JP2022552155A - 新規方法 - Google Patents

新規方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022552155A
JP2022552155A JP2022520576A JP2022520576A JP2022552155A JP 2022552155 A JP2022552155 A JP 2022552155A JP 2022520576 A JP2022520576 A JP 2022520576A JP 2022520576 A JP2022520576 A JP 2022520576A JP 2022552155 A JP2022552155 A JP 2022552155A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
acid segments
target nucleic
fragments
segments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022520576A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021064430A5 (ja
Inventor
マリシェヴァ ヴァレリア
ショエンフェルデル ステファン
スピヴァコフ ミハイール
隆 永野
フレイザー ピーター
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Babraham Institute
Original Assignee
Babraham Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Babraham Institute filed Critical Babraham Institute
Publication of JP2022552155A publication Critical patent/JP2022552155A/ja
Publication of JPWO2021064430A5 publication Critical patent/JPWO2021064430A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するための方法並びにこの方法を実施するためのキットに関する。また、本発明は、特定の疾患を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法に関する。【選択図】図１

Description

(発明の分野)
本発明は、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するための方法並びにこの方法を実施するためのキットに関する。また、本発明は、特定の疾患を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法に関する。
(発明の背景)
調節エレメントは生物の遺伝的制御において中心的な役割を果たし、健康及び疾患(例えば、癌及び自己免疫障害)に寄与することが示されている。そのような調節エレメント(例えば、エンハンサー)は、その標的遺伝子から(線形スケールで)かなりのゲノム距離だけ離れた所に位置する場合があることが、実証されている。これらの調節エレメント及びその標的遺伝子を捉えるためのアプローチが開発され、遺伝子発現及び表現形の確立に対する調節領域原動力(regulatory landscape dynamics)の影響を調べ、並びに疾患発症における遺伝子改変の役割を調べるために広く応用されている。しかしながら、少数の細胞を用いて研究する場合、これらの調節エレメントがどの標的遺伝子を調節するかを決定することは主要な課題となる。
ゲノム座間の相互作用を特定するために開発された最初の方法の1つは、染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)技術であった(Dekkerらの文献、Science (2002) 295:1306-1311)。この方法は:空間的に極近接するゲノム座が連結された状態となるように、核組成物 (nuclear composition)を架橋すること;架橋間に介在するDNAループを消化により除去すること;及び相互作用領域の架橋をライゲーションし、逆行させて3Cライブラリを作製することによる、3Cライブラリの創出を必要としていた。続いてこのライブラリを使用して、既知の配列間の相互作用の頻度を検出/特定することができる。しかしながら、この方法は、対象とする相互作用領域を検出するために、予め相互作用することが分かっていることを要件とする。以降、3C法の制約を克服するためにさらなる技術開発がなされてきた。
Hi-Cは対象とするインタラクトームについての事前知識が何ら要求されないゲノムワイド方法である。この方法は、接合部マーカーを使用して、細胞中の全てのライゲーションされた相互作用配列を単離する(WO 2010/036323及びLieberman-Aidenらの文献、2009を参照されたい)。この方法は、特定の時点に核組成物中で発生する全ての相互作用に関する情報を提供するが、結果として得るライブラリは極めて複雑であり、これにより、特定のエレメント、例えばプロモーター及びエンハンサーの間の有意義な相互作用を特定するのに必要となる解像度でそれを解析することが妨げられている。この制約を克服するため、対象とする領域を含む少なくとも一方の末端での染色体相互作用についてHi-Cライブラリを富化するキャプチャー工程を伴うキャプチャーHi-C技術が開発されている(WO 2015/033134, Drydenらの文献、2014及びSchoenfelderらの文献、2015)。WO 2015/033134は、単離用核酸分子を使用することにより標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法及びキットを開示する。しかしながら、この方法は、多数の細胞(3000万～4000万個の細胞)を用いて開始する必要があり、これは希少な細胞種、生物発生の早期段階又は患者/生検試料に由来する細胞を用いて研究する場合、不可能である。
従って、現在利用可能な方法論の制約を克服する、核酸相互作用を特定するための改良方法を提供することのニーズが存在する。
(発明の概要)
本発明の第1の態様に従い、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を取得する工程;
(b)該核酸組成物を架橋する工程;
(c)架橋核酸組成物をエンドヌクレアーゼ酵素を用いて断片化する工程;
(d)断片化された架橋核酸セグメントの末端を、共有結合により連結されたビオチン部分を含む1以上のヌクレオチドで充填する工程;
(e)工程(d)で取得した断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(f)リコンビナーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入を実施する工程;
(g)工程(d)のビオチン部分を含む断片を富化する工程;
(h)該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化する工程;
(i)工程(h)で取得した富化断片を配列決定して、該1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程を含む、前記方法を提供する。
本発明のさらなる態様に従い、特定の疾患状態を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)特定の疾患を有する個体から取得した核酸組成物に本明細書で定義する方法を実施すること;
(b)核酸セグメント及び1以上の標的核酸セグメント間の相互作用の頻度を定量化すること;及び
(c)該疾患状態を有する個体由来の該核酸組成物における相互作用の頻度を、健康な対象由来の正常対照核組成物における相互作用の頻度と比較することであって、その結果該核酸組成物における相互作用の頻度の差が特定の疾患を示す、前記比較すること、を含む、前記方法を提供する。
本発明のなおさらなる態様に従い、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットであって、本明細書で定義する方法を実施可能な緩衝剤及び試薬を含む、前記キットを提供する。
(図面の簡単な説明)
本明細書で提示する最小化プロモーターのキャプチャーHi-Cプロトコルと比較した、従来のプロトコルの比較概要図。略語:Tn5―リコンビナーゼ/トランスポザーゼ酵素、B―ビオチン、NGS―次世代配列決定、UMI―固有の分子識別子。 本明細書で定義する方法を使用して得られた結果。試験試料―50000細胞及び100万細胞の出発材料を含むヒトCD4+ T細胞において(出発材料の1/600及び1/30を、それぞれ従来のHi-Cプロトコルで使用した)、CHiCAGOを使用して有意な相互作用であるか否かを判定した。
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様に従い、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を取得する工程;
(b)該核酸組成物を架橋する工程;
(c)架橋核酸組成物をエンドヌクレアーゼ酵素を用いて断片化する工程;
(d)断片化された架橋核酸セグメントの末端を、共有結合により連結されたビオチン部分を含む1以上のヌクレオチドで充填する工程;
(e)工程(d)で取得した断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(f)トランスポザーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入を実施する工程;
(g)工程(d)のビオチン部分を含む断片を富化する工程;
(h)該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化する工程;
(i)工程(h)で取得した富化断片を配列決定して、該1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程を含む、前記方法を提供する。
本発明の方法は、標的化増幅又は1以上の標的核酸セグメントを単離するための単離用核酸分子を使用することにより、相互作用配列及び相互作用核酸セグメントを特定するための手段を提供する。そのような方法は、非常に複雑なライブラリ中の特定の相互作用のデータに焦点が当たるという利点を有する。さらに、標的化増幅又は1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子の追加を含む方法を使用して、選択に使用した試薬の種類又は使用した単離用核酸分子の種類(例えば、プロモーター相互作用を特定するためのプロモーター)に応じ、情報を組織化して様々な部分集団とすることもできる。続いて、対象とする特定の標的群内の染色体相互作用に関する詳細な情報を得ることができる。
