CN111575343A - 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒 - Google Patents

一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111575343A
CN111575343A CN201910119361.0A CN201910119361A CN111575343A CN 111575343 A CN111575343 A CN 111575343A CN 201910119361 A CN201910119361 A CN 201910119361A CN 111575343 A CN111575343 A CN 111575343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
specific
gene
primer
sequencing
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910119361.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王力刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Original Assignee
Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd filed Critical Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Priority to CN201910119361.0A priority Critical patent/CN111575343A/zh
Publication of CN111575343A publication Critical patent/CN111575343A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫组库多样性的检测方法。本发明的目的之一提供一种免疫组库测序文库构建的方法，（a）提取样本RNA，（b）使用逆转录引物逆转录合成cDNA，并在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的基因特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除扩增偏倚。使用该方法可以覆盖TCR和BCR的全部CDR区域，并且有效排除PCR扩增偏倚干扰，特异性更强，分析结果更准确。本发明的目的之二是提供一个免疫组库测序的试剂盒。

Description

一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫组库多样性的检测方法。
背景技术
免疫组库是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。免疫组库测序是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性。
免疫组测序可以观察和分析T细胞和B细胞，达到前所未有的深度和特异性。在疾病监控，抗体生产，疫苗研究，健康体检等领域有广泛的应用。
目前免疫组库测序广泛使用的文库构建方法主要有多重引物扩增法、半巢式扩增法、5’ RACE扩增法、SMART扩增法。
多重引物扩增法主要扩增TCR或BCR 的CDR3区，并且容易出现扩增偏倚，特异性较差，导致检测结果不准确。
5’ RACE扩增法使用末端转移酶技术，在逆转录完成后，经过末端添加C、结合ployG引物并合成第二链，在cDNA末端添加特异性接头，可以使用一对引物扩增TCR或BCR的全部互补决定区，但仍不能完全避免PCR偏倚和特异性差的缺点，虽然也有使用一条内侧引物和特异性接头进行扩增，但也仅解决了特异性差的缺点，无法完全消除PCR扩增偏倚。
SMART扩增原理与5’RACE扩增法类似，不同处在于，SMART使用逆转录酶的模板转换特性在cDNA末端添加特异性接头进行扩增。其缺点与5’ RACE相同，但是实现了逆转录反应和添加特异性接头一步完成。
因此，寻找一种可以覆盖全部CDR区，有效排除PCR偏倚干扰，特异性强的文库构建方法尤为重要。
发明内容
为了克服以上技术的缺点，本发明的目的之一提供一种免疫组库测序文库构建的方法，使用该方法可以覆盖TCR和BCR的全部CDR区域，并且有效排除PCR扩增偏倚干扰，特异性更强，分析结果更准确。
本发明的目的之二是提供一个免疫组库测序的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种免疫组库测序文库构建的方法。
在一个方面，所述的方法包括：（a）提取样本RNA，（b）使用逆转录引物逆转录合成cDNA，并在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的基因特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除扩增偏倚。
在进一步的一个方面，所述的样本不限物种，可以为人源样本，也可以为鼠源。
在进一步的另一个方面，所述的逆转录引物可以为oligodT，也可以为基因特异性引物。
在进一步的另一个方面，所述的分子标签序列为（N）X，N=A或T或C或G，X大于等于2，优选的X=10。
在进一步的另一个方面，所述的含有分子标签序列的特异性接头是在3’端含有polyGr的单链序列。
在进一步的另一个方面，所述的含有分子标签序列的特异性接头中的分子标签序列在接头3’端的polyGr之前。
在进一步的另一个方面，特异性接头可以包含测序接头的部分或全部。
在进一步的另一个方面，特异性接头引物为特异性接头5’端的部分序列。
在进一步的另一个方面，特异性接头引物可以包含测序接头的部分或全部。
在进一步的另一个方面，所述的含有分子标签序列的基因特异性引物的分子标签序列在基因特异性序列之前。
在进一步的另一个方面，所述的含有分子标签序列的基因特异性引物可以包含测序接头的部分或全部。
