CN102181519B - 利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法 - Google Patents

Abstract

一种分子生物技术领域的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，利用转肽酶Sortase A将线性的RNase H环化、具有茎环结构的探针、待测DNA片段、待测DNA特异性的正向引物与反向引物、Vent DNA聚合酶、环化的APERNase HII，测定待测DNA片段特定位点的SNP，提高了RNase H的热稳定性。

Description

利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物技术领域的方法，具体是一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法。

背景技术

单核苷酸多态性SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异而导致的基因序列的多态性。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。SNP在高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究方面具有重要的应用价值。目前，已开发了多种SNP的检测技术。但是现有SNP检测技术或是操作过程繁琐[BioTechniques，2009，46：201-208]，或灵敏度差[BMC Genomics 2010，11：641]，或需要昂贵的检测设备[Nucleic Acides Research，2003，Vol.31，No.7e37]，或检测成本过高[BMC Genomics，2006，7：291-291]。

RNase H具有识别DNA与RNA杂合双链中错配碱基的特性。(1)当杂合双链完全匹配时，RNase H能够识别杂合双链中的碱基并切割杂合双链；(2)当杂合双链中含有错配碱基时，RNase H不能识别杂合双链中的碱基，不能切割杂合双链。利用RNase H这一特殊的酶学特性结合PCR技术可以快速、精确地对SNP位点进行检测。但是，线性RNase H的缺点是在PCR较高的反应温度下往往变得不稳定甚至失活。而蛋白质环化后在生物学活性未受影响的同时其热稳定性得到提高的报道[Rev.Biochem.2003，72，249-289]为提高RNase H的稳定性提供了重要依据。

转肽酶Sortase A具有环化蛋白质的功能。在线性蛋白质在N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG时，在转肽酶Sortase A的作用下会将线性的蛋白质环化[JBC，2009，M901752200]。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，利用转肽酶Sortase A将线性的RNase H环化、具有茎环结构的探针、待测DNA片段、待测DNA特异性的正向引物与反向引物、Vent DNA聚合酶、环化的APE RNase HⅡ，测定待测DNA片段特定位点的SNP，提高了RNase H的热稳定性。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性APE RNaseHⅡ，具体步骤包括：

1.1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸；

突变正向引物：ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGGAGGCGGCCGCAAA

突变反向引物：CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTCCGTTGTGTAC

1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG；

正向引物：GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG

反向引物：GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAA CTCGTCC

1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I\Bam HI，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；

1.4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准贮存缓冲液中；

所述的标准贮存缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH 8.0。

步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HⅡ：转肽酶Sortase A与线性的APE RNase HⅡ在标准反应缓冲液并温浴24h。

所述的标准反应缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和10mM CaCl₂且pH 8.0。

所述的转肽酶SortaseA与线性的APE RNase HⅡ的浓度比为1：1的比例。

所述的温浴为37℃。

步骤三、鉴定环化RNase H的热稳定性。环化的RNase H与未环化的RNase H经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性。

步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，其结构的特征是：探针5’末端及3’末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸配对；

步骤五、设计合成用于扩增目的DNA的特异性正向引物和反向引物，PCR扩增目的DNA，

正向引物：GCTCCCACTCCATGAGGTATT

反向引物：GGGACAAGGGTCTCGGAGT

所述的PCR扩增中PCR反应条件为94℃×5min；(94℃×30s，50℃×30s，72℃×15s)×30循环；72℃×2min，扩增后的DNA片段，经胶回收纯化贮存。

步骤六、利用合成的探针及环化的RNase H，在Steponeplus仪上进行PCR反应，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性，具体步骤包括：

6.1)配制反应混合溶液20μL。将反应所需的酶：环化的RNase H、Vent DNA聚合酶，底物：探针、待测DNA片段，特异正向/反向引物，buffer，DEPC H2O，dNTP等混合均匀，除气泡。

6.2)反应溶液转移至Steponeplus仪进行反应，同时检测DNA的单核苷酸多态性。

本发明与现有的SNP检测技术相比，主要优势如下：(1)操作简单方便，可以进行高通量的检测；(2)结果快速准确，数据直观，易于分析；(3)检测设备简单，不需要昂贵的检测仪器。本发明可以检测各种生物样本的SNP。

附图说明

图1是蛋白质环化的示意图。

图2是环化APE RNase HⅡ的实施例示意图。

图3是提高APE RNase HⅡ热稳定性的实施例示意图。

图4是Real-time PCR检测SNP位点的示意图。

图5是环化APE RNase HⅡRNase H在检测SNP位点中的实施例示意图。

图6是环化GFP蛋白的电泳实施例示意图。

图7是环化GFP蛋白热稳定性的实施例示意图。

图8是环化GFP与未环化GFP的Tm值比较分析实施例示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

人类白细胞抗原(HLA)第274位核苷酸种类的鉴定

本实施例中的，待测SNP位点为人类白细胞抗原HLA第274位核苷酸种类，环化的RNaseH为APE RNase HⅡ，实施例探针为与待测DNA匹配的C探针及错配的U探针。