本発明の方法は、一工程の断片化及びリコンビナーゼ酵素を使用したオリゴヌクレオチドの挿入をさらに提供する。そのような一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入は、方法に全工程数の顕著な減少及び核酸組成物の操作の減少を提供するという利点を有する。例えば、本方法の特定の実施態様において、1つのチューブを核酸組成物の取得(本明細書で定義する工程(a))から、断片化された核酸セグメントのライゲーション(本明細書で定義する工程(ｅ))まで、並びにまた一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入の実施(本明細書で定義する工程(f))からビオチンを含む断片の富化(本明細書で定義する工程(g))まで利用することができる。一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入を含まない方法では、物理的又は酵素的手段(例えば、超音波処理又は制限酵素消化)による断片化、ライブラリ断片の末端修復、ライブラリ断片の3'-末端へのdATPの付加、サイズ選択、オリゴヌクレオチド配列のライゲーション及びライゲーションされなかったオリゴヌクレオチドからの断片の精製を別々に行う必要がある(WO 2015/033134に開示する方法など)。従って、本発明は、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するための方法であって、より簡素でより少ない工程を含み、かつ完了までの短縮された時間枠を含み得る、前記方法を提供することは理解されよう。そのため、本発明の方法は従来のプロトコルよりも時間がかからず、さらにライブラリ作製の全体的なコストを低下させる。また、そのような利点により核酸組成物の損失が低下し得ることも理解されよう。そのような核酸組成物の損失の低下により出発材料の量、例えばそこから核酸組成物が取得される細胞の数を低下させ、又は結果として得る後続の分析に利用可能な核酸組成物を増加させることが可能となる。
さらに、既存の技術、例えば4Cは、1つ又は数個のプロモーターのゲノムワイドの相互作用をキャプチャーすることが可能であったのに対し、本明細書に記載の方法は、1回の実験で22000超のプロモーター及びそれらと相互作用するゲノム座をキャプチャーすることができる。さらに、本方法は、顕著により定量的な読出しを生じる。
ゲノムワイド会合研究(Genome-Wide Association Studies)(GWAS)は、疾患と関連づけられた数千の一塩基多型(SNPs)を特定してきた。しかしながら、これらのSNPsの多くは、遺伝子から非常に離れた所に位置しており、そのためにそのSNPsがどの遺伝子に作用するかを予測することは非常に困難となっていた。従って、本方法では、それらがゲノム中で互いに遠く離れて位置している場合でさえも、相互作用核酸セグメントを特定する方法を提供する。
本明細書で使用する「核酸セグメント」への言及は、「核酸配列」への言及と等価であり、任意のヌクレオチド(すなわち、例えばアデニン(A)、チミジン(T)、シトシン(C)、グアノシン(G)及び/又はウラシル(U))の重合体を指す。この重合体は、機能的なゲノム断片又は遺伝子をもたらしてももたらさなくてもよい。核酸配列の組合わせは、最終的に染色体を含み得る。デオキシリボヌクレオシドを含む核酸配列は、デオキシリボ核酸(DNA)と呼ぶ。リボヌクレオシドを含む核酸配列は、リボ核酸(RNA)と呼ぶ。RNAは、さらに特性評価され、いくつかの種類、例えばタンパク質コードRNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、運搬RNA(tRNA)、長鎖非コードRNA(lnRNA)、長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)、アンチセンスRNA(asRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、低分子核(snRNA)、及び低分子核小体RNA(snoRNA)に分けることができる。
「一塩基多型」又は「SNPs」は、生物種の成員間で、又は対をなす染色体間で異なるゲノム中の単一ヌクレオチドの変化(すなわち、A、C、G、又はT)である。
「1以上の標的核酸セグメント」という用語は、使用者が知悉している対象とする1以上の配列を指すことは理解されよう。1以上の標的核酸セグメントを含むライゲーションされた断片のみを単離することは、対象とする特定の遺伝子又は遺伝子セグメントとの特異的相互作用を特定するデータに焦点を当てる助けとなる。あるいは、標的化増幅を実施して1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化させることは、1以上の標的核酸セグメントを含む組成物中の断片の比率を増加させることにより、対象とする特定の遺伝子又は遺伝子セグメントとの特異的相互作用を特定するデータに焦点を当てる助けとなる。
本明細書における用語「相互作用」又は「相互作用する」への言及は、2つのエレメント間の会合、例えば本方法においては核酸セグメント及び標的核酸セグメントの間のゲノム相互作用を指す。相互作用は、一方の相互作用するエレメントが他方に対し作用、例えばそれが結合するエレメントのサイレンシング又は活性化を及ぼしめ得る。相互作用は、線状ゲノム配列上で共に近接しているか、又は遠く離れて位置する2つの核酸セグメント間で生じ得る。従って、一実施態様において、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する1以上の核酸セグメントは、線状ゲノム配列上で該1以上の標的核酸セグメントとごく近接しており、例えば同じ染色体上で互いに相対的に近接している。さらなる実施態様において、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する1以上の核酸セグメントは、線状ゲノム配列上で該1以上の標的核酸セグメントから遠く離れて位置しており、例えば、異なる染色体上に存在するか、又は同じ染色体上であってもさらに離れている。
本明細書における用語「核酸組成物」への言及は、核酸及びタンパク質を含む任意の組成物を指す。核酸組成物中の核酸は組織化されて染色体となり、ここで調節機能を有するタンパク質(すなわち、例えばヒストン)は、染色体に会合する状態になり得る。一実施態様において、核酸組成物は核組成物を含む。そのような核組成物には、典型的に核ゲノム組織又はクロマチンが含まれ得る。
本明細書で使用する「架橋する」又は「架橋」への言及は、2つの化合物間の任意の安定した化学的会合を指し、その結果それらは1つのユニットとしてさらに処理することができる。そのような安定性は、共有結合及び/又は非共有結合性結合(例えば、イオン)に基づき得る。例えば、核酸及び/又はタンパク質は、化学物質(すなわち、例えば固定試薬)、熱、圧力、pHの変化、又は放射線照射によって架橋させることができ、その結果それらは定例的実験室手順(すなわち、例えば抽出、洗浄、遠心分離など)の間もそれらの空間的関係を維持する。本明細書で使用する架橋は、任意かつ全ての細胞プロセスを不動化する任意の方法又はプロセスに適用される用語「固定する」又は「固定」と等価である。従って、架橋された/固定された細胞は、固定時の核酸組成物中の成分間の空間的関係を正確に維持する。これらに限定はされないが、ホルムアルデヒド、ホルマリン、又はグルタルアルデヒドを含む多くの化学物質は、固定を提供し得る。
本明細書で使用する用語「断片」への言及は、任意の核酸配列がそれに由来する配列よりも短い任意の核酸配列を指す。断片は、数メガベース及び/又は数キロベースのヌクレオチド長から、数ヌクレオチド長までの範囲に及ぶ、任意のサイズとし得る。断片は、好適には5ヌクレオチド塩基超の長さ、例えば10、15、20、25、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、5000、又は10000ヌクレオチド塩基の長さである。断片はさらに長く、例えば1、5、10、20、25、50、75、100、200、300、400、又は500ヌクレオチドキロベースの長さであり得る。例えば、制限酵素消化、超音波処理、酸インキュベーション、塩基インキュベーション、マイクロ流動化などの方法は全て、核酸組成物の断片化に使用することができる。
いくつかの実施態様において、断片化(すなわち、工程(c))は、エンドヌクレアーゼ酵素を使用して実施する。好適なエンドヌクレアーゼ酵素の例には、これらに限定はされないが、配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば制限酵素、及び配列非特異的エンドヌクレアーゼ、例えばMNase又はDNaseがある。
従って、一実施態様において、エンドヌクレアーゼ酵素は配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば制限酵素である。本明細書で使用する用語「制限酵素」は、特定の塩基対配列で核酸を切断する任意のタンパク質を指す。切断は、選択した制限酵素の種類に応じて、平滑又は付着末端をもたらし得る。制限酵素の例には、これらに限定はされないが、Eco RI、Eco RII、Bam HI、Hind III、Dpn II、Bgl II、Nco I、Taq I、Not I、Hinf I、Sau 3A、Pvu II、Sma I、Hae III、Hga I、Alu I、Eco RV、Kpn I、Pst I、Sac I、Sal I、Sca I、Spe I、Sph I、Stu I、Xba Iがある。さらなる実施態様において、制限酵素を使用して断片化(すなわち、工程(c))を実施する。一実施態様において、制限酵素はHind IIIである。さらなる実施態様において、制限酵素はDpn IIである。
別の実施態様において、エンドヌクレアーゼ酵素は配列非特異的なエンドヌクレアーゼである。本明細書で使用する用語「配列非特異的エンドヌクレアーゼ」は、核酸を切断する任意のタンパク質を指し、該核酸の配列に制限されない。例えば、配列非特異的エンドヌクレアーゼは、タンパク質(例えば、ヌクレオソーム及び/又は転写調節因子)が結合していない任意の領域で核酸を切断し得る。配列非特異的エンドヌクレアーゼの例は当該技術分野で公知であり、これらに限定はされないが、DNase、RNase、及びMNaseがある。MNaseは、細菌の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来する非特異的エンド-エキソヌクレアーゼであり、クロマチン上のDNAのタンパク質非結合領域に結合してこれを切断する―ヒストン又は他のクロマチン結合タンパク質と結合したDNAは未消化のままとなる。なおさらなる実施態様において、断片化(すなわち、工程(c))は、配列非特異的エンドヌクレアーゼを使用して実施する。
別の実施態様において、断片化(すなわち、工程(c))は、超音波処理を使用して実施する。
本明細書における用語、断片又は核酸セグメントの「末端を充填する」への言及は、断片化の後、架橋核酸組成物又はセグメントの3’末端にヌクレオチドを付加することを指す。そのような充填は、核酸組成物又はセグメントの3'末端にdATP、dCTP、dGTP、及び/又はdTTPヌクレオチドを付加することを含む。ライゲーションされ、従ってライゲーション接合部を含む核酸断片又はセグメントの富化を可能にするために、本明細書に記載の充填に使用する1以上のヌクレオチドは、共有結合により連結されたビオチン部分を含み得る。従って、一実施態様において、断片化された架橋核酸セグメントの末端を充填することは、架橋核酸断片の末端にビオチン部分を付加することを含む。さらなる実施態様において、断片化された架橋核酸セグメントの末端を充填することは、「接合部マーカー」を用いて架橋核酸断片の末端を「マーキング」することを含む。そのような架橋核酸断片の末端の「マーキング」又は該末端へのビオチン部分の付加により、工程(e)及び本明細書で定義する方法に従いライゲーションされた核酸断片及び/又はセグメントを引き続き選択し、又は富化することが可能となる。
接合部マーカーにより、富化工程(h)の前にライゲーションされた断片を精製することが可能となり、従ってライゲーションされていない(すなわち、相互作用しない)断片ではなくライゲーションされた配列のみが確実に富化される。
ある実施態様において、接合部マーカーは標識ヌクレオチドリンカー(すなわち、共有結合により連結されたビオチン部分を含むヌクレオチド)を含む。さらなる実施態様において、接合部マーカーはビオチンを含む。一実施態様において、接合部マーカーは修飾ヌクレオチドを含み得る。一実施態様において、接合部マーカーはオリゴヌクレオチドリンカー配列を含み得る。
本明細書における用語「ライゲーションされた」又は「ライゲーションする」への言及は、通常ホスホジエステル結合を含む2つの核酸セグメントが任意に連結されることを指す。連結は通常、補因子試薬及びエネルギー源(すなわち、例えばアデノシン三リン酸(ATP)の存在下、触媒酵素(すなわち、例えばT4 DNAリガーゼなどのリガーゼ)の存在により促進される。本明細書に記載の方法において、単一のライゲーションされた断片を生成させるために、架橋された2つの核酸セグメントの断片をライゲーションして一体化させる。