在进一步的另一个方面，所述的添加测序文库接头可以为连接酶介导的测序接头连接。
在进一步的另一个方面，所述的添加测序文库接头可以为测序文库接头引物扩增引入测序接头。
在另一个方面，所述的方法包括：（a）提取样本总RNA，（b）使用C区外侧特异性引物逆转录合成cDNA的同时，在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的C区内侧特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除扩增偏倚。
在进一步的一个方面，所述的C区内侧特异性引物可以为靠近CDR3区的序列，优选的为紧邻CDR3区的序列。
在一个实施方案中，所述的方法主要分为四步：（a）提取血液总RNA，（b）使用C区外侧引物逆转录合成cDNA的同时，在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的C区内侧引物进行PCR扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。在分析测序数据时，通过分子标签序列识别原始RNA分子，排除PCR扩增偏倚。
在一个方面，所述的C区外侧引物可以为TRA基因的C区，可以为TRB 基因的C区，可以为TRG基因的C区，可以为TRD基因的C区，可以为IGH基因的C区，可以为IGK基因的C区，可以为IGL基因的C区，也可以为以上几种基因C区引物的混合。
在另一个方面，所述的含有分子标签序列的特异性接头结构上包含3部分：5’端可以为测序接头的部分或全部，优选的包含部分测序接头序列；中间为分子标签序列；3’端含有polyGr。
在进一步的一个方面，所述的3’端含有polyGr包括poly（Gr）Y（N）Z，N=A或T或C或G，Y大于等于2，Z大于等于1。
在另一个方面，所述的分子标签序列为（N）X，N=A或T或C或G，X大于等于2，优选的X在6~12之间，更优选的X=10。
在另一个方面，所述的特异性接头引物包含测序接头的部分或全部，也包含特异性接头的5’端部分或全部序列。优选的包含部分测序接头序列。
在另一个方面，所述的C区内侧引物结构上分为三个部分：3’端为C区特异性引物；中间为分子标签序列；5’端可以为测序接头的部分或全部，优选的包含部分测序接头序列。
在进一步的一个方面，所述的C区特异性引物可以为TRA基因的C区，可以为TRB 基因的C区，可以为TRG基因的C区，可以为TRD基因的C区，可以为IGH基因的C区，可以为IGK基因的C区，可以为IGL基因的C区。
在进一步的另一个方面，所述的C区内侧引物，可以为多个C区引物的混合。
在另一个方面，所述的添加测序文库接头可以为使用包含c步引物5’端部分序列的测序接头引物扩增。
在进一步的一个方面，所述的测序接头引物为Illumina测序接头引物，且包含6~8个碱基的barcode序列。
所述的方法可以进一步的在illumina测序平台进行测序，优选的使用Hiseq 2500测序仪进行PE150双端测序。也可以选择PE250 测序模式，和Miseq测序平台的PE300双端测序模式。
在以上所述的方法中，所述的样本包括淋巴细胞、淋巴组织、淋巴细胞浸润肿瘤组织、外周血、肿瘤组织等，以及从以上组织中获得的细胞。进一步的，细胞或组织来源不限于动物或人。
本发明还涵盖了使用上述方法进行免疫组库测序的试剂盒。试剂盒包括含有分子标签序列的特异性接头、逆转录引物、扩增引物、文库接头引物，还包括相关的逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液等。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种免疫组测序文库构建的方法，可以覆盖TCR和BCR的全部CDR区域，使用该方法引入分子标签，可以有效排除PCR扩增偏倚，通过C区内外两条引物检测，扩增特异性更强，分析结果更准确。
附图说明
图1是文库构建步骤示意图。
发明详述
除非另外定义，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域技术人员所通常的理解含义相同。
除非另外指示，当术语“一个/一种”在文中使用时，其指“至少一个/一种”，或“一个或多个”。
如本文中所使用的术语“扩增”，指目的核酸拷贝数的增加，可以使用本领域中任何已知的方法实现。核酸的扩增包括多个循环的变温扩增和单一温度的恒温扩增。变温扩增包含众所周知的聚合酶链式反应（PCR）。PCR包括热变性将双链DNA变成单链，将引物与单链DNA退火结合，用DNA聚合酶延伸合成互补链三个步骤。也可以将退火与延伸步骤合并。
如本文中所使用的术语“逆转录”，是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录使用引物与RNA模板结合，在逆转录酶催化下合成互补的DNA单链。
如本文中所使用的术语“添加”，指通过连接或延伸将其他已知序列DNA结合在目的核酸的末端。其中连接使用连接酶介导催化磷酸二酯键合成。延伸通过DNA合成酶介导催化合成互补链。目的核酸可以为单链DNA，也可以为双链DNA。延伸法包括使用末端转移酶在目的核酸3’末端添加固定碱基，并用3’端携带固定碱基的互补碱基序列与之退火结合，再依靠DNA合成酶延伸的方法（5’ RACE）；也包括使用逆转录酶直接在目的核酸3’末端实现模板转换，直接延伸合成的方法（SMART）。
如本文中所使用的术语“polyGr”，指多聚鸟嘌呤核糖核苷酸，即大于等于2个的连续鸟嘌呤核糖核苷酸。poly（Gr）Y（N）Z是指在polyGr后结合其他脱氧核糖核苷酸，以保护鸟嘌呤核糖核苷酸不被降解。
如本文中所使用的术语“扩增偏倚”，指核酸扩增过程中引入的碱基错误和核酸拷贝数增加不一致。碱基错误主要由在扩增过程中核苷酸错配导致的。核酸拷贝数增加不一致主要由核酸序列GC含量及长度不同导致扩增速率不一致。
如本文中所使用的术语“C区”，指TCR基因或BCR基因中的保守区序列。TCR基因为T细胞受体基因，可以为TRA基因、TRB基因、TRD基因、TRG基因等。BCR基因为B细胞受体基因，可以为IGH基因，IGK基因，IGL基因等。
