见,附图1中22个位点并没有完全获得STR分型,而且峰值很低导致该STR图谱可信度低;而附图2中22个位点全部获得分型,且峰值很高故该STR图谱可信度达100%。实验组一实验组二的区别在于实验组二的PCR扩增反应体系中添加了琼脂糖,对比结果可见,实验组二比实验组一具有更高的PCR扩增反应体系敏感度,从而大幅提升PCR扩增反应的成功率,最终获得了完整的STR分型结果,实验效果明显。
对于从志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA进行PCR扩增的结果,对比附图3、附图4可见,对于采用常规STR荧光检测试剂盒的实验组三、实验组四,当PCR扩增体系降至5μl后,STR图谱峰值明显降低,可见由于常规PCR扩增反应体系的敏感度较低使得5μlPCR扩增体系下扩增的结果不能获得完整的STR分型;对比附图4、附图5可见,当同为5μlPCR扩增体系时,采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒的实验组五的STR图谱相比于采用常规STR荧光检测试剂盒的实验组四的STR图谱,峰值有明显增高,STR分型测试结果良好,可见实验组五的添加了琼脂糖的PCR扩增反应体系具备更高的PCR反应敏感度,从而成功完成志愿者二使用过的牙刷上提取的口腔脱落细胞DNA的PCR的扩增,获得完整的STR分型结果;对比附图3、附图5可见,虽实验组五的5μlPCR扩增体系仅为实验组三的一半,但采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒使实验组五的STR图谱具有更好的峰值,比常规10μlPCR扩增体系的实验组四具有更好的扩增效果。
实验组三、实验组四、实验组五的STR图谱对比可见,采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒不仅可以明显提高PCR扩增反应的敏感度进而提高PCR扩增反应成功率,并且可以在保证实验成功率的前提下降低PCR扩增体系,从而大程度降低实验成本,实验效果明显。
对于进一步降低PCR扩增反应体系至3μl的结果,如附图6、附图7所示。大量实验证明,采用本实施方式提供的添加了琼脂糖的PCR扩增试剂盒在3μlPCR扩增体系下,仍然具有较高的PCR扩增反应敏感度并能够获得完整STR分型,且STR图谱峰值较高。由于目前常规的PCR扩增反应只能采用10μl及10μl以上的PCR扩增体系,3μl的反应体系可大大降低实验成本。
综上所述,琼脂糖在PCR扩增反应中具有提高PCR敏感度的效果,从而提高了PCR成功率并能够获得完整的STR分型,同时大幅降低PCR扩增过程中试剂的使用量,降低实验成本,经过大量的实验证明琼脂糖提高PCR扩增反应敏感度的效果明显、稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种琼脂糖在PCR扩增中的应用,其特征在于:在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖。
2.如权利要求1所述的琼脂糖在PCR扩增中的应用,其特征在于:所述琼脂糖溶解于一溶剂后配置为琼脂糖流体使用。
3.如权利要求2所述的琼脂糖在PCR扩增中的应用,其特征在于:所述溶剂为水或缓冲液。
4.如权利要求2所述的琼脂糖在PCR扩增中的应用,其特征在于:所述琼脂糖流体中,琼脂糖的质量百分比为0.01%~0.5%。
5.一种PCR扩增试剂盒,包括盒体及盒体中单独存放的试剂,其特征在于:所述试剂包括琼脂糖。
6.如权利要求5所述的PCR扩增试剂盒,其特征在于:所述琼脂糖为质量浓度为0.01%~0.5%的流体。
7.如权利要求5所述的PCR扩增试剂盒,其特征在于:所述试剂还包括PCRmix、Taq酶、引物。
8.一种PCR扩增方法,其特征在于:所述方法包括在配置PCR扩增体系过程中加入琼脂糖的步骤。
9.如权利要求8所述的PCR扩增方法,其特征在于:所述方法还包括琼脂糖溶解于一溶剂后配置为琼脂糖流体。
10.如权利要求9所述的PCR扩增方法,其特征在于:所述溶剂为水或缓冲液。
11.如权利要求9所述的PCR扩增方法,其特征在于:所述琼脂糖流体中,琼脂糖的质量百分比为0.01%~0.5%。
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