一実施態様において、断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーションされた断片を生成すること(すなわち、工程(e))は、核内ライゲーションを利用する。従って、ある実施態様において、断片化された核酸セグメントのライゲーションは核内ライゲーションによって実施する。そのような核内ライゲーションには、使用する試薬が少量で済むという利点があり、それにより核酸組成物の損失が減少し、従って核内ライゲーションは出発材料の量を減少させることも可能とする。例えば、核酸組成物をそこから取得する細胞の数を減少させることができ、又は結果として得る後続の分析に利用可能な核酸組成物を増加させることができる。
本明細書における「一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入」への言及は、ライゲーションされた断片の断片化及びオリゴヌクレオチド配列の挿入を一工程で行うことを指す。そのような方法は、オリゴヌクレオチド配列に結合し、断片にこれらを挿入するリコンビナーゼ酵素を利用する。このプロセスは「タグメンテーション(tagmentation)」としても知られている。従って、一実施態様において、一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入はタグメンテーションを含む。
一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドのライゲーションの利点には、上記したものに加え、さらに核酸組成物に取り込まれた任意の結合対エレメント(例えば、ビオチン)をライゲーションされていない断片から除去する必要がなく、ライゲーションされた断片のサイズ選択を実施する必要がなく、リコンビナーゼによる酵素的断片化は、超音波処理を実施しないため、末端修復の必要性を排し、かつA尾部の付加を実施する必要がない点がある。さらに、バーコード配列及び/又は固有の分子識別子を含み得るオリゴヌクレオチドの挿入及び/又はアダプター配列の挿入を、断片化と同時に実施する。そのようなバーコード配列又は固有の分子識別子により、後続の分析及び処理において特定の核酸組成物を特定することが可能となり、かつ複数の核酸組成物を後続の工程において組み合わせることが可能となる。一方で、個々の核酸組成物を特定し、かつ分析する能力は保持される。従って、一実施態様において、オリゴヌクレオチド配列は後続のライブラリ調製及びアダプターを含む核酸断片の配列決定を可能とし、又は容易にする「アダプター」配列である。さらなる実施態様において、アダプターはバーコード配列及び/又は固有の分子識別子を含む。
なおさらなる実施態様において、一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入は、バーコード配列をライゲーションされた断片に挿入することを含む。一実施態様において、対をなす末端アダプター配列は、バーコード配列及び/又は固有の分子識別子を含む。
本発明の方法のなおさらなる利点において、本明細書で提示する一工程の断片化及びオリゴヌクレオチドライゲーション(例えば、タグメンテーション)は、過去に公開されたプロトコルと比較して1以上の標的核酸セグメントを含む断片の顕著に富化されたライブラリの取得である。例えば、既存の公知の又は従来のHi-Cプロトコルに従い作製されたライブラリと比較して、少なくとも5倍～20倍、又は少なくとも5倍～80倍の富化値を生成することができる。一実施態様において、従来のHi-Cプロトコルに従い生成されたライブラリと比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、又は少なくとも20倍富化されたライブラリを、本明細書で定義する方法に従い生成することができる。さらなる実施態様において、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、少なくとも13倍、少なくとも14倍、又は少なくとも15倍富化されたライブラリを、本明細書で定義する方法に従い生成することができる。なおさらなる実施態様において、少なくとも50倍、少なくとも55倍、又は少なくとも60倍富化されたライブラリを本明細書で定義する方法に従い生成することができる。従来のHi-Cプロトコルに従い生成されたライブラリと比較した、本明細書で定義する方法を実施する際に取得されるライブラリの任意の富化値は、架橋核酸組成物の断片化に使用されるエンドヌクレアーゼ酵素の固有性に応じて決定され得ることは理解されよう。例えば、制限酵素Hind IIIを使用する場合、最大20倍の富化値が得られる。あるいは、制限酵素Dpn IIを使用する場合、最大80倍の富化値が得られる。
本明細書で使用する用語「対をなす末端アダプター」は、両末端から読み取りを行う自動化ハイスループット配列決定を可能とする、任意のプライマー対のセットを指す。例えば、これらのアダプターに適合するそのようなハイスループット配列決定装置には、これらに限定はされないが、Solexa(Illumina)、454 System、及び/又はABI SOLiDがある。例えば、本方法は、ユニバーサルプライマーをポリA尾部と一緒に使用することを含み得る。
本方法における使用に好適なリコンビナーゼ酵素は、配列を除去し(又は切断し)、配列をオリゴヌクレオチド又は核酸断片に挿入することができる任意の酵素を含むことは理解されよう。そのようなリコンビナーゼ酵素の例には、レトロウイルスインテグラーゼ、及びトランスポザーゼ酵素、例えばMuA、Tn5、Tn7、及びTc1/mariner型トランスポザーゼがある。従って、本方法の一実施態様において、リコンビナーゼ酵素はレトロウイルスインテグラーゼである。さらなる実施態様において、リコンビナーゼ酵素はトランスポザーゼ酵素、例えばTn5トランスポザーゼである。本明細書で提示する方法においてリコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はトランスポザーゼ酵素を活性化させるため、酵素を突然変異させて天然の状態でのそのような酵素の低レベルの活性を克服してもよい。従って、なおさらなる実施態様において、リコンビナーゼ酵素は突然変異体トランスポザーゼ、例えば活動亢進性トランスポザーゼである。そのような活動亢進性トランスポザーゼは、突然変異体Tn5トランスポザーゼであり得る。一実施態様において、リコンビナーゼはTn5トランスポザーゼ、例えば活動亢進性Tn5トランスポザーゼである。
Tn5トランスポザーゼは、RNaseスーパーファミリーのリコンビナーゼタンパク質の成員であり、レトロウイルスインテグラーゼを含み、いわゆる「カットアンドペースト」機構により核酸の一部の、ゲノムの別の部分又は別のゲノムへの移動(トランスポゾンとして知られる)を触媒する。リコンビナーゼ、例えばトランスポザーゼ酵素及びトランスポゾンエレメントは特定の細菌に見出され、抗生物質抵抗性の獲得に関与する。
トランスポザーゼ酵素は一般的に不活性であり、タンパク質の活性部位又はその他の部位に突然変異が生じると、活動亢進性酵素が生成し得る。Tn5トランスポザーゼ酵素の作製方法は、当該技術分野で公知である(Picelliらの文献、(2014) Genome Research 24:2033-2040)。しかしながら、Tn5トランスポザーゼ酵素を精製する際には、アダプター配列などのオリゴヌクレオチド配列を利用することにより、これらの方法をさらに適応させることができる。
リコンビナーゼ酵素(例えば、Tn5トランスポーゼ)を精製する際に使用されるアダプター配列などのオリゴヌクレオチド配列は、酵素と一体化し、引き続き該リコンビナーゼにより核酸断片又はセグメントに挿入される。そのような配列は、その配列が多様であり、それらが挿入される核酸断片又はセグメントのさらなる処理を可能とする追加のエレメントを含み得る。例えば、精製リコンビナーゼ酵素と一体化されたオリゴヌクレオチドは、配列決定のためのアダプター配列及び/又はバーコード配列を含み得る。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドは全て、酵素との一体化を可能とするトランスポゾン配列又はエレメントを含むことは理解されよう。トランスポゾン配列又はエレメントの例には、Tn5トランスポザーゼ適合性モザイク末端(ME)配列並びにリコンビナーゼ及び/又はトランスポザーゼ酵素の結合ポケットと立体的に適合性の配列がある。
従って、一実施態様により、本方法のリコンビナーゼ酵素は、モザイク末端二本鎖(MEDS)オリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは対をなす末端アダプター配列の半分を含む。さらなる実施態様において、リコンビナーゼ酵素は、配列決定用の対をなす末端アダプター配列を含む。なおさらなる実施態様において、トランスポザーゼ酵素は、さらにバーコード配列を含む配列決定用の対をなす末端アダプター配列を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる実施態様において、オリゴヌクレオチド配列は:本明細書で定義する配列番号:1、配列番号:2、及び/又は配列番号:3から選択される。代替の実施態様において、オリゴヌクレオチド配列は、後続のライブラリ調製及び配列決定を可能にする任意の配列を含む。そのような配列は、核酸セグメントの増幅及び単離、並びにハイスループット(high-throughout)又は次世代配列決定による配列分析のために該核酸セグメントと結合させることができることは理解されよう。次世代配列決定のプラットフォームの例には: Roche 454(すなわち、Roche 454 GS FLX)、Applied Biosystems社のSOLiD system(すなわち、SOLiDv4)、Illumina社のGAIIx、HiSeq 2000、及びMiSeq配列決定装置、Life Technologies社のIon Torrent半導体ベース配列決定装置、Pacific Biosciences社のPacBio RS及びOxford Nanopore社のMinIONがある。
本明細書における、「富化すること」又は「富化」への言及は、あらゆる核酸セグメントの単離、又は核組成物中の他の核酸セグメントに対する対象となる核酸セグメント又は標的核酸セグメントの比率の増加を指す。そのような言及には、「単離すること」、「単離」、「分離」、「除去」、及び「精製」などの用語が含まれることは理解されよう。例えば、対象とする核酸セグメント又は標的核酸セグメントの濃縮又は単離は、対象とする核酸セグメント若しくは標的核酸セグメントの「プルアウト」などのポジティブ法を含み得、又は対象としない若しくは標的核酸セグメントを含まない核酸セグメントの除外などのネガティブ法を含み得る。あるいは、富化又は単離は、対象とする核酸セグメント又は標的核酸セグメントの選択的又は標的化増幅を含み得る。そのような対象とする核酸セグメント又は標的核酸セグメントの選択的又は標的化増幅は、核酸組成物中のそのようなセグメントの比率を増加させる(すなわち、当該セグメントが富化する)。
一実施態様において、該富化工程(h)は、標的化増幅を実施して、該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化する工程を含む。
別の実施態様において、該濃縮工程(h)は、該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化するために:
(i)該1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子を付加する工程であって、該単離用核酸分子を結合対の第1の半分で標識する、前記工程;及び
(ii)該結合対の第2の半分を使用することにより該単離用核酸分子に結合した、該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を単離する工程、を含む。ある実施態様において、上記工程(i)及び(ii)を順次実施する、つまり、工程(i)を実施し、続いて工程(ii)を実施することができる。さらなる実施態様において、上記工程(i)及び(ii)を同時に実施することができる。
