CN114480622A - 一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂在制备用于预测银屑病对免疫调节药物治疗的敏感性的产品中的应用。本发明通过检测银屑病患者外周血T细胞α链免疫组库多样性来评估判断该患者是否适合甲氨蝶呤治疗，这将临床判断是否选择甲氨蝶呤进行银屑病治疗提供一个客观的评价指标，为解决临床上无法判断患者是否响应甲氨蝶呤治疗提供了很好的解决方法和解决思路。

Description

一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒。
背景技术
银屑病是一种高度流行的炎症性皮肤疾病，影响全球6000多万人。银屑病的临床特征是皮肤上覆盖着银鳞片的鲑红色斑块。此外，银屑病皮肤的典型组织病理学特征是表皮中角质形成细胞的过度增殖和异常分化，以及真皮中炎症细胞的广泛浸润。多种证据表明，T辅助性17细胞(Th17)的高反应性和调节性T细胞(Treg)的功能障碍在银屑病的发病机制中起着重要作用。此外，新出现的证据表明，特定B细胞亚群的异常表达和功能也参与了银屑病的发病机制。2013年，Yanaba等人。结果表明，产生IL-10的CD19+CD38+CD24+调节性B细胞(Bregs)的缺失加重了咪喹莫德诱导的CD19-/-小鼠银屑病皮肤炎症。此外，Kahlert等人。发现中度至重度银屑病患者中B细胞总的百分比，特别是总浆细胞和记忆B细胞的百分比显著降低。综上所述，这些发现强调了T/B细胞作为参与银屑病发病机制的关键角色的重要性。
免疫调节药物如甲氨蝶呤全身治疗是一种很有前途的治疗中度银屑病[10<PASI(银屑病面积和严重程度指数)≤20]的治疗策略。实际上，甲氨蝶呤可以有效抑制5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸转化酶活性，从而抑制淋巴细胞功能，已被用于治疗中重度银屑病和银屑病关节炎50多年。虽然甲氨蝶呤是治疗中度至重度银屑病最常用的药物，但只有50％的中度至重度银屑病患者从甲氨蝶呤治疗中获益。因此，迫切需要探索用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的标志物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗敏感性的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂在制备用于预测银屑病对免疫调节药物治疗的敏感性的产品中的应用。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述免疫调节药物为甲氨蝶呤。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述银屑病为中度银屑病或重度银屑病。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述样品为人外周血。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述试剂包括使用免疫组库测序方法检测T细胞α链免疫组库多样性的试剂。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述T细胞α链免疫组库多样性的指数阀值为7.48。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述T细胞α链免疫组库多样性指数高于7.48为对甲氨蝶呤治疗敏感；所述T细胞α链免疫组库多样性指数低于7.48为对甲氨蝶呤治疗不敏感。
本发明还提供一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述样品为人外周血。
本发明的有益效果：本发明提供了检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂在制备用于预测银屑病对免疫调节药物治疗的敏感性的产品中的应用。甲氨蝶呤是治疗中度或重度银屑病最常用的药物，但只有50％的中度或重度银屑病患者从甲氨蝶呤治疗中获益，且临床上确实缺乏一个可以在治疗前用于评估银屑病患者是否适合甲氨蝶呤治疗的可靠的指标。本发明通过检测银屑病患者外周血T细胞α链免疫组库多样性来评估判断该患者是否适合甲氨蝶呤治疗，这将临床判断是否选择甲氨蝶呤进行银屑病治疗提供一个客观的评价指标，为解决临床上无法判断患者是否响应甲氨蝶呤治疗提供了很好的解决方法和解决思路。
附图说明
图1为实施例1对银屑病患者甲氨蝶呤治疗前外周血T细胞α链(TRA)免疫组库多样性的检测以及甲氨蝶呤治疗疗效进行追踪的实验流程图。
图2为甲氨蝶呤敏感组和甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者治疗前外周血免疫组库TRA、TRB、TRD、TRG、IGH、IGK和IGL的多样性主成分分析以及后续统计检测结果。
图3为甲氨蝶呤敏感组和甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者采用甲氨蝶呤治疗前外周血T细胞α链(TRA)免疫组库多样性的受试者操作特征(Receiver-operatingcharacteristic，ROC)分析图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
本实施例对11名银屑病患者甲氨蝶呤治疗前外周血T细胞α链(TRA)免疫组库多样性的检测以及甲氨蝶呤治疗疗效进行追踪，实验流程如图1所示。
1、研究参与者招募与分组