第一步，纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性APE RNaseHⅡ，具体步骤包括：

1.1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸；

1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG；

1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I \Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；

1.4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准的贮存缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0)中。

第二步，环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HⅡ：转肽酶Sortase A 与线性的APE RNase HⅡ在标准反应缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，10mMCaCl2，pH 8.0)中，按照转肽酶Sortase A与线性蛋白质的浓度比为1∶1的比例混合(反应体系100μL)，37℃温浴24h。

如图1所示，转肽酶SortaseA在标准反应条件下环化线性蛋白质的示意图。

如图2所示，环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HⅡ的具体实施例。100μL反应体系，线性APE RNase HⅡ40μL，转肽酶Sortase A20μL，缓冲液，ddH2O，37℃温浴24h。去除反应溶液中转肽酶Sortase A的方法为按反应溶液：Ni柱＝100∶30的比例，4℃温浴30min，离心取上清。环化结果跑15％SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色鉴定。环化结果：1为未环化的APE RNase HⅡ；2为环化的APE RNase HⅡ；3为除去Sortase A的环化APE RNase HⅡ；4为SortaseA。通过计算APE RNase HⅡ的环化效率大约为95％。可见转肽酶Sortase A可以有效地实施蛋白质的环化反应。

第三步，鉴定环化APE RNase HⅡ的热稳定性。如图3所示，环化RNase H及未环化RNaseH在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃加热处理10min后，在标准的反应条件下(反应体系10μL：酶1μL，末端带有荧光标记的底物1pM，缓冲液，DEPC水；30℃温浴15mmin)检测它们的活性，反应结束后跑20％脲素-PAGE胶在荧光仪上查看测活结果：(a)为未环化APE RNase HⅡ活性测定结果；(b)为环化APE RNase HⅡ活性测定结果。环化后的RNase H活性与未环化的RNase H相比热稳定增加了5℃，在70℃时环化的RNase H的活性仍维持在95％，而未环化的RNaseH活性仅为5％。

第四步，合成具有茎环结构的探针。

第五步，制备待测人类白细胞抗原的DNA片段。设计与人类白细胞抗原序列完全匹配的正向序列和反响序列。采用KOD DNA聚合酶PCR扩增人类白细胞抗原DNA片段。PCR反应条件：94℃×5min；(94℃×30s，50℃×30s，72℃×15s)×30循环；72℃×2min。扩增后的DNA片段，经胶回收纯化贮存。

第六步，如图4所示，检测人类白细胞抗原274位核苷酸种类，具体步骤包括：(1)为人工合成的具有茎环结构的探针，两端含有一个荧光基团和相应的淬灭基团。探针的N端、C端部分序列互补，使探针在单链状态下，由于淬灭基团与荧光基团相接触，使得荧光基团淬灭；(2)在PCR反应中加入茎环结构的探针和环化的APE RNase HⅡ检测SNP位点。PCR反应循环退火阶段，探针与相应的互补DNA片段形成杂合双链，温浴阶段进行荧光信号的检测：(a)杂合双链完全匹配时，APE RNase HⅡ切割杂合双链中的SNP位点，产生断裂的探针片段。下一轮循环变性后，温浴阶段断裂探针的N端与C端处于游离状态，荧光基团激发发出荧光信号。随着PCR循环数的增加，产生的断裂探针片段增加，相应的荧光信号增强；(b)杂合双链中含有错配碱基时，RNase H不能在杂合双链的SNP位点处发生切割。下一轮循环变性后，温浴阶段探针自身重新形成茎环结构，由于荧光基团与淬灭基团接触使得荧光基团淬灭。随着PCR循环数的增加，荧光值维持在较平稳的水平。

如图5所示，利用环化APE RNase HⅡ检测基因多态性SNP的实施例。反应体系(20μL)：模板5ng，待测DNA的正向\反向引物1pM，缓冲液，VentDNA聚合酶0.5μL，探针0.5pM，DEPC水，APE RNase HⅡ1μL。反应条件为：95℃，1min30s；(94℃，15s，49℃，2min，49℃检测荧光值)×40循环；16℃，2min。(a)为探针与目的DNA序列完全匹配时，环化APE RNase HⅡ、未环化APE RNase HⅡ及阴性对照的检测结果：A为环化APE RNase HⅡ检测结果，B为未环化APE RNase HⅡ检测结果，C为阴性对照；(b)为探针与目的DNA序列错配时，环化APE RNase HⅡ、未环化APE RNase HⅡ及阴性对照的检测结果。A为环化APE RNase HⅡ检测结果，B为未环化APE RNase HⅡ检测结果，C为阴性对照。当探针与待测DNA完全匹配时，由于环化APE RNase HⅡ的切割作用，随着循环数的增加荧光信号呈上升趋势；当探针与待测DNA不匹配时，环化APE RNase HⅡ不对杂合双链产生切割，随着循环数的增加荧光信号并不增加。比较环化APE RNase HⅡ、未环化APE RNase HⅡ对SNP位点的检测结果：环化的APE RNase HⅡ与未环化APE RNase HⅡ相比由于其热稳定性得到了提高，在PCR循环的热变性处理后仍可以保持相应的活性而鉴定出SNP位点；线性APE RNase HⅡ由于热稳定性差，正确及错配碱基的PCR反应都未出现荧光信号的差异，因而不能有效地鉴定SNP位点。

