CN108315216A - 一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法 - Google Patents

一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，包括此方法使用的设备等温扩增装置本体，根据上述装置的使用方法，所述方法包括如下步骤：扩增前准备：打开上盖，在反应管内滴入22‑28微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.4‑0.7毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体内注入1‑2毫升的1000×SYBR Green I染料。本发明要解决的技术问题是解决LAMP假阳性污染问题，提供一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，操作简单，步骤合理，有效的消除LAMP假阳性污染的问题。

Description

一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法
技术领域
本发明涉及假阳性污染改良技术领域，具体是指一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法。
背景技术
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)是日本学者Notomi等2000年创建的。LAMP反应需要4条或6条引物共同作用，及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶完成扩增。反应在60℃-65℃恒温扩增,不需要热循环。该反应有特异性高、灵敏度高、反应时间短、设备要求简单等优点。同时由于LAMP产物量巨大，实验结束后开盖形成气溶胶污染实验室，造成结果假阳性的问题十分严重。因此，研究LAMP假阳性污染问题的改良方法具有重要的意义。
目前常用的防止假阳性污染问题的方法主要有以下几种：方法一，使用特定的PCR管，管中有一个固定的小隔板将管分成两个区域，一个加反应液一个加DNA染料，这种方法增加了加液次数，不适用于大批量检测；方法二，将染料包埋在石蜡中，反应结束后高温石蜡融化，释放染料，该方法制备包埋染料，增加检测准备时间。针对这样的情况，有必要研制一种新方法，来解决LAMP假阳性污染问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是解决LAMP假阳性污染问题，提供一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，操作简单，步骤合理，有效的消除LAMP假阳性污染的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，包括此方法使用的设备等温扩增装置本体，所述等温扩增装置本体上设有上盖和底座，上盖和底座铰接连接，所述底座内固定设有至少两个放置架，所述放置架内设有可更换的透明反应管，所述透明反应管开口处设有水平的支撑条，所述支撑条中心处设有挤压凸起，所述上盖顶部设有气缸腔，所述气缸腔内顶部设有气缸，所述气缸的活塞杆连接设有蒸汽管架，所述蒸汽管架贯通上盖盖壁处设有蒸汽喷头，所述蒸汽管架连通蒸汽喷头，所述蒸汽喷头端部设有单向阀腔体，所述蒸汽管架一端连通设有蒸汽进口，另一端设有泄压阀，所述底座底部中心处设有排水阀，排水阀连通等温扩增装置本体内腔，所述等温扩增装置本体内设有恒温控制器，所述恒温控制器、气缸和排水阀均电性连接控制器；
根据上述装置的结构原理，所述使用方法包括如下步骤：
1)扩增前准备：打开上盖，在透明反应管内滴入22-28微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.4-0.7毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体内注入1-2毫升的1000×SYBRGreen I染料，环介导等温扩增体系试剂各组分体积分别为：BstDNA聚合酶(8000U/mL)0.75-1.25微升，10×Buffer 2.25-2.75微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.25-0.75微升(终浓度4mM)，dNTP(10mM)0.75-1.25微升(终浓度0.4mM)，内引物10mM FIP、BIP各3.75-4.25微升(终浓度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.25-0.75微升(终浓度0.2mM)，环引物10mM LF、LB各0.75-1.25微升(终浓度0.4mM)，灭菌水7.75-8.25微升，模板0.75-1.25微升；
2)等温扩增：调节恒温控制器，使得等温扩增装置本体内的温度为60-65℃，扩增55-65分钟；
3)改良处理：扩增结束后，调节恒温控制器，使得等温扩增装置本体内的温度为90-100℃，高温变性，然后通水蒸汽，蒸汽喷头释放水蒸气，反应形成的气溶胶被水蒸气吸附；
4)检测环节：静置1-2分钟，待琼脂糖凝固；控制单向阀腔体的出液为1微升/滴，气缸动作，使得单向阀腔体出液1-2滴，反应1-2分钟后，控制打开排水阀排废水，然后打开上盖，观察反应后的颜色变化；肉眼观察的判断依据为：橙色为阴性结果，绿色为阳性结果。
作为改进，所述蒸汽喷头上设有若干蒸汽喷孔，可以使气溶胶被水蒸气充分吸附。