如本文中所使用的术语“外侧引物”和“内侧引物”，涉及“巢式PCR技术”，指扩增基因时以外部引物产生的核酸产物为模板，进一步使用内侧引物扩增目的核酸，保证扩增的特异性。
如本文中所使用的术语“测序接头”，指高通量测序时，在文库末端添加用于辅助测序的核酸序列，包括但不局限于illumina测序接头、ion torrent 测序接头等。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 一种人TCR多样性检测试剂盒在illumina测序平台检测应用
1、总RNA的提取。
1. 向200uL体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H。
2. 在冰上孵育10-15 min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。
3. 4℃ 2,100 rpm (~400×g) 离心10 min，将上清完全去除。
4. 向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H，重悬细胞。
5. 4℃，2,100 rpm (~400×g) 离心10 min，将上清完全去除。
6. 向白细胞沉淀中加入350uL裂解液RLH (使用前请加入β-巯基乙醇) ，涡旋或使用移液器混匀。
7. 将溶液转移至过滤柱CS中 (过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min，弃去过滤柱CS，收集滤液。
8. 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350 μl或600 μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g) 离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
9. DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350 μl 去蛋白液RW1H，12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
10. DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μlRDD溶液，轻柔混匀。
11. 向吸附柱CR4中央加入80 μl的DNase I 工作液，室温放置15 min。
12. 向吸附柱CR4中加入350 μl 去蛋白液RW1H，12,000 rpm (~13,400×g) 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
13. 向吸附柱CR4中加入500 μl漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，12,000 rpm (~13,400×g) 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
14. 重复步骤13。
15. 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
16. 将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入50 μl RNase-FreeddH2O室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
2、逆转录。
1. 取100ng 总RNA，加入TRACo引物（SEQ ID No.1）、TRBCo引物（SEQ ID No.2）、TRGCo引物（SEQ ID No.3）、TRDCo引物（SEQ ID No.4），dNTPs，逆转录Buffer，逆转录酶，ILTS接头（SEQ ID No.5），总体系20uL。
2. 在PCR仪上反应，50℃ 30分钟；25℃ 5分钟；42℃ 25分钟。
3、预扩增。
1. 取2uL 逆转录产物，加入PCR master mix，ILT引物（SEQ ID No.6），TRACi引物（SEQ ID No.7）、TRBCi引物（SEQ ID No.8），补水至20uL体系。
2. 取2uL 逆转录产物，加入PCR master mix，ILT引物（SEQ ID No.6），TRGCi引物（SEQ ID No.9）、TRDCi引物（SEQ ID No.10），补水至20uL体系。
3. 在PCR仪上反应，95℃ 3分钟；95℃ 30秒，65℃ 30s，72℃ 30s，20循环；72℃ 5分钟。
4. 分别加入30uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，弃上清。
5. 加入80%新配乙醇洗磁珠2次，磁力架分离磁珠，彻底弃上清。
6. 室温晾干至磁珠微裂，加入10uL 水重悬磁珠，室温5分钟。
7. 在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，为纯化的预扩增产物。
4、文库扩增。
1. 取纯化的预扩增产物，加入PCR master mix，测序接头引物（adapterF，adapterR），补水至20uL体系。
2. 在PCR仪上反应，95℃ 3分钟；95℃ 30秒，65℃ 30s，72℃ 30s，10循环；72℃ 5分钟。
3. 分别加入10uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，再加入4uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，弃上清。
5. 加入80%新配乙醇洗磁珠2次，磁力架分离磁珠，彻底弃上清。
6. 室温晾干至磁珠微裂，加入25uL TE溶液重悬磁珠，室温5分钟。
7. 在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，为测序文库。
实施例2 一种人BCR多样性检测试剂盒在illumina测序平台检测应用
1、总RNA的提取。
2、逆转录。