从广州中医药大学第二附属医院共招募了11名中度至重度银屑病患者(10<PASI≤20)。然后每周对这些患者使用7.5mg甲氨蝶呤进行治疗，持续治疗4个月。根据银屑病患者对甲氨蝶呤的反应，进一步将甲氨蝶呤治疗的银屑病患者分为两组：甲氨蝶呤敏感组(n＝6，4个月后的最终PASI>75)和甲氨蝶呤不敏感组(n＝5，甲氨蝶呤治疗4个月后的最终PASI<50)。所有参与者均签署知情同意书。本研究经广州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准。
2、外周血样本的采集和RNA的提取
分别在上述银屑病患者进行甲氨蝶呤治疗前以及采用甲氨蝶呤治疗4个月后各采集一次外周血。所采集的外周血在室温下保存在PAXgene血液RNA管中2小时，然后将PAXgene血液RNA管将进一步放置在-20℃保存，并使用PAXgene血液RNA提取试剂盒来提取RNA。
3、文库的制备和测序
使用iRepertoire公司全自动建库系统进行T细胞α链(TRA)免疫组库的文库构建。具体方法如下：(1)将实验试剂、样本于室温放置30min解冻。(2)涡旋震荡卡盒，混匀卡盒内试剂，轻甩将试剂沉降至卡盒底部。(3)计算样本RNA加入量，取1000ng，体积≤18L。填写建库实验记录单。(4)在0.2mL试管中加入20L External Mix，2L酶，RNA样本，补水至总体积40L，涡旋混匀15秒，微离心。(5)核对卡盒信息；(6)核对卡盒，样本，建库实验流程单。(6)打开盒盖，将配制好的上样Mix加入卡盒中，盖上盒盖，填写建库实验记录单上卡盒相关信息。(7)将卡盒放入iR processor单元，填写仪器相关信息。(8)建库程序完成后取出卡盒，在卡盒反应孔中加入35L无酶水，吸打混匀。(9)转移液体至0.2mL PCR管中，轻弹管底混匀，静置3min，至产物完全洗脱(可金属浴50℃5min加快洗脱)。(10)将上一步PCR管放置于磁力架上静置2min，至溶液澄清。(11)取上清转移至新的1.5mL EP管中。(12)后续将质检合格的混合测序文库装载到测序仪(Illumina公司Next-seq测序平台)进行后续的测序。
4、数据分析
将序列与IMGT/GENE-DB数据库中的TRA的V-和j-基因进行比对。通过使用iR-map管道的史密斯-沃特曼算法进行分析，并在iRweb中进行可视化，计算了肽序列的数量和V/J基因的使用情况。我们使用曼恩-惠特尼检验来评估健康对照组和银屑病患者之间的差异。此外，我们还使用Mann-WhitneyU检验来评估甲氨蝶呤敏感组银屑病患和甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者之间的差异。使用SigmaPlot12.5进行分析，并以平均值的平均±标准误差(SEM)表示。
5、实验结果
如表1所示，本实验评估了甲氨蝶呤敏感组和甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者治疗前外周血免疫组库7条链(TRA、TRB、TRD、TRG、IGH、IGK和IGL)的多样性。进一步分析上述免疫组库7条链的主要成分以及统计检验，由图2可知，甲氨蝶呤敏感组银屑病患者的T细胞α链免疫组库多样性指数远高于甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者。
表1甲氨蝶呤敏感组和甲氨蝶呤不敏感组银屑病患者治疗前外周血免疫组库7条链的多样性
Figure BDA0003495545070000051
6、随机森林模型评估
本实施例还训练了一个随机森林模型来评估T细胞α链(TRA)免疫组库的多样性是否可以帮助预测甲氨蝶呤治疗的临床反应，结果如图3所示。由图3可知，甲氨蝶呤治疗前，银屑病患者的外周血T细胞α链(TRA)免疫组库的多样性为7.48时，能明确区分银屑病患者是否对甲氨蝶呤敏感(曲线下面积(AUC)为0.90，95％CI：0.80～1.00)。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂在制备用于预测银屑病对免疫调节药物治疗的敏感性的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫调节药物为甲氨蝶呤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银屑病为中度银屑病或重度银屑病。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品为人外周血。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括使用免疫组库测序方法检测T细胞α链免疫组库多样性的试剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述T细胞α链免疫组库多样性的指数阀值为7.48。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述T细胞α链免疫组库多样性指数高于7.48为对甲氨蝶呤治疗敏感；所述T细胞α链免疫组库多样性指数低于7.48为对甲氨蝶呤治疗不敏感。
8.一种用于预测银屑病对甲氨蝶呤治疗的敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测样品中T细胞α链免疫组库多样性的试剂。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品为人外周血。
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