従って、本方法の富化工程(h)は、特定の標的セグメント又は配列を含む対象とする核酸断片若しくはセグメント又は標的核酸セグメントの富化を含む。
本明細書における「標的化増幅」への言及は、対象とする特定の核酸セグメント又は標的核酸セグメントを優先的に増幅する方法を用いた増幅を指す。そのような標的化増幅は、標的核酸セグメント又は標的核酸セグメント中に存在する配列(例えば、プロモーター又はサイレンサー配列)に相補的な特定のプライマー配列を利用し得る。従って、一実施態様において、プライマー配列はプロモーター配列に相補的である。別の実施態様において、プライマー配列はSNPを含む配列に相補的である。本明細書において提示する方法で利用されるプライマー配列は、後続する増幅された核酸セグメントの処理又は分析に関与する追加のエレメントを含み得る。例えば、プライマー配列は、本明細書に記載の配列決定のためのアダプター配列又は核酸セグメント若しくはセグメントの群(例えば、特定の試料に由来するもの)の特定に有用な固有の分子識別子を含み得る。あるいはさらに、標的化増幅は、標的核酸セグメント又は標的核酸セグメントを含む断片の増幅に有利な特定の条件を利用し得る。増幅は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施することができることは理解されよう。本明細書に記載する標的化増幅は、溶液中の、又は富化に使用される支持部分、例えばビーズ表面の、核酸セグメントの増幅を含み得ることはさらに理解されよう。また、支持部分上での増幅が該伸長された配列及び核酸セグメントの増幅の前にプライマー配列を伸長させる工程をさらに含み得るものとするように、プライマー配列の伸長を増幅前に実施することもできる。
本明細書における「単離用核酸分子」への言及は、1以上の標的核酸セグメントに結合するように構成された核酸から形成される分子を指す。例えば、単離用核酸分子は、1以上の標的核酸セグメントに相補的な配列を含み得、該配列はその後1以上の標的核酸セグメントのヌクレオチド塩基との相互作用を形成する(すなわち、塩基対(bp)を形成する)。単離用核酸分子、例えばビオチン化RNAは相補的相互作用を形成し、1以上の標的核酸セグメントを核酸組成物から単離するために1以上の標的核酸セグメントの相補的配列の全体を含む必要はないことは理解されよう。単離用核酸分子は、少なくとも10ヌクレオチド塩基長、例えば少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、130、150、170、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、又は5000ヌクレオチド塩基長とし得る。
一実施態様において、1以上の標的核酸セグメントに結合する単離用核酸分子の付加は65℃～72℃で実施する。特定の実施態様において、単離核酸分子の付加は65℃で実施する。従って、さらなる実施態様において、上記富化工程(h)の工程(i)は65℃～72℃、例えば65℃で実施する。別の実施態様において、該結合対の第2の半分を用いた、単離用核酸分子に結合された1以上の標的核酸セグメントを含む断片の単離は、68℃～72℃で実施する。特定の実施態様において、結合対の第2の半分を用いた断片の単離は、68℃で実施する。従って、なおさらなる実施態様において、富化工程(h)の工程(ii)は、68℃～72℃、例えば68℃で実施する。
一実施態様において、単離用核酸分子をブロッキング又はブロッカー配列の存在下で付加する。そのようなブロッカー配列は、アダプター配列の任意の配列相補性を介した、アダプター配列を含むライゲーションされた断片のアダプター配列を含む他のライゲーションされた断片との結合を妨げる。従って、そのようなブロッカー配列は、1以上の標的核酸セグメントを含まない断片の、1以上の標的核酸セグメントを含む断片との結合を妨げる。ある実施態様において、ブロッカー配列は、単離用核酸分子を付加する前にライゲーションされた断片に付加する。別の実施態様において、ブロッカー配列を単離用核酸分子と同時に、又はそれと合わせてライゲーションされた断片に付加する。従って、一実施態様において、ブロッカー配列は、断片にライゲーションされたアダプター配列、例えば特定のアダプター配列に相補的な配列と適合する任意の配列を含む。さらなる実施態様において、ブロッカー配列は、例えば対をなす末端アダプター配列の半分を含むMEDSオリゴヌクレオチドに相補的なものに適合する任意の配列を含む。いくつかの実施態様において、ブロッカー配列は:本明細書で定義する配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、及び/又は配列番号:17から選択される。
さらに、本方法の富化工程(h)は、当該技術分野において公知の方法に従い、かつ公知の試薬を利用して実施することができる。例えば、富化工程(h)が、本明細書に記載の1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子を含む場合、本方法又は本方法の工程は、例えば100mM～600mMの高濃度二価陽イオンの塩を含む緩衝剤の存在下で実施することができる。塩は、2.5:1～60:1のモル比で存在し得る。また、体積排除/増粘剤も、例えば0.002%～0.1%の濃度で存在し得る。さらにあるいは、該方法又は方法の工程は、緩衝剤の存在下で核酸組成物をインキュベートすることを含み得る。インキュベーションは任意に2つの異なる温度の下、8時間以下の期間にわたり行うことができ、ここで2つの異なる温度を2～100回周期変動させる。そのような緩衝剤及び方法の例は、US 9,587,268に記載されている。従って、富化工程(h)を本明細書で開示する特定の実施態様に従い実施する場合、単離核酸分子を含む富化は、従来の試薬及び反応方法を使用した場合よりも迅速に行えることは理解されよう。
本明細書における「結合対」への言及は、結合を形成するために相互を特異的に認識する少なくとも2つの部分(すなわち、第1の半分及び第2の半分)を指す。好適な結合対には、例えばビオチン及びアビジン、又はビオチン及びアビジンの誘導体、例えばストレプトアビジン及びニュートラビジンがある。
本明細書における「標識する」又は「標識された」への言及は、マーカーを結合させることにより標的を識別するプロセスを指し、ここでマーカーは、リガンドとの固有の親和性を有する特異的部分(すなわち、アフィニティータグ)を含む。例えば、標識は、単離用核酸配列を選択的に精製する(すなわち、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより)役割を果たし得る。そのような標識には、これらに限定はされないが、ビオチン標識、ヒスチジン標識(例えば、6His)、又はFLAG標識があり得る。
一実施態様において、単離用核酸分子はビオチンを含む。さらなる実施態様において、単離用核酸分子はビオチンで標識される。なおさらなる実施態様において、単離用核酸分子はヒスチジン標識又はFLAG標識で標識される。従って、特定の実施態様に従い、結合対は標識(例えば、ヒスチジン又はFLAG標識)及び抗体を含み得る。
一実施態様において、1以上の標的核酸セグメントはプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はインスレーターから選択される。さらなる実施態様において、1以上の標的核酸セグメントはプロモーターである。さらに別の実施態様において、1以上の標的核酸セグメントはインスレーターである。
本明細書における「プロモーター」及び「複数のプロモーター」という用語への言及は、作用可能に連結されたコード領域の転写の開始を促進する核酸配列を指す。プロモーターは時に「転写開始領域」と呼ばれる。調節エレメントは、多くの場合転写を活性化又は阻害するために、プロモーターと相互作用する。
本件発明者は本発明の方法を使用して数千ものプロモーター相互作用を特定し、プロモーター当たり10～20の相互作用が見出された。本明細書に記載する方法により、いくつかの細胞特異的相互作用又は様々な疾患状態に関連付けられる相互作用が特定された。相互作用する核酸セグメント間の広範な隔離距離も特定された。大部分の相互作用は100キロベース以内であるが、一部の相互作用は2メガベース以上にも及び延在した。興味深いことに、本方法の使用により、活性遺伝子及び不活性遺伝子の両方が相互作用を形成することも示される。
プロモーターと相互作用することが特定された核酸セグメントは、適切な遺伝子制御に要求される調節エレメントの候補である。それらの破綻は、転写生産量を変化させ、疾患に寄与する可能性があり、従ってこれらのエレメントのその標的遺伝子との結びつきは新規治療法の潜在的な新規薬物標的を提供し得る。
どの調節エレメントがプロモーターと相互作用するかを特定することは、遺伝的相互作用を理解するのに極めて重要である。また、本方法は、特定の時点における核酸組成物中の相互作用の瞬間像を提供するため、本方法は一連の時点、又は発生状態、又は実験条件にわたり実施して、細胞の核酸組成物中の相互作用の変化の像を構築し得ることが想定される。
一実施態様において、標的核酸セグメントは調節エレメントを含む核酸セグメントと相互作用することは理解されよう。さらなる実施態様において、調節エレメントはエンハンサー、サイレンサー、又はインスレーターを含む。
本明細書で使用する用語「調節遺伝子」は、タンパク質をコードする任意の核酸配列を指し、ここでタンパク質は同じ又は異なる核酸配列に結合することにより、転写速度を調節し、又はそうでなくとも同じ又は異なる核酸配列の発現レベルに影響を及ぼす。本明細書で使用する用語「調節エレメント」は、別のゲノムエレメントの活動状態に影響を及ぼす任意の核酸配列を指す。例えば、様々な調節エレメントには、これらに限定はされないが、エンハンサー、アクチベーター、リプレッサー、インスレーター、プロモーター、又はサイレンサーがあり得る。
一実施態様において、標的核酸分子はクロマチン免疫沈降(ChIP)配列決定を介して特定されたゲノム部位である。ChIP配列決定実験では、核酸組成物中でタンパク質-DNA複合体を架橋することによりタンパク質-DNA相互作用を分析する。タンパク質-DNAの複合体を、続いて(免疫沈降法により)単離した後、そのタンパク質が結合しているゲノム領域を配列決定する。
いくつかの実施態様において、核酸セグメントは標的核酸セグメントと同じ染色体上に位置することが想定される。あるいは、核酸セグメントは標的核酸セグメントとは異なる染色体上に位置する。
本方法を使用して、長距離相互作用、短距離相互作用、又は極近接相互作用を特定することができる。本明細書で使用する用語「長距離相互作用」は、線状ゲノム配列中で遠く離れて相互作用する核酸セグメントの検出を指す。この種の相互作用は、例えば同じ染色体の異なる腕に位置するか、又は異なる染色体に位置する2つのゲノム領域を特定することができる。
本明細書で使用する用語「短距離相互作用」は、ゲノム中の相互に比較的近接した位置で相互作用する核酸セグメントの検出を指す。本明細書で使用する用語「極近接相互作用」は、線状ゲノム中で相互に非常に近接している、例えば同じ遺伝子の一部で相互作用する核酸セグメントの検出を指す。
本件発明者らはSNPsが、確率論的に期待されるよりも高頻度で相互作用する核酸セグメント中に位置していたことを示した。従って本発明の方法を使用することにより、特定の遺伝子と相互作用し、かつそのために該遺伝子を調節する可能性が高いSNPsを特定することができる。
従って、本明細書で提示する開示から、本方法を使用して任意の核酸相互作用、特に核酸組成物中のDNA-DNA相互作用を特定することができることは理解されよう。
一実施態様において、単離用核酸分子は、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから取得する。さらなる実施態様において、単離用核酸分子は細菌人工染色体(BAC)から取得する。