1. 取100ng 总RNA，加入IGHCo引物（SEQ ID No.11）、IGKCo引物（SEQ ID No.12）、IGLCo引物（SEQ ID No.13），dNTPs，逆转录Buffer，逆转录酶，ILTS接头（SEQ ID No.5），总体系20uL。
2. 在PCR仪上反应，50℃ 30分钟；25℃ 5分钟；42℃ 25分钟。
3、预扩增。
1. 取2uL 逆转录产物，加入PCR master mix，ILT引物（SEQ ID No.6），IGHCi引物（SEQ ID No.14）、IGKCi引物（SEQ ID No.15）、IGLCi引物（SEQ ID No.16），补水至20uL体系。
2. 在PCR仪上反应，95℃ 3分钟；95℃ 30秒，65℃ 30s，72℃ 30s，20循环；72℃ 5分钟。
3.加入30uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，弃上清。
4. 加入80%新配乙醇洗磁珠2次，磁力架分离磁珠，彻底弃上清。
5. 室温晾干至磁珠微裂，加入10uL 水重悬磁珠，室温5分钟。
6. 在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，为纯化的预扩增产物。
4、文库扩增。
1. 取纯化的预扩增产物，加入PCR master mix，测序接头引物（adapterF，adapterR），补水至20uL体系。
2. 在PCR仪上反应，95℃ 3分钟；95℃ 30秒，65℃ 30s，72℃ 30s，10循环；72℃ 5分钟。
3. 分别加入10uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，再加入4uL kapa磁珠混匀，室温静置5分钟，在磁力架上分离磁珠，弃上清。
5. 加入80%新配乙醇洗磁珠2次，磁力架分离磁珠，彻底弃上清。
6. 室温晾干至磁珠微裂，加入25uL TE溶液重悬磁珠，室温5分钟。
7. 在磁力架上分离磁珠，将上清转移至新管，为测序文库。
序列表
<110> 北京全谱医学检验实验室有限公司
<120> 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagacagact tgtcactgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtcgggga agaagcctgt 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaaggtat gttccagcct tct 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttcaccag acaagcgaca tttg 24
<210> 5
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctacactct ttccctacac gacgctcttc cgatctnnnn nnnnnnggg 49
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctacactct ttccctacac 20
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnnacacgg cagggtcagg 60
gttc 64
<210> 8
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnntgggaa cacctttttc 60
aggtcct 67
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnnggaaac atctgcatca 60
agttgtttat 70
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnngatggt ttggtatgag 60
gctgacttc 69
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgtgtggcc ggcagggtca g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacaacagag gcagttccag 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acaccagtgt ggccttgttg g 21
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnntacctg aggagacggt 60
gacc 64
<210> 15
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnncagatg gtgcagccac 60
agttc 65
<210> 16
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnngagggc gggaacagag 60
tgac 64
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg 50

Claims (12)

1.本发明提供了一种免疫组库测序文库构建的方法，包括通过在原始的基因分子上添加分子标签序列，扩增免疫组库基因序列，并引入测序文库接头。
2.权利要求1的方法，包括（a）提取样本RNA，（b）使用逆转录引物和逆转录酶合成cDNA，并在末端添加含有分子标签序列的特异性接头，（c）以b步产物为模板，通过特异性接头引物与含有分子标签序列的基因特异性引物进行扩增，（d）最后在扩增产物上添加测序文库接头，完成文库构建。
3.根据权利要求2，所述的逆转录引物包括oligodT引物、TCR或BCR基因特异性引物。
4.根据权利要求1，所述的分子标签序列为（N）X，N=A或T或C或G，X大于等于2。
5.根据权利要求2，所述的特异性接头为特定的核酸序列，可以为测序接头的全部或部分。