实施例2

环化绿色荧光蛋白GFP的热稳定性分析

本实施例利用转肽酶Sortase A的活性，将N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶SortaseA识别序列LPETG的绿色荧光蛋白GFP环化。

第一步，纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性GFP，具体步骤包括：

1.1)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG；

正向引物：GGGGGGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT

反向引物：GGGGGGGATCCTCATCCGGTTTCTGGTAATTTGTATAGTTCATCCATGCC

1.2)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I \Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；

1.3)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准的贮存缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0)中。

第二步，环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性GFP：转肽酶Sortase A与线性的GFP在标准反应缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，10mMCaCl2，pH 8.0)中，按照转肽酶Sortase A与线性蛋白质的浓度比为1∶1的比例混合(反应体系100μL)，37℃温浴24h。

如图6所示，100μL反应体系，线性GFP40μL，转肽酶Sortase A20μL，缓冲液，ddH2O，37℃温浴24h。去除反应溶液中转肽酶Sortase A的方法为按反应溶液：Ni柱＝100∶30的比例，4℃温浴30min，离心取上清。环化结果跑15％SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色鉴定。环化结果：1为未环化的GFP；2为环化的GFP；3为除去Sortase A的环化GFP；4为Sortase A。通过计算GFP的环化效率大约为90％。可见转肽酶Sortase A可以有效地实施蛋白质的环化反应。

第三步，鉴定环化GFP的热稳定性。

如图7所示，在Steponeplus仪检测环化GFP的热稳定性。分别取环化GFP、未环化GFP、ddH2O各20μL，除气泡后，放入Steponeplus仪中，设置温度梯度从40℃起始，间隔0.5℃，上升至85℃，连续收集荧光信号。检测结果为：横坐标为循环次数，纵坐标为荧光值，A为未环化GFP荧光信号；B为环化GFP荧光信号；C为ddH2O荧光信号。可以看出环化GFP热变性时间比未环化GFP推迟了10个循环。

如图8所示，环化GFP与未环化GFP的Tm值比较分析。将图7的实验结果经Steponeplus软件分析，得出环化GFP与未环化GFP的Tm值的差异性，可以看出环化GFP比未环化GFP的Tm值提高了5℃。

Claims (4)

1.一种非诊断目的利用环化APE RNase H II检测基因多态性SNP位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性APE RNase H II；

步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HII：转肽酶Sortase A与线性的APE RNase H II在标准反应缓冲液中温浴24h；

步骤三、鉴定环化APE RNase H II的热稳定性，环化的APE RNase H II与未环化的APE RNase H II经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性；

步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，探针5’末端及3’末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸配对；

步骤五、设计合成用于扩增目的DNA的特异性正向引物和反向引物，PCR扩增目的DNA；

步骤六、利用合成的探针及环化的APE RNase H II，在Steponeplus仪上进行PCR反应，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性；

所述的第一步具体步骤包括：

1.1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸，其中：

突变正向引物：

ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGGAGGCGGCCGCAAA，

突变反向引物：

CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTCCGTTGTGTAC；

1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶SortaseA的识别序列LPXTG，其中：

正向引物：GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG，

反向引物：GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAACTCGTCC；

1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I和Bam H I，构建含有SortaseA识别序列的蛋白质亚克隆；

1.4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准贮存缓冲液中；

所述的标准贮存缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH8.0；

所述的标准反应缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和10mMCaCl₂且pH8.0；

所述的转肽酶Sortase A与线性的APE RNase H II II的浓度比为1∶1的比例；

所述的温浴为37℃。

2.根据权利要求1所述的利用环化APE RNase H II检测基因多态性SNP位点的方法，其特征在于，所述的特异性正向引物和反向引物为：

正向引物：GCTCCCACTCCATGAGGTATT，

反向引物：GGGACAAGGGTCTCGGAGT。

3.根据权利要求1所述的利用环化APE RNase H II检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的PCR扩增中PCR反应条件为94℃×5min；94℃×30s，50℃×30s，72℃×15s，共30个循环；72℃×2min，扩增后的DNA片段，经胶回收纯化贮存。

4.根据权利要求1所述的利用环化APE RNase H II检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的第六步具体步骤包括：

6.1)配制反应混合溶液20μL，将环化的APE RNase H II、Vent DNA聚合酶、探针、待测DNA片段、特异性正向引物和反向引物、buffer、DEPC H₂O、dNTP混合均匀，除气泡；

6.2)反应溶液转移至Steponeplus仪进行反应，同时检测DNA的单核苷酸多态性。

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