一実施態様において、単離用核酸分子はDNA、cDNA、又はRNAである。さらなる実施態様において、単離用核酸分子はRNAである。
単離用核酸分子は、溶液ハイブリダイゼーション選択などの好適な方法で利用することができる(WO 2009/099602を参照されたい)。この方法では、「ベイト」配列のセットが生成し、ハイブリダイゼーション混合物が形成される。これを使用して、試料(すなわち、「ポンド」)から標的核酸のサブグループを単離することができる。
一実施態様において、結合対の第1の半分がビオチンを含み、かつ結合対の第2の半分がストレプトアビジンを含む。
一実施態様において、本方法はさらに、工程(f)の前に架橋を逆行させることを含む。架橋を逆行させるための当該技術分野で公知の方法はいくつかあるが、それは架橋が当初形成された方法に応じて異なることは理解されよう。例えば、架橋核酸組成物を高熱、例えば50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃超又はそれ以上に付すことにより架橋は逆行し得る。さらに、架橋核酸組成物は1時間超、例えば少なくとも5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、又は12時間以上にわたり高熱に付される必要がある。一実施態様において、工程(f)の前の架橋の逆行は、架橋核酸組成物をプロテイナーゼKの存在下、65℃で少なくとも8時間(すなわち、一晩)にわたりインキュベートすることを含む。
一実施態様において、本方法はさらに核酸組成物を精製して工程(f)の前に接合部マーカーを含まないあらゆる断片を除去することを含む。
本明細書における「精製」への言及は、さまざまな他の成分を除去するための処理(すなわち、例えば分画)に付した核酸組成物を指し、該組成物は実質的にその発現された生物活性を保持する。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この呼称は、その核酸が組成物の主要な成分を形成する、例えば組成物の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約95%以上(すなわち、例えば重量/重量(w/w)、体積/体積(v/v)、及び/又は重量/体積(w/v))を構成する組成物を指す。
一実施態様において、本方法はさらに、工程(i)の前に単離された標的のライゲーションされた断片を増幅することを含む。さらなる実施態様において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施する。
一実施態様において、核酸組成物は、哺乳動物細胞核に由来する。さらなる実施態様において、哺乳動物細胞核は、ヒト細胞核であり得る。本明細書に記載する方法において使用するための多くのヒト細胞、例えばGM12878(ヒトリンパ芽球様細胞株)又はCD34+(ヒトエクスビボ造血前駆細胞)が当該技術分野において利用可能である。
本明細書に記載する方法は、ヒトに限らず様々な生物における有用性が見いだされることは、理解されよう。また、例えば本方法を使用して、植物及び動物のゲノム相互作用を特定することができる。
従って、別の実施態様において、核酸組成物は、非ヒト細胞核に由来する。一実施態様において、非ヒト細胞は、これらに限定はされないが、植物、酵母、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、又はヒツジを含む群から選択される。一実施態様において、非ヒト細胞核は、マウス細胞核又は植物細胞核である。
本明細書で言及する発明の利点から、本方法が本明細書で言及した工程の間の核酸組成物の損失の低下を提供することは、理解されよう。そのような核酸組成物の損失の低下により出発材料の量、例えばそこから核酸組成物が取得される細胞の数を低下させることが可能となる。従って、一実施態様において、核酸組成物は既存のプロモーターキャプチャー又はコンフォメーションキャプチャー技術よりも少数の細胞に由来し得る。さらなる実施態様において、核酸組成物は100万個以下の細胞、50万個以下の細胞、20万個以下の細胞、50000個以下の細胞、又は10000個以下の細胞に由来する。なおさらなる実施態様において、核酸組成物は、100万個の細胞、50万個の細胞、20万個の細胞、50000個の細胞、又は10000個の細胞に由来する。ある実施態様において、核酸組成物は100万個の細胞、50000個の細胞、又は10000個の細胞に由来する。
一実施態様において、本明細書で定義する方法は:
(i)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を架橋する工程;
(ii)架橋核酸組成物を断片化する工程;
(iii)断片の末端をビオチンでマーキングする工程;
(iv)断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(v)架橋を逆行させる工程;
(vi)トランスポザーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びアダプターの挿入を実施する工程;
(vii)ライゲーション断片をストレプトアビジンを用いてプルダウンする工程;
(viii)1以上の標的核酸セグメントを含む断片の標的化増幅を実施する工程;及び
(ix)配列決定して、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程を含む。
別の実施態様において、本明細書で定義する方法は:
(i)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を架橋する工程;
(ii)架橋核酸組成物を断片化する工程;
(iii)断片の末端をビオチンでマーキングする工程;
(iv)断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(v)架橋を逆行させる工程;
(vi)トランスポザーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びアダプターの挿入を実施する工程;
(vii)ストレプトアビジンを用いた断片のプルダウン及びPCRを使用した増幅を行う工程;
(viii)1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子を付加することによるプロモーターキャプチャーを行う工程であって、該単離用核酸分子を結合対の第1の半分で標識する、前記工程;及び
(ix)結合対の第2の半分を使用することにより単離用核酸分子に結合した、1以上の標的核酸セグメントを含む、ライゲーション断片を単離する工程;
(x)PCRを使用した増幅を行う工程;及び
(xi)配列決定して、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程を含む。
本発明のさらなる態様に従い、特定の疾患状態を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
a)特定の疾患状態を有する個体から得られた核酸組成物に本明細書で定義する方法を実施すること;
b)核酸セグメント及び1以上の標的核酸セグメント間の相互作用の頻度を定量化すること;
c)該疾患状態を有する個体由来の核酸組成物における相互作用の頻度を、健康な対象由来の正常対照核酸組成物における相互作用の頻度と比較することであって、その結果核酸組成物における相互作用の頻度の差が特定の疾患を示す、前記比較すること、を含む、前記方法を提供する。
本明細書で使用する「相互作用の頻度」又は「相互作用頻度」への言及は、核酸組成物(すなわち、試料)中に特異的相互作用が見出される回数を指す。場合によっては、健常対象由来の正常な対照核酸組成物と比較して、核酸組成物中の相互作用頻度が低下していることは、特定の疾患状態を示す(すなわち、核酸セグメントがより低頻度で相互作用するため)。あるいは、健常対象由来の正常な対照核酸組成物と比較して、核酸組成物中の相互作用頻度が増加していることは、特定の疾患状態を示す(すなわち、核酸セグメントがより高頻度で相互作用するため)。場合によっては、差は少なくとも0.5倍の差、例えば1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7倍、又は10倍の差となる。
本発明の一態様において、相互作用の頻度を使用して、2つの異なる核酸セグメントの空間的近接度を決定することができる。相互作用頻度が増加すると、2つのゲノム領域が3D核空間内で互いに物理的に近接する確率が増加する。逆に、相互作用頻度が低下すると、2つのゲノム領域が3D核空間内で互いに物理的に近接する確率が低下する。
定量化は、患者由来の核酸組成物の相互作用の頻度の計算又は核酸組成物試料若しくはその希釈物の精製若しくは抽出に好適な任意の方法によって実施することができる。また例えば、ハイスループット配列決定の結果により、特定の相互作用の頻度を調べることが可能となる。本発明の方法において、定量化は、1以上の試料中の標的核酸セグメント又はライゲーション産物の濃度を測定することにより実施することができる。核酸組成物は、脳脊髄液(CSF)、全血、血清、血漿、又はそれらからの抽出物若しくは精製物、又はそれらの希釈物を含み得る生物学的試料中の細胞から得られる。一実施態様において、生物学的試料は脳脊髄液(CSF)、全血、血清、又は血漿であり得る。また、生物学的試料には、生きた対象からの又は死後に採取した組織ホモジェネート、組織切片、及び生検試料がある。試料を調製することができ、例えば適切であれば通常の方法で希釈し、又は濃縮し、かつ保存することができる。
一実施態様において、疾患状態は、癌、自己免疫疾患、発達障害、遺伝性障害、糖尿病、心血管疾患、腎疾患、肺疾患、肝疾患、神経疾患、ウイルス感染症又は細菌感染症から選択される。さらなる実施態様において、疾患状態は癌又は自己免疫疾患である。なおさらなる実施態様において、疾患状態は、癌、例えば乳癌、腸癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、若しくは子宮癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は黒色腫である。
本明細書における「自己免疫疾患」への言及は、ヒト自身の体を標的化する免疫反応から生じる疾病、例えば急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、強直性脊椎炎、ベーチェット病、セリアック病、クローン病、1型糖尿病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎を含む。
本明細書における「発達障害」への言及は、通常幼年期に根差した疾病、例えば学習能力障害、コミュニケーション障害、自閉症、注意欠陥多動障害(ADHD)、及び発達性協調運動症を含む。
本明細書における「遺伝性障害」への言及は、ゲノム中の1以上の異常に起因する疾病、例えばアンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色覚障害、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、及びターナー症候群を含む。
本発明のさらなる態様に従い、1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットであって、本明細書で定義する方法を実施可能な緩衝剤及び試薬を含む、前記キットを提供する。
キットには、本方法の実施のための1以上の物品及び/又は試薬を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドプローブ、増幅プライマーの対、及び/又はリコンビナーゼ酵素関連オリゴヌクレオチドは、単離された形態で提供され、かつキットの一部、例えば内容物を外部環境から保護するバイアルなどの好適な容器中にあり得る。キットは、本明細書に記載の方法のプロトコルに従って使用するための指示書を含み得る。核酸をPCRにおいて使用することが意図されるキットは、反応に必要となる1以上の他の試薬、例えばポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液などを含み得る。