作为改进，所述排水阀连通位置为底座内底平面最低位置处，能使试验废水集中到排水阀并全部排出。
采用以上结构后，本发明具有如下优点：本发明将琼脂糖粉预先加入透明反应管中，恒温扩增时琼脂糖粉不干扰扩增，同时反应结束后高温琼脂糖融化，冷却后扩增体系凝固，有效防止LAMP产物形成气溶胶污染实验室；同时水蒸气吸附残留的气溶胶，冷却后成废水排出等温扩增装置本体。
附图说明
图1是本发明专利涉及到的等温扩增装置结构示意图。
如图所示：1、等温扩增装置本体，2、上盖，3、底座，4、放置架，5、透明反应管，6、支撑条，7、挤压凸起，8、气缸腔，9、气缸，10、蒸汽管架，11、蒸汽喷头，12、单向阀腔体，13、蒸汽进口，14、泄压阀，15、排水阀，16、控制器，17、恒温控制器。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
结合附图1。
实施例1
一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，包括此方法使用的设备等温扩增装置本体1，所述等温扩增装置本体1上设有上盖2和底座3，上盖2和底座3铰接连接，所述底座3内固定设有至少两个放置架4，所述放置架4内设有可更换的透明反应管5，所述透明反应管5开口处设有水平的支撑条6，所述支撑条6中心处设有挤压凸起7，所述上盖2顶部设有气缸腔8，所述气缸腔8内顶部设有气缸9，所述气缸9的活塞杆连接设有蒸汽管架10，所述蒸汽管架10贯通上盖2盖壁处设有蒸汽喷头11，所述蒸汽管架10连通蒸汽喷头11，所述蒸汽喷头11端部设有单向阀腔体12，所述蒸汽管架10一端连通设有蒸汽进口13，另一端设有泄压阀14，所述底座3底部中心处设有排水阀15，排水阀15连通等温扩增装置本体1内腔，所述等温扩增装置本体1内设有恒温控制器17，所述恒温控制器17、气缸9和排水阀15均电性连接控制器16；
根据上述装置的结构原理，所述使用方法包括如下步骤：
1)扩增前准备：打开上盖2，在透明反应管5内滴入22微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.4毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体12内注入1毫升的1000×SYBR GreenI染料，环介导等温扩增体系试剂各组分体积分别为：BstDNA聚合酶(8000U/mL)0.75微升，10×Buffer 2.25微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.25微升(终浓度4mM)，dNTP(10mM)0.75微升(终浓度0.4mM)，内引物10mM FIP、BIP各3.75微升(终浓度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.25微升(终浓度0.2mM)，环引物10mM LF、LB各0.75微升(终浓度0.4mM)，灭菌水7.75微升，模板0.75微升；
2)等温扩增：调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为60℃，扩增55分钟；
3)改良处理：扩增结束后，调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为90℃，高温变性，然后通水蒸汽，蒸汽喷头11释放水蒸气，反应形成的气溶胶被水蒸气吸附；
4)检测环节：静置1分钟，待琼脂糖凝固；控制单向阀腔体12的出液为1微升/滴，气缸9动作，使得单向阀腔体12出液1滴，反应1分钟后，控制打开排水阀15排废水，然后打开上盖2，观察反应后的颜色变化；肉眼观察的判断依据为：橙色为阴性结果，绿色为阳性结果。
所述蒸汽喷头11上设有若干蒸汽喷孔。
所述排水阀15连通位置为底座3内底平面最低位置处。
实施例2
所述实施例2所涉及的设备与实施例1中一致，其中不同之处在于：
根据上述装置的结构原理，所述使用方法包括如下步骤：
1)扩增前准备：打开上盖2，在透明反应管5内滴入28微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.7毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体12内注入2毫升的1000×SYBR GreenI染料，环介导等温扩增体系试剂各组分体积分别为：BstDNA聚合酶(8000U/mL)1.25微升，10×Buffer 2.75微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.75微升(终浓度4mM)，dNTP(10mM)1.25微升(终浓度0.4mM)，内引物10mM FIP、BIP各4.25微升(终浓度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.75微升(终浓度0.2mM)，环引物10mM LF、LB各1.25微升(终浓度0.4mM)，灭菌水8.25微升，模板1.25微升；
2)等温扩增：调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为65℃，扩增65分钟；
3)改良处理：扩增结束后，调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为100℃，高温变性，然后通水蒸汽，蒸汽喷头11释放水蒸气，反应形成的气溶胶被水蒸气吸附；
