JPWO2021064430A5

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Publication number: JPWO2021064430A5
Application number: JP2022520576A
Authority: JP
Publication date: 2023-10-10

Description

(洗浄緩衝液#2)
(「高ストリンジェンシー緩衝液」―低親和性ハイブリダイゼーションプローブを除去するための、低塩濃度、高温)0.1×SSC、0.1% SDS、及びH₂O。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)1以上の標的核酸セグメントを含む核酸組成物を取得する工程;
(b)該核酸組成物を架橋する工程;
(c)架橋核酸組成物をエンドヌクレアーゼ酵素を用いて断片化する工程;
(d)断片化された架橋核酸セグメントの末端を、共有結合により連結されたビオチン部分を含む1以上のヌクレオチドで充填する工程;
(e)工程(d)で取得した断片化された核酸セグメントをライゲーションして、ライゲーション断片を作製する工程;
(f)リコンビナーゼ酵素を使用して、該ライゲーション断片上に、一工程で断片化及びオリゴヌクレオチドの挿入を実施する工程;
(g)工程(d)のビオチン部分を含む断片を富化する工程;
(h)該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化する工程;
(i)工程(h)で取得した富化断片を配列決定して、該1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する工程、を含む、前記方法。
（態様２）
工程(h)が、標的化増幅を実施して、前記1以上の標的核酸セグメントを含む断片を富化することを含む、態様1記載の方法。
（態様３）
工程(h)が:
(i)前記1以上の標的核酸セグメントと結合する単離用核酸分子を付加することであって、該単離用核酸分子を結合対の第1の半分で標識する、前記付加すること;及び
(ii)該結合対の第2の半分を使用することにより該単離用核酸分子に結合した、該1以上の標的核酸セグメントを含む断片を単離すること、を含む、態様1記載の方法。
（態様４）
工程(f)を、タグメンテーションにより実施する、態様1～3のいずれか1項記載の方法。
（態様５）
工程(e)が、核内ライゲーションを利用する、態様1～4のいずれか1項記載の方法。
（態様６）
前記リコンビナーゼ酵素がレトロウイルスインテグラーゼ、例えば突然変異体トランスポザーゼ、例えば活動亢進性Tn5トランスポザーゼである、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様７）
前記リコンビナーゼ酵素が配列決定用の対をなす末端アダプター配列又はその断片を含む、態様1～6のいずれか1項記載の方法。
（態様８）
前記オリゴヌクレオチド及び/又はアダプター配列がバーコード配列を含む、態様1～7のいずれか1項記載の方法。
（態様９）
前記オリゴヌクレオチド及び/又はアダプター配列が:配列番号:1、配列番号:2、及び/若しくは配列番号:3、又は後続のライブラリ調製及び配列決定を可能とするオリゴヌクレオチド配列から選択される、態様7又は8記載の方法。
（態様１０）
工程(h)における単離用核酸分子の付加を、アダプター配列の相補性を介したライゲーション断片の他のライゲーション断片との結合を妨げる配列、例えばブロッカー配列の存在下で実施する、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様１１）
前記1以上の標的核酸セグメントが:プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、又はインスレーターから選択される、態様1～10のいずれか1項記載の方法。
（態様１２）
前記単離用核酸分子が、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから取得される、態様1～11のいずれか1項記載の方法。
（態様１３）
前記単離用核酸分子がRNAである、態様1又は3～12のいずれか1項記載の方法。
（態様１４）
前記結合対の第1の半分がビオチンを含み、かつ前記結合対の第2の半分がストレプトアビジンを含む、態様3～13のいずれか1項記載の方法。
（態様１５）
工程(c)で使用する制限酵素がHind III又はDpn IIである、態様1～14のいずれか1項記載の方法。
（態様１６）
工程(g)において前記ビオチン部分を含む前記富化断片を増幅することをさらに含む、態様3～15のいずれか1項記載の方法。
（態様１７）
工程(i)の前に単離されたライゲーション断片を増幅することをさらに含む、態様1～16のいずれか1項記載の方法。
（態様１８）
前記標的化増幅又は増幅することが、PCRによって実施される、態様1、2、又は4～17のいずれか1項記載の方法。
（態様１９）
前記核酸組成物が哺乳動物細胞核、例えばヒト細胞核に由来する、態様1～18のいずれか1項記載の方法。
（態様２０）
前記核酸組成物が非ヒト細胞核、例えばマウス細胞核又は植物細胞核に由来する、態様1～19のいずれか1項記載の方法。
（態様２１）
前記核酸組成物が10000、50000、20万、50万、又は100万個の細胞に由来する、態様1～20のいずれか1項記載の方法。
（態様２２）
特定の疾患状態を示す1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)特定の疾患を有する個体から取得した核酸組成物に態様1～21のいずれか1項記載の方法を実施すること;
(b)核酸セグメント及び1以上の標的核酸セグメントの間の相互作用の頻度を定量化すること;及び
(c)該疾患状態を有する個体由来の該核酸組成物における相互作用の頻度を、健康な対象由来の正常対照核組成物における相互作用の頻度と比較することであって、その結果該核酸組成物における相互作用の頻度の差が特定の疾患を示す、前記比較すること、を含む、前記方法。
（態様２３）
前記疾患状態が:癌、自己免疫疾患、発達疾患、又は遺伝性障害から選択される、態様22記載の方法。
（態様２４）
1以上の標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットであって、態様1～21のいずれか1項記載の方法を実施可能な緩衝剤及び試薬を含む、前記キット。
（態様２５）
前記リコンビナーゼ酵素がレトロウイルスインテグラーゼ又はトランスポザーゼ酵素、例えば突然変異体トランスポザーゼ酵素、例えば活動亢進性Tn5トランスポザーゼである、態様24記載のキット。