一実施態様において、キットは、リコンビナーゼ酵素を含む。さらなる実施態様において、本明細書で定義するキット中に含まれるリコンビナーゼ酵素は、トランスポザーゼ酵素、例えば活動亢進性突然変異体トランスポザーゼ酵素、例えば活動亢進性突然変異体Tn5トランスポザーゼである。
本発明のなおさらなる態様に従い、一工程の断片化及びアダプター挿入を可能とする本明細書で定義するリコンビナーゼ酵素を提供する。従って、本明細書ではまた、タグメンテーションが可能なリコンビナーゼ酵素を提供する。
一実施態様において、本明細書で提供するリコンビナーゼ酵素は、活動亢進性突然変異体トランスポザーゼ酵素である。さらなる実施態様において、トランスポザーゼ酵素は活動亢進性突然変異体Tn5トランスポザーゼである。なおさらなる実施態様において、トランスポザーゼ酵素は、対をなす末端アダプター配列を含む。
キットに含まれる既に説明した緩衝剤及び試薬以外の緩衝剤及び試薬の種類の例は、本明細書に記載の実施例において読み取ることができることは理解されよう。
以下の研究及びプロトコルは、本明細書に記載の方法の実施態様を例証する。
(実施例)
(略語)
Figure 2022552155000002
(細胞の固定)
1.1回の実験につき最低50000個の細胞を最終濃度2%のホルムアルデヒドにより室温で10分間固定しなくてはならない。
・最終濃度0.125Mのグリシンでクエンチする。
・4℃、1500rpm(400×g)で5分間遠心分離する。
・上清を捨て、100μlの冷1×PBS中で注意深くペレットを再懸濁させる。4℃、1500rpm(400×g)で5分間遠心分離する。
・上清を捨て、液体窒素中で瞬間凍結させるか、又は直接次の工程に進む。
(細胞の透過性付与及び制限消化)
2.工程1で得た固定した細胞ペレットを100μLの氷冷溶解緩衝液中に再懸濁させる。チューブを氷上で30分間インキュベートする。
3.チューブを4℃、およそ600gで5分間遠心分離する。
4.上清を除去し、核ペレットを含むおよそ20μlの溶液を残す。
5.ペレットを100μL 1.2×NEBuffer3(Dpn IIを使用する場合)又はNEBuffer2(Hind IIIを使用する場合)で2回洗浄する。
6.およそ20μLを残して上清を除去する。334μlの1.2×NEBuffer3(又はHind IIIを用いて作業する場合はNEBuffer2)を追加する。
7.12μlの10% SDS(最終濃度0.3%、w/v)を加える;サーモミキサー上で37℃、950rpmで1時間振盪させる。
8.80μlの10% Triton(最終濃度1.8%、v/v)を加える。サーモミキサー上で37℃、950rpmで1時間振盪させる。
9.30μlのDpn II(50U/μl)(又は15μlのHind III―100U/μl及び15μlのH2O)を加え、12～16時間にわたりサーモミキサー上で37℃、950rpmで振盪させる。
(ビオチン標識及びHi-Cライゲーション)
10.消化ミックスを短時間スピンする。
11.4.5μlのdCTP、dTTP、及びdGTP(10mMミックス)、37.5μlのビオチン-dATP、及び10μlのクレノウ(5U/μl)を追加する。30秒ごとに10秒間700rpmで振盪させながら、37℃で45分間にわたりインキュベートする。
12.4℃、600gで6分間遠心分離する。
13.ペレットを含めておよそ50μlを残し、上清を除去する。
14.835μlのH2O/100μl T4 DNAリガーゼ緩衝液/5μl BSA(20mg/ml)/10μl T4 DNAリガーゼ(Invitrogen)を追加する。
15.16℃で最低4時間(又は最大12時間)にわたりインキュベートする。
(Hi-C DNAの精製)
16.チューブを4℃、600gで6分間遠心分離する。
17.チューブに200μlを残して800μlの上清を除去する。
18.15μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を追加する。65℃で4時間インキュベートする(任意)。
19.15μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を追加する。65℃で一晩インキュベートする。
20.製造業者の指示に従い、1×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter Ampure XP beads A63881)を用いて精製する。長鎖DNA断片の回収量が低下し得るため、ビーズが乾燥し過ぎないようにする。ヌクレアーゼ不含水中で10分間インキュベートする。
(タグメンテーション)
21.(収集したDNAの総量に従い)以下のようにいくつかのタグメンテーション反応物を準備する:
・XμlのDNA
・4μlのタグメンテーション緩衝液(5×)
・YμlのTn5
・16-X-Yのヌクレアーゼ不含水。
混合せずに55℃で7分間インキュベートする。
DNA断片がおよそ400bpの分布となるようにする。
ガイドラインとして:およそ50ngのDNAを用いて作業する場合、0.5～1μlの12.3uM Tn5を使用する。100～300ngのDNAを用いて作業する場合、1μlの24.6uM Tn5を使用する。
より良い結果を得るため、Tn5の量を調整して適切な断片分布を得る。
22.TapeStation又はBioanalyzerでDNA断片の分布を確認する:
・タグメンテーションミックスから1μlを使用し、3μlのH20及び1μlの0.2% SDSを追加する。55℃で7分間インキュベートする。
・5μlの0.2% SDSを追加して、55℃で7分間インキュベートすることにより、トランスポザーゼを脱離させる。
・この混合物から2μlを使用して、TapeStation又はBioanalyzerに負荷する。
分布が正確である場合、工程21で得た最初のタグメンテーションミックスに1μlのヌクレアーゼ不含水を追加し、5μlの0.2% SDSを追加して、55℃で7分間インキュベートすることにより、Tn5を脱離させる。
23.25μlのこのタグメンテーションミックスを、工程22で得た混合物の残りの3μlと合わせる。
(Hi-Cライゲーション産物のプルダウン)
24.ライゲーション事象のプルダウンのための、試料当たり25μlのストレプトアビジンMyOne C1 Dynabeadsを使用する。ビーズを調製するために、ビーズを400μlのTB緩衝液で2回洗浄する(洗浄当たり3分間回転させる)。25μlのビーズを50μlの2×NTB緩衝液に再懸濁させる。
25.(前工程で得た)ビーズを22μlのTLE及び(工程24で得た)28μlのタグメンテーションミックスと一つに混合する。室温で45分間インキュベートし、ゆっくりと回転させる。
26.ビーズを100μlの1×NTBで4回洗浄し、続いて50μlのTLEで2回洗浄する。25μlのヌクレアーゼ不含水にビーズを再懸濁させる。
(ライブラリ調製)
27.以下のように5つの反応物を作製する:
・前工程で得た混合物からの5μl
・29.5μlのH2O
・10μlのKAPA HiFi緩衝液(5×)
・1.5μl dNTP(10mM)
・1μl KAPA HiFi DNAポリメラーゼ
・3μl i7/i5プライマー(10uM)ミックス。
PCR条件は:
・72℃で3'
・4～7サイクルの{95℃で10'’、55℃で30'’、72℃で30'’}
・72℃で5'
28.反応物を合わせ、Ampure SPRIビーズ(1×比)を用いて精製する。TapeStation/Bioanalyzer及びQubitにより、キャプチャーHi-Cライブラリの質及び量を確認する。
(ビオチン-RNAを用いたHi-Cライブラリのキャプチャーハイブリダイゼーション―方法1)
3つのPCRストリップ:「DNA」、「ハイブリダイゼーション」、及び「RNA」を調製する。
29a.Hi-Cライブラリの調製:300ng～1μg、特に500ngに相当する容量のHi-Cライブラリを、1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、SpeedVac(45℃、およそ15分間)を使用して乾燥させる。4μlのヌクレアーゼ不含水でHi-C DNAペレットを再懸濁させる。
30a.ブロッカーミックスを調製する。試料ごとに:
・ブロッカー#1―2.5μl(Agilent Technologies)
・ブロッカー#2―2.5μl(Agilent Technologies)
・カスタムブロッカー―1μl。
31a.前工程で得たブロッカーミックスを、工程29で得たDNAライブラリと混合する。10μlのDNAライブラリを対応するPCRストリップのウェルに移す。氷上に保つ。
32a.ハイブリッドミックスを調製する。これを室温に保つ。
・HBI―25μl
・HBII―1μl
・HBIII―10μl
・HBIV―13μl 。
十分に混合する;沈殿物が形成された場合、65℃で5分間熱する。「ハイブリダイゼーション」PCRストリップ(Agilent 410022)の各ウェルにキャプチャー当たり30μlを分注し、PCRストリップチューブの蓋を閉め(Agilent optical cap 8x strip 401425)、室温に保つ。
33a.1:4のRNaseブロック溶液を調製する(例えば、3μl RNaseブロック＋9μl水)。
34a.ビオチン-RNAを調製する。キャプチャーごとに：5μlのカスタムベイト(又はキャプチャーシステムのサイズが＜3Mbの場合は2ulカスタムベイト＋3ulのヌクレアーゼ不含水)を2μlのRNaseブロック希釈液と混合する。これらの7μlを「RNA」PCRストリップに移す。氷上に保つ。
35a.ハイブリダイゼーション反応：PCRサーモサイクラーを以下のプログラムに設定する: 95℃で5'、65℃で∞。
PCR装置の蓋は加熱されなくてはならない。手順全体を通して、作業は手早く行い、PCR装置の蓋が空いている時間を可能な限り最小に保つよう努める。試料が蒸発すると、ハイブリダイゼーション条件が最適でなくなる。
36a.Hi-Cライブラリを含む「DNA」 PCRストリップをPCR装置の以下の黒くマーキングした位置に移し、PCRプログラムを開始する。DNAを95℃で5分間インキュベートする。
Figure 2022552155000003
 37a.温度が65℃に達したら、ハイブリダイゼーション緩衝液を含む「ハイブリダイゼーション」PCRストリップをPCR装置の以下の灰色でマーキングした位置に移す。65℃で5分間インキュベートする。
Figure 2022552155000004
 38a.ビオチン化RNAベイトを含む「RNA」 PCRストリップをPCR装置の以下のクロスハッチングによりマーキングした位置に移す。2分間インキュベートする。
Figure 2022552155000005
 39a.「ハイブリダイゼーション」及び「RNA」ストリップの蓋を開ける。13μlのハイブリダイゼーション緩衝液を7μlのRNAベイトにピペットで移す(灰色からクロスハッチングへ)。ハイブリダイゼーション緩衝液を含むPCRストリップを捨てる。すぐに次の工程に進む。
Figure 2022552155000006
 40a.Hi-Cライブラリを含む「DNA」PCRストリップから蓋を外す。10μlのHi-Cライブラリをハイブリダイゼーション緩衝液を含む20μlのRNAベイトにピペットで移す(黒からクロスハッチングへ)。DNA PCRストリップに何も残っていないことを確認し、これを捨てる。
Figure 2022552155000007
 すぐに新しいPCRストリップチューブの蓋で残りの「RNA」PCRストリップ(この時点でHi-Cライブラリ/ハイブリダイゼーション緩衝液/RNAベイトを含む)の蓋を閉じ、65℃で24時間インキュベートする。
Figure 2022552155000008
(上記方法1で使用するためのストレプトアビジン-ビオチンプルダウン及び洗浄)
41a.バッファの調製:
室温の結合緩衝液(BB、Agilent Technologies)
室温の洗浄緩衝液I(WB I、Agilent Technologies)
65℃～72℃、特に65℃の洗浄緩衝液II(WB II Agilent Technologies)