6.根据权利要求2，所述的特异性接头引物为特定的核酸序列，可以为特异性接头的全部或部分，也可以为测序接头的全部或部分。
7.根据权利要求2或3，所述基因特异性引物包括TCR基因保守区或BCR基因保守区的一种特异性引物。
8.根据权利要求2，所述的含有分子标签序列的特异性接头包括接头序列和分子标签序列和polyGr。
9.根据权利要求2，所述的含有分子标签序列的基因特异性引物，包括基因特异性引物序列和分子标签序列和接头序列，优选的接头序列为测序接头序列的部分或全部。
10.根据权利要求2，所述的测序文库接头包括但不局限于illumina文库接头、iontorrent 文库接头。
11.根据权利要求2或3，权利要求2 中c步所述的基因特异性引物可以同于权利要求3所述的基因特异性引物，也可以位于权利要求3所述的基因特异性引物内侧，即靠近TCR基因或BCR基因J区的一侧。
12.本发明提供了免疫组库测序的试剂盒，组分包含但不限于含分子标签序列的特异性接头、逆转录引物、含分子标签序列的扩增引物、测序接头以及相关的试剂，如逆转录酶、DNA聚合酶等。
CN201910119361.0A 2019-02-18 2019-02-18 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒 Pending CN111575343A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910119361.0A CN111575343A (zh) 2019-02-18 2019-02-18 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910119361.0A CN111575343A (zh) 2019-02-18 2019-02-18 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111575343A true CN111575343A (zh) 2020-08-25

Family

ID=72120650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910119361.0A Pending CN111575343A (zh) 2019-02-18 2019-02-18 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111575343A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176422A (zh) * 2020-10-19 2021-01-05 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 Rna文库的构建方法
CN113999891A (zh) * 2021-09-17 2022-02-01 广东省人民医院 用于构建去除样本内嵌合体序列的免疫组库高通量测序文库的方法、一组引物和试剂盒
CN114107287A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 云测智能科技有限公司 一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法
CN114480622A (zh) * 2022-01-29 2022-05-13 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院） 一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒
WO2023222022A1 (zh) * 2022-05-18 2023-11-23 京东方科技集团股份有限公司 锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用
CN117126921A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 立凌生物制药(苏州)有限公司 一种检测t细胞和b细胞免疫组库的建库方法及其引物和试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282179A (zh) * 2016-09-13 2017-01-04 北京天科雅生物科技有限公司 一种基于高通量测序构建鼠tcra文库的多重pcr引物及方法
CN107893068A (zh) * 2017-10-20 2018-04-10 重庆天科雅生物科技有限公司 一种构建人TCRbetaCDR3区文库的方法
WO2018095108A1 (zh) * 2016-09-27 2018-05-31 广州精科医学检验所有限公司 引物组合物、其用途、构建文库和确定核酸序列的方法
CN108893464A (zh) * 2018-07-13 2018-11-27 广州华银医学检验中心有限公司 一种免疫组库高通量测序文库的构建方法
CN109136329A (zh) * 2018-08-13 2019-01-04 湖南大地同年生物科技有限公司 一种单分子标签tcr免疫组库高通量测序文库的构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282179A (zh) * 2016-09-13 2017-01-04 北京天科雅生物科技有限公司 一种基于高通量测序构建鼠tcra文库的多重pcr引物及方法
WO2018095108A1 (zh) * 2016-09-27 2018-05-31 广州精科医学检验所有限公司 引物组合物、其用途、构建文库和确定核酸序列的方法
CN107893068A (zh) * 2017-10-20 2018-04-10 重庆天科雅生物科技有限公司 一种构建人TCRbetaCDR3区文库的方法
CN108893464A (zh) * 2018-07-13 2018-11-27 广州华银医学检验中心有限公司 一种免疫组库高通量测序文库的构建方法