4)检测环节：静置2分钟，待琼脂糖凝固；控制单向阀腔体12的出液为1微升/滴，气缸9动作，使得单向阀腔体12出液2滴，反应2分钟后，控制打开排水阀15排废水，然后打开上盖2，观察反应后的颜色变化；肉眼观察的判断依据为：橙色为阴性结果，绿色为阳性结果。
所述蒸汽喷头11上设有若干蒸汽喷孔。
所述排水阀15连通位置为底座3内底平面最低位置处。
实施例3
所述实施例3所涉及的设备与实施例1中一致，其中不同之处在于：
根据上述装置的结构原理，所述使用方法包括如下步骤：
1)扩增前准备：打开上盖2，在透明反应管5内滴入25微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.6毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体12内注入2毫升的1000×SYBR GreenI染料，环介导等温扩增体系试剂各组分体积分别为：BstDNA聚合酶(8000U/mL)1微升，10×Buffer2.5微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.5微升(终浓度4mM)，dNTP(10mM)1微升(终浓度0.4mM)，内引物10mM FIP、BIP各4微升(终浓度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.5微升(终浓度0.2mM)，环引物10mM LF、LB各1微升(终浓度0.4mM)，灭菌水8微升，模板1微升；
2)等温扩增：调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为65℃，扩增60分钟；
3)改良处理：扩增结束后，调节恒温控制器17，使得等温扩增装置本体1内的温度为95℃，高温变性，然后通水蒸汽，蒸汽喷头11释放水蒸气，反应形成的气溶胶被水蒸气吸附；
4)检测环节：静置2分钟，待琼脂糖凝固；控制单向阀腔体12的出液为1微升/滴，气缸9动作，使得单向阀腔体12出液2滴，反应2分钟后，控制打开排水阀15排废水，然后打开上盖2，观察反应后的颜色变化；肉眼观察的判断依据为：橙色为阴性结果，绿色为阳性结果。
所述蒸汽喷头11上设有若干蒸汽喷孔。
所述排水阀15连通位置为底座3内底平面最低位置处。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，包括此方法使用的设备等温扩增装置本体(1)，其特征在于：所述等温扩增装置本体(1)上设有上盖(2)和底座(3)，上盖(2)和底座(3)铰接连接，所述底座(3)内固定设有至少两个放置架(4)，所述放置架(4)内设有可更换的透明反应管(5)，所述透明反应管(5)开口处设有水平的支撑条(6)，所述支撑条(6)中心处设有挤压凸起(7)，所述上盖(2)顶部设有气缸腔(8)，所述气缸腔(8)内顶部设有气缸(9)，所述气缸(9)的活塞杆连接设有蒸汽管架(10)，所述蒸汽管架(10)贯通上盖(2)盖壁处设有蒸汽喷头(11)，所述蒸汽管架(10)连通蒸汽喷头(11)，所述蒸汽喷头(11)端部设有单向阀腔体(12)，所述蒸汽管架(10)一端连通设有蒸汽进口(13)，另一端设有泄压阀(14)，所述底座(3)底部中心处设有排水阀(15)，排水阀(15)连通等温扩增装置本体(1)内腔，所述等温扩增装置本体(1)内设有恒温控制器(17)，所述恒温控制器(17)、气缸(9)和排水阀(15)均电性连接控制器(16)；
根据上述装置的结构原理，所述使用方法包括如下步骤：
1)扩增前准备：打开上盖(2)，在透明反应管(5)内滴入22-28微升环介导等温扩增体系的试剂，同时加入0.4-0.7毫克琼脂糖粉，然后在单向阀腔体(12)内注入1-2毫升的1000×SYBR Green I染料，环介导等温扩增体系试剂各组分体积分别为：BstDNA聚合酶(8000U/mL)0.75-1.25微升，10×Buffer 2.25-2.75微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.25-0.75微升(终浓度4mM)，dNTP(10mM)0.75-1.25微升(终浓度0.4mM)，内引物10mM FIP、BIP各3.75-4.25微升(终浓度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.25-0.75微升(终浓度0.2mM)，环引物10mMLF、LB各0.75-1.25微升(终浓度0.4mM)，灭菌水7.75-8.25微升，模板0.75-1.25微升；
2)等温扩增：调节恒温控制器(17)，使得等温扩增装置本体(1)内的温度为60-65℃，扩增55-65分钟；
3)改良处理：扩增结束后，调节恒温控制器(17)，使得等温扩增装置本体(1)内的温度为90-100℃，高温变性，然后通水蒸汽，蒸汽喷头(11)释放水蒸气，反应形成的气溶胶被水蒸气吸附；
4)检测环节：静置1-2分钟，待琼脂糖凝固；控制单向阀腔体(12)的出液为1微升/滴，气缸(9)动作，使得单向阀腔体(12)出液1-2滴，反应1-2分钟后，控制打开排水阀(15)排废水，然后打开上盖(2)，观察反应后的颜色变化；肉眼观察的判断依据为：橙色为阴性结果，绿色为阳性结果。
2.根据权利要求1所述的一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，其特征在于：所述蒸汽喷头(11)上设有若干蒸汽喷孔。
3.根据权利要求1所述的一种环介导等温扩增技术假阳性污染问题的有效改良方法，其特征在于：所述排水阀(15)连通位置为底座(3)内底平面最低位置处。
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