室温のNEB2 1×(NEB B7002S)
42a.磁気ビーズを洗浄する:
Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1(Life Technologies 65601)を十分に混合した後、キャプチャーHi-C試料当たり60μlを1.5mlの低結合(lobind)エッペンドルフチューブに追加する。ビーズを以下のように洗浄する(全ての後続の洗浄工程についても同じ手順で行う):
・200μl BBを追加する。
・5秒間ボルテックスで混合する(低～中速の設定)。
・チューブをDynal磁気分離装置(Life Technologies)に配置する。
・ビーズを再生し、上清を廃棄する。
工程a)～d)を繰り返して、全部で3回の洗浄を行う。
43a.ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン:
新しい低結合エッペンドルフチューブに入れた200μl BB中のDynabeads MyOneストレプトアビジンT1ビーズを用い、(PCR装置を動作させながら)PCR装置の蓋を開け、全てのハイブリダイゼーション反応液をストレプトアビジンビーズを含むチューブにピペットで移す。回転盤上にて室温で30分間インキュベートする。
44a.洗浄:
30分後、試料を磁気分離装置に配置し、上清を捨てる。
ビーズを500μl WB Iに再懸濁させ、新しいチューブに移す。室温で15分間インキュベートする。2～3分ごとに各々5秒間、ボルテックスに付す。
磁気分離装置上でビーズ及び緩衝液を分離し、上清を除去する。500μl WB II(65～72℃、特に65℃まで事前に加温)に再懸濁し、新しいチューブに移す。65～72℃、特に65℃で10分間インキュベートし、2～3分ごとに5秒間ボルテックスに付す(低～中速設定)。全て65℃～72℃、特に65℃でWB IIでの洗浄を全部で3回繰り返す。
200μlのNeb2 1×に再懸濁させる。磁石に直接取り付ける。上清を除去し、30μlのNeb2 1×で再懸濁させる。
この時点で、ビーズ表面のRNA/DNA混合物ハイブリッド「キャッチ」の、PCR増幅の準備が完了する(工程45)。
(ビオチン-RNAを用いたHi-Cライブラリのキャプチャーハイブリダイゼーション―方法2(高濃度の二価陽イオンの塩を含む緩衝液を使用し、本明細書で「迅速ハイブリダイゼーション」と呼ぶ)
本明細書にこの方法を利用する実施態様に従い記載されるように、調製時間は大きく低下し得る(例えば、およそ2時間45分)。
29b.迅速ハイブリダイゼーション緩衝液を解凍するまで室温で事前に加温し、使用準備ができるまで室温に保つ。
30b.ブロッカーミックスを調製する:
・2.5μlの核酸組成物が由来する種と同じ種から得た1mg/ml Cot-1 DNA、例えばヒトCot-1 DNA
・2.5μlの10mg/mlサケ精子DNA
・1μlカスタムブロッカー。
31b.以下の通り室温でブロッキング反応を準備する:
・6μlの上記調製したブロッカーミックスを、11μlの調製されたDNA試料(およそ100ng～1μg、例えば、500ng)に追加する。
・上下にピペッティングして混合する。短時間スピンダウンする。
32b.以下に示すようにサーマルサイクラーをプログラムする。プログラムを起動し、すぐにポーズボタンを押す。これにより、あらかじめ調製されたゲノムDNA断片のライブラリにブロッカーミックスを追加しながら、蓋が加熱される。
・変性―95℃で5分間
・ブロッキング―65℃で10分間
・ハイブリダイゼーション―65℃で1分間;37℃で3秒間―50サイクル
・保存―65℃に固定。
33b.試料をサーマルサイクラーに入れ、プログラムを再開して変性及びブロッキングを実施する。
34b.試料をサーマルサイクラー上でインキュベートする間に、氷上でキャプチャーベイトミックスを調製する。
35b. キャプチャー用のSureSelect RNaseブロックを希釈する(RNaseブロック1部:水3部):
・1μlのRNaseブロックを混合する(Agilent Technologies社)。
・3μlの水 。
36b.ハイブリダイゼーションミックスの調製:
・2μlの希釈SureSelect RNaseブロック
・5μl SureSelectカスタムベイト(又はキャプチャーシステムが＜3Mbである場合、2ul SureSelectカスタムベイト＋3ulヌクレアーゼ不含水)
・6μlの室温の5×迅速ハイブリダイゼーション緩衝液。
37b.サーマルサイクルが65℃で第1のハイブリダイゼーションサイクルに達したら、ポーズボタンを押す。この時点でサーマルサイクラーは65℃に維持されている。サーマルサイクラーの蓋を開け、13μlのハイブリダイゼーションミックスを各々対応するブロッキング反応液にピペットで移す。上下にゆっくり8～10回ピペッティングすることにより、十分に混合する。ハイブリダイゼーション反応液はこの時点で30μlである。
38b.ウェルをキャップで密封して蓋を閉じ、プレイボタンを押して、プログラムを再開させると、加熱された蓋が作動した状態でサイクルするハイブリダイゼーションプロファイルが実行される。
39b.磁気ビーズ(Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1、Invitrogen)を調製する。
・ボルテックスミキサーで、Dynal(Invitrogen)磁気ビーズを激しく再懸濁させる。
・各ハイブリダイゼーション試料につき、60μl Dynabeads T1磁気ビーズを使用する。
・ビーズを洗浄する:
(a)200μl SureSelect結合緩衝液(Agilent Technologies社)を追加する。
(b)上下に10回ピペッティングすることにより、ビーズを混合する。
(c)チューブを磁気スタンドに配置する。
(d)2～5分間待ち、上清を捨てる。
(e)工程(a)～(d)を繰り返して、全部で3回の洗浄を行う。
(f)20μlのSureSelect結合緩衝液でビーズを再懸濁させる。
40b.ストレプトアビジンビーズを使用してハイブリダイズしたDNAをキャプチャーする。
・インキュベーション後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、室温で短時間スピンして液体を収集する。
・各試料の全てのハイブリダイゼーション混合物を対応する洗浄して準備のできたDynal MyOne T1ストレプトアビジンビーズ溶液に追加し、プレートに乗せたストリップチューブを反転させて3～5回混合させる。
・ローテータ又はシェイカー上でハイブリッドキャプチャー/ビーズ溶液を室温で30分間インキュベートする。
・試料当たり1500μlを分注することにより、68℃～72℃、特に68℃で洗浄緩衝液#2を事前に加温する。
・30分後にハイブリッドキャプチャー/ビーズ溶液を短時間スピンダウンする。
41b.ビーズを洗浄する:
(a)磁気分離装置上でビーズ及び緩衝液を分離し、上清を除去する。
(b)上下に8～10回ピペッティングすることにより500μl洗浄緩衝液#1にビーズを再懸濁させ、その後23℃で10分間放置する。磁器分離装置上でビーズ及び緩衝液を分離して上清を除去する。
(c)工程(a)～(b)を繰り返す。
(d)磁気スタンド上でビーズ及び緩衝液を1分間分離させ、上清を除去する。
(e)500μlの事前に加温した洗浄緩衝液#2を追加する。ゆっくりと上下に10回ピペッティングしてビーズを再懸濁させる。洗浄緩衝液を上下にピペッティングする際に、ペレット化したビーズに緩衝液を直接分配して、迅速にビーズを再懸濁させる。
(f)試料を68℃～72℃、特に68℃で10分間インキュベートする。
(g)工程(d)～(f)を繰り返して、全部で3回の洗浄を行う。
(h)磁気スタンド上でビーズ及び緩衝液を分離する。全ての洗浄緩衝液#2が確実に除去されるようにする。
(i)50μlのヌクレアーゼ不含水で再懸濁し、磁気スタンド上でビーズを分離して上清を除去する。
(j)23μlのヌクレアーゼ不含水にビーズを再懸濁させ、PCRに進む。
キャプチャーHi-CライブラリのPCR増幅に進む(工程45)。
(キャプチャーHi-CライブラリのPCR増幅)
45.以下のように、5回の増幅サイクルによるPCRを準備する:
・前工程で得たミックスからの5μl
・29.5μlのmQ(水)
・10μlのKAPA HiFi緩衝液(5×)
・1.5μl dNTP(10mM)
・1μl KAPA HiFi DNAポリメラーゼ
・3μlプライマー(10uM)ミックス(P5-FCA-R及びFCA-P7F)
PCR条件:
・95℃で3'
・5サイクルの{95℃で20'’、55℃で30'’、72℃で30'’}
・72℃で3'
46.上記の工程で得た個別のPCR反応を全てプールする。磁気分離装置に配置し、上清を新しい1.5mlの低結合エッペンドルフチューブに移す。製造業者の指示に従い、1×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter Ampure XP beads A63881)を精製する。最終容量20μlのTLE又はヌクレアーゼ不含水に再懸濁させる。
TapeStation/Bioanalyzer及びKAPA qPCRにより、キャプチャーHi-Cライブラリの質及び量を確認する。
(Tn5トランスポザーゼアダプター配列)
Tn5トランスポザーゼ上のアセンブリに使用される配列:
Figure 2022552155000009
(プレキャプチャーPCR用プライマー)
Figure 2022552155000010
 「rc」は、バーコード配列が逆相補的であることを示す。
(ブロッカー配列)
Figure 2022552155000011
(緩衝溶液)
(5×迅速ハイブリダイゼーション緩衝液)
1540 mM MgCl2*6H2O、0.0417% w/w HPMC、100 mM Tris (pH 8.0)及びH2O。
(洗浄緩衝液#1)
「低ストリンジェンシー緩衝液」―非特異的結合プローブを除去するための、高塩濃度、低温)2×SSC、0.1% SDS及びH2O。
(洗浄緩衝液#2)
(「高ストリンジェンシー緩衝液」―低親和性ハイブリダイゼーションプローブを除去するための、低塩濃度、高温)0.1×SSC、0.1% SDS、及びH2O。

Claims (25)

1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を取得する工程;
(b)該核酸組成物を架橋する工程;
(c)架橋核酸組成物をエンドヌクレアーゼ酵素を用いて断片化する工程;
(d)断片化された架橋核酸セグメントの末端を、共有結合により連結されたビオチン部分を含む1以上のヌクレオチドで充填する工程;
(e)工程(d)で取得した断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(f)リコンビナーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入を実施する工程;
(g)工程(d)のビオチン部分を含む断片を富化する工程;
(h)該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化する工程;
(i)工程(h)で取得した富化断片を配列決定して、該1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程、を含む、前記方法。
工程(h)が、標的化増幅を実施して、前記1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化することを含む、請求項1記載の方法。
工程(h)が:
(i)前記1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子を付加することであって、該単離用核酸分子を結合対の第1の半分で標識する、前記付加すること;及び
(ii)該結合対の第2の半分を使用することにより該単離用核酸分子に結合した、該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を単離すること、を含む、請求項1記載の方法。