CN109136329A (zh) * 2018-08-13 2019-01-04 湖南大地同年生物科技有限公司 一种单分子标签tcr免疫组库高通量测序文库的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李鹏: "免疫组库高通量数据分析流程的构建与应用", 《中国优秀硕士论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176422A (zh) * 2020-10-19 2021-01-05 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 Rna文库的构建方法
CN113999891A (zh) * 2021-09-17 2022-02-01 广东省人民医院 用于构建去除样本内嵌合体序列的免疫组库高通量测序文库的方法、一组引物和试剂盒
CN113999891B (zh) * 2021-09-17 2024-01-16 广东省人民医院 用于构建去除样本内嵌合体序列的免疫组库高通量测序文库的方法、一组引物和试剂盒
CN114107287A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 云测智能科技有限公司 一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法
CN114480622A (zh) * 2022-01-29 2022-05-13 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院） 一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒
WO2023222022A1 (zh) * 2022-05-18 2023-11-23 京东方科技集团股份有限公司 锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用
CN117126921A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 立凌生物制药(苏州)有限公司 一种检测t细胞和b细胞免疫组库的建库方法及其引物和试剂盒
CN117126921B (zh) * 2023-10-26 2024-01-26 立凌生物制药(苏州)有限公司 一种检测t细胞和b细胞免疫组库的建库方法及其引物和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111575343A (zh) 一种免疫组库测序文库的构建方法及试剂盒
US11692218B2 (en) Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US11053543B2 (en) System and methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
CN104838014B (zh) 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
US20220259638A1 (en) Methods and compositions for high throughput sample preparation using double unique dual indexing
CN111344416A (zh) 用于免疫组库测序的组合物和方法
JP2022036975A (ja) ナノポア技術を用いた短いｄｎａ断片の迅速な配列決定
AU2014406026A1 (en) Isolated oligonucleotide and use thereof in nucleic acid sequencing
CA2525122A1 (en) Identification of clonal cells by repeats in t-cell receptor and immunoglobulin v/d/j genes
CN103298955A (zh) 用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒
JP2015516814A (ja) 標的化されたｄｎａの濃縮および配列決定
CN114729349A (zh) 条码化核酸用于检测和测序的方法
CN110747514B (zh) 一种高通量单细胞小rna文库构建方法
CN109628573B (zh) 一种用于无创产前检测12种染色体微缺失微重复综合征的试剂盒及其专用探针组
JP2022145606A (ja) 核酸の正確な並行定量のための高感度な方法
CN111748606A (zh) 一种快速构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒
US20210403994A1 (en) Methods for rapid dna extraction from tissue and library preparation for nanopore-based sequencing
CN111534858B (zh) 用于高通量测序的文库构建方法及高通量测序方法
CN110832086A (zh) 用于制造用于基于序列的遗传检验的对照的组合物和方法
US20230193356A1 (en) Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids
Dilanyan Open-Source Custom Beads for Single-Cell Transcriptomics
CA3218561A1 (en) Method for parallel real-time sequence analysis
CN115175985A (zh) 从未经处理的生物样本中提取单链dna和rna并测序的方法
JP2022552155A (ja) 新規方法
CN113549693A (zh) 一种多重巢式pcr方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200825