工程(f)を、タグメンテーションにより実施する、請求項1～3のいずれか1項記載の方法。
工程(e)が、核内ライゲーションを利用する、請求項1～4のいずれか1項記載の方法。
前記リコンビナーゼ酵素がレトロウイルスインテグラーゼ、例えば突然変異体トランスポザーゼ、例えば活動亢進性Tn5トランスポザーゼである、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
前記リコンビナーゼ酵素が配列決定用の対をなす末端アダプター配列又はその断片を含む、請求項1～6のいずれか1項記載の方法。
前記オリゴヌクレオチド及び/又はアダプター配列がバーコード配列を含む、請求項1～7のいずれか1項記載の方法。
前記オリゴヌクレオチド及び/又はアダプター配列が:配列番号:1、配列番号:2、及び/若しくは配列番号:3、又は後続のライブラリ調製及び配列決定を可能とするオリゴヌクレオチド配列から選択される、請求項7又は8記載の方法。
工程(h)における単離用核酸分子の付加を、アダプター配列の相補性を介したライゲーション断片の他のライゲーション断片との結合を妨げる配列、例えばブロッカー配列の存在下で実施する、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
前記1以上の標的核酸セグメントが:プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、又はインスレーターから選択される、請求項1～10のいずれか1項記載の方法。
前記単離用核酸分子が、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから取得される、請求項1～11のいずれか1項記載の方法。
前記単離用核酸分子がRNAである、請求項1又は3～12のいずれか1項記載の方法。
前記結合対の第1の半分がビオチンを含み、かつ前記結合対の第2の半分がストレプトアビジンを含む、請求項3～13のいずれか1項記載の方法。
工程(c)で使用する制限酵素がHind III又はDpn IIである、請求項1～14のいずれか1項記載の方法。
工程(g)において前記ビオチン部分を含む前記富化断片を増幅することをさらに含む、請求項3～15のいずれか1項記載の方法。
工程(i)の前に単離されたライゲーション断片を増幅することをさらに含む、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
前記標的化増幅又は増幅することが、PCRによって実施される、請求項1、2、又は4～17のいずれか1項記載の方法。
前記核酸組成物が哺乳動物細胞核、例えばヒト細胞核に由来する、請求項1～18のいずれか1項記載の方法。
前記核酸組成物が非ヒト細胞核、例えばマウス細胞核又は植物細胞核に由来する、請求項1～19のいずれか1項記載の方法。
前記核酸組成物が10000、50000、20万、50万、又は100万個の細胞に由来する、請求項1～20のいずれか1項記載の方法。
特定の疾患状態を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)特定の疾患を有する個体から取得した核酸組成物に請求項1～21のいずれか1項記載の方法を実施すること;
(b)核酸セグメント及び1以上の標的核酸セグメントの間の相互作用の頻度を定量化すること;及び
(c)該疾患状態を有する個体由来の該核酸組成物における相互作用の頻度を、健康な対象由来の正常対照核組成物における相互作用の頻度と比較することであって、その結果該核酸組成物における相互作用の頻度の差が特定の疾患を示す、前記比較すること、を含む、前記方法。
前記疾患状態が:癌、自己免疫疾患、発達疾患、又は遺伝性障害から選択される、請求項22記載の方法。
1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットであって、請求項1～21のいずれか1項記載の方法を実施可能な緩衝剤及び試薬を含む、前記キット。
前記リコンビナーゼ酵素がレトロウイルスインテグラーゼ又はトランスポザーゼ酵素、例えば突然変異体トランスポザーゼ酵素、例えば活動亢進性Tn5トランスポザーゼである、請求項24記載のキット。
JP2022520576A 2019-10-04 2020-10-05 新規方法 Pending JP2022552155A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201914325A GB201914325D0 (en) 2019-10-04 2019-10-04 Novel meethod
GB1914325.4 2019-10-04
PCT/GB2020/052448 WO2021064430A1 (en) 2019-10-04 2020-10-05 Novel method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022552155A true JP2022552155A (ja) 2022-12-15
JPWO2021064430A5 JPWO2021064430A5 (ja) 2023-10-10

Family

ID=68541246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022520576A Pending JP2022552155A (ja) 2019-10-04 2020-10-05 新規方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220282327A1 (ja)
EP (1) EP4041913B1 (ja)
JP (1) JP2022552155A (ja)
CN (1) CN114787378A (ja)
AU (1) AU2020361082A1 (ja)
CA (1) CA3155854A1 (ja)
ES (1) ES2972957T3 (ja)
GB (1) GB201914325D0 (ja)
WO (1) WO2021064430A1 (ja)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029498A1 (en) 2008-02-04 2010-02-04 Andreas Gnirke Selection of nucleic acids by solution hybridization to oligonucleotide baits
WO2010036323A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 University Of Massachusetts Medical School Method of identifing interactions between genomic loci
US10287621B2 (en) * 2013-04-11 2019-05-14 Pelin Sahlén Targeted chromosome conformation capture
GB2517936B (en) 2013-09-05 2016-10-19 Babraham Inst Chromosome conformation capture method including selection and enrichment steps
US9587268B2 (en) 2014-01-29 2017-03-07 Agilent Technologies Inc. Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment
GB201518843D0 (en) * 2015-10-23 2015-12-09 Isis Innovation Method of analysing DNA sequences

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020361082A1 (en) 2022-04-14
EP4041913A1 (en) 2022-08-17
ES2972957T3 (es) 2024-06-17
WO2021064430A1 (en) 2021-04-08
CN114787378A (zh) 2022-07-22
GB201914325D0 (en) 2019-11-20
US20220282327A1 (en) 2022-09-08
EP4041913B1 (en) 2023-11-29
CA3155854A1 (en) 2021-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113166797B (zh) 基于核酸酶的rna耗尽
Stark et al. RNA sequencing: the teenage years
US10731152B2 (en) Method for controlled DNA fragmentation
CN107109485B (zh) 用于多重捕获反应的通用阻断寡聚物系统和改进的杂交捕获的方法
EP3252174B1 (en) Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
AU2014406026B2 (en) Isolated oligonucleotide and use thereof in nucleic acid sequencing
CN105658813B (zh) 包括选择和富集步骤的染色体构象捕获方法
JP2022036975A (ja) ナノポア技術を用いた短いｄｎａ断片の迅速な配列決定
CN115896252A (zh) 用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品
US20140336058A1 (en) Method and kit for characterizing rna in a composition
CN112739829A (zh) 测序文库的构建方法和得到的测序文库及测序方法
JP2023547394A (ja) オリゴハイブリダイゼーションおよびｐｃｒベースの増幅による核酸検出方法
US20180291436A1 (en) Nucleic acid capture method and kit
US11136576B2 (en) Method for controlled DNA fragmentation
EP4041913B1 (en) Novel method
WO2023215524A2 (en) Primary template-directed amplification and methods thereof
WO2023237180A1 (en) Optimised set of oligonucleotides for bulk rna barcoding and sequencing
EP4392577A1 (en) Optimised set of oligonucleotides for bulk rna barcoding and sequencing
WO2024059622A2 (en) Methods for simultaneous amplification of dna and rna
CN105247076B (zh) 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
Jansen et al. Serial analysis of gene expression in human keratinocytes and epidermis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220707

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220411

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